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Cancer Research

Utilisation des ultrasons guidés axés sur les tissus cellulaire Implantation pour la mise en place de xénogreffes tumorales métastatiques biologiquement pertinente

doi: 10.3791/57558 Published: May 25, 2018

Summary

Nous présentons ici un protocole pour utiliser injection guidée par ultrason du neuroblastome (NB) et cellules (ES) le sarcome d’Ewing (établi de lignées cellulaires et les cellules tumorales dérivées de patient) aux sites biologiquement pertinentes pour créer des modèles précliniques fiables pour le cancer recherche.

Abstract

Des essais précliniques d’antinéoplasiques s’appuie sur des modèles de xénogreffes pertinentes qui imitent les tendances innées du cancer. Avantages des modèles standard de flanc sous-cutanée sont facilité procédurale et la capacité de surveiller la progression tumorale et la réponse sans imagerie invasives. Ces modèles sont souvent incompatibles dans les essais cliniques translationnelles et ont limité les caractéristiques biologiquement pertinentes avec faible propension à produire des métastases, comme il y a un manque d’un micro-environnement natif. En comparaison, des modèles de xénogreffes orthotopiques à native tumoraux ont démontré pour imiter le microenvironnement tumoral et de reproduire les caractéristiques de la maladie importante tels que les métastases lointain. Ces modèles nécessitent souvent fastidieuses procédures chirurgicales avec longues périodes de temps et récupération anesthésiques. Pour y remédier, chercheurs sur le cancer ont récemment utilisé des techniques d’injection guidée par échographie afin d’établir des modèles de xénogreffes de cancer pour les expériences précliniques, qui prévoit la mise en place rapide et fiable des modèles murins axés sur les tissus. Visualisation échographique fournit également une méthode non invasive d’évaluation longitudinale du greffe de la tumeur et de la croissance. Nous décrivons ici la méthode pour injection guidée par ultrason des cellules cancéreuses, utilisant la glande surrénale pour NB et de la capsule rénale sub pour ES. Cette approche mini-invasive surmonte l’implantation des cellules cancéreuses dans les localités de tissu-spécifique pour la croissance et la métastase fastidieux chirurgie ouverte et diminue les périodes de récupération morbide. Les auteurs décrivent l’utilisation de lignées cellulaires établies et lignées cellulaires dérivées patient pour injection orthotopique. Pré-faites kits commerciaux sont disponibles pour la dissociation de la tumeur et la luciférase marquage de cellules. Injection de la suspension de cellules à l’aide du guidage par l’image fournit une plate-forme minimalement invasive et reproductible pour la création de modèles précliniques. Cette méthode est utilisée pour créer des modèles précliniques fiables d’autres cancers tels que la vessie, foie et pancréas illustrant son potentiel inexploité de nombreux modèles de cancer.

Introduction

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Des modèles de xénogreffes animales sont des outils indispensables pour les études précliniques de nouveaux traitements anticancéreux. Xénogreffes murines standards s’appuient sur l’implantation sous-cutanée flanc des cellules, offrant un site efficace et facilement accessible pour la surveillance de la croissance tumorale. L’inconvénient des modèles sous-cutanée est leur manque de caractéristiques biologiques propres à la tumeur, qui peut limiter leur capacité à métastaser1. Ces limites sont dépassées par l’utilisation des xénogreffes orthotopiques dans les tumeurs des cellules sont implantés sur les sites de tissus natifs, fournissant un micro-environnement pertinent avec potentiel métastatique2. Des modèles de xénogreffes orthotopiques maintiennent les éléments d’origine biologiques et fournissent des modèles fiables pour médicament préclinique découverte3,4. Les cellules cancéreuses utilisées pour l’implantation de tissus dirigée sont lignées cellulaires établies ou des cellules dérivées de patient patients tumeurs. Xénogreffes, établis à partir de lignées cellulaires cancéreuses peuvent présenter un forte divergence génétique de la tumeur primaire par rapport aux patients des xénogreffes dérivés5. Ceci étant dit, la mise en place des xénogreffes orthotopiques dérivé de patient est devenu la norme préférée pour l’essai de nouvelles thérapeutiques dans la découverte de médicaments du cancer.

Dans le neuroblastome cancer pédiatrique (NB), des modèles de xénogreffes orthotopiques récapitulent la biologie de la tumeur primitive et de développent des métastases aux sites typiques de NB répartis6,7. NB se développe dans la glande surrénale ou le long de la chaîne sympathique paravertébraux. Les méthodes les plus courantes d’implantation orthotopique nécessitent des procédures chirurgicales transabdominale ouvertes. Ces méthodes sont souvent fastidieux, ont une morbidité élevée animale et les périodes de récupération complexe. Échographie haute résolution a été récemment utilisé pour axés sur les tissus implantation de cellules tumorales dans le développement de plusieurs modèles murins pour cancer recherche8,9. La technique est fiable, reproductible, efficace et sans danger pour la mise en place de tumeur métastatique des xénogreffes10,11.

La mise en place de xénogreffe de cancer pédiatrique par l’implantation de localisation et de l’aiguille d’orgue cible guidée par échographie de lignées cellulaires et les cellules tumorales dérivées de patient est démontrée11. La technique a été utilisée pour NB ciblé à la glande surrénale murine. Sarcome d’Ewing (ES) est principalement un cancer osseux, couramment observé dans les os longs comme le fémur et de la ceinture pelvienne de12. Rapports de cas ont montré que, pour déterminer si la croissance d’un cancer en principalement osseux est faisable dans le tissu rénal, un emplacement capsulaire void rénale a été choisi pour orthotopique implantation13. Implantation de cellule capsulaire void rénale des cellules tumorales a été utilisée comme un modèle prometteur pour l’étude des métastases spontanées pour ES14.

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Protocol

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Tout le travail a été fait conformément à The University of Michigan, Institutional Review Board (HUM 00052430) et est conforme aux procédures approuvées par le Comité de l’Université sur l’utilisation et l’entretien des animaux (UCUCA). L’unité pour le laboratoire de médecine animale (ULAM) a supervisé les soins aux animaux.

Tout le travail a été fait avec l’approbation de l’Université du Michigan, Institutional Review Board (HUM 00052430) et est conforme à toutes les recherches humaines éthique Comité réglementation. Les cellules humaines sont considérés comme une matière potentiellement, afin de suivre toutes les précautions spéciales et des pratiques de biosécurité appropriées qui sont requis par votre établissement. NSG souris sont sévèrement immunodéprimés et sensibles aux maladies causées par des bactéries communément trouvés dans l’environnement.
Utilisez toujours strictement technique stérile lors de la préparation des matériaux pour l’implantation et effectuer les injections.

1. Culture cellulaire

  1. Croissance établies lignées de cellules humaines pour NB (SH-SY5Y, SK-N-BE2 et IMR32) dans un milieu minimum essentiel, additionné de sérum de veau fœtal 10 %, 2 mM de glutamine, 100 unités/mL de pénicilline et 100 μg/mL de streptomycine. Supplément IMR32 cellules de plus avec 1 mM pyruvate et 0,075 % NaHCO3. Maintenir toutes les cellules à 37 ° C, 5 % de CO2 et confluence de 70-80 %.
  2. Cultiver des lignées de cellules ES humaines (TC32, A673, ABSC-25 et A4573) dans un milieu RPMI additionné de sérum de veau fœtal 10 % et de 6 mM de L-glutamine. Maintenir toutes les cellules à 37 ° C, 5 % de CO2 à 70-80 % confluence.
  3. Envoyer toutes les lignées cellulaires pour l’authentification.
    Remarque : La cellule authentification est effectuée dans une installation extérieure, veuillez vous référer aux remerciements.

2. préparation des cellules de la tumeur primaire dérivé de Patient

  1. Avec le consentement du patient et la sanction, récolter des tissus humains mis au rebut de tumeur NB de patients devant subir une résection chirurgicale pour un contrôle local et le transport au laboratoire de la solution de stockage de tissus pour la conservation.
    Remarque : Tous les échantillons de patients sont rendus anonymes et traitées conformément aux directives de l’Institutional Review Board.
  2. Générer une suspension de cellules seul cancer patient dérivés (UMNBL001, UMNBL002) à partir de tissu de tumeur à l’aide d’un kit de dissociation de tumeur. Transférer environ 0,5 g de tumeur dans une boîte de Petri de cellule 100 mm contenant 5 mL de tampon RPMI, 200 µL d’enzyme H, 100 µL d’enzyme R et 25 µL d’enzyme A partir du kit de dissociation tumorales humaines.
  3. Émincer la tumeur en petits morceaux (2 à 4 mm) à l’aide de ciseaux et pinces à tissus. Mélanger ces fragments avec les solutions à l’étape 2.2.
  4. Dans un tube dissociator, déposer le mélange de la tumeur et fermer le tube. Inverser le tube et fixez sur le manchon de la dissociator tissulaire. Exécutez le programme h_tumor_01.
  5. Incuber la suspension de cellules de tumeur obtenue ci-dessus à 37 ° C pendant 1 h sur un comptoir tournant avec intermittente trituration toutes les 15 min.
  6. La suspension de cellules de transfert dans un nouveau tube conique de 50 mL et ajouter 10 mL de milieu RPMI. Centrifuger la suspension cellulaire à 314 x g pendant 5 min.
  7. Retirez le surnageant et suspendre le culot dans 5 mL de RPMI. Passez cette solution à travers un tamis de cellule de 40 µm et recueillir la solution tendue dans un tube conique frais 50 mL. Lavez cette passoire une fois avec 5 mL de médias RPMI et centrifuger le mélange à 314 x g pendant 5 min recueillir une boulette.
  8. Mesurer la densité des cellules à l’aide d’un Hémacytomètre15. Suspendre le culot obtenu par le haut dans RPMI pour obtenir une concentration finale de 4 × 105 cellules/10 µL. Prendre 5 µL de cette suspension cellulaire et 5 µL de matrigel à faire 10 µL de solution portable pour chaque injection.
    NOTE : Montant de RPMI utilisé dépend de la mesure de la densité cellulaire. Par exemple, si la densité des cellules mesurée du culot obtenu est 4 x 105 cellules, suspendre le culot dans 10 µL de RPMI.

3. luciférase marquage des cellules cancéreuses

  1. Faire 10 mL de médias de transduction avec 5 mL du surnageant viral EF1a-Luc2-IRES-mCherry et 5 mL de cellules souches médias. Ajouter 7,5 µL de polybrene 1 x.
  2. Mélanger 5 × 106 cellules de cancer dans les médias de transduction et plaque en plaque de fixation ultra faible de 100 mm. Incuber à 37 ° C et 5 % de CO2 pendant la nuit.
    Remarque : Comme les plaques de fixation bas sont utilisés, cellules n’adhérera pas à la plaque.
  3. Après 24h, ramenez la plaque de 100 mm contenant des cellules sous capot de culture de tissus et transférer le mélange dans un tube conique de 15 mL. Centrifuger la suspension cellulaire à 314 x g pendant 5 min obtenir le culot cellulaire. Laver le culot cellulaire une fois avec 1 mL de 1 x solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et suspendre le culot dans 1 mL de HBSS contenant 1 % sérum fœtal (SVF).
    1. Trier les cellules luciférase fondées sur le signal positif GFP sur cellule activée par fluorescence tri analyse (FACS). Plaque les cellules triées sur culture de tissus de 100 mm traité plat et maintiennent au confluent de 70 à 80 %, 37 ° C et 5 % CO2 jusqu'à leur utilisation.
  4. Confirmer la luciférase signal avec trousse luciférase. Plaque de 10 x 104 tri cellules / puits dans un illuminometer compatible 96 bien plat et incuber les cellules durant la nuit à 37 ° C et 5 % de CO2. Après 24h, porter la plaque 96 puits à température ambiante et ajouter Steady-Glo réactif aux médias cultivés dans les puits en rapport 1:1. Permettre aux cellules de lyser pendant 5 min et lire de luminescence dans le spectrophotomètre.
  5. Apportez le plat de 100 mm sous une hotte de culture de tissus. Jeter les surnageants médias. Laver les cellules une fois avec 2 mL de PBS 1 x.
  6. Ajouter 2 mL de 0,25 % de trypsine et remettez le plat de 100 mm dans l’incubateur pendant 2-3 min. Après 2-3 min, vérifier les cellules délogent sous microscope et ajoutez 8 mL de RPMI pour désactiver la trypsine.
  7. Recueillir la suspension de cellules dans un tube conique de 15 mL et centrifuger à 314 x g pendant 5 min obtenir une boulette. Jeter le surnageant. Laver le culot cellulaire avec 1 mL de PBS 1 x, suspendre le culot dans 5 mL de RPMI et déterminer la densité des cellules à l’aide d’un Hémacytomètre15. Centrifuger yhe restant solution cellulaire à 314 g pendant 5 min obtenir une boulette.
  8. Suspendre le culot dans RPMI pour obtenir une concentration de 4 x 105 cellules/10 µL. Prendre 5 µL de la suspension cellulaire et 5 µL de matrigel à faire 10 µL de solution portable pour chaque injection.

4. ultrasons guidés glande surrénale (NB) ou l’Implantation de Capsule (ES) Sub rénale

Remarque : Toutes les procédures d’inspection par ultrasons sont effectuées en utilisant une haute résolution en vivo système d’imagerie. Les procédures décrites, le transducteur, qui a une fréquence de 40 MHz et une bande passante de 22 à 55 MHz ont été utilisé.

  1. Utiliser 6-8-week-old immunodéficientes NSG souris de toutes les méthodes d’injection.
  2. Refroidir le matrigel et autoclavés seringues Hamilton munis d’une aiguille de 27G (1.25"), et les cathéters de 22G (0,9 mm de diamètre extérieur, longueur 25 mm) pour la nuit à 4 ° C.
  3. Placer la solution cellulaire établie à l’étape 3 sur la glace.
  4. Anesthésier les souris dans une chambre d’induction à l’aide de 2 % isoflurane O2 livré à 2 L/min.
    Remarque : Anesthésie adéquate est déterminé avec le manque de mouvement actif et le maintien de la respiration spontanée.
  5. Une fois anesthésié, épiler le dos et les flancs des animaux à l’aide de la lotion de suppression de cheveux (comme Nair) et un rasoir.
  6. Transférer l’animal à la plate-forme d’imagerie abdominale, face vers le bas, où le nez de l’animal est placé dans une ogive et sécurisé tout en inspirant l’isoflurane.
  7. Placez optique pommade dans les yeux de l’animal pour éviter le dessèchement. Tape la souris en place pour empêcher tout mouvement involontaire.
  8. Identifier le foie murine, vena cava, rate, rein gauche et glande surrénale gauche adjacente à l’aide de visualisation échographique.
  9. Utiliser des gants stériles, masque et capuchon de protection personnelle et d’entretien des conditions stériles. Sous guidage échographique, délicatement insérer un cathéter de 22G à travers la peau et muscle de retour directement dans la glande surrénale gauche de fournir un canal pour injection cellulaire. Retirer l’aiguille et laisser le cathéter en place.
  10. Charge une seringue de Hamilton réfrigérée munie d’une aiguille de petit calibre avec 10 µL de solution de la cellule, puis guider la seringue stereotactically par le cathéter placé dans le centre de la glande surrénale.
  11. Injecter les cellules dans le tissu surrénalien ciblé. Laisser l’aiguille en place pendant 1-2 min permettre le matrigel à définir. Retirez lentement l’aiguille, suivi par le retrait du cathéter.
  12. Replacez les souris dans leur cage, puis assurez-vous que la souris reprend conscience suffisante pour maintenir le décubitus sternal.
    NOTE : en raison de la nature invasive de cette technique, douleur post est minime, mais toujours surveillé sur une base quotidienne avec des contrôles de santé souris. » devrait être suivi par une phrase : « si inattendu des signes de douleur ou de détresse sont identifiées au cours d’une expérience, consulter votre unité de soutien institutionnel de vétérinaire pour plus d’informations au sujet de l’analgésie ou d’autres soins médicaux.

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Representative Results

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En utilisant les procédures présentées, guidée par échographie d’implantation de cellules NB dans la glande surrénale a été faite dans une salle dédié équipée d’une table d’opération chirurgicale chauffée. Plaquettes de bras et les pieds ont été placées pour surveiller l’activité de coeur murines (Figure 1 a). L’animal est resté anesthésié sous isoflurane utiliser coiffe l’inhalation. À l’aide d’une sonde d’échographie à haute résolution, le rein gauche a été identifié avec la glande surrénale juste crânienne pour le rein (Figure 1 b). L’aiguille est ensuite avancé dans la glande surrénale sous visualisation directe (Figure 1). Au cours de la première utilisation de cette technique, un mélange de colorant de bleu de méthylène et de matrigel a été utilisé pour confirmer la localisation exacte de la glande surrénale. L’animal a été sacrifié, et le succès de la procédure a été confirmé sur autopsie en visualisant le colorant de bleu de méthylène sous la capsule de la glande surrénale (Figure 1).

Hebdomadaire échographie et l’imagerie de bioluminescence ont été les modalités utilisées pour surveiller les taux de prise de greffe et la croissance tumorale. Imagerie de la bioluminescence de la région d’intérêt a été mesuré en photons/s/cm2/steridian (p/s/cm2/sr) avec un nombre minimal de 106 à 108 l’indicatif de la taille de la tumeur adéquate pour des expériences précliniques9 ( Figure 2). Analyse à l’aide de t -test ont montré une augmentation statistiquement significative de bioluminescence a noté au cours de la période de huit semaines (* p< 0,05 ; **p< 0,001 ; ***p< 0,0001). L’échographie a permis de mesurer non invasif de la tumeur et de volume. Ceci avec mesure de la bioluminescence surveillé fois prise de greffe tumorale et de progression (Figure 3). Des procédures similaires ont été utilisées pour ES cellules injectées dans la capsule rénale void (Figure 4).

Analyse macroscopiques et histologique des tumeurs qui en résulte caractérise les tumeurs primaires et les métastases à l’autopsie. Des échantillons de tissus examinées pour modèles morphologiques cellulaires et colorés pour les marqueurs de protéines spécifiques de la tumeur (Figure 5, Figure 6). Greffe de la tumeur primaire pour les lignées cellulaires NB (IMR32, SH-SY-5Y, SK-N-BE2, UMNBL001, UMNBL002) varie de 62 à 100 %, avec métastases dans le 0-100 % des souris injectées. Les métastases plus robustes ont été observés chez les SK-N-BE2 (33 %) et UMNBL002 (100 %). Sites métastatiques pour NB étaient des ganglions lymphatiques, foie, poumon et l’os cortical. Le greffe capsulaire rénale sub pour les lignées de cellules ES (A4573, A673, ABSC-25, TC-32) ont varié de 60 à 100 %, avec métastases chez 0-40 % des souris injectées. Les sites métastatiques examinés pour ES inclus ganglions, OS corticales et les poumons. La prise de greffe plus robuste (100 %) et de métastases (40 %) ont été observés chez les souris de xénogreffe de TC-32.

Figure 1
Figure 1 . Murin de glande surrénale localisation et guidée par échographie NB cellules implantation. (A) l’échographie des organes abdominaux murins haute résolution a permis de glande surrénale implantation des cellules tumorales. (B) rein la gauche a été identifié. (C) la glande surrénale gauche est adjacent au rein gauche comme un hypoéchogènes (foncé) rond structure. L’aiguille a été avancé dans la glande surrénale, suivie par l’injection de cellules. (D) un mélange de matrigel et colorant de bleu de méthylène a été utilisé pour évaluer la précision des procédures d’injection. Représentant ex vivo image du rein gauche et glande surrénale avec colorant matrigel et au bleu de méthylène à la capsule de la glande surrénale et l’espace péri-surrénalien. Ce chiffre a été modifié avec la permission de Van Noord, R.A. et al. 11. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 . In vivo imagerie de la bioluminescence des taux de croissance et de prise de greffe tumorale. (A) humaines xénogreffes surrénaliennes NB ont été suivies pour la prise de greffe et la croissance tumorale en huit semaines. (B) signal de bioluminescence maximale a été déterminée au sein de la région d’intérêt. NB lignées (SH-SY5Y, TMI 32, SK-N-BE2) et les cellules dérivées de patient (UMNBL001, UMNBL002) avaient augmenté de modes de radiance et de croissance au fil du temps. Augmentation de la bioluminescence au cours de la période de huit semaines était statistiquement significative (*p< 0,05 ; **p< 0,001 ; ***p< 0,0001). Ce chiffre a été modifié avec la permission de Van Noord, R.A. et al. 11. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 . In vivo l’échographie du greffe de la tumeur et de la croissance. L’échographie surveillés en vivo la progression tumorale. Images échographiques et des images de bioluminescence correspondantes à un, deux et huit semaines sont indiqués. À une semaine, la prise de greffe a été visualisée dans deux modalités d’imagerie. Volume et la zone de la tumeur ont été calculées à l’aide de l’échographie. Images de l’échographie 3D en miroir excisés de tumeurs à l’achèvement de l’étude. Ce chiffre a été modifié avec la permission de Van Noord, R.A. et al. 11. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 . Localisation de rein murin et guidée par échographie de l’implantation de cellules ES. (A) bioluminescence a été utilisé pour surveiller la croissance et l’éclat de la tumeur. (B-C) Animaux ont développé des tumeurs localement envahissantes qui déformé autour des structures abdominales et envahirent dans des structures locales telles que du muscle. Ce chiffre a été modifié avec la permission de Van Noord, R.A. et al. 11. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 . L’histopathologie des tumeurs de xénogreffe NB et ES tumeur. (A) NB xénogreffe souris ont localement infiltrantes tumeurs primaires sur les sites de la glande surrénale et peri-surrénales, qui faussait les organes abdominaux adjacents. (B) au microscope (20 X, barre = 50 µm), les tumeurs surrénaliennes de xénogreffe a montré des caractéristiques morphologiques compatibles avec NB humaine (grappes de mal différencient angulaire pour arrondir les cellules), incluant la formation de rosette pseudo occasionnels (flèche). Tissu tumoral (C) a montré l’immunoréactivité forte tyrosine hydroxylase (marqueur de tumeur NB) (40 X, bar = 40 µm ; contrôle positif coloration indiqué sur le panneau de gauche ; 1/100). (D) tumeur de xénogreffe ES avait des caractéristiques histologiques compatibles avec ES infiltrante (40 X, bar = 40 µm), amas d’angulaire pour arrondir des cellules épithélioïdes séparant par un stroma vasculaire fine fibro, effacement et la compression de rein côté normal (flèche ; compressé restes du parenchyme rénal). (E) tissu tumoral ES a montré l’immunoréactivité de membrane solide pour le marqueur de tumeur ES CD99 (40 X, bar = 40 µm ; contrôle positif coloration indiqué sur le panneau de gauche ; 1/100). Ce chiffre a été modifié avec la permission de Van Noord, R.A. et al. 11. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 . Métastases développées dans xénogreffes établies par la technique d’injection guidée par ultrason. (A) l’imagerie montrant la tumeur primaire de NB à l’espace de la glande surrénale et les foyers métastatiques détectés à l’os cortical de bioluminescence. (B) microscopique analyse a montré une tumeur métastatique (flèche), effaçant la cavité médullaire et la corticale osseuse du fémur proximal (4 X, bar = 400 µm). (C) tyrosine hydroxylase cytoplasmique l’immunoréactivité du site métastatique osseuse corticale NB (40 X, bar = 40 µm). (D) microscopie des xénogreffes orthotopiques dérivé de patient (UMNBL002) avec une métastase hépatique (flèche) dans une veine hépatique (pointe de flèche montre des cellules endothéliales) et infiltrant le parenchyme du foie adjacent (L) (20 X, barre = 50 µm). (E) métastase micro de neuroblastome (flèche) dans le parenchyme pulmonaire (40 X, bar = 40 µm). Ce chiffre a été modifié avec la permission de Van Noord, R.A. et al. 11. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

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L’implantation des cellules NB et ES guidée par échographie est une méthode efficace et sûre pour établir des xénogreffes murines fiables pour les études précliniques en biologie du cancer. Essentielle à la réussite de guidée par échographie ciblée tissus implantation est la présence et la disponibilité de personnel qualifié ayant une expertise dans la localisation anatomique de l’organe d’intérêt et stéréotaxique injection des cellules tumorales.

La dissociation du tissu tumoral s’est avérée pour être une étape cruciale dans le développement du modèle de xénogreffe de dérivés patient décrit. Tissu tumoral Native comprend un microenvironnement cellulaire et le stroma environnant qui peut-être affecter l’absorption de la tumeur ou la greffe. Les numérations, après que le processus de dissociation était complet, a fourni une mesure de la densité cellulaire dans l’échantillon, avec 2 x 105 cellules/10 μL, considéré comme un nombre de cellules optimale pour implantation et greffe réussie de tumeur.

Luciférase marquage des cellules autorisées pour la validation de prise de greffe tumorale et la surveillance de la croissance tumorale en mesurant le signal de bioluminescence, avec 106 108 étant considérée comme indicative de tumeur absorption9. Afin d’assurer le succès transduction, activité de la luciférase a été confirmé in vitro avant l’injection de cellules. Cela a été fait par immunofluorescence, trousses de dosage de luciférase et également en examinant les cellules pour signal de bioluminescence. Paramètres utilisés pour mesurer la bioluminescence ont été maintenues constantes, fournissant des données cohérentes au cours de mesures hebdomadaires.

Ex vivo l’analyse histopathologique des tumeurs a confirmé le type cellulaire et la morphologie des tumeurs qui en résulte avec une coloration spécifique pour marqueurs protéiques. Analyse histopathologique a confirmé la prise de greffe tumorale et les métastases démontrée par l’échographie et l’imagerie bioluminescent.

Avantages de l’implantation cellulaire guidée par échographie comprennent son caractère non invasif, animaux minime de l’indisponibilité et un succès croissant dans la mise en place de plusieurs modèles de xénogreffes réussie. Imagerie par ultrasons fournit également une méthode fiable pour surveiller en vivo tumeur tumorale et progression des volumes. Dans ces modèles précliniques, tumeurs atteint localement invasives avec métastases en 5 semaines. Limitations incluent la disponibilité de la technologie d’imagerie de haute résolution et la capacité de localiser systématiquement l’organe cible. Disponibilité du personnel ayant une expertise en imagerie par ultrasons de l’organe d’intérêt sont des composantes essentielles de cette technique.

La disponibilité de l’échographie à haute résolution a considérablement augmenté durant la dernière décennie et son utilisation continue à s’étendre non seulement dans la pratique clinique, mais aussi dans la recherche en laboratoire. L’utilisation des ultrasons pour le développement des xénogreffes murines modernes est une application prometteuse, avec un potentiel pour faire avancer les modèles de recherche préclinique à la découverte de médicaments du cancer.

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Disclosures

Les auteurs n’ont aucune divulgation.

Acknowledgments

Cet ouvrage a reçu le soutien de la Robert Wood Johnson Foundation/Amos médicale Faculté Development Programme, Taubman Research Institute et la Section de chirurgie pédiatrique, de l’Université du Michigan. Les auteurs tiennent à remercier Kimber Converso-Baran et Dr Marcus Jarboe pour l’assistance aux procédures d’injection échographie et la plate-forme d’imagerie. Nous remercions Paul Trombley pour son aide avec des graphiques de la figure. Nous remercions également le service de la radiologie à l’Université du Michigan pour l’utilisation du centre d’imagerie moléculaire et la tumeur Imaging Core, qui sont soutenus en partie par complets Cancer Centre NIH, accorder P30 CA046592. L’Université du Michigan physiologie phénotypage Core qui est en partie financé par subvention du NIH (OD016502) et le centre de circulation sanguine Frankel. Authentification de ligne cellulaire a été faite dans les installations Bioresearch de IDEXX RADIL, Columbia, Missouri Nous remercions Tammy Stoll, Dr Rajen Mody et le programme d’oncologie tumeur solide Mott. Nos patients et les familles sont tient à reconnaître pour leur inspiration, de courage et un soutien continu de nos recherches.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Mice
NOD-SCID Charles River 394
NSG The Jackson Laboratory 5557
Cell Line 
NB
IMR-32 ATCC CCL-127 Established human neuroblastoma cell line
SH-SY5Y ATCC CRL-2266 Established human neuroblastoma cell line
SK-N-Be2 ATCC CRL-2271 Established human neuroblastoma cell line
ES
TC32  COGcell.ORG Established human Ewing's Sarcoma cell line
A673 COGcell.ORG Established human Ewing's Sarcoma cell line
CHLA-25 COGcell.ORG Established human Ewing's Sarcoma cell line
A4573 COGcell.ORG Established human Ewing's Sarcoma cell line
Cell Line media
RPMI Life Technologies 11875-093
Matrigel BD BioSciences 354234
Dissociation
Dissection Tools KentScientific INSMOUSEKIT
Human Tumor Dissociation Kit  MACS Miltenyi Biotec 130-095-929
gentleMACS dissociator MACS Miltenyi Biotec 130-093-235
gentleMACS C tubes MACS Miltenyi Biotec 130-096-334
Cell Strainer Corning 431751
Luciferase Tagging
Lenti-GFP1 virus University of Michigan, Vector Core Luciferase Virus
Steady Glo-Luciferase Assay Kit Promega E2510
Bioluminescence Imaging
Ivis Spectrum Imaging System PerkinElmer 124262
D-Luciferin Promega E160X
Anesthetic
Inhaled Isoflurane  Piramal Critical Care Inc 66794-0017-25
Ultrasound Guided Injection
Vevo 2100 High Resolution Imaging Vevo 2100
Hamilton Syringes (27 gauge needle) Hamilton 80000
22 Gauge Angiocatheter BD Biosciences 381423
Optical ointment Major Pharmaceuticals 301909
Nair Church & Dwight Co Hair Removal agent
Aquasonic 100 Ultrasound Transmission gel Parker Ultrasound gel
Histology
CD99 DAKO M3601 Primary Antibody
Tyrosine Hydroxylase Sigma-Aldrich T2928 Primary Antibody
Secondary HRP-Polymer antibody Biocare BRR4056KG
Miscelleneous
10 mL Pipettes Fisher Scientific 13-676-10J
5 mL Pipettes Fisher Scientific 13-676-10H
1.5 mL Microcentrifuge tubes Fisher Scientific 05-408-129
P1000 pipette Eppendorf 3120000062
P200 pipette Eppendorf 3120000054
P1000 pipette tips Fisher Scientific 21-375E
P200 pipette tips Fisher Scientific 21-375D
Portable pipette aid Drummond 4-000-101
digital animal Weighing Scale  KentScientific SCL-1015
Calipers Fisher Scientific 06-664-16
6well low attachment plates Corning 07-200-601
10 cm Tissue Culture Treated Dishes Fisher Scientific FB012924
Polybrene Sigma-Aldrich TR-1003-G

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References

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Utilisation des ultrasons guidés axés sur les tissus cellulaire Implantation pour la mise en place de xénogreffes tumorales métastatiques biologiquement pertinente
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Thomas, T. T., Chukkapalli, S., Van Noord, R. A., Krook, M., Hoenerhoff, M. J., Dillman, J. R., Lawlor, E. R., Opipari, V. P., Newman, E. A. Utilization of Ultrasound Guided Tissue-directed Cellular Implantation for the Establishment of Biologically Relevant Metastatic Tumor Xenografts. J. Vis. Exp. (135), e57558, doi:10.3791/57558 (2018).More

Thomas, T. T., Chukkapalli, S., Van Noord, R. A., Krook, M., Hoenerhoff, M. J., Dillman, J. R., Lawlor, E. R., Opipari, V. P., Newman, E. A. Utilization of Ultrasound Guided Tissue-directed Cellular Implantation for the Establishment of Biologically Relevant Metastatic Tumor Xenografts. J. Vis. Exp. (135), e57558, doi:10.3791/57558 (2018).

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