Summary
Hier bieden we een gedetailleerd protocol te verrichten in vivo cardiale gene bewerken in muizen met behulp van recombinant Adeno-Associated Virus (rAAV)-gemedieerde levering van CRISPR. Dit protocol biedt een veelbelovende therapeutische strategie voor de behandeling van Dystrofe cardiomyopathie in Duchenne spierdystrofie en kan worden gebruikt voor het genereren van cardiale-specifieke knock-out in de postnatale muizen.
Abstract
De geclusterde regelmatig interspaced, korte, palindromische herhalen (CRISPR)-systeem heeft zeer genoom engineering in zowel de gekweekte cellen en de levende organismen van allerlei soorten vergemakkelijkt. De CRISPR-technologie is ook onderzocht als nieuwe therapieën voor een aantal ziekten bij de mens. Proof-of-concept gegevens zijn zeer bemoedigend, zoals wordt geïllustreerd door de recente studies die aantonen dat de haalbaarheid en de werkzaamheid van gene bewerken gebaseerde therapeutische benadering voor Duchenne muscular dystrophy (DMD) met behulp van een lymfkliertest model. Met name heeft intraveneuze en intraperitoneale injectie van de recombinante adeno-associated virus (rAAV) serotype rh.74 (rAAVrh.74) ingeschakeld, efficiënte cardiale levering van de Staphylococcus aureus CRISPR-geassocieerde proteïne 9 (SaCas9) en twee begeleiden RNAs (gRNA) als u wilt verwijderen van een genomic regio met een mutant codon in exon 23 van muis Dmd gen. Deze dezelfde benadering kan ook worden gebruikt voor knock-out de gen-of-interest en hun hartfunctie bij postnatale muizen bestuderen wanneer de gRNA is ontworpen om te richten van de codering regio van het gen. In dit protocol tonen we in detail hoe ingenieur rAAVrh.74-CRISPR-vector en hoe te bereiken hoogefficiënte cardiale levering in neonatale muizen.
Introduction
De geclusterde, regelmatig interspaced, korte palindromische herhalen (CRISPR) technologie is de meest recente vooruitgang in genoom engineering en heeft een revolutie teweeggebracht in de huidige praktijk van genetica in cellen en organismen. CRISPR gebaseerde genoom bewerken maakt gebruik van een enkele gids RNA (gRNA) om een CRISPR-geassocieerde endonuclease zoals CRISPR-geassocieerde proteïne 9 (Cas9) en Cpf1 aan de genomic DNA doel dat is een aanvulling in de juiste volgorde op de protospacer gecodeerd door de gRNA met een specifieke protospacer aangrenzende motief (PAM)1,2. De PAM is afhankelijk van de bacteriële soorten het Cas9 of Cpf1 gen. De meest gebruikte Cas9 nuclease afgeleid van Streptococcus pyogenes (SpCas9) herkent een reeks PAM NGG dat in de genomic DNA, op de doelsoort onderdeel direct stroomafwaarts van de doel-reeks schuilt. Op de doelsite, de Cas9 en Cpf1 eiwitten genereren een pauze met dubbel-strand (DSB), die vervolgens via de intrinsieke cellulaire DNA herstelmechanismes, met inbegrip van niet-homologe einde deelname aan (NHEJ) en homologie geleide reparatie (HDR) trajecten3is hersteld, 4. Bij gebrek aan een DNA-sjabloon voor homologe recombinatie, wordt de DSB voornamelijk hersteld door de vergissing-geneigd NHEJ traject, die in invoegingen of verwijderingen (microdeleties resulteren kan) van nucleotiden frameshift mutaties veroorzaken als de DSB in de codering ontstonden regio van een gen5,6. Dus, het CRISPR-systeem is wijd verbeid gebruikt om ingenieur verlies-van-functie mutaties in diverse cellulaire modellen en hele organismen, om te onderzoeken van de functie van een gen. Bovendien, de catalytically inactief Cas9 en Cpf1 zijn ontwikkeld om transcriptionally en epigenetically het moduleren van de expressie van doel genen7,8.
Meer recentelijk, zowel SpCas9 als SaCas9 (afgeleid van Staphylococcus aureus) zijn verpakt in recombinante adeno-associated virus (rAAV) vectoren voor postnatale gene correctie in de diermodel van ziekten bij de mens, met name, Duchenne muscular dystrophy (DMD)9,10,11,12,13,14,15. DMD is een dodelijke X-gebonden recessieve ziekte veroorzaakt door mutaties in het DMD -gen, dat Dystrofine-eiwit16,17 codeert, die ongeveer één in 3500 mannelijke geboorten volgens pasgeboren screening18 , 19. het wordt gekenmerkt door progressieve spierzwakte en verspillen. De DMD-patiënten verliezen meestal het vermogen om te lopen tussen 10 en 12 jaar oud en sterven van de luchtwegen en/of cardiale mislukking door de leeftijd van 20-30 jaar20. Met name, cardiomyopathie ontwikkelt > 90% van de patiënten DMD en vertegenwoordigt de toonaangevende veroorzaken van de dood in DMD patiënten21,22. Hoewel Deflazacort (een anti-ontsteking drug) en Eteplirsen (een exon skipping geneeskunde voor het overslaan van de exon 51) zijn onlangs goedgekeurd voor DMD door de Food and Drug Administration (FDA)23,24, geen van deze behandelingen Corrigeer het genetische gebrek aan de genomic DNA-niveau. De MDX-muis, die een punt mutatie bij exon 23 van het Dystrofine-gen draagt, is wijd verbeid gebruikt als een DMD model25. Bovendien, we eerder aangetoond dat de expressie van functionele Dystrofine werd gerestaureerd door-frame schrapping van de genomic DNA die betrekking hebben op exons 21, 22 en 23 in de skeletspieren van mdx muizen met behulp van intramusculaire Ad-SpCas9/gRNA levering9 , en in de spieren van het hart van mdx/utrophin+/- muizen met behulp van intraveneuze en intraperitoneaal levering van rAAVrh.74-SaCas9/gRNA26.
In dit protocol beschrijven we in detail elke stap in de postnatale cardiale gene bewerken om te herstellen van Dystrofine in mdx/utrophin+/- muizen met behulp van rAAVrh.74-SaCas9/gRNA vectoren, van gRNA ontwerp tot Dystrofine analyse in de secties van de spier hart.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De dieren die worden gebruikt in dit protocol werden op The Ohio University Laboratory Animal staatsmiddelen gehouden overeenkomstig de richtsnoeren voor het gebruik van de dierlijke. Alle dierlijke studies werden toegestaan door de institutionele Animal Care gebruik en de Commissie ter beoordeling van de Ohio State University.
1. ontwerp en klonen van gRNAs in de CRISPR-Vector
- Selecteer 2 gRNAs richtend Dystrofine intron 20 en intron 23 (i20 en i23) voor SaCas9: i20: 5'-GGGCGTTGAAATTCTCATTAC CAGAGT en i23: 5'-CACCGATGAGAGGGAAAGGTC CTGAAT (de volgorde van de PAM is onderstreept en cursief).
Opmerking: De doel-sites voor i20 en i23 zijn ongeveer 23 kilo basenpaar (kbp) weg. Verstoort of een codering gen, twee gRNAs, gericht op de gemeenschappelijke exons met de NNGRRT PAM volgnummer voor SaCas9 (bij voorkeur NNGAAT, NNGGGT en NNGAGT) en afstand binnen 20 kbp worden aanbevolen. - Kunt de volgende parameters van de PCR ontharden de gRNA oligos (100 µmol/L) in 1 x gloeien buffer (de 5 x gloeien buffervoorraad bevat 0,5 mol/L K-acetaat, 150 mmol/L HEPES-KOH, 10 mmol/L Mg-acetaat, pH7.4): 95 ° C 10 min, 90 cycli van 95 tot en met 59 ° C met een 0.4 ° C dalen cyclus voor 20 s, 90 cycli van 59 tot en met 32 ° C met een daling van 0,3 ° C per cyclus voor 20 s, 20 cycli van 32 tot en met 26 ° C met een daling van 0,3 ° C per cyclus voor 20 s.
- Afbinden van oligos van de ontharde gRNA in de pX601-CMV-SaCas9-mPA-U6-gRNA met behulp van BsaI en T4 DNA ligase in een reactie (1 µL 50 ng/µL pX601-CMV-SaCas9-mPA-U6-gRNA 1 µL gegloeid oligos 1.5 µL 10 x T4 DNA ligase buffer, 0,5 µL T4 DNA ligase, 1 µL BsaI, 10 µL ddH2O ), met de volgende reactie voorwaarde in een PCR-cycler: 5 cycli van [37 ° C 5 min en 16 ° C 10 min]; 37 ° C 20 min; 80 ° C 5 min.
- Het product van de afbinding 15 µL omvormen 30 µL bevoegde cellen, plaat van de cellen in agarplaat met 100 µg/mL ampicilline en cultuur bij 37 ° C gedurende 24 uur.
- Pick-up de kolonies en de cultuur in LB opslagmedium met 100 µg/mL ampicilline bij 37 ° C, 250 rpm in een shaker incubator voor 3-4 h 5-10.
- Het scherm van de kolonies door PCR: 10 µL 2 x PCR master mix 8 µL ddH2O, 1 µL E. Coli cultuur, 1 µL 10 µmol/L U6-forward primer, 1 µL i20 of i23 gRNA reverse primer. De PCR fietsen parameters: 95 ° C 5 min, 35 cycli van 95 ° C 30 s, 61 ° C 30 s, 72 ° C 30 s.
- Bereiden 5 mL cultuur van de positieve klonen door toevoegen 4 mL verse LB middellange containing100 µg/mL ampicilline, en cultuur 's nachts bij 37 ° C, 250 rpm.
- Zuiveren van de plasmide DNA met behulp van de juiste plasmide extractie kit en controleer of de plasmide door Sanger sequencing met de U6-forward-primer.
- Cultuur van de C2C12 cellen in DMEM aangevuld met 10% FBS en 1% Pen-Strep tot het bereiken van ~ 70% confluentie voor het testen van het bewerken van de werkzaamheid van de plasmiden gen.
- Electroporate een totaal van 5 µg SaCas9/gRNA plasmide mengsel in de molaire verhouding 1:1 in 1 x 106 C2C12 cellen volgens protocol van de fabrikant.
- Na 48u na transfectie, oogsten van de cellen van de C2C12 en haal genomic DNA.
- Gebruik 100 ng genomic DNA als sjabloon voor het uitvoeren van de PCR reactie voor muis Dystrofine locus: toekomen primer 5'-GGCCAAAGCAAACTCTGGTA (1 µL 10 µmol/L), omkeren primer 5'-TTTAATCCCACGTCATGCAA (1 µL van 10 µmol/L), 10 µL 2 x de groene PCR master mix, 7 µL ddH2O, 1 µL genomic DNA () 100 ng). Gebruik van PCR fietsen voorwaarden als 95 ° C 5 min, 35 cycli van [95 ° C 30 s, 61 ° C 30 s, 72 ° C 30 s], 72 ° C 2 min.
2. rAAV productie
- Om de cultuur van de cellen, zaad AD293 cellen op 20 tot 40 van 15 cm schotels en onderhouden in DMEM aangevuld met 10% FBS en 1% Pen-Strep tot het bereiken van ~ 90% confluentie voor Transfectie.
- Verdun 3 plasmiden met 200 µL verminderd serum medium (per schotel): 1) 10 µg pHelper; 2) 5 µg pXR (rh.74 of andere serotypen) en 3) een totaal van 5 µg pX601-i20 en pX601-i23 mengsel (verhouding 1:1). Het uitvoeren van polyethylenimine (PEI) transfectie door het te mengen met 80 µL PEI en Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten toevoegen het mengsel op de celculturen AD293 op een dropwise manier.
- Voor AAV virus productie, na 72 h post transfectie, gebruikt u een cel schraper om te verzamelen van zowel de media als de AD293 cel pellets door centrifugeren bij 1100 x g gedurende 10 minuten.
- Resuspendeer de cel pellets in 15 mL rAAV lysis-buffermengsel (50 mmol/L Tris Base, 150 mmol/L NaCl, pH 8,5) gevolgd door 3 bevriezen-ontdooien cycli met afwisselende incubatie in vloeibare stikstof en een 42 ° C waterbad. Bewaar de cel lysates in-80 ° C voor de toekomstige verwerking als ze niet onmiddellijk worden verwerkt.
- De voedingsbodems filteren met een 0,45 µm filter en een 40% PEG8000 in 2,5 mol/L NaCl toevoegen om een eindconcentratie van 8%. Incubeer het mengsel bij 4 ° C gedurende 1 h en centrifuge op 1100 x g gedurende 15 minuten.
- Resuspendeer de pellets in rAAV lysis-buffermengsel en combineren met de cel lysates uit stap 2.3, gevolgd door behandeling van de benzonase (50 U/mL) bij 37 ° C gedurende 1 uur.
- Centrifugeer het benzonase-behandeld rAAV met mengsel 1100 x g gedurende 15 minuten staan bij 4 ° C, en sla het supernatant (de voorbereiding van de ruwe rAAV).
3. rAAV reiniging en concentratie
- Laden van de ruwe rAAV voorbereiding op het verloop van een iodixanol in een buis van de ultracentrifuge in de volgende volgorde vanaf de top naar de onderkant: ruwe AAV lysate (~ 15 mL), 8 mL 15% Iodixanol, 6 mL 25% Iodixanol, 5 mL 40% Iodixanol, 5 mL 58% Iodixanol. Vul het resterende lege volume van de buis aan de bovenkant met 1 x DPBS.
- Centrifugeer de monsters bij 230.000 x g in een rotor ultracentrifuge gedurende 120 minuten bij 10 ° C en 3-4 mL van de 40% kleurovergang breuk met de rAAV deeltjes met een naald 18 G te verzamelen.
- Verdun de rAAV deeltjes met 1 x DPBS en centrifuge met behulp van de centrifugaal filter eenheid (MWCO 100 kDa). Herhaal deze stap voor 3 - 5 keer en ten slotte het concentreren van de voorbereiding van de rAAV aan 300-500 µL.
4. rAAV Titering
- Extract van de genomic DNA van 2 µL geconcentreerd rAAV, overhaaste met 3 M NaOAc in ethanol en resuspendeer in 20 µL ddH2O.
- De standaard curve voor rAAV kwantificatie verkrijgen door seriële verdunning van de plasmide pX601: 1 x 109, 1 x 10,8,1 x 10,7, 1 x 106, 1 x 105 exemplaren in elk 10 µL ddH2O. Dilute de DNAase-behandelde rAAV monsters als 1:10, 1:50, 1:100 en 1:1000.
- Bepalen van de titer van de rAAV door kwantitatieve PCR in real time (qPCR) met behulp van qPCR Kit volgens instructie van de fabrikant in een Real-Time PCR-systeem: 1 µL 10 µmol/L voor elke primer (5'-GGATTTCCAAGTCTCCACCC en 5'-TCCCACCGT ACACGCCTAC), 5 µL 2 x PCR master mix, 1 µL verdund rAAV monsters en 2 µL ddH2O. de reactie worden uitgevoerd met de volgende fietsen parameters: 95 ° C 3 min, 45 cycles van [95 ° C 5 sec en 61 ° C 20 sec].
5. intraveneuze en intraperitoneale injectie van rAAVrh.74-CRISPR in de neonatale mdx/utrophin+/- muizen
- Immobiliseren de mdx/utrophin+/- muis pups (dag 3) door te plaatsen op het ijs voor 1 min en vervolgens beheren met 1 x 1012 virale deeltjes in 50 µL per muis systemisch via een retro-orbitaal aanpak of een intraperitoneale injectie.
- Laat de muizen te herstellen en plaats terug in hun huis kooien. Euthanaseren op tien weken na toediening van de rAAV, de muizen door CO2 blootstelling voor weefsel collectie.
- Module-freeze weefsels voor genomic DNA en RNA extractie en gebruik koeling van tolueen in vloeibare stikstof te bevriezen weefsels met optimale scherpe temperatuur samengestelde voor cryosectioning.
6. analyse van Target-gen bewerken van resultaten
-
Genomic DNA PCR analyse
- Isoleren van de totale genomic DNA van het hart weefsels van mdx/utrophin+/- muizen behandeld met of zonder rAAV.
- Hetzelfde protocol gebruiken in stap 1.12 voor PCR analyse.
-
RT-PCR analyse van Dystrofine expressie
- Uittreksel totaal RNA van het hart weefsels met de RNA extractie kit na de handleiding van de fabrikant.
- Uitvoeren van omgekeerde transcriptie, vooraf behandelen de totale RNA met een RNase-vrije DNase en 5 µg behandelde RNA gebruiken als sjabloon voor eerste-strand cDNA synthese met de omgekeerde transcriptie kit.
- Gebruik van het product reverse transcriptie voor RT-PCR analyse van Dystrofine expressie met het Dystrofine cDNA inleidingen: 5'-GGCTAGAGTATCAAACCAACATCAT en 5'-TGGAGGCTTACGGTTTTATCC.
-
Schatten van de gene werkzaamheid bewerken door qPCR analyse
- Schatten van het gen bewerken werkzaamheid door kwantitatieve RT-PCR te sporen van de vermindering van de exon 22-bevattende afschriften met behulp van de voorwaartse primer (exon 21): 5'-TTGTCAGCTCTTCAGCCTCAAA en de omgekeerde primer (exon 23): 5'-AAACTCTCCTTCACAGTGTCACT. Gebruik Gapdh als een referentie-gen met de voorwaartse primer: 5'-AGGTTGTCTCCTGCGACTTC en de omgekeerde primer: 5'-GGTGGTCCAGGGTTTCTTACT.
- Uitvoeren van de kwantitatieve PCR in real time (qPCR) met behulp van de qPCR Kit volgens instructie van de fabrikant in een Real-Time PCR-systeem en de reactie van 2-step-voorwaarden: 95 ° C 3 min, 45 cycles van 95 ° C 5 sec en 61 ° C 30 sec.
-
Immunofluorescentie kleuring voor het analyseren van Dystrofine expressie
- Snijd het bevroren weefsels met behulp van een cryostaat bij een dikte van 10 µm. Fix de bevroren secties met 4% paraformaldehyde bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten.
- Wassen 2 x met PBS en incubeer met oplossing (10% paard serum) blokkeren voor 1 h.
- Incubeer de anti-Dystrofine primair antilichaam, bij 4 ° C's nachts.
- Wassen van de dia's met PBS 3 x 5 min en incubeer met fluorescerende secundaire antilichamen (1:500) bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
- Monteer de dia's met behulp van het montage-medium met DAPI en beeldbewerking met een omgekeerde confocal microscoop.
7. off-target analyse met behulp van de T7E1 van
- Voorspellen de potentiële uit doelsoort zijn sites die gebruik maken van de online CRISPR ontwerp tools zoals < http://crispr.mit.edu>.
- Versterken van de genomic regio's die betrekking hebben op de top 5-10 potentiële af-target sites door PCR: genomic DNA 200 ng 1 µL HiFi-polymerase van DNA, 5 µL 10 x PCR Buffer mix, 1.5 µL 10 µmol/L site-specific voorwaartse en omgekeerde inleidingen, aanpassing van het totale volume aan 50 µL met ddH2O.
- De PCR-producten worden uitgevoerd door elektroforese, uittreksel en zuiveren van het DNA met behulp van een gel extractie kit. Het meten van de concentratie met behulp van spectrofotometers.
- Heteroduplex-vorming te bevorderen door denaturering en opnieuw gloeien de gezuiverde waarbij langzaam in de Buffer 2.1 met behulp van een PCR-cycler. Gebruik dezelfde fietsen voorwaarden zoals beschreven in stap 1,2.
- De opnieuw ontharde producten gedurende 30 minuten bij 37 ° C met 0,5 µL T7E1 enzym verteren, en analyseren van de reactie door elektroforese met behulp van 1-2% agarose gel.
Opmerking: De waarbij kunnen ook worden geanalyseerd door gerichte diepe sequentiebepaling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De werkzaamheid van de gRNAs voor het opwekken van de schrapping van de target genomic DNA regio moet worden geëvalueerd in celculturen vóór verpakking in rAAV voor in vivo onderzoek. Te dien einde, de gRNAs en SaCas9-uiten constructies waren electroporated in C2C12 cellen en de genomic DNA door PCR werd geanalyseerd met de inleidingen flankerend de doelgroep sites (Figuur 1). Een PCR-product van ~ 500 bp geeft aan succesvolle schrapping van het doel genomic DNA als gevolg van gen bewerken terwijl de controle cellen moeten een band als gevolg van de grote omvang van de genomic DNA niet opleveren.
Zodra de doeltreffendheid van de gRNAs is bevestigd in celculturen, kunnen zij worden verpakt in rAAVrh.74 of andere serotypen (zoals AAV6, 8 of 9, alle weergegeven: robuuste cardiale gene levering) met behulp van de drie plasmiden co transfectie in AAV293 cellen. We vonden dat het niet noodzakelijk om twee afzonderlijke rAAV voorbereiding voor de twee gRNAs, in plaats daarvan we de twee gRNA constructies in een gelijke molaire verhouding gemengd en geproduceerd een voorbereiding van enkele rAAV. De rAAV virale deeltjes werden gezuiverd met behulp van de kleurovergang ultracentrifugatie dichtheid en de zuiverheid werd geanalyseerd door SDS-PAGE. De hoogst gezuiverde rAAV voorbereiding zou opleveren slechts drie bands die overeenkomt met de eiwitten Eiwitmantel VP1 en VP2 VP3, respectievelijk op SDS-pagina zoals afgebeeld in Figuur 2.
De gezuiverde rAAVrh.74 virale deeltjes waren geïnjecteerd in dag 1-3 pasgeborenen van mdx/utrophin+/- muizen via retro-orbitaal of intraperitoneale injectie. We vonden beide methoden goed gewerkt voor cardiale levering van de rAAVrh.74-CRISPR. De geïnjecteerde muizen kunnen worden geanalyseerd voor Dystrofine expressie met immunofluorescentie (Figuur 3) kleuring op 10 weken oud.
Figuur 1: validatie van de gRNAs voor SaCas9-gemedieerde gene bewerken in cellen van de C2C12. De Elektroforese van het gel van de representatieve agarose toonde de PCR-producten van genomic DNA geëxtraheerd uit electroporated C2C12 met of zonder SaCas9/gRNAs. De pijl geeft dat het PCR-product het gevolg is van het gen bewerken. Gapdh diende als referentie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: analyse van rAAVrh.74 deeltjes door SDS-PAGE. Gezuiverde rAAVrh.74 virale deeltjes niet uitvoeren op SDS-pagina toonde drie bands, overeenkomt met de drie Eiwitmantel eiwitten van AAV, VP1 (87 kDa), VP2 (72 kDa) en VP3 (62 kDa), respectievelijk. De aanwezigheid van alleen deze 3 bands geeft de hoge zuiverheid van de voorbereiding van de rAAV zonder andere cellulaire eiwitten besmetten. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: Immunofluorescentie kleuring van de secties van het hart van mdx/utrophin+/- muizen op 10 weken na de behandeling van de AAV-SaCas9/gRNAs. De representatieve immunofluorescentie beelden bleek de expressie van Dystrofine (rood) en caveolin-3 (groen) in de secties hart van WT, mdx/utrophin+/- en mdx/utrophin+/- muizen behandeld met 1 x 1012 vg AAV-SaCas9/gRNA systemisch. DAPI werd gebruikt om de label van de kernen (blauw). Schaal bar: 100 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In dit protocol detailleren wij alle noodzakelijke stappen voor het bereiken van de in vivo cardiale gene bewerken in postnatale muizen met behulp van rAAVrh.74-gemedieerde levering van SaCas9 en twee gRNAs. Zoals eerder opgemerkt, deze benadering kan worden gebruikt om te herstellen van Dystrofine expressie in dystrophique muizen, zoals beschreven in onze werk-27, maar het kunnen ook snelle reverse genetics studies van cardiale-gerelateerde genen in muizen zonder het langdurige proces van de traditionele knockout aanpak te genereren en knock-out Muismodellen fokken.
Met het oog op een hoge gene efficiëntie in het doelweefsel bewerken, er zijn verschillende kritische stappen in gedachten te houden: 1) de werkzaamheid van de SaCas9/gRNA voor het opwekken van de schrapping van gerichte genomic DNA moet worden gevalideerd met behulp van geschikte cellijnen; 2) het is zeer belangrijk om te kiezen van een juiste AAV serotype die een hoog niveau van gene signaaltransductie in het doelweefsel is terechtgekomen en 3 kan bemiddelen) bepalen van de optimale bezorgingsroute van AAV vectoren op genoverdracht op het gewenste weefsel.
In het huidige protocol, de ontworpen SaCas9/gRNAs werden verpakt in AAVrh.74 eerder dan eerder gemeld AAV8 en AAV9 voor het bewerken van Dmd gene12,28. AAVrh.74 vertoont ongeveer 93% homologie AAV829 en heeft aangetoond dat niet-pathogene en effectief in het transducing van de skeletspieren van volgende geïsoleerd ledematen levering29,30,31. In dit protocol gebruiken we retro-orbitaal en intraperitoneale injectie van rh.74 in de neonatale muizen voor cardiale genenoverdracht. We vonden dat de administratie van de pasgeborene van rAAVrh.74 is zeer efficiënt voor het herstel van Dystrofine expressie in ongeveer 30-40% van cardiomyocytes in de ontvangst van een hoge dosering van rAAVrh.74 (1 x 1012 vg) muizen. Interessant, vonden we dat de skeletspieren Dystrofine expressie niet effectief werd gered. Dit is waarschijnlijk te wijten aan de lage skeletspieren tropisme van rh.74 serotype bij toediening via de intraveneuze of intraperitoneale injectie, hoewel eerdere studies is gebleken dat geïsoleerde ledemaat levering van rAAVrh.74 kan effectief transduce muis en aap skelet spier29,30,31. Ook, wanneer de rAAVrh.74 werd toegediend in volwassen muizen, zien we zeer lage efficiëntie in de expressie van het Dystrofine te herstellen. Het zou interessant zijn om te bepalen van de minimale dosering die vereist is voor het bereiken van de hoogste Dystrofine redding. Andere serotypen en leveringsmethoden kunnen bovendien worden getest en vergeleken voor het bereiken van optimale cardiale gene bewerken.
Succesvolle schrapping van een groot stuk voor genomic DNA vereist gelijktijdige levering van twee gRNAs. We vonden dat het is niet nodig om twee afzonderlijke rAAV preparaten voor het leveren van twee gRNAs. In dit protocol, we gewoon de twee gRNA-plasmiden in een gelijke hoeveelheid gemengd tijdens transfectie voor de productie van rAAV, en deze gecombineerde productie van rAAV bleek effectief te zijn in het leveren van beide gRNAs. Deze gecombineerde aanpak is daarom kosten - en arbeidsbesparende en aanbevolen wanneer gelijktijdige levering van twee gRNAs nodig zijn.
In veel gevallen kan het noodzakelijk om te analyseren van het gen efficiëntie door genetische benaderingen bewerken wanneer een goede antilichaam niet beschikbaar voor het doelproduct gen is worden. Het is echter technisch uitdagende te kwantificeren nauwkeurig de gene werkzaamheid bewerken met twee gRNAs gericht op de dezelfde locus aangezien de bewerken genproducten doel reeks schrapping, doel reeks inversie en kleine microdeleties op slechts één doel zijn zou website. In plaats daarvan is het meer zinvol en haalbaar is om het kwantificeren van de efficiëntie van de verwijdering van de gewenste gerichte volgorde zoals in ons geval waar de vermindering van de transcripten met exons 21-23 door RT-PCR in real time kan worden gekwantificeerd.
In dit protocol beschrijven we ook het gebruik van T7E1 assay en computationele voorspelling voor het analyseren van de potentiële uit doelsoort zijn activiteit. Voor de bepaling goed te werken, is het noodzakelijk om te gebruiken van een hifi-polymerase van DNA. Ook, het is altijd een goed idee om voor te bereiden voor een negatieve controle-experiment (bijvoorbeeld DNA producten versterkt uit de cellen/weefsels zonder gen kan worden bewerkt en op dezelfde manier behandeld als de analysemonsters) en een positieve controle-experiment (bijvoorbeeld een bekend monster met goed gekarakteriseerd gene bewerken). Het is echter van de opmerking dat de detectiegrens van de T7E1 assay ongeveer 5%32, en dus het is niet opgespoord door de bepaling van de T7E1 worden mag als de activiteit af-target minder dan 5 is %. Gids-seq33 kan worden gebruikt voor het analyseren van unbiasedly de uit-target activiteit van de SaCas9/gRNA-gemedieerde gene bewerken. De geïdentificeerde af-target sites van T7E1 assay, computationele voorspelling en/of gids-seq benaderingen kunnen verder worden gekwantificeerd Voorfrequenties indel na in vivo gene bewerken door high-throughput sequentiebepaling.
Tezamen hebben wij een geoptimaliseerde cardiale gene bewerken aanpak met behulp van de rAAVrh.74 verstrekt. Deze gangbaar protocol kan verder te worden getest voor therapeutische toepassingen en omgekeerde genetische studies.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflict bestaat.
Acknowledgments
R.H. wordt ondersteund door de Amerikaanse National Institutes of Health grants (R01HL116546 en R01 AR064241).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 555 goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | A-21428 | |
| Benzonase Nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | |
| Bio Safety Cabinets | Thermo Fisher Scientific | 1347 | 1300 Series A2 Class II, Type A2 |
| BsaI | New England BioLabs Inc | RO535S | |
| Competent cells | Agilent Technologies | 200314 | |
| Cell culture dishes, 150mm | Nest Scientific USA | 715001 | |
| Cryostat | Leica Biosystems | Leica CM3050S | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | MT10017CV | Corning cellgro |
| Dystrophin antibody | Spring Bioscience | E2660 | |
| Fast-Ion Midi Plasmdi Kits | IBI Scientific | IB47111 | |
| FBS | Thermo Fisher Scientific | 26-140-079 | |
| Filter Unit, 0.45μm | Thermo Fisher Scientific | 166-0045 | |
| GoTaq Master Mixes | Promega | M7122 | |
| High-speed plasmid mini kit | IBI Scientific | IB47102 | |
| Horse serum | Abcam | ab139501 | |
| Isotemp 2239 Water Bath | Thermo Fisher Scientific | 15-460-11Q | |
| Isotemp Heat Block | Thermo Fisher Scientific | 11-718 | |
| Inverted confocal microscope | Carl Zeiss Microscopy, LLC | LSM 780 | |
| LightCycler 480 instrument | Roche | 5015243001 | LightCycler 480 Instrument II |
| Large Capacity Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 46-910 | Thermo Scientific Sorvall RC 6 Plus |
| Microcentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75002445 | Sorvall Legend Micro 21R |
| Nanodrop spectrophotometers | Thermo Scientific | ND2000CLAPTOP | NanoDrop™ 2000/2000c |
| Oligos for i20-F | Integrated DNA Technologies | CACCgGGCGT TGAAATTCTCATTAC |
|
| Oligos for i20-R | Integrated DNA Technologies | AAAC GTAATGAGAATTTCAACGCCc; | |
| Oligos for i23-F | Integrated DNA Technologies | CACCgCACCGATGAGAGGG AAAGGTC |
|
| Oligos for i23-R | Integrated DNA Technologies | GACCTTTCCCTCTCATCGGTGc | |
| Oligos | Integrated DNA Technologies | ||
| OptiPrep Density Gradient Medium | Sigma-Aldrich | D1556-250ML | |
| OptiMEM | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
| PEG8000 | Sigma-Aldrich | 89510-1kg-F | |
| Polyethylenimine | Polysciences | 23966 | |
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | P2308 | |
| Quick-Seal centrifuge tube | Beckman Coulter Inc | 342414 | |
| QIAquick Gel Extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| Radiant SYBR Green Hi-ROX qPCR Kits | Alkali Scientific | QS2005 | |
| RevertAid RT Reverse Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific | K1691 | |
| Rotor | Beckman Coulter Inc | 337922 | Type 70Ti |
| T4 DNA ligase | New England BioLabs Inc | M0202S | |
| Thermal Cycler | Bio-rad | 1861096 | |
| TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter Inc | 8043-30-1192 | Optima le-80k |
| Ultra centrifugal filter unit | MilliporeSigma | UFC510096 | |
| VECTASHIELD Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories, Inc | H-1200 |
References
- Makarova, K. S., Koonin, E. V. Annotation and Classification of CRISPR-Cas Systems. Methods Mol Biol. 1311, 47-75 (2015).
- Zetsche, B., et al. Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system. Cell. 163, 759-771 (2015).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339, 819-823 (2013).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339, 823-826 (2013).
- Lieber, M. R. The mechanism of double-strand DNA break repair by the nonhomologous DNA end-joining pathway. Annual review of biochemistry. 79, 181-211 (2010).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature protocols. 8, 2281-2308 (2013).
- Zhang, X., Wang, J., Cheng, Q., Zheng, X., Zhao, G. Multiplex gene regulation by CRISPR-ddCpf1. Cell discovery. 3, 17018 (2017).
- Zhang, X. H., Tee, L. Y., Wang, X. G., Huang, Q. S., Yang, S. H. Off-target Effects in CRISPR/Cas9-mediated Genome Engineering. Molecular therapy. Nucleic acids. 4, e264 (2015).
- Xu, L., et al. CRISPR-mediated genome editing restores dystrophin expression and function in mdx mice. Mol Ther. 24, 564-569 (2015).
- Long, C., et al. Postnatal genome editing partially restores dystrophin expression in a mouse model of muscular dystrophy. Science. 351, 400-403 (2016).
- Long, C. Z., et al. Prevention of muscular dystrophy in mice by CRISPR/Cas9-mediated editing of germline DNA. Science. 345, 1184-1188 (2014).
- Nelson, C. E., et al. In vivo genome editing improves muscle function in a mouse model of Duchenne muscular dystrophy. Science. 351, 403-407 (2016).
- Ousterout, D. G. K., Thakore, A. M., Majoros, P. I., Reddy, T. E. W. H., Gersbach, C. A. Multiplex CRISPR/Cas9-based genome editing for correction of dystrophin mutations that cause Duchenne muscular dystrophy. Nat Commun. 6, 6244 (2015).
- Tabebordbar, M., et al. In vivo gene editing in dystrophic mouse muscle and muscle stem cells. Science. 351, 407-411 (2016).
- Bengtsson, N. E., et al. Muscle-specific CRISPR/Cas9 dystrophin gene editing ameliorates pathophysiology in a mouse model for Duchenne muscular dystrophy. Nat Commun. 8, 14454 (2017).
- Hoffman, E. P., Brown, R. H., Kunkel, L. M. Dystrophin: the protein product of the Duchenne muscular dystrophy locus. Cell. 51, 919-928 (1987).
- Nowak, K. J., Davies, K. E. Duchenne muscular dystrophy and dystrophin: pathogenesis and opportunities for treatment. EMBO reports. 5, 872-876 (2004).
- Mendell, J. R., et al. Evidence-based path to newborn screening for Duchenne muscular dystrophy. Annals of neurology. 71, 304-313 (2012).
- Mendell, J. R., Lloyd-Puryear, M. Report of MDA muscle disease symposium on newborn screening for Duchenne muscular dystrophy. Muscle Nerve. 48, 21-26 (2013).
- Spurney, C. F. Cardiomyopathy of Duchenne muscular dystrophy: current understanding and future directions. Muscle Nerve. 44, 8-19 (2011).
- Moriuchi, T., Kagawa, N., Mukoyama, M., Hizawa, K. Autopsy analyses of the muscular dystrophies. Tokushima J Exp Med. 40, 83-93 (1993).
- McNally, E. M. New approaches in the therapy of cardiomyopathy in muscular dystrophy. Annual review of medicine. 58, 75-88 (2007).
- Baker, D. E. Approvals, Submission, and Important Labeling Changes for US Marketed Pharmaceuticals. Hosp Pharm. 52, 306-307 (2013).
- Baker, D. E. Eteplirsen. Hosp Pharm. 52, 302-305 (2017).
- Sicinski, P., et al. The molecular basis of muscular dystrophy in the mdx mouse: a point mutation. Science. 244, 1578-1580 (1989).
- Xu, L., et al. CRISPR-mediated Genome Editing Restores Dystrophin Expression and Function in mdx Mice. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 24, 564-569 (2016).
- El Refaey, M., et al. In Vivo Genome Editing Restores Dystrophin Expression and Cardiac Function in Dystrophic Mice. Circ Res. 121, 923-929 (2017).
- Tabebordbar, M., et al. In vivo gene editing in dystrophic mouse muscle and muscle stem cells. Science. 351, 407-411 (2016).
- Pozsgai, E. R., Griffin, D. A., Heller, K. N., Mendell, J. R., Rodino-Klapac, L. R. beta-Sarcoglycan gene transfer decreases fibrosis and restores force in LGMD2E mice. Gene therapy. 23, 57-66 (2016).
- Chicoine, L. G., et al. Plasmapheresis eliminates the negative impact of AAV antibodies on microdystrophin gene expression following vascular delivery. Mol Ther. 22, 338-347 (2014).
- Chicoine, L. G., et al. Vascular delivery of rAAVrh74.MCK.GALGT2 to the gastrocnemius muscle of the rhesus macaque stimulates the expression of dystrophin and laminin alpha2 surrogates. Mol Ther. 22, 713-724 (2014).
- Vouillot, L., Thelie, A., Pollet, N. Comparison of T7E1 and surveyor mismatch cleavage assays to detect mutations triggered by engineered nucleases. G3. 5, 407-415 (2015).
- Tsai, S. Q., et al. GUIDE-seq enables genome-wide profiling of off-target cleavage by CRISPR-Cas nucleases. Nat Biotechnol. 33, 187-197 (2015).
