Summary
Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur Ultraschall-gesteuerte Injektion von Neuroblastom (NB) und Ewing Sarkom (ES) Zellen zu nutzen (gegründet Zelllinien und Patienten abgeleitet Tumorzellen) an biologisch relevanten Standorten erstellen zuverlässigere präklinische Modellen für Krebs Forschung.
Abstract
Präklinische Tests von Anti-Krebs-Therapien setzt auf relevante Xenograft-Modelle, die die angeborenen Tendenzen des Krebses zu imitieren. Vorteile des standard subkutane Flanke Modelle sind prozedurale Leichtigkeit und die Fähigkeit, Monitor Tumorprogression und Antwort ohne invasive Bildgebung. Solche Modelle sind oft widersprüchlich in translationalen klinischen Studien und eingeschränkten biologisch relevante Merkmale mit geringer Neigung, Metastasen, zu produzieren wie eine native Mikroumgebung fehlt. Im Vergleich dazu zeigten orthotopen Xenograft Modelle an native Tumor Standorten zu imitieren den Tumor Mikroumgebung und wichtige Erkrankung Merkmale wie Ferne Metastasierung zu replizieren. Diese Modelle erfordern oft mühsame Operationsverfahren mit Narkose längere Zeit und Erholung. Um dieses Problem anzugehen, haben Krebsforscher kürzlich Ultraschall-geführte Injektionstechniken zu Krebs Xenograft Modelle für präklinische Experimente, ermöglicht eine schnelle und zuverlässige Einrichtung unter der Regie von Gewebe murinen Modellen genutzt. Ultraschall-Visualisierung ermöglicht auch eine nicht-invasive Methode zur longitudinalen Beurteilung der Tumor Engraftment und Wachstum. Hier beschreiben wir die Methode für die Ultraschall-gesteuerte Injektion von Krebszellen, unter Verwendung der Nebenniere für NB und renale Sub Kapsel für ES. Diese minimal-invasive Ansatz überwindet mühsam offene Operation Implantation von Krebszellen im Gewebe-spezifische Standorte für Wachstum und Metastasierung und morbide Erholungsphasen nachlässt. Wir beschreiben die Verwendung von etablierten Zelllinien und Patienten abgeleitete Zellinien zur orthotopen Injektion. Vorgefertigte kommerziellen Kits sind erhältlich für Tumor Dissoziation und Luciferase tagging von Zellen. Injektion von Zellsuspension mit Bildführung bietet eine minimalinvasive und reproduzierbare Plattform für die Erstellung von präklinischen Modellen. Diese Methode wird genutzt, um zuverlässige präklinischen Modellen für andere Krebsarten wie Blase, Leber und Bauchspeicheldrüse Veranschaulichung seiner ungenutzte Potenzial für zahlreiche Krebs-Modelle zu erstellen.
Introduction
Tierische Xenograft Modelle sind unverzichtbare Werkzeuge für präklinische Studien neuartiger Anti-Krebs-Therapien. Standard murinen Xenotransplantate setzen auf subkutane Flanke Implantation von Zellen, die vorsieht, dass einer effiziente und leicht zugänglichen Website Überwachung Tumorwachstum. Der Nachteil der subkutanen Modelle ist ihr Mangel an Tumor-spezifische biologische Merkmale, die ihr Potenzial metastasize1eingeschränkt werden kann. Solche Einschränkungen sind durch den Einsatz von orthotopen Xenotransplantate in welchem, die Tumor Zellen bei nativen Gewebe, die relevanten Mikroumgebung mit metastasierendem potenzielle2aufgeprägt sind. Orthotopen Xenograft Modelle erhalten ursprüngliche biologischen Eigenschaften und bieten zuverlässige Modelle für präklinische Drug Discovery3,4. Die Krebszellen genutzt für die Implantation unter der Regie von Gewebe sind etablierte Zelllinien oder Patienten gewonnenen Zellen von Patienten Tumoren. Gegründet von Krebszelllinien Xenotransplantate können hohe genetische Abweichung von den primären Tumor im Vergleich zu Patienten abgeleiteten Xenotransplantate5aufweisen. Angesichts dieser Tatsache ist die Einrichtung des Patienten abgeleitet orthotopen Xenotransplantate bevorzugter Standard für das Testen neuen Therapeutika in der Drogeentdeckung Krebs geworden.
In der pädiatrischen Krebs Neuroblastom (NB) orthotopen Xenograft Modelle rekapitulieren Primärtumor Biologie und Metastasen zu typischen Sehenswürdigkeiten der NB verteilt6,7zu entwickeln. NB entwickelt in der Nebenniere oder entlang der paravertebralen Grenzstrang. Die am häufigsten verwendeten Methoden der orthotopen Implantation erfordern offene Trans abdominale chirurgische Eingriffe. Solche Methoden sind oft langweilig, haben hohe Tier Morbidität und komplexe Erholungsphasen. Hochauflösende Ultraschall wurde vor kurzem für Gewebe gerichtet Implantation von Tumorzellen in der Entwicklung von mehreren murinen Modellen für Krebs Forschung8,9genutzt. Die Technik ist zuverlässige, reproduzierbare, effizient und sicher für die Einrichtung von entsprechenden metastasiertem Tumor Xenografts10,11.
Die Einrichtung der pädiatrischen Krebs Xenotransplantate durch Ultraschall-geführte Ziel Orgel Lokalisierung und Nadel Implantation von Zelllinien und Patienten abgeleitet Tumorzellen ist nachgewiesene11. Die Technik war für NB gezielt an der murinen Nebenniere genutzt. Ewing Sarkom (ES) ist überwiegend ein knöcherner Krebs, häufig in den langen Röhrenknochen wie Femur und Beckenknochen12zu sehen. Fallberichte haben gezeigt, dass um festzustellen, ob eine überwiegend knöcherner Krebswachstum in renal Gewebe machbar ist, eine renale Sub Kapsel Lage für orthotopen Implantation13gewählt wurde. Renal Sub Kapsel Zelle Implantation von Tumorzellen ist als ein zukunftsträchtiges Modell, spontane Metastasen für ES14zu studieren verwendet worden.
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Protocol
Alle Arbeit erfolgte in Übereinstimmung mit der University of Michigan Institutional Review Board (HUM 00052430) und entspricht den Verfahren, die von der Universität Ausschuss für Gebrauch und Pflege von Tieren (UCUCA) genehmigt. Die Einheit für Labor von Tier Medizin (ULAM) beaufsichtigte Tierpflege.
Alle Arbeit wurde mit Genehmigung von der University of Michigan Institutional Review Board (HUM 00052430) getan und alle Humanforschung Ethik Komitee Vorschriften entspricht. Menschliche Zellen gelten als potenziell biogefährliches Material sein, also folgen alle Vorsichtsmaßnahmen und entsprechende Biosafety-Praktiken, die von Ihrer Institution erforderlich sind. NSG-Mäuse sind stark immungeschwächten und anfällig für Krankheiten, verursacht durch Bakterien in der Umwelt weit verbreitet.
Verwenden Sie immer strengen sterilen Technik, bei der Vorbereitung der Materialien für die Implantation und die Injektionen durchführen.
(1) Zellkultur
- Etablierten menschlichen NB Zelllinien (SH-SY5Y, SK-N-BE2 und IMR32) in minimaler wesentliches Medium wachsen mit 10 % fötalen Rinderserum, 2 mM Glutamin, 100 Einheiten/mL Penicillin und 100 μg/mL Streptomycin ergänzt. IMR32 Zellen weiter mit 1 mM Pyruvat und 0.075 % Nahco33zu ergänzen. Halten Sie alle Zellen bei 37 ° C, 5 % CO2 und 70-80 % Zusammenfluss.
- Wachsen Sie menschliche ES Zelllinien (TC32, A673 CHLA-25 und A4573) in RPMI Medium mit 10 % fötalen Rinderserum und 6 mM L-Glutamin ergänzt. Halten Sie alle Zellen bei 37 ° C, 5 % CO2 auf 70-80 %.
- Senden Sie alle Zelllinien für die Authentifizierung.
Hinweis: Zelle Authentifizierung erfolgt bei einer Außenanlage, verweisen wir auf Bestätigungen.
2. Vorbereitung des Patienten abgeleitet Primärtumor Zellen
- Mit Zustimmung des Patienten und Zustimmung verworfen Ernte menschlichen NB Tumorgewebe von Patienten, die eine chirurgische Resektion für lokale Kontrolle und Transport ins Labor in Gewebe Speicherlösung für Erhaltung.
Hinweis: Alle Patientenproben de identifiziert und entsprechend den Institutional Review Board Richtlinien behandelt. - Generieren Sie einen einzigen Patienten abgeleitet Krebs Zellsuspension (UMNBL001, UMNBL002) aus Tumorgewebe mit einem Tumor Dissoziation-Kit. Transfer ca. 0,5 g des Tumors zum einen 100 mm Zelle Kulturschale mit 5 mL RPMI Puffer, 200 µL Enzym H, 100 µL Enzym R und 25 µL Enzym A aus dem menschlichen Tumor-Dissoziation-Kit.
- Hacken den Tumor in kleine Stücke (2-4 mm) mit Schere und Zange Gewebe. Mischen Sie diese Fragmente mit den Lösungen im Schritt 2.2.
- Pipette die Tumor-Mischung in ein Dissociator Rohr und das Röhrchen verschließen. Invertieren der Röhre und auf der Hülle der Gewebe Dissociator befestigen. Führen Sie auf Programm h_tumor_01.
- Inkubieren Sie die Tumor-Zellsuspension oben erhaltenen bei 37 ° C für 1 h auf einem drehbaren Gestell mit intermittierenden Verreibung alle 15 min.
- Übertragen der Zellsuspension auf eine neue konische Rohr 50 mL und 10 mL RPMI. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 314 X g für 5 min.
- Den überstand zu entfernen und das Pellet in 5 mL RPMI auszusetzen. Diese Lösung durch ein 40 µm Zelle Sieb passieren und die angespannte Lösung in ein frisches 50 mL konische Röhrchen sammeln. Waschen Sie dieses Sieb einmal mit 5 mL RPMI Medien und Zentrifugieren Sie die Mischung bei 314 X g für 5 min, ein Pellet zu sammeln.
- Messen Sie die Zelldichte mit einem Hemacytometer15. Aussetzen der Pellets von oben erwarb RPMI, eine Endkonzentration von 4 × 105 Zellen/10 µL zu erhalten. Nehmen Sie 5 µL dieser Zellsuspension und 5 µL Matrigel 10 µL der Zelle Lösung für jede Injektion zu machen.
Hinweis: RPMI verwendet hängt die Zelle Dichtemessung. Beispielsweise wenn die gemessenen Zelldichte des erhaltenen Pellets 4 x 105 Zellen ist, aussetzen Sie, das Pellet in 10 µL RPMI.
(3) Luciferase Tagging von Krebszellen
- Machen Sie 10 mL der Transduktion Medien mit viralen überstand EF1a-Luc2-IRES-mCherry 5 mL und 5 mL Stammzell-Medien. Fügen Sie 7,5 µL 1 X Polybrene.
- Mix 5 × 106 Krebszellen in Transduktion Medien und Platte in 100 mm ultra-niedrigen Befestigungsplatte. Inkubation bei 37 ° C und 5 % CO2 über Nacht.
Hinweis: Da niedrige anbauplatten verwendet werden, werden Zellen nicht Platte eingehalten. - Bringen Sie nach 24 h 100 mm Platte Zellen unter Gewebekultur Haube zu, und übertragen Sie die Mischung in ein 15 mL konische Röhrchen. Zentrifugieren der Zellsuspension bei 314 X g für 5 min. zu Fuß die Zelle Pellet. Waschen Sie die Zelle Pellet einmal mit 1 mL 1 x Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) und Aussetzen der Zelle Pellet in 1 mL HBSS, enthält 1 % fetalen bovine Serum (FBS).
- Sortieren Sie Luciferase Zellen basierend auf GFP-positiven Signal auf Fluoreszenz-aktivierte Zelle Sortieren (FACS) Analyse. Platte der sortierten Zellen auf 100 mm Gewebekultur behandelt-Speise- und pflegen auf 70-80 % Zusammenfluss, 37 ° C und 5 % CO2 bis erforderlich.
- Luciferase Signal mit Luciferase Assay Kit zu bestätigen. Platte 10 x 104 sortiert Zellen pro Bohrloch in ein Illuminometer kompatibel 96 gut Platte und inkubieren Sie Zellen über Nacht bei 37 ° C und 5 % CO2. Nach 24 h 96-well-Platte auf Raumtemperatur bringen und kultivierten Medien in Brunnen im Verhältnis 1:1 Steady-Glo Reagenz hinzuzufügen. Können Sie Zellen lysiert für 5 min und Lumineszenz im Spektralphotometer zu lesen.
- Bringen Sie die 100 mm Schale unter einer Gewebekultur Haube. Verwerfen Sie die überstand Medien. Waschen Sie die Zellen einmal mit 2 mL 1 X PBS.
- Fügen Sie 2 mL 0,25 % Trypsin und 100 Millimeter-Teller in den Inkubator für 2-3 min zurück. Nach 2-3 min verdrängt Zellen unter dem Mikroskop suchen Sie und 8 mL RPMI, Trypsin zu deaktivieren.
- Sammeln Sie die Zellsuspension in einem 15 mL konische Rohr und Zentrifuge bei 314 X g für 5 min. zu Fuß ein Pellet. Verwerfen Sie den überstand. Waschen Sie die Zelle Pellet mit 1 mL 1 X PBS, auszusetzen Sie, das Pellet in 5 mL RPMI und bestimmen Sie die Zelldichte mit einem Hemacytometer15. Zentrifugieren Sie Yhe verbleibende Zelle Lösung bei 314 X g für 5 min um eine Kugel zu erhalten.
- Hängen Sie das Pellet in RPMI, eine Konzentration von 4 x 105 Zellen/10 µL zu erhalten. Nehmen Sie 5 µL Zellsuspension und 5 µL Matrigel 10 µL der Zelle Lösung für jede Injektion zu machen.
4. Ultraschall geführte Nebenniere (NB) oder renale Sub-Kapsel (ES)-Implantation
Hinweis: Alle Ultraschall-Verfahren werden mit einer hohen Auflösung in Vivo imaging-System durchgeführt. Für die beschriebenen Verfahren wurde die Wandler, hat eine Mittenfrequenz von 40 MHz und eine Bandbreite von 22-55 MHz verwendet.
- 6-8-Woche-alten immundefiziente NSG Mäuse für alle Injektionsverfahren zu nutzen.
- Chill Matrigel und autoklaviert Hamilton Spritzen ausgestattet mit einer 27G Nadel (1,25") und 22G Katheter (0,9 mm Außendurchmesser, Länge 25 mm) über Nacht bei 4 ° c
- Legen Sie die Zelle Lösung in Schritt 3 auf Eis zubereitet.
- Betäuben Sie die Mäuse in einer Induktion Kammer mit 2 % Isofluran O2 bei 2 L/min geliefert.
Hinweis: Ausreichende Anästhesie wird mit der Mangel an Bewegung und die Erhaltung der Spontanatmung bestimmt. - Sobald betäubt, enthaaren Sie den Rücken und die Flanken der Tiere mit Haarwasser entfernen (z. B. Nair) und einen Rasierer.
- Das Tier zum Übertragen der imaging Plattform mit Bauch Seite nach unten, wo die Nase des Tieres in eine Nosecone platziert und sicherte sich beim Einatmen Isofluran
- Setzen Sie optische Salbe in das Tier Augen Austrocknen zu verhindern. Kleben Sie die Maus um eine unbeabsichtigte Bewegung zu verhindern.
- Identifizieren der murinen Leber, Vena Cava, Milz, linke Niere und angrenzenden linke Nebenniere mit Ultraschall Visualisierung.
- Sterile Handschuhe, Maske und Mütze für persönlichen Schutz und Pflege der sterilen Bedingungen zu verwenden. Unter Ultraschallkontrolle sanft legen Sie 22G Katheter durch die Haut und sichern Sie Muskel direkt in der linken Nebenniere für zelluläre Injektion einen Kanal zu. Entfernen Sie die Nadel und verlassen Sie den Katheter im Ort zu.
- Last einer gekühlten Hamilton-Spritze mit einer KK Nadel mit 10 µL der Zelle-Lösung ausgestattet, dann führen Sie die Spritze hierbei durch den Katheter positioniert in der Mitte der Nebenniere.
- Injizieren Sie die Zellen in den Nebennieren Zielgewebe. Belassen der Nadelöhrs für 1-2 min erlauben die Matrigel festlegen. Langsam ziehen Sie die Nadel, gefolgt von der Entfernung des Katheters.
- Setzen Sie die Mäuse wieder in ihren Käfig und sicherstellen Sie, dass die Maus ausreichend zur Aufrechterhaltung der sternalen liegen wieder zu sich kommt.
Hinweis: aufgrund des minimal-invasiven Charakters dieser Technik, post prozeduralen Schmerz ist minimal, aber immer noch überwacht auf einer täglichen Basis mit Mäusen Gesundheit Kontrollen. "befolgt werden mit einem Satz:" Wenn unerwartete Zeichen von Schmerz oder Stress im Verlauf gekennzeichnet sind ein Experiment wenden Sie sich bitte mit Ihrem institutionellen tierärztliche Unterstützung Gerät Informationen zur Analgesie oder andere medizinische Versorgung.
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Representative Results
Mit den beschriebenen Verfahren vorgestellt, erfolgte Ultraschall-geführte Implantation von NB-Zellen in der Nebenniere in einem speziellen Verfahren Raum verfügt über eine beheizte OP-Tisch. Arm und Fuß-Pads stellte für die Überwachung der murinen Herztätigkeit (Abbildung 1A). Das Tier blieb unter kegelkonus Inhalation mit Isofluran betäubt. Mit einer hochauflösenden Ultraschallsonde, wurde die linke Niere mit Nebenniere nur cranial der Niere (Abb. 1 b) gekennzeichnet. Die Nadel wurde dann in der Nebenniere unter direkter Visualisierung (Abbildung 1) vorgeschoben. Während der ersten Nutzung dieser Technik war eine Mischung von Methylenblau-Dye und Matrigel verwendet, um korrekte Lokalisierung der Nebenniere zu bestätigen. Das Tier wurde geopfert, und der Erfolg des Verfahrens wurde am Autopsie bestätigt durch die Visualisierung Methylenblau Farbstoff unter die Nebenniere Kapsel (Abbildung 1).
Wöchentliche Ultraschall- und Biolumineszenz Bildgebung wurden die Modalitäten zur Überwachung der Tumor Engraftment und Wachstum Rate. Biolumineszenz-Bildgebung der Region von Interesse war gemessen als Photonen/s/cm2/steridian (p/s/cm2/sr) mit einer minimalen Anzahl von 106 bis 108 bezeichnend für angemessene Tumorgröße für präklinische Experimente9 ( Abbildung 2). Analyse mit t -Test zeigte statistisch signifikanten Anstieg der Biolumineszenz wurde im Zeitraum von acht Wochen (* p< 0,05; **p< 0,001; ***p< 0,0001). Ultraschall-Bildgebung erlaubt nicht-invasive Messung der Tumor Fläche und das Volumen. Dies zusammen mit Biolumineszenz Messung überwacht Tumor Engraftment und Progression (Abbildung 3). Ähnliche Verfahren wurden für ES-Zellen injiziert in die renale Sub-Kapsel (Abbildung 4) eingesetzt.
Brutto- und histologische Analyse der daraus resultierenden Tumoren gekennzeichnet die Primärtumoren und Metastasen auf Autopsie. Gewebeproben wurden für morphologische Zellmuster untersucht und gebeizt für Tumor-spezifische Protein-Marker (Abbildung 5, Abbildung 6). Primärtumor Engraftment für NB-Zell-Linien (IMR32 SH-SY-5Y, SK-N-BE2, UMNBL001, UMNBL002) reichten von 62-100 % mit Metastasen gesehen in 0-100 % der injizierten Mäusen. Die robustesten Metastasen wurden gesehen in der SK-N-BE2 (33 %) und UMNBL002 (100 %). Metastasiertem Websites für NB wurden Lymphknoten, Leber, Lunge und Kortikalis. Renal Sub Kapsel Engraftment für ES-Zell-Linien (A4573, A673, CHLA-25, TC-32) reichten von 60-100 % mit Metastasen gesehen in 0-40 % der injizierten Mäusen. Metastasiertem Websites untersucht ES inklusive Lymphknoten, kortikale Knochen und Lunge. Die robusteste Engraftment (100 %) und Metastasen (40 %) wurden in TC-32 Xenograft Mäuse gesehen.
Abbildung 1 . Murine Nebenniere Lokalisierung und Ultraschall-geführte NB Zelle Implantation. (A) hochauflösende Ultraschall-Bildgebung der murinen Bauchorgane erlaubt Nebenniere Implantation von Tumorzellen. (B) linke Niere wurde identifiziert. (C) der linken Nebenniere befindet sich angrenzend an die linke Niere wie ein echoarm (dunkel), Runde Struktur. Die Nadel wurde in der Nebenniere, gefolgt von Zelle Injektion vorangetrieben. (D) eine Mischung aus Matrigel und Methylenblau-Dye wurde verwendet, um die Genauigkeit der Injektionsverfahren zu bewerten. Repräsentative ex Vivo Bild der linken Niere und Nebenniere mit Matrigel und Methylenblau Farbstoff an der Nebenniere Kapsel und Peri-Nebennieren-Raum. Diese Zahl verändert wurde, mit freundlicher Genehmigung von Van Noord, R.A. Et Al. 11. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 . In vivo Biolumineszenz Bildgebung der Tumor Engraftment und Wachstum Rate. (A) menschliche NB Nebennieren Xenotransplantate wurden Engraftment und Tumorwachstum über acht Wochen beobachtet. (B) maximale Biolumineszenz Signal wurde in der Region von Interesse bestimmt. NB-Zell-Linien (SH-SY5Y, IMR 32, SK-N-BE2) und Patienten gewonnenen Zellen (UMNBL001, UMNBL002) hatte Ausstrahlung und Wachstum Muster im Laufe der Zeit erhöht. Erhöhung der Biolumineszenz über die acht-Wochen-Frist war statistisch signifikant (*p< 0,05; **p< 0,001; ***p< 0,0001). Diese Zahl verändert wurde, mit freundlicher Genehmigung von Van Noord, R.A. Et Al. 11. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 . In vivo Ultraschall-Bildgebung der Tumor Engraftment und des Wachstums. Ultraschall-Bildgebung überwacht in Vivo Tumorprogression. Ultraschall-Bildern und entsprechenden Biolumineszenz Bilder bei eins, zwei und acht Wochen werden angezeigt. Eine Woche war Engraftment in beiden bildgebenden Verfahren visualisiert. Tumor-Fläche und das Volumen wurden mit Ultraschall-Bildgebung berechnet. 3D Ultraschallbilder gespiegelt ausgeschnittene Tumoren bei Abschluss der Studie. Diese Zahl verändert wurde, mit freundlicher Genehmigung von Van Noord, R.A. Et Al. 11. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4 . Murine Niere Lokalisierung und Ultraschall-geführte Implantation Embryonaler Stammzellen. (A) Biolumineszenz wurde verwendet, um Tumor Ausstrahlung und Wachstum zu überwachen. (B-C) Tiere entwickelten lokal invasive Tumoren, die verzerrt umgebenden Abdominal-Strukturen und drangen in die lokalen Strukturen wie Muskeln. Diese Zahl verändert wurde, mit freundlicher Genehmigung von Van Noord, R.A. Et Al. 11. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5 . Tumor-Histopathologie von NB und ES Xenograft Tumoren. (A) NB Xenograft Mäuse hatten lokal infiltrative primären Tumoren an den Nebennieren und Peri Adrenal Gland-Standorten, die benachbarte Bauchorgane verzerrt. (B) mikroskopisch (20 X, bar = 50 µm), die Xenograft-Nebennieren-Tumoren zeigten morphologische Merkmale mit menschlichen NB (Cluster von schlecht differenziert eckige, Runde Zellen), einschließlich gelegentliche Pseudo Rosette Bildung (Pfeil). (C) Tumorgewebe zeigte starke Tyrosin-Hydroxylase (NB Tumormarker)-Immunoreactivity (40 X, bar = 40 µm; Positivkontrolle Färbung in der linken Leiste dargestellt; 1: 100). (D) ES Xenograft Tumor hatte histologische Eigenschaften infiltrative ES entsprechen (40 X, bar = 40 µm), Cluster von eckigen, runden Epitheloiden Zellen getrennt durch eine feine Fibro vaskulären Stroma, auszulöschen und Komprimieren von normalen angrenzenden Niere (Pfeil; komprimierte Reste von nierenparenchym). (E) ES Tumorgewebe zeigte starke Membran Immunoreactivity für ES Tumormarker CD99 (40 X, bar = 40 µm; Positivkontrolle Färbung in der linken Leiste dargestellt; 1: 100). Diese Zahl verändert wurde, mit freundlicher Genehmigung von Van Noord, R.A. Et Al. 11. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 6 . Fernmetastasen entwickelt in Xenotransplantate festgelegten Ultraschall-geführte Injektionstechnik. (A) Biolumineszenz Bildgebung zeigt der Primärtumor NB an der Nebenniere Raum und metastatischen Herde in kortikalen Knochen entdeckt. (B) mikroskopische Analyse ergab einen metastasierenden Tumor (Pfeil) auszulöschen Knochenmark Kavität und Kortikalis des proximalen Femur (4 X bar = 400 µm). (C) Tyrosin Hydroxylase zytoplasmatischen Immunoreactivity des Standortes Kortikalis NB metastasierendem (40 X, bar = 40 µm). (D) Mikroskopie des Patienten abgeleitet orthotopen Xenograft (UMNBL002) mit einer hepatischen Metastase (Pfeil) innerhalb einer Lebervene (Pfeilspitze zeigt Endothelzellen) und Infiltration der angrenzenden Leber (L) Parenchym (20 X, bar = 50 µm). (E) Neuroblastom micro Metastase (Pfeil) innerhalb des Lungenparenchyms (40 X, bar = 40 µm). Diese Zahl verändert wurde, mit freundlicher Genehmigung von Van Noord, R.A. Et Al. 11. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Ultraschall-geführte Implantation von NB und ES Zellen ist eine effiziente und sichere Methode, um zuverlässige murinen Xenotransplantate für präklinische Studien in der Krebsbiologie zu etablieren. Entscheidend für den Erfolg des Ultraschall-geführte Gewebe gezielt Implantation ist die Präsenz und Verfügbarkeit von geschultem Personal mit Fachwissen in anatomisch Lokalisierung der Orgel von Interesse und Stereotaktische Injektion von Tumorzellen.
Die Dissoziation des Tumorgewebes erwies sich als ein entscheidender Schritt bei der Entwicklung der beschriebenen Patienten-derived Xenograft-Modells. Native Tumorgewebe umfasst eine zelluläre Mikroumgebung und umgebenden Stroma, die den Tumor Aufnahme oder Engraftment beeinträchtigen können. Zelle zählt, nach der Dissoziation-Prozess abgeschlossen ist, ein Gradmesser für die zelluläre Dichte in der Probe mit 2 x 105 Zellen/10 μL betrachtet eine optimale Zellzahl für Implantation und erfolgreichen Tumor Engraftment versehen war.
Luciferase tagging von Zellen, die für die Validierung der Tumor Engraftment erlaubt und Überwachung des Tumorwachstums durch Biolumineszenz Messsignal mit 106 bis 108 Hinweis auf Tumor Aufnahme9gezogen. Um erfolgreiche Transduktion zu gewährleisten, wurde Luciferase Aktivität bestätigten in Vitro vor der Injektion von Zellen. Dies geschah durch Immunfluoreszenz, Luciferase Assay Kits, und auch durch die Untersuchung der Zellen für die Biolumineszenz-Signal. Einstellungen zur Messung der Biolumineszenz waren konstant gehalten, Bereitstellung von konsistenten Daten während der wöchentlichen Messungen.
Ex-Vivo histopathologische Analyse von Tumoren bestätigt die Zelltyp und Morphologie der daraus resultierenden Tumoren mit spezifischen Färbung für Protein-Marker. Histopathologische Analyse bestätigte Tumor Engraftment und Metastasierung durch Ultraschall und Biolumineszenz Bildgebung nachgewiesen.
Vorteile der Ultraschall-geführte zellulären Implantation gehören seine nicht-invasive Art, minimale Tier Erholungszeit und wachsenden Erfolg bei der Gründung von mehreren erfolgreichen Xenograft-Modellen. Ultraschall-Bildgebung bietet auch eine zuverlässige Methode zur Überwachung der in Vivo Tumor Progression und Tumor Bände. In diesen präklinischen Modellen fortgeschritten Tumoren lokal invasiven Erkrankungen mit Metastasen innerhalb von 5 Wochen. Grenzen sind die Verfügbarkeit von hoher Auflösung imaging-Technologie und die Fähigkeit, konsequent das Zielorgan zu lokalisieren. Verfügbarkeit von Personal mit Know-how in der Ultraschall-Bildgebung der Orgel von Interesse sind wichtige Komponenten dieser Technik.
Die Verfügbarkeit von hochauflösenden Ultraschall-Bildgebung hat in den letzten zehn Jahren erheblich zugenommen und weiterhin, dass seine Verwendung nicht nur in der klinischen Praxis, sondern auch in der Forschung im Labor zu erweitern. Die Nutzung von Ultraschall für die Entwicklung der modernen murinen Xenotransplantate ist eine vielversprechende Anwendung mit Potenzial für die Förderung der präklinischen Forschungsmodelle für die Wirkstoffforschung Krebs.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Angaben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der Robert Wood Johnson Foundation/Amos medizinische Fakultät Entwicklung Programm, Taubman Research Institute, und die Sektion für Kinderchirurgie, der University of Michigan unterstützt. Die Autoren möchten Kimber Converso-Baran und Dr. Marcus Jarboe danken für die Unterstützung bei der Ultraschall-Injektionsverfahren und imaging Plattform. Wir danken Paul Trombley für seine Unterstützung bei der Abbildung Grafiken. Gewähren Sie wir danken auch die Abteilung für Radiologie an der University of Michigan für den Einsatz des Center für Molekulare Bildgebung und der Tumor-Imaging-Kern, die teilweise durch umfassende Cancer Center NIH unterstützt werden, P30 CA046592. Der University of Michigan Physiologie Phänotypisierung Kern, der teilweise durch Zuschüsse von der NIH (OD016502) und Frankel Cardiovascular Center unterstützt wird. Zelle Zeile Authentifizierung erfolgte bei IDEXX RADIEN Bioresearch Einrichtungen, Columbia, MO. Wir danken Tammy Stoll, Dr. Rajen Mody und Mott solide Tumor-Onkologie-Programm. Unsere Patienten und Angehörigen sind dankbar für ihre Inspiration, Mut und kontinuierliche Unterstützung unserer Forschung anerkannt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | |||
| NOD-SCID | Charles River | 394 | |
| NSG | The Jackson Laboratory | 5557 | |
| Cell Line | |||
| NB | |||
| IMR-32 | ATCC | CCL-127 | Established human neuroblastoma cell line |
| SH-SY5Y | ATCC | CRL-2266 | Established human neuroblastoma cell line |
| SK-N-Be2 | ATCC | CRL-2271 | Established human neuroblastoma cell line |
| ES | |||
| TC32 | COGcell.ORG | Established human Ewing's Sarcoma cell line | |
| A673 | COGcell.ORG | Established human Ewing's Sarcoma cell line | |
| CHLA-25 | COGcell.ORG | Established human Ewing's Sarcoma cell line | |
| A4573 | COGcell.ORG | Established human Ewing's Sarcoma cell line | |
| Cell Line media | |||
| RPMI | Life Technologies | 11875-093 | |
| Matrigel | BD BioSciences | 354234 | |
| Dissociation | |||
| Dissection Tools | KentScientific | INSMOUSEKIT | |
| Human Tumor Dissociation Kit | MACS Miltenyi Biotec | 130-095-929 | |
| gentleMACS dissociator | MACS Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| gentleMACS C tubes | MACS Miltenyi Biotec | 130-096-334 | |
| Cell Strainer | Corning | 431751 | |
| Luciferase Tagging | |||
| Lenti-GFP1 virus | University of Michigan, Vector Core | Luciferase Virus | |
| Steady Glo-Luciferase Assay Kit | Promega | E2510 | |
| Bioluminescence Imaging | |||
| Ivis Spectrum Imaging System | PerkinElmer | 124262 | |
| D-Luciferin | Promega | E160X | |
| Anesthetic | |||
| Inhaled Isoflurane | Piramal Critical Care Inc | 66794-0017-25 | |
| Ultrasound Guided Injection | |||
| Vevo 2100 High Resolution Imaging | Vevo | 2100 | |
| Hamilton Syringes (27 gauge needle) | Hamilton | 80000 | |
| 22 Gauge Angiocatheter | BD Biosciences | 381423 | |
| Optical ointment | Major Pharmaceuticals | 301909 | |
| Nair | Church & Dwight Co | Hair Removal agent | |
| Aquasonic 100 Ultrasound Transmission gel | Parker | Ultrasound gel | |
| Histology | |||
| CD99 | DAKO | M3601 | Primary Antibody |
| Tyrosine Hydroxylase | Sigma-Aldrich | T2928 | Primary Antibody |
| Secondary HRP-Polymer antibody | Biocare | BRR4056KG | |
| Miscelleneous | |||
| 10 mL Pipettes | Fisher Scientific | 13-676-10J | |
| 5 mL Pipettes | Fisher Scientific | 13-676-10H | |
| 1.5 mL Microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| P1000 pipette | Eppendorf | 3120000062 | |
| P200 pipette | Eppendorf | 3120000054 | |
| P1000 pipette tips | Fisher Scientific | 21-375E | |
| P200 pipette tips | Fisher Scientific | 21-375D | |
| Portable pipette aid | Drummond | 4-000-101 | |
| digital animal Weighing Scale | KentScientific | SCL-1015 | |
| Calipers | Fisher Scientific | 06-664-16 | |
| 6well low attachment plates | Corning | 07-200-601 | |
| 10 cm Tissue Culture Treated Dishes | Fisher Scientific | FB012924 | |
| Polybrene | Sigma-Aldrich | TR-1003-G |
References
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- Fidler, I. J., Hart, I. R. Biological diversity in metastatic neoplasms: origins and implications. Science. 217 (4564), 998-1003 (1982).
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