Summary
Vi præsenterer her, en protokol for at udnytte ultralydsvejledt injektion af neuroblastoma (NB) og Ewings sarkom (ES) celler (etableret cellelinjer og patient-afledte tumorceller) på biologisk relevante websteder til at oprette pålidelige prækliniske modeller for kræft forskning.
Abstract
Præklinisk afprøvning af anticancer behandlingsformer bygger på relevante xenograft modeller, der efterligner de medfødte tendenser af kræft. Fordele ved standard subkutane flanke modeller omfatter proceduremæssige lethed og evnen til at overvåge tumor progression og svar uden invasive billeddannelse. Sådanne modeller er ofte uforenelige i translationel kliniske forsøg og har begrænset biologisk relevante egenskaber med lav hang til at producere metastase, da der mangler en native mikromiljø. I sammenligning, har orthotopic xenograft modeller på native tumor websteder vist sig at efterligne tumor mikromiljø og kopiere vigtige sygdomskendetegn som metastatisk spredning. Disse modeller kræver ofte trættende kirurgiske procedurer med langvarig bedøvelsesmiddel tid og recovery perioder. For at løse dette, har kræftforskere for nylig udnyttet ultralydsvejledt injektion teknikker for at etablere kræft xenograft modeller for prækliniske forsøg, som giver mulighed for hurtig og pålidelig etablering af væv-instrueret murine modeller. Ultralyd visualisering giver også en invasiv metode for langsgående vurdering af tumor engraftment og vækst. Her, beskrive vi metoden til ultralydsvejledt injektion af kræftceller, udnytter binyrerne for NB og renal sub kapsel til ES. Denne minimalt invasiv metode overvinder kedelig åben kirurgi implantation af kræftceller i væv-specifikke steder for vækst og metastase, og aftager morbid fredninger. Vi beskriver udnyttelse af både etablerede cellelinier og patient afledte cellelinjer til orthotopic injektion. Pre-Made kommercielle kits er tilgængelige for tumor dissociation og luciferase tagging af celler. Injektion af cellesuspension ved hjælp af billede-vejledning giver et minimalt invasive og reproducerbare platform for oprettelsen af prækliniske modeller. Denne metode er udnyttet til at skabe pålidelige prækliniske modeller for andre kræftformer såsom blære, leveren og bugspytkirtlen eksemplificere sin uudnyttet potentiale for mange cancer modeller.
Introduction
Animalske xenograft modeller er uundværlige redskaber til prækliniske undersøgelser af roman anticancer behandlingsformer. Standard murine xenografts stole på subkutan flanke implantation af celler, giver en effektiv og let tilgængelig hjemmeside overvågning tumorvækst. Ulempen ved subkutan modeller er deres manglende tumor-specifikke biologiske karakteristika, som kan begrænse deres potentiale til at metastaserer1. Sådanne begrænsninger er overvundet ved hjælp af orthotopic xenografts i hvilke tumor celler er aflægger på native væv websteder, giver en relevant mikromiljø med metastatisk potentielle2. Orthotopic xenograft modeller bevare oprindelige biologiske funktioner og give pålidelige modeller for prækliniske drug discovery3,4. Kræftcellerne udnyttet til væv-instrueret implantation er enten etablerede cellelinier eller patient-afledte celler fra patientens tumorer. Xenografts etableret fra kræft cellelinjer kan udstille høj genetisk afvigelse fra den primære tumor i forhold til patientens afledte xenografts5. Da dette, er etablering af patient-afledt orthotopic xenografts blevet den foretrukne standard for afprøvning roman therapeutics i kræft drug discovery.
I pædiatriske kræft neuroblastoma (NB), orthotopic xenograft modeller sammenfatte primær tumor biologi og udvikle metastaser til typiske lokaliteter af NB sprede6,7. NB udvikler i binyrerne eller langs paravertebral sympatisk kæde. De mest almindelige metoder til orthotopic implantation kræver åben trans-abdominal kirurgiske procedurer. Sådanne metoder er ofte kedelige, høj animalsk sygelighed og komplekse fredninger. Høj opløsning ultralyd er for nylig blevet udnyttet til væv-instrueret implantation af tumorceller i udviklingen af flere murine modeller for kræft forskning8,9. Teknikken er pålidelige, reproducerbar, effektiv og sikker for etablering af relevante metastatisk tumor xenografts10,11.
Etablering af pediatric cancer xenografts ved ultralyd-styrede målet orgel lokalisering og nål implantation af cellelinjer og patient-afledte tumorceller er påvist11. Teknikken blev udnyttet til NB målrettet mod murine binyrerne. Ewings sarkom (ES) er overvejende en ossøse kræft, almindeligvis ses i de lange knogler som femur og bækken knogler12. Case rapporter har vist, for at afgøre om vækst af en overvejende ossøse kræft er muligt i nyre væv, en nyre sub kapsulær placering blev valgt til orthotopic implantation13. Renal sub kapsulær celle implantation af tumorceller har været udnyttet som en lovende model til at studere spontan metastaser til ES14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alt arbejde blev udført i overensstemmelse med The University of Michigan institutionelle Review Board (HUM 00052430) og er i overensstemmelse med procedurer, der er godkendt af universitetet Udvalget om brug og pleje af dyr (UCUCA). Enhed til laboratoriet af dyr medicin (ULAM) overvågede dyrs pleje.
Alt arbejde blev udført med godkendelse fra The University of Michigan institutionelle Review Board (HUM 00052430) og overholder alle menneskelige forskning etiske udvalg forordninger. Menneskelige celler anses for at være et potentielt biologisk materiale, så Følg alle særlige forsigtighedsregler og passende biosikkerhed praksis, der kræves af din institution. NSG mus er alvorligt immunkompromitterede og modtagelige for sygdom forårsaget af bakterier er almindeligt forekommende i miljøet.
Brug altid strenge steril teknik ved udarbejdelsen af materialer til implantation og klarer injektionerne.
1. cellekultur
- Vokse etablerede menneskelige NB cellelinjer (SH-SY5Y, SK-N-BE2 og IMR32) i minimal afgørende medium, suppleret med 10% føtal bovint serum, 2 mM glutamin, 100 enheder/mL penicillin og 100 μg/mL streptomycin. Supplere IMR32 celler yderligere med 1 mM pyruvat og 0.075% NaHCO3. Opretholde alle celler ved 37 ° C, 5% CO2 og 70-80% sammenløbet.
- Dyrke menneskelige ES cellelinjer (TC32, A673, CHLA-25 og A4573) i RPMI medium suppleret med 10% føtal bovint serum og 6 mM L-glutamin. Opretholde alle celler ved 37 ° C, 5% CO2 på 70-80% confluence.
- Send alle cellelinjer til godkendelse.
Bemærk: Celle godkendelse er udført på en udendørs facilitet, henvises til anerkendelser.
2. forberedelse af primære Patient-afledte tumorceller
- Med patientens samtykke og samstemmende udtalelse kasseret høst menneskelige NB tumor væv fra patienter, som gennemgår kirurgisk resektion for lokal kontrol og transport til laboratoriet i væv lagerløsning til bevarelse.
Bemærk: Alle patientprøver er de identificeret og håndteret i overensstemmelse med institutionelle Review Board retningslinjer. - Generere en enkelt patient-afledte kræft cellesuspension (UMNBL001, UMNBL002) fra tumor væv ved hjælp af en tumor dissociation kit. Overføre ca. 0,5 g tumor til en 100 mm celle kultur parabol der indeholder 5 mL af RPMI buffer, 200 µL af enzymet H, 100 µL af enzymet R og 25 µL af enzymet A fra menneskelige tumor dissociation kit.
- Hakkekød tumor i små stykker (2-4 mm) ved hjælp af saks og væv pincet. Bland disse fragmenter med løsninger i trin 2.2.
- Der afpipetteres tumor blandingen i et dissociator rør og lukke røret. Vend røret og vedhæfte på ærmet af væv dissociator. Køres på program h_tumor_01.
- Inkuber tumor cellesuspension opnås over ved 37 ° C i 1 time på en roterende rack med intermitterende ændring hver 15 min.
- Overføre cellesuspension til en ny 50 mL konisk slange og der tilsættes 10 mL af RPMI. Der centrifugeres cellesuspension ved 314 x g i 5 min.
- Fjern supernatanten og suspendere pellet i 5 mL af RPMI. Passere en 40 µm celle si denne løsning og indsamle den anstrengte løsning i en frisk 50 mL konisk slange. Vaske denne si engang med 5 mL af RPMI media og centrifugeres blandingen på 314 x g for 5 min at indsamle en pellet.
- Måle celle tætheden ved hjælp af en hemacytometer15. Suspendere pellet opnået fra oven i RPMI at opnå en endelig koncentration på 4 × 105 celler/10 µL. Tage 5 µL af denne cellesuspension og 5 µL af matrigel at gøre 10 µL af celle løsning for hver injektion.
Bemærk: Mængden af RPMI anvendes afhænger densitetsmåling celle. Hvis målte celle massefylden af den fremstillede pellet er 4 x 105 celler, skal du afbryde toerstoffet i 10 µL af RPMI.
3. luciferase Tagging af kræftceller
- Gøre 10 mL af transduktion medier med 5 mL af viral supernatanten EF1a-Luc2-IRES-mCherry og 5 mL af stamceller medier. Tilføje 7,5 µL 1 x polybrene.
- Mix 5 × 106 kræftceller i transduktion medier og plade i 100 mm ultra-lav vedhæftede plade. Der inkuberes ved 37 ° C og 5% CO2 natten over.
Bemærk: Som lav vedhæftede plader anvendes, celler vil ikke overholde plade. - Efter 24 h, bringe 100 mm plade der indeholder celler under vævskultur hood og overføre blandingen ind i en 15 mL konisk rør. Der centrifugeres cellesuspension ved 314 x g i 5 min at få celle pellet. Vaske celle pellet engang med 1 mL af 1 x fosfatbufferet saltopløsning (PBS) og suspendere celle pellet i 1 mL af HBSS indeholdende 1% føtal bovint serum (FBS).
- Sortere luciferase celler baseret på normal god landbrugspraksis-positive signal på fluorescens-aktiveret celle sortering (FACS) analyse. Plade 100 mm vævskultur behandlet sorteret cellerne fad og opretholde på 70-80% sammenløb, 37 ° C og 5% CO2 indtil kræves.
- Bekræfte luciferase signal med luciferase assay kit. Plade 10 x 104 sorteret celler pr. brønd i en illuminometer kompatibel 96 godt plade og inkuberes celler natten over ved 37 ° C og 5% CO2. Efter 24 h, bringe 96 godt pladen til stuetemperatur og tilføje Steady-Glo reagens til kulturperler medier i brønde i forholdet 1:1. Tillad celler til at lyse i 5 min og læse luminescence i spektrofotometret.
- Bringe 100 mm fadet under en vævskultur hætte. Kassér den supernatanten medier. Vaske cellerne en gang med 2 mL 1 x PBS.
- Der tilsættes 2 mL 0,25% trypsin og returnere 100 mm parabol til rugemaskine for 2-3 min. Efter 2-3 min, kontrollere for forrykke celler under mikroskop og tilsæt 8 mL af RPMI at deaktivere trypsin.
- Indsamle cellesuspension i en 15 mL konisk rør og centrifugeres ved 314 x g i 5 min at få en pellet. Supernatanten. Vaske celle toerstoffet med 1 mL PBS, 1 x, suspendere pellet i 5 mL af RPMI og bestemme den celle tæthed ved hjælp af en hemacytometer15. Der centrifugeres yhe resterende celle løsning på 314 x g for 5 min at få en pellet.
- Suspendere pellet i RPMI at opnå en koncentration af 4 x 105 celler/10 µL. Tage 5 µL af cellesuspension og 5 µL af matrigel at gøre 10 µL af celle løsning for hver injektion.
4. ultralyd guidede binyrerne (NB) eller Renal Sub kapsel (ES) Implantation
Bemærk: Alle ultralyd procedurerne udføres med en høj opløsning i vivo imaging system. De beskrevne procedurer, blev transducer, som har en center frekvens på 40 MHz og en båndbredde på 22-55 MHz brugt.
- Udnytte 6-8 uge gamle immun-mangelfuld NSG mus til alle injektion procedurer.
- Chill matrigel og autoklaveres Hamilton sprøjter udstyret med en 27G nål (1,25"), og 22G katetre (0,9 mm ydre diameter, 25 mm længde) natten over ved 4 ° C.
- Placer den celle løsning parat i trin 3 på is.
- Bedøver mus i en induktion kammer ved hjælp af 2% isofluran i O2 leveres på 2 L/min.
Bemærk: Tilstrækkelig anæstesi bestemmes med manglen på aktiv bevægelse og vedligeholdelse af spontan respiration. - Når bedøvede, depilate ryggen og flanken af dyr ved hjælp af hår fjernelse lotion (såsom Nair) og en barbermaskine.
- Overføre dyret til den billeddiagnostiske platform med abdominal side ned, hvor næsen af dyret er placeret i en nosecone og sikrede samtidig indånding isofluran.
- Placer optisk salve i dyrets øjne til at forhindre udtørring. Tape mus for at forhindre enhver utilsigtet bevægelse.
- Identificere murine leveren, vena cava, milten, venstre nyre og tilstødende venstre binyrerne ved hjælp af ultralyd visualisering.
- Bruge sterile handsker, maske og cap for personlig beskyttelse og vedligeholdelse i sterile forhold. Under ultralyd-vejledning, forsigtigt indsætte en 22G kateter gennem huden og tilbage muskel direkte ind i den venstre binyrerne til at give en kanal for cellulære injektion. Fjern nålen og efterlade kateteret sted.
- Indlæs en kølet Hamilton sprøjte forsynet med mennesker nål med 10 µL af celle løsning, så guide sprøjte stereotactically gennem kateteret placeret i midten af binyrerne.
- Tilføre den målrettede adrenal væv celler. Lad nålen i stedet for 1-2 min til at tillade matrigel at indstille. Langsomt fjerne nålen, efterfulgt af fjernelse af kateteret.
- Placere mus tilbage i deres bur og sikre, at musen genvinder tilstrækkelig bevidsthed for at opretholde brystbenet recumbency.
Bemærk: på grund af minimalt invasive karakteren af denne teknik, indlæg proceduremæssige smerte er minimal, men stadig overvåges dagligt med mus sundhed kontrol. "følges med en sætning:"Hvis uventede tegn på smerte eller lidelse er identificeret i løbet af et eksperiment, rådføre sig med din institutionelle veterinære støtteenhed oplysninger vedrørende analgesi eller anden medicinsk behandling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Anvendelse af de procedurer, der er fremlagt, blev ultralydsvejledt implantering af NB celler i binyrerne gjort i en dedikeret procedure værelse udstyret med en opvarmet kirurgisk bord. Arm og mund puder var lagt til overvågning af murine hjertet aktivitet (figur 1A). Dyret forblev bedøvede under isofluran ved hjælp af næsen kegle indånding. Ved hjælp af en høj opløsning ultralydssonde, blev venstre nyre identificeret med binyrerne bare kranie til nyre (figur 1B). Nålen blev derefter rykkede ind i binyrerne under direkte visualisering (figur 1 c). Under indledende udnyttelse af denne teknik, blev en blanding af methylenblåt farvning og matrigel brugt til at bekræfte korrekte lokalisering af binyrerne. Dyret blev ofret, og succesen af proceduren blev bekræftet på obduktion af visualisere methylenblåt farvning under binyrerne kapsel (fig. 1 d).
Ugentlige ultralyd og bioluminescens imaging var modaliteter bruges til at overvåge tumoren engraftment og vækst sats. Bioluminescens billeddannelse af region af interesse blev målt som fotoner/s/cm2/steridian (p/s/cm2/sr) med et minimalt antal 106 til 108 vejledende af passende tumorstørrelse for prækliniske forsøg9 ( Figur 2). Analyse ved hjælp af t -test viste statistisk signifikant stigning i bioluminescens blev bemærket i den otte-ugers periode (* p< 0,05; **p< 0,001; ***p< 0,0001). Ultralyd imaging lov noninvasive målinger af tumor areal og bind. Dette sammen med bioluminescens måling overvåges både tumor engraftment og progression (figur 3). Lignende procedurer blev udnyttet til ES-celler injiceres renal sub kapsel (figur 4).
Makroskopiske og histologiske analyse af resulterende tumorer karakteriseret primære tumorer og metastaser ved obduktion. Vævsprøver er undersøgt for morfologiske celle mønstre og farvet for tumor-specifik protein markører (figur 5, figur 6). Primær tumor engraftment for NB cellelinjer (IMR32, SH-SY-5Y, SK-N-BE2, UMNBL001, UMNBL002) varierede fra 62-100%, med metastaser set i 0-100% af injicerede mus. De mest robuste metastaser blev set i SK-N-BE2 (33%) og UMNBL002 (100%). Metastatisk websteder for NB var lymfeknuder, lever, lunge og kortikale knogle. Renal sub kapsulær engraftment for ES cellelinjer (A4573, A673, CHLA-25, TC-32) varierede fra 60-100%, med metastaser set i 0-40% af injicerede mus. Metastatisk steder undersøges for ES medtaget lymfeknuder, kortikal ben og lunger. Den mest robuste engraftment (100%) og metastaser (40%) blev set i TC-32 xenograft mus.
Figur 1 . Murine binyrerne lokalisering og ultralydsvejledt NB celle implantation. (A) høj opløsning ultrasound imaging af murine abdominale organer tilladt binyrerne implantation af tumorceller. (B) venstre nyre blev identificeret. (C) venstre binyrerne er beliggende ved siden af venstre nyre som en hypoechoic (mørk) runde struktur. Nålen var avanceret til binyrerne efterfulgt af celle indsprøjtning. (D) en blanding af matrigel og methylenblåt farvning blev brugt til at vurdere nøjagtigheden af injektion procedurer. Repræsentative ex vivo billedet af den venstre nyre og binyrerne med matrigel og methylenblåt farvning på binyrerne kapsel og peri-adrenal plads. Dette tal er blevet ændret med tilladelse fra Van Noord, R.A. mfl. 11. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 . In vivo bioluminescens billeddannelse af tumor engraftment og vækst sats. (A) menneskelige NB adrenal xenografts blev overvåget engraftment og tumorvækst over otte uger. (B) maksimal bioluminescens signal blev fastsat inden for det pågældende område. NB cellelinjer (SH-SY5Y, IMR 32, SK-N-BE2) og patient-afledte celler (UMNBL001, UMNBL002) var steget udstråling og vækstmønstre over tid. Forøgelse af bioluminescens i otte-ugers perioden var statistisk signifikant (*p< 0,05; **p< 0,001; ***p< 0,0001). Dette tal er blevet ændret med tilladelse fra Van Noord, R.A. mfl. 11. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 . In vivo ultralyd billeddannelse af tumor engraftment og vækst. Ultralyd imaging overvåges i vivo tumor progression. Ultralyd billeder og tilsvarende bioluminescens billeder på én, to og otte uger er vist. På en uge, var engraftment visualiseret i begge billeddiagnostiske modaliteter. Tumor areal og bind blev beregnet ved hjælp af ultralyd billeddannelse. 3D ultralyd billeder spejlet skåret tumorer ved afslutningen af undersøgelsen. Dette tal er blevet ændret med tilladelse fra Van Noord, R.A. mfl. 11. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 . Murine nyre lokalisering og ultralydsvejledt implantation af ES-celler. (A) bioluminescens blev brugt til at overvåge tumoren udstråling og vækst. (B-C) Dyr udviklet lokalt invasive tumorer, der fordrejes omkring abdominal strukturer og invaderede i lokale strukturer såsom muskel. Dette tal er blevet ændret med tilladelse fra Van Noord, R.A. mfl. 11. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5 . Tumor histopatologi af NB og ES xenograft tumorer. (A) NB xenograft mus havde lokalt infiltrativ primære tumorer på adrenal og peri-adrenal kirtel websteder, som fordrejet tilstødende abdominale organer. B mikroskopisk (20 X, bar = 50 µm), xenograft adrenal tumorer viste morfologiske funktioner i overensstemmelse med menneskets NB (klynger af dårligt differentieret kantede at runde celler), herunder lejlighedsvis pseudo roset dannelse (pil). (C) Tumor væv viste stærk tyrosin hydroxylase (NB tumormarkør) immunoreactivity (40 X, bar = 40 µm; positiv kontrol farvning vist i venstre panel; 1: 100). D ES xenograft tumor havde histologisk funktioner som infiltrativ ES (40 X, bar = 40 µm), klynger af kantede at runde epithelioid cellerne adskilt af en fin fibro vaskulære stroma, effacing og komprimere normale tilstødende nyre (pil; komprimeret resterne af nyre parenkym). (E) ES tumor væv viste stærk membran immunoreactivity for ES tumormarkør CD99 (40 X, bar = 40 µm; positiv kontrol farvning vist i venstre panel; 1: 100). Dette tal er blevet ændret med tilladelse fra Van Noord, R.A. mfl. 11. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6 . Fjern metastaser udviklet i xenografts etableret af ultralydsvejledt injektionsteknik. (A) bioluminescens imaging viser den primære NB tumor på binyrerne plads og metastatiske foci opdaget på kortikale knogle. B mikroskopisk analyse demonstreret en metastatisk tumor (pil) effacing marv hulrum og kortikale knogle i den proksimale femur (4 X, bar = 400 µm). C tyrosin hydroxylase cytoplasmatisk immunoreactivity af kortikale knogle NB metastatisk websted (40 X, bar = 40 µm). (D) mikroskopi af patient-afledte orthotopic xenograft (UMNBL002) med en hepatisk metastaser (pil) inden for en leverens vene (pilespidsen viser endotelceller), og infiltrerer den tilstødende leveren (L) parenkym (20 X, bar = 50 µm). (E) neuroblastoma mikro metastaser (pil) i lunge parenkym (40 X, bar = 40 µm). Dette tal er blevet ændret med tilladelse fra Van Noord, R.A. mfl. 11. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ultralydsvejledt implantation af NB og ES-celler er en effektiv og sikker metode til at oprette pålidelige murine xenografts for prækliniske undersøgelser i kræft biologi. Afgørende for succes af ultralydsvejledt væv-målrettet implantation er tilstedeværelsen og tilgængeligheden af uddannet personale med ekspertise i anatomisk lokalisering orgel af interesse og stereotactic injektion af tumorceller.
Dissociation af tumor væv viste sig for at være et afgørende skridt i udviklingen af den beskrevne patient-afledte xenograft model. Native tumor væv omfatter cellulære mikromiljø og omkringliggende stroma, der kan påvirke tumor optagelse eller engraftment. Celle tæller, efter dissociation processen var komplet, forudsat en sporvidde af de cellulære tæthed i stikprøven, med 2 x 105 celler/10 μL betragtes som en optimal celletal for implantation og vellykket tumor engraftment.
Luciferase tagging af celler tilladt for validering af tumor engraftment og overvågning af tumorvækst ved at måle bioluminescens signal, med 106 108 betragtes som vejledende af tumor optagelse9. For at sikre vellykket transduktion, blev luciferase aktivitet bekræftet i vitro før indsprøjtning af celler. Dette blev gjort ved immunfluorescens, luciferase assay kits, og også ved at undersøge celler for bioluminescens signal. Indstillinger, der bruges til at måle bioluminescens blev holdt konstant, giver konsistente data under ugentlige målinger.
Ex vivo histopatologiske analyse af tumorer bekræftet celletype og morfologi af resulterende tumorer med specifik farvning for protein markører. Histopatologisk analyse bekræftet tumor engraftment og metastase dokumenteret ved ultralyd og en bioluminescerende billeddannelse.
Fordele ved ultralyd-styrede cellulære implantation omfatter dens non-invasiv art, minimal animalske restitutionstid og voksende succes i etableringen af flere succesrige xenograft modeller. Ultralyd imaging giver også en pålidelig metode til at overvåge i vivo tumor progression og tumor diskenheder. I disse prækliniske modeller skred tumorer til lokalt invasiv sygdom med metastaser i 5 uger. Begrænsninger omfatter tilgængeligheden af høj opløsning imaging-teknologi og evnen til at konsekvent lokalisere målorgan. Tilgængeligheden af personale med ekspertise i ultralyd billeddannelse af orgel af interesse er kritiske komponenter i denne teknik.
Tilgængeligheden af høj opløsning ultrasound imaging er steget betydeligt inden for det sidste årti og dets brug fortsætter med at udvide ikke kun i den kliniske praksis, men også i laboratorie-forskning. Udnyttelsen af ultralyd til udviklingen af moderne murine xenografts er et lovende program, med potentiale for at fremme prækliniske forskning modeller for kræft drug discovery.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen oplysninger.
Acknowledgments
Dette arbejde fik støtte fra den Robert Wood Johnson Foundation/Amos medicinske fakultet udvikling Program, Taubman Research Institute, og afsnit af Pediatric kirurgi, The University of Michigan. Forfatterne vil gerne takke Kimber Converso-Baran og Dr. Marcus Jarboe bistand med ultralyd injektion procedurer og billedbehandling-platformen. Vi vil gerne takke Paul Trombley for hans hjælp med figur grafik. Vi takker også Institut for radiologi på The University of Michigan til brug af Center for Molekylær Imaging og Tumor Imaging kerne, som er delvist understøttet af omfattende Cancer Center NIH, give P30 CA046592. University of Michigan fysiologi fænotyper kerne, der er delvist understøttet af tilskud fra NIH (OD016502) og Frankel Cardiovascular Center. Celle linje godkendelse blev gjort på IDEXX RADIL Bioresearch faciliteter, Columbia, MO. Vi takker Tammy Stoll, Dr. Rajen Mody og Mott Solid Tumor onkologi Program. Vores patienter og familier er taknemmeligt anerkendt for deres inspiration, mod og løbende støtte til vores forskning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | |||
| NOD-SCID | Charles River | 394 | |
| NSG | The Jackson Laboratory | 5557 | |
| Cell Line | |||
| NB | |||
| IMR-32 | ATCC | CCL-127 | Established human neuroblastoma cell line |
| SH-SY5Y | ATCC | CRL-2266 | Established human neuroblastoma cell line |
| SK-N-Be2 | ATCC | CRL-2271 | Established human neuroblastoma cell line |
| ES | |||
| TC32 | COGcell.ORG | Established human Ewing's Sarcoma cell line | |
| A673 | COGcell.ORG | Established human Ewing's Sarcoma cell line | |
| CHLA-25 | COGcell.ORG | Established human Ewing's Sarcoma cell line | |
| A4573 | COGcell.ORG | Established human Ewing's Sarcoma cell line | |
| Cell Line media | |||
| RPMI | Life Technologies | 11875-093 | |
| Matrigel | BD BioSciences | 354234 | |
| Dissociation | |||
| Dissection Tools | KentScientific | INSMOUSEKIT | |
| Human Tumor Dissociation Kit | MACS Miltenyi Biotec | 130-095-929 | |
| gentleMACS dissociator | MACS Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| gentleMACS C tubes | MACS Miltenyi Biotec | 130-096-334 | |
| Cell Strainer | Corning | 431751 | |
| Luciferase Tagging | |||
| Lenti-GFP1 virus | University of Michigan, Vector Core | Luciferase Virus | |
| Steady Glo-Luciferase Assay Kit | Promega | E2510 | |
| Bioluminescence Imaging | |||
| Ivis Spectrum Imaging System | PerkinElmer | 124262 | |
| D-Luciferin | Promega | E160X | |
| Anesthetic | |||
| Inhaled Isoflurane | Piramal Critical Care Inc | 66794-0017-25 | |
| Ultrasound Guided Injection | |||
| Vevo 2100 High Resolution Imaging | Vevo | 2100 | |
| Hamilton Syringes (27 gauge needle) | Hamilton | 80000 | |
| 22 Gauge Angiocatheter | BD Biosciences | 381423 | |
| Optical ointment | Major Pharmaceuticals | 301909 | |
| Nair | Church & Dwight Co | Hair Removal agent | |
| Aquasonic 100 Ultrasound Transmission gel | Parker | Ultrasound gel | |
| Histology | |||
| CD99 | DAKO | M3601 | Primary Antibody |
| Tyrosine Hydroxylase | Sigma-Aldrich | T2928 | Primary Antibody |
| Secondary HRP-Polymer antibody | Biocare | BRR4056KG | |
| Miscelleneous | |||
| 10 mL Pipettes | Fisher Scientific | 13-676-10J | |
| 5 mL Pipettes | Fisher Scientific | 13-676-10H | |
| 1.5 mL Microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| P1000 pipette | Eppendorf | 3120000062 | |
| P200 pipette | Eppendorf | 3120000054 | |
| P1000 pipette tips | Fisher Scientific | 21-375E | |
| P200 pipette tips | Fisher Scientific | 21-375D | |
| Portable pipette aid | Drummond | 4-000-101 | |
| digital animal Weighing Scale | KentScientific | SCL-1015 | |
| Calipers | Fisher Scientific | 06-664-16 | |
| 6well low attachment plates | Corning | 07-200-601 | |
| 10 cm Tissue Culture Treated Dishes | Fisher Scientific | FB012924 | |
| Polybrene | Sigma-Aldrich | TR-1003-G |
References
- Sanmamed, M. F., Chester, C., Melero, I., Kohrt, H. Defining the optimal murine models to investigate immune checkpoint blockers and their combination with other immunotherapies. Ann Oncol. 27 (7), 1190-1198 (2016).
- Fidler, I. J., Hart, I. R. Biological diversity in metastatic neoplasms: origins and implications. Science. 217 (4564), 998-1003 (1982).
- Bibby, M. C. Orthotopic models of cancer for preclinical drug evaluation. Eur J Cancer. 40 (6), 852-857 (2004).
- Killion, J. J., Radinsky, R., Fidler, I. J. Orthotopic Models are Necessary to Predict Therapy of Transplantable Tumors in Mice. Cancer Metastasis Rev. 17 (3), 279-284 (1998).
- Daniel, V. C., et al. A primary xenograft model of small-cell lung cancer reveals irreversible changes in gene expression imposed by culture in vitro. Cancer Res. 69 (8), 3364-3373 (2009).
- Khanna, C., Jaboin, J. J., Drakos, E., Tsokos, M., Thiele, C. J. Biologically relevant orthotopic neuroblastoma xenograft models: Primary adrenal tumor growth and spontaneous distant metastasis. In Vivo. 16 (2), 77-85 (2002).
- Stewart, E., et al. Development and characterization of a human orthotopic neuroblastoma xenograft. Dev Biol. 407, 344-355 (2015).
- Jäger, W., et al. Minimally Invasive Establishment of Murine Orthotopic Bladder Xenografts. J. Vis. Exp. (84), e51123 (2014).
- Teitz, T., et al. Preclinical Models for Neuroblastoma: Establishing a Baseline for Treatment. PLoS ONE. 6 (4), e19133 (2011).
- Braekeveldt, N., et al. Neuroblastoma patient-derived orthotopic xenografts retain metastatic patterns and geno- and phenotypes of patient tumours. International Journal of Cancer. 136 (5), 252-261 (2015).
- Van Noord, R. A., et al. Tissue-directed Implantation Using Ultrasound Visualization for Development of Biologically Relevant Metastatic Tumor Xenografts. In Vivo. 31 (5), 779-791 (2017).
- Vormoor, B., et al. Development of a Preclinical Orthotopic Xenograft Model of Ewing Sarcoma and Other Human Malignant Bone Disease Using Advanced In Vivo Imaging. PLoS ONE. 9 (1), e85128 (2014).
- Hakky, T. S., Gonzalvo, A. A., Lockhart, J. L., Rodriguez, A. R. Primary Ewing sarcoma of the kidney: a symptomatic presentation and review of the literature. Ther Adv Urol. 5 (3), 153-159 (2013).
- Cheng, H., Clarkson, P. W., Gao, D., Pacheco, M., Wang, Y., Nielsen, T. O. Therapeutic Antibodies Targeting CSF1 Impede Macrophage Recruitment in a Xenograft Model of Tenosynovial Giant Cell Tumor. Sarcoma. 2010, 174528 (2010).
- JoVE Science Education Database. Using a Hemacytometer to Count Cells. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , JoVE. Cambridge, MA. (2018).
