Summary
Her vi gir en detaljert protokoll til å utføre i vivo cardiac genet redigering i mus ved hjelp av rekombinant Adeno-Associated Virus (rAAV)-mediert levering av CRISPR. Denne protokollen tilbyr en lovende terapeutiske strategi for å behandle dystrophic kardiomyopati i Duchenne muskeldystrofi og kan brukes til å generere hjerte-spesifikke knockout i postnatal mus.
Abstract
Gruppert, regelmessig interspaced, kort, palindromic gjenta (CRISPR) systemet har mye lettere genomet engineering i både kulturperler celler og levende organismer fra et bredt utvalg av arter. CRISPR teknologien har blitt utforsket som roman legemiddelselskap for en rekke menneskelige sykdommer. Proof-of-concept data er svært oppmuntrende som eksemplifisert ved studier som viser den gjennomførbarhet og effekten av genet redigering terapeutisk tilnærming for Duchenne muskeldystrofi (DMD) bruker en murine modell. Spesielt har intravenøs og intraperitoneal injeksjon av rekombinant adeno-assosiert virus (rAAV) serotype rh.74 (rAAVrh.74) aktivert effektiv cardiac levering av Staphylococcus aureus CRISPR-assosiert protein 9 (SaCas9) og to Guide RNAs (gRNA) for å slette en genomisk region med en mutant codon i ekson 23 av musen Dmd genet. Denne samme tilnærming kan også brukes til å slå ut den gen-av-begrave og studere deres hjertefunksjon i postnatal mus når gRNA er utformet for å målrette den gen-regionen av genet. I denne protokollen viser vi i detalj hvordan ingeniør rAAVrh.74 CRISPR vektor og oppnå svært effektiv cardiac levering i neonatal mus.
Introduction
Gruppert, regelmessig interspaced, korte palindromic gjenta (CRISPR) teknologien representerer det nyeste fremskrittet i genomet engineering og har revolusjonert dagens praksis med genetikk i celler og organismer. CRISPR-baserte genomet redigering benytter en enkelt hjelpelinje RNA (gRNA) slik at en CRISPR-assosiert endonuclease som CRISPR-assosiert protein 9 (Cas9) og Cpf1 til et genomisk DNA-mål som er komplementære i rekkefølge til protospacer kodet av gRNA med en bestemt protospacer tilstøtende motiv (PAM)1,2. PAM varierer avhengig av bakteriell artene av Cas9 eller Cpf1 genet. Den mest brukte Cas9 nuclease avledet fra Streptococcus pyogenes (SpCas9) gjenkjenner en PAM sekvens av NGG som finnes direkte nedstrøms mål sekvensen i genomisk DNA, på den ikke-mål stranden. På målområdet generere Cas9 og Cpf1 proteiner en dobbel-strand pause (DSB), som deretter repareres via iboende cellulære DNA reparasjon mekanismer inkludert ikke-homologe slutten med (NHEJ) og homologi-rettet reparasjon (HDR) veier3, 4. I fravær av en DNA mal for homologe rekombinasjon, er DSB primært reparert av feilutsatte NHEJ veien, som kan resultere i innsettinger eller slettinger (indeler) av nukleotider forårsaker frameshift mutasjoner hvis DSB ble opprettet i koding regionen et gen5,6. Dermed har CRISPR systemet vært mye brukt til ingeniør tap-av-funksjon mutasjoner i ulike mobilnettet modeller og hele organismer, for å undersøke funksjonen av et gen. Videre katalytisk inaktive Cas9 og Cpf1 har blitt utviklet til transcriptionally og modulerer epigenetically uttrykk for målet gener7,8.
Flere nylig, både SpCas9 og SaCas9 (avledet fra Staphylococcus aureus) har blitt pakket i rekombinant adeno-assosiert virus (rAAV) vektorer for postnatal genet korreksjon i dyr modell av menneskelige sykdommer, særlig Duchenne muskeldystrofi (DMD)9,10,11,12,13,14,15. DMD er en dødelig X-tilknyttet recessiv sykdom forårsaket av mutasjoner i genet DMD , som koder dystrophin proteiner16,17, påvirker ca ett i 3500 mann fødsler ifølge nyfødt screening18 , 19. det er preget av progressiv muskelsvakhet og sløse. DMD pasienter mister vanligvis evnen til å gå mellom 10 og 12 år og dø av luftveiene og/eller hjerte svikt av 20-30 årene20år. Spesielt kardiomyopati utvikler i > 90% av DMD pasienter og representerer ledende årsak til død i DMD pasienter21,22. Selv om Deflazacort (en anti-betennelse stoff) og Eteplirsen (en ekson hoppe medisin for hoppe ekson 51) har nylig godkjent for DMD av Food and Drug Administration (FDA)23,24, ingen av disse behandlingene korrigere den genetisk defekten på genomisk DNA-nivå. Mdx musen, som bærer en punkt mutasjon på ekson 23 av dystrophin genet, har vært mye brukt som en DMD modell25. Videre har vi tidligere viste at funksjonelle dystrophin uttrykket ble restaurert av-ramme sletting av genomisk DNA dekker exons 21, 22 og 23 i skjelettmuskulatur mdx mus ved hjelp av intramuscular Ad-SpCas9/gRNA levering9 , og i hjertet muskler mdx/utrophin+ /- mus ved hjelp av intravenøs og intraperitoneal rAAVrh.74-SaCas9/gRNA levering26.
I denne protokollen beskrive vi i detalj alle trinn i postnatal cardiac genet redigering for å gjenopprette dystrophin i mdx/utrophin+ /- mus ved hjelp av rAAVrh.74-SaCas9/gRNA vektorer, fra gRNA design dystrophin analyser i delene hjertet muskel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dyrene i denne protokollen ble opprettholdt på The Ohio State University laboratorium dyr ressurser dyr bruk retningslinjer. Alle dyrestudier ble godkjent av institusjonelle Animal Care, bruk og gjennomgangen komiteen ved Ohio State University.
1. design og kloning av gRNAs inn CRISPR vektor
- Velg 2 gRNAs målretting dystrophin intron 20 og intron 23 (i20 og i23) for SaCas9: i20: 5-GGGCGTTGAAATTCTCATTAC CAGAGT og i23: 5-CACCGATGAGAGGGAAAGGTC CTGAAT (PAM sekvensen er understreket og kursiv).
Merk: Målområdene for i20 og i23 er ca 23 kilo base par (kbp) unna. Hvis du vil avbryte en koding genet, to gRNAs rettet mot de vanlige exons med NNGRRT-PAM sekvens for SaCas9 (fortrinnsvis NNGAAT, NNGGGT og NNGAGT) og avstand i 20 kbp anbefales. - Bruk følgende PCR parametere for å anneal gRNA oligos (100 µmol/L) i 1 x annealing buffer (5 x annealing reservelager inneholder 0,5 mol/L K-acetate, 150 mmol/L HEPES-KOH, 10 mmol/L Mg-acetate, pH7.4): 95 ° C 10 min, 90 sykluser av 95 til 59 ° C med 0,4 ° C redusere syklus for 20 s, 90 sykluser av 59 til 32 ° C med en 0,3 ° C reduksjon per syklus for 20 s, 20 sykluser av 32 til 26 ° C med en 0,3 ° C reduksjon per syklus for 20 s.
- Ligate glødet gRNA oligos inn i pX601-CMV-SaCas9-mPA-U6-gRNA med BsaI og T4 DNA ligase en reaksjon (1 µL 50 ng/µL pX601-CMV-SaCas9-mPA-U6-gRNA, 1 µL herdet oligos, 1,5 µL 10 x T4 DNA ligase buffer, 0,5 µL T4 DNA ligase, 1 µL BsaI, 10 µL ddH2O ), med følgende reaksjon betingelse i et PCR cycler: 5 sykluser av [37 ° C 5 min og 16 ° C 10 min]; 37 ° C 20 min; 80 ° C 5 min.
- Forvandle 15 µL ligation produktet i 30 µL kompetent celler, plate cellene i agar plate med 100 µg/mL Ampicillin og kultur ved 37 ° C i 24 timer.
- Plukk opp 5-10 kolonier og kultur i LB medium som inneholder 100 µg/mL Ampicillin ved 37 ° C, 250 rpm i en shaker inkubator for 3-4 h.
- Skjermen koloniene av PCR: 10 µL 2 x PCR master mix, 8 µL ddH2O, 1 µL E. Coli kultur, 1 µL 10 µmol/L U6 fram primer, 1 µL i20 eller i23 gRNA omvendt primer. Parameterne for PCR-sykling: 95 ° C 5 min, 35 sykluser av 95 ° C 30 s, 61 ° C 30 s, 72 ° C 30 s.
- Forberede 5 mL kultur positiv kloner av legge 4 mL frisk LB middels containing100 µg/mL Ampicillin, og kultur overnatting på 37 ° C, 250 rpm.
- Rense plasmider DNA ved hjelp av riktig plasmider utvinning kit, og kontroller plasmider av Sanger sekvensering med U6 fram primer.
- Kultur C2C12 celler i DMEM med 10% FBS og 1% penn-Strep fram ~ 70% confluency for å teste genet redigering effekten av plasmider.
- Electroporate totalt 5 µg SaCas9/gRNA plasmider blandingen i molar forholdet 1:1 til 1 x 106 C2C12 celler i henhold til produsentens protokollen.
- Etter 48 timer etter transfection, høste C2C12 cellene og ekstra genomisk DNA.
- Bruk 100 ng genomisk DNA som mal å utføre PCR reaksjonen for mus dystrophin locus: videresende primer 5'-GGCCAAAGCAAACTCTGGTA (1 µL 10 µmol/L), snu primer 5'-TTTAATCCCACGTCATGCAA (1 µL 10 µmol/L), 10 µL 2 x den grønne PCR master mix, 7 µL ddH2O, 1 µL genomisk DNA ( 100 ng). Bruker PCR sykling forhold som 95 ° C 5 min, 35 sykluser av [95 ° C 30 s, 61 ° C 30 s, 72 ° C 30 s], 72 ° C 2 min.
2. rAAV produksjon
- For å kultur cellene, frø AD293 celler på 20 til 40 15 cm retter og vedlikeholde i DMEM med 10% FBS og 1% penn-Strep fram ~ 90% confluency for hva.
- Fortynne 3 plasmider med 200 µL redusert serum medium (per fat): 1) 10 µg pHelper; 2) 5 µg pXR (rh.74 eller andre serotyper) og 3) totalt 5 µg av pX601-i20 og pX601-i23 blanding (1:1 ratio). Utføre polyethylenimine (PEI) hva ved å blande med 80 µL PEI og ruge ved romtemperatur for 10 min. Legg blandingen på cellekulturer AD293 på en dropwise måte.
- For AAV virus produksjon, etter 72 h innlegget transfection, bruker du cellen skraper for å samle både media og AD293 celle pellets med sentrifugering 1100 x g i 10 minutter.
- Resuspend celle pellets i 15 mL rAAV lyseringsbuffer (50 mmol/L Tris Base, 150 mmol/L NaCl, pH 8.5) etterfulgt av 3 fryse-Tin sykluser med vekslende inkubasjon i flytende nitrogen og en 42 ° C vannbad. Lagre celle lysates i-80 ° C for fremtidige behandling hvis de ikke blir behandlet umiddelbart.
- Filtrere kultur media med filtere 0.45-µm og legge til en 40% PEG8000 i 2,5 mol/L NaCl en siste konsentrasjon av 8%. Inkuber blandingen ved 4 ° C i 1 time og sentrifuger 1100 x g i 15 min.
- Resuspend pellets i rAAV lyseringsbuffer og kombinere med cellen lysates fra trinn 2.3, etterfulgt av benzonase (50 U/mL) behandling på 37 ° C i 1 time.
- Sentrifuge benzonase-behandlet rAAV som inneholder blanding 1100 x g i 15 min på 4 ° C, og lagre nedbryting (rå rAAV utarbeidelse).
3. rAAV rensing og konsentrasjon
- Last råolje rAAV forberedelse på en iodixanol gradert i et ultracentrifuge rør i følgende rekkefølge fra toppen til bunnen: råolje AAV lysate (~ 15 mL), 8 mL 15% Iodixanol, 6 mL 25% Iodixanol, 5 mL 40% Iodixanol, 5 mL 58% Iodixanol. Fyll gjenværende tomme volumet av røret til Bakkanosi 1 x DPBS.
- Sentrifuge prøvene 230.000 x g i en ultracentrifuge rotoren for 120 min på 10 ° C og samle 3-4 mL av 40% gradient brøken inneholder rAAV partikler med en 18 G nål.
- Fortynn rAAV partikler med 1 x DPBS og sentrifuger ved hjelp av sentrifugal filter enhet (MWCO 100 kDa). Gjenta dette trinnet for 3 - 5 ganger og endelig konsentrere rAAV forberedelse til 300-500 µL.
4. rAAV Titering
- Ekstra genomisk DNA fra 2 µL konsentrert rAAV, bunnfall med 3 M NaOAc i etanol og resuspend i 20 µL ddH2O.
- Få standardkurven for rAAV kvantifisering av føljetong fortynning av pX601 plasmider: 1 x 109, 1 x 108,1 x 107, 1 x 106, 1 x 105 eksemplarer i hver 10 µL ddH2O. Dilute DNAase-behandlet rAAV prøver som 1:10, 1:50, 1: 100, og 1:1000.
- Bestemme rAAV titer av kvantitative sanntid PCR (qPCR) bruker qPCR Kit i henhold til produsentens instruksjoner i en Real-Time PCR-system: 1 µL 10 µmol/L av hver primer (5-GGATTTCCAAGTCTCCACCC og 5-TCCCACCGT ACACGCCTAC), 5 µL 2 x PCR master mix, 1 µL fortynnet rAAV prøver og 2 µL ddH2O. kjøre reaksjonen med følgende sykling parametere: 95 ° C 3 minutter, 45 sykluser av [95 ° C 5 sek og 61 ° C 20 sek].
5. intravenøs og Intraperitoneal injeksjon av rAAVrh.74-CRISPR i Neonatal mdx/utrophin+ /- mus
- Nakkens mdx/utrophin+ / mus valpene (dag 3) ved å plassere på is 1 min, og deretter administrere med 1 x 1012 virus partikler i 50 µL per musen systemisk via en retro-orbital tilnærming eller en intraperitoneal injeksjon.
- Tillate at mus til å gjenopprette og plassere tilbake i burene sine hjem. På ti uker etter rAAV administrasjon, euthanize musene av CO2 eksponering for vev samling.
- Snapin-fryse vev for genomisk DNA og RNA utvinning, og bruk kjøling isopentane i flytende nitrogen å fryse vev med optimal kutte temperatur sammensatte for og kryosnitt.
6. analyse av målet Gene redigering resultater
-
Genomic DNA PCR-analyse
- Isolere totalen genomisk DNA fra hjertet vev av mdx/utrophin+ / mus behandlet med eller uten rAAV.
- Bruke samme protokoll i trinn 1,12 for PCR analyse.
-
RT PCR analyse av dystrophin uttrykk
- Trekke ut totalt RNA fra hjertet vev med RNA utvinning kit etter produsentens håndbok.
- Utføre omvendt transkripsjon, pre-spandere den totale RNA med en RNase-fri DNase og bruker 5 µg av behandlet som mal for første-strand cDNA syntese med omvendt transkripsjon kit.
- Bruke omvendt transkripsjon produktet for RT PCR analyse av dystrophin uttrykk med dystrophin cDNA primer: 5-GGCTAGAGTATCAAACCAACATCAT og 5-TGGAGGCTTACGGTTTTATCC.
-
Beregne genet redigering effekt av qPCR analyse
- Beregne genet redigering effekt av kvantitative RT PCR å oppdage reduksjon av ekson 22 inneholder transkripsjoner bruker frem primer (ekson 21): 5-TTGTCAGCTCTTCAGCCTCAAA og omvendt primer (ekson 23): 5-AAACTCTCCTTCACAGTGTCACT. Bruke Gapdh som en referanse genet med fremover primer: 5-AGGTTGTCTCCTGCGACTTC og omvendt primer: 5-GGTGGTCCAGGGTTTCTTACT.
- Kjøre den kvantitative sanntid PCR (qPCR) bruker qPCR Kit i henhold til produsentens instruksjoner i en Real-Time PCR-systemet og 2-trinns reaksjonen forhold: 95 ° C 3 minutter, 45 sykluser av 95 ° C 5 sek og 61 ° C 30 sek.
-
Immunofluorescence flekk for å analysere dystrophin uttrykk
- Kuttet frosne vev med en kryostaten på tykkelse på 10 µm. fastsette de frosne snitt med 4% paraformaldehyde i romtemperatur i 15 min.
- Vask 2 x med PBS og ruge med blokkering løsning (10% hest serum) 1t.
- Inkuber anti-dystrophin primære antistoffer, på 4 ° C over natten.
- Vask lysbildene med PBS 3 x 5 min og Inkuber med fluorescerende sekundære antistoffer (1:500) i romtemperatur 1t.
- Montere lysbildene bruker montering mediet med DAPI og tenkelig med en invertert AC confocal mikroskop.
7. off-målet analyse av T7E1 analyse
- Forutsi den potensielle off-mål områder som bruker den online CRISPR design verktøy som < http://crispr.mit.edu>.
- Forsterke genomisk regionene som dekker toppen 5-10 potensielle off-målet områder av PCR: genomisk DNA 200 ng, 1 µL Hi-Fi-DNA polymerase, 5 µL 10 x PCR Buffer blanding, 1,5 µL 10 µmol/L områdespesifikke forover og bakover grunning, justere det totale volumet til 50 µL med ddH2O.
- Kjører PCR-produkter av geleelektroforese, ekstra og rense bruker en gel utvinning kit. Måle konsentrasjonen bruker Spektrofotometrene.
- Fremme heteroduplex dannelsen av denaturing og re annealing renset amplicons sakte i Buffer 2.1 bruker en PCR cycler. Bruk samme sykling vilkår som beskrevet i trinn 1.2.
- Fordøye re glødet produktene i 30 min på 37 ° C med 0,5 µL T7E1 enzym og analysere reaksjonen av geleelektroforese med 1-2% agarose gel.
Merk: I amplicons kan også analyseres av målrettet dyp sekvensering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Effekten av gRNAs å indusere sletting av målregion genomisk DNA bør vurderes i cellekulturer før emballasje i rAAV for i vivo studier. Dette gRNAs og SaCas9-uttrykke konstruksjoner var electroporated i C2C12 celler og genomisk DNA ble analysert av PCR med primerne flankert målområder (figur 1). Et PCR produkt av ~ 500 bp indikerer vellykket sletting av målet genomisk DNA fra gene redigering mens kontroll cellene ikke bør gi et band på grunn av den store størrelsen av genomisk DNA.
Etter effekten av gRNAs har blitt bekreftet i cellekulturer, kan de være pakket inn i rAAVrh.74 eller andre serotyper (som AAV6, 8 eller 9, alle viser robust cardiac gen levering) ved hjelp av tre plasmider co transfection i AAV293 celler. Vi fant at det er ikke nødvendig å gjøre to individuelle rAAV forberedelse for de to gRNAs, i stedet vi blandet de to gRNA konstruksjoner i en lik molar forhold og produsert en enkelt rAAV forberedelse. RAAV virus partikler var renset med tetthet gradert ultracentrifugation og renheten ble analysert av SDS-side. Høyrenset rAAV utarbeidelse ville gi tre band tilsvarer kapsid proteiner VP1, VP2 og VP3, henholdsvis på SDS-side som vist i figur 2.
De renset rAAVrh.74 virus partiklene ble injisert i dag 1-3 nyfødte mdx/utrophin+ / mus via retro-orbital eller intraperitoneal injeksjon. Vi fant begge metodene fungerte bra for hjerte levering av rAAVrh.74-CRISPR. Injisert mus kan bli analysert for dystrophin uttrykk av immunofluorescence flekker (Figur 3) for 10 ukens av alderen.
Figur 1: validering av gRNAs for SaCas9-mediert genet redigering i C2C12 celler. Representant agarose gel geleelektroforese viste PCR produkter av genomisk DNA utdraget fra electroporated C2C12 med eller uten SaCas9/gRNAs. Pilen viser PCR produktet resulterte fra gene redigering. Gapdh var en referanse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: analyse av rAAVrh.74 partikler av SDS side. Renset rAAVrh.74 virus partikler kjøre på SDS side viste tre band, tilsvarer tre kapsid proteiner av AAV, VP1 (87 kDa), VP2 (72 kDa) og VP3 (62 kDa), henholdsvis. Tilstedeværelsen av bare disse 3 band indikerer høy renhet av rAAV utarbeidelse uten forurensende andre cellulære proteiner. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Immunofluorescence farging av hjertet fra mdx/utrophin+ /- mus på 10 ukene etter AAV-SaCas9/gRNAs behandling. Representant immunofluorescence bildene viste uttrykk for dystrophin (rød) og caveolin-3 (grønn) i delene hjertet av WT, mdx/utrophin+ /- og mdx/utrophin+ / mus behandlet med 1 x 1012 vg AAV-SaCas9/gRNA systematisk. DAPI ble brukt til å merke kjerner (blå). Skala bar: 100 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne protokollen detalj vi alle trinnene som er nødvendig for å oppnå i vivo cardiac genet redigering i postnatal mus ved hjelp av rAAVrh.74-mediert levering av SaCas9 og to gRNAs. Som tidligere nevnt, denne tilnærmingen kan brukes til å gjenopprette dystrophin uttrykk i dystrophic mus som beskrevet i våre arbeid27, men det kan også aktivere rask omvendt genetikk studier av hjerte-relaterte gener i mus uten den omstendelige prosessen med den tradisjonelle knockout tilnærming til å generere og rase knockout musen modeller.
For å oppnå høy genet redigering effektivitet i vevet, det er flere viktige trinn Husk: 1) effekten av SaCas9/gRNA å indusere sletting av målrettet genomisk DNA må godkjennes ved hjelp av aktuelle cellelinjer; 2) er det svært viktig å velge en riktig AAV serotype som kan megle høy genet signaltransduksjon inn i vevet og 3) bestemme optimal levering ruten AAV vektorer for genoverføring til ønsket vev.
I gjeldende protokollen, designet SaCas9/gRNAs ble pakket inn i AAVrh.74 snarere enn tidligere rapportert AAV8 og AAV9 til å redigere Dmd genet12,28. AAVrh.74 utstillinger 93% homologi AAV829 og har vist seg for å være ikke-patogene og effektivt i transducing Skjelettmuskel følgende isolert lemmer levering29,30,31. I denne protokollen bruker vi retro-orbital og intraperitoneal injeksjon av rh.74 i neonatal mus for cardiac genoverføring. Vi fant at neonate administrasjonen av rAAVrh.74 er svært effektiv for restaurering av dystrophin uttrykk i ca 30-40% av cardiomyocytes i mus mottar en høy dose av rAAVrh.74 (1 x 1012 vg). Interessant, fant vi at skjelettlidelser muskel dystrophin uttrykket ikke ble effektivt reddet. Det skyldes sannsyligvis ved lav Skjelettmuskel tropism av rh.74 serotype når det gis via intravenøse eller intraperitoneal injeksjon, selv om tidligere studier viste at isolert lem levering av rAAVrh.74 kan effektivt transduce musen og monkey skjelett muskel29,30,31. Også når rAAVrh.74 ble gitt til voksne mus, observerte vi svært lav effektivitet i å gjenopprette dystrophin uttrykk. Det ville være interessant å bestemme minste dosen som kreves for å oppnå den høyeste dystrophin redningen. Videre kan andre serotyper og leveringsmåter være testet og sammenliknet for å oppnå optimal cardiac genet redigering.
Vellykket sletting av et stort genomisk DNA stykke krever samtidige levering av to gRNAs. Vi fant det ikke er nødvendig å gjøre to separate rAAV forberedelser for å levere to gRNAs. I denne protokollen, vi bare blandet to gRNA plasmider i like mye under hva for rAAV produksjon og denne kombinerte produksjonen av rAAV ble funnet for å være effektive i å levere begge gRNAs. Dette kombinert tilnærming er derfor kostnader - og arbeidsbesparende og anbefales når samtidige levering av to gRNAs kreves.
I mange tilfeller kan det være nødvendig å analysere genet redigering effektiviteten av genetisk tilnærminger når en fint antistoffet ikke er tilgjengelig for målet gene produktet. Men er det teknisk utfordrende å tallfeste nøyaktig genet redigering effekt med to gRNAs målretting samme locus siden genet redigering produktene inkluderer målet sekvens sletting, målet sekvens inversjon og små indeler på bare ett mål området. I stedet er det mer meningsfylt og mulig å måle effektiviteten av ønsket målrettet rekkefølge sletting som i vårt tilfelle hvor reduksjon av utskrifter som inneholder exons 21-23 kan kvantifiseres av sanntids RT PCR.
I denne protokollen beskriver vi også bruk av T7E1 analysen og beregningsorientert prediksjon å analysere potensielle off-målet aktiviteten. For analysen å fungere godt, er det nødvendig å bruke en høy kvalitet DNA polymerase. Også, det er alltid lurt å forberede for en negativ kontroll eksperiment (f.eks DNA produkter forsterket fra celler/vev uten genet redigering og behandlet på samme måte som testprøvene) og en positiv kontroll eksperiment (f.eks et kjent eksempel med godt karakterisert genet redigering). Det er imidlertid merke at oppdagelsen grensen på T7E1 analysen er om 5%32, og dermed det ikke kan være synlig ved T7E1 analysen hvis off-målet aktiviteten er under 5%. GUIDE-seq33 kan brukes til å analysere unbiasedly off-målet aktiviteten SaCas9/gRNA-mediert genet redigering. De identifiserte off-mål nettstedene fra T7E1 analysen, beregningsorientert prediksjon og/eller GUIDE-seq tilnærminger kan videre kvantifiseres for indel frekvenser etter i vivo genet redigering av høy gjennomstrømming sekvensering.
Sammen har vi gitt en optimalisert cardiac genet redigering tilnærming ved hjelp av rAAVrh.74. Denne etablert protokoll kan videre testes for terapeutiske programmer og omvendt genetiske studier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Det finnes ingen interessekonflikt.
Acknowledgments
R.H. støttes av amerikanske National Institutes of Health tilskudd (R01HL116546 og R01 AR064241).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 555 goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | A-21428 | |
| Benzonase Nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | |
| Bio Safety Cabinets | Thermo Fisher Scientific | 1347 | 1300 Series A2 Class II, Type A2 |
| BsaI | New England BioLabs Inc | RO535S | |
| Competent cells | Agilent Technologies | 200314 | |
| Cell culture dishes, 150mm | Nest Scientific USA | 715001 | |
| Cryostat | Leica Biosystems | Leica CM3050S | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | MT10017CV | Corning cellgro |
| Dystrophin antibody | Spring Bioscience | E2660 | |
| Fast-Ion Midi Plasmdi Kits | IBI Scientific | IB47111 | |
| FBS | Thermo Fisher Scientific | 26-140-079 | |
| Filter Unit, 0.45μm | Thermo Fisher Scientific | 166-0045 | |
| GoTaq Master Mixes | Promega | M7122 | |
| High-speed plasmid mini kit | IBI Scientific | IB47102 | |
| Horse serum | Abcam | ab139501 | |
| Isotemp 2239 Water Bath | Thermo Fisher Scientific | 15-460-11Q | |
| Isotemp Heat Block | Thermo Fisher Scientific | 11-718 | |
| Inverted confocal microscope | Carl Zeiss Microscopy, LLC | LSM 780 | |
| LightCycler 480 instrument | Roche | 5015243001 | LightCycler 480 Instrument II |
| Large Capacity Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 46-910 | Thermo Scientific Sorvall RC 6 Plus |
| Microcentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75002445 | Sorvall Legend Micro 21R |
| Nanodrop spectrophotometers | Thermo Scientific | ND2000CLAPTOP | NanoDrop™ 2000/2000c |
| Oligos for i20-F | Integrated DNA Technologies | CACCgGGCGT TGAAATTCTCATTAC |
|
| Oligos for i20-R | Integrated DNA Technologies | AAAC GTAATGAGAATTTCAACGCCc; | |
| Oligos for i23-F | Integrated DNA Technologies | CACCgCACCGATGAGAGGG AAAGGTC |
|
| Oligos for i23-R | Integrated DNA Technologies | GACCTTTCCCTCTCATCGGTGc | |
| Oligos | Integrated DNA Technologies | ||
| OptiPrep Density Gradient Medium | Sigma-Aldrich | D1556-250ML | |
| OptiMEM | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
| PEG8000 | Sigma-Aldrich | 89510-1kg-F | |
| Polyethylenimine | Polysciences | 23966 | |
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | P2308 | |
| Quick-Seal centrifuge tube | Beckman Coulter Inc | 342414 | |
| QIAquick Gel Extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| Radiant SYBR Green Hi-ROX qPCR Kits | Alkali Scientific | QS2005 | |
| RevertAid RT Reverse Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific | K1691 | |
| Rotor | Beckman Coulter Inc | 337922 | Type 70Ti |
| T4 DNA ligase | New England BioLabs Inc | M0202S | |
| Thermal Cycler | Bio-rad | 1861096 | |
| TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter Inc | 8043-30-1192 | Optima le-80k |
| Ultra centrifugal filter unit | MilliporeSigma | UFC510096 | |
| VECTASHIELD Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories, Inc | H-1200 |
References
- Makarova, K. S., Koonin, E. V. Annotation and Classification of CRISPR-Cas Systems. Methods Mol Biol. 1311, 47-75 (2015).
- Zetsche, B., et al. Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system. Cell. 163, 759-771 (2015).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339, 819-823 (2013).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339, 823-826 (2013).
- Lieber, M. R. The mechanism of double-strand DNA break repair by the nonhomologous DNA end-joining pathway. Annual review of biochemistry. 79, 181-211 (2010).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature protocols. 8, 2281-2308 (2013).
- Zhang, X., Wang, J., Cheng, Q., Zheng, X., Zhao, G. Multiplex gene regulation by CRISPR-ddCpf1. Cell discovery. 3, 17018 (2017).
- Zhang, X. H., Tee, L. Y., Wang, X. G., Huang, Q. S., Yang, S. H. Off-target Effects in CRISPR/Cas9-mediated Genome Engineering. Molecular therapy. Nucleic acids. 4, e264 (2015).
- Xu, L., et al. CRISPR-mediated genome editing restores dystrophin expression and function in mdx mice. Mol Ther. 24, 564-569 (2015).
- Long, C., et al. Postnatal genome editing partially restores dystrophin expression in a mouse model of muscular dystrophy. Science. 351, 400-403 (2016).
- Long, C. Z., et al. Prevention of muscular dystrophy in mice by CRISPR/Cas9-mediated editing of germline DNA. Science. 345, 1184-1188 (2014).
- Nelson, C. E., et al. In vivo genome editing improves muscle function in a mouse model of Duchenne muscular dystrophy. Science. 351, 403-407 (2016).
- Ousterout, D. G. K., Thakore, A. M., Majoros, P. I., Reddy, T. E. W. H., Gersbach, C. A. Multiplex CRISPR/Cas9-based genome editing for correction of dystrophin mutations that cause Duchenne muscular dystrophy. Nat Commun. 6, 6244 (2015).
- Tabebordbar, M., et al. In vivo gene editing in dystrophic mouse muscle and muscle stem cells. Science. 351, 407-411 (2016).
- Bengtsson, N. E., et al. Muscle-specific CRISPR/Cas9 dystrophin gene editing ameliorates pathophysiology in a mouse model for Duchenne muscular dystrophy. Nat Commun. 8, 14454 (2017).
- Hoffman, E. P., Brown, R. H., Kunkel, L. M. Dystrophin: the protein product of the Duchenne muscular dystrophy locus. Cell. 51, 919-928 (1987).
- Nowak, K. J., Davies, K. E. Duchenne muscular dystrophy and dystrophin: pathogenesis and opportunities for treatment. EMBO reports. 5, 872-876 (2004).
- Mendell, J. R., et al. Evidence-based path to newborn screening for Duchenne muscular dystrophy. Annals of neurology. 71, 304-313 (2012).
- Mendell, J. R., Lloyd-Puryear, M. Report of MDA muscle disease symposium on newborn screening for Duchenne muscular dystrophy. Muscle Nerve. 48, 21-26 (2013).
- Spurney, C. F. Cardiomyopathy of Duchenne muscular dystrophy: current understanding and future directions. Muscle Nerve. 44, 8-19 (2011).
- Moriuchi, T., Kagawa, N., Mukoyama, M., Hizawa, K. Autopsy analyses of the muscular dystrophies. Tokushima J Exp Med. 40, 83-93 (1993).
- McNally, E. M. New approaches in the therapy of cardiomyopathy in muscular dystrophy. Annual review of medicine. 58, 75-88 (2007).
- Baker, D. E. Approvals, Submission, and Important Labeling Changes for US Marketed Pharmaceuticals. Hosp Pharm. 52, 306-307 (2013).
- Baker, D. E. Eteplirsen. Hosp Pharm. 52, 302-305 (2017).
- Sicinski, P., et al. The molecular basis of muscular dystrophy in the mdx mouse: a point mutation. Science. 244, 1578-1580 (1989).
- Xu, L., et al. CRISPR-mediated Genome Editing Restores Dystrophin Expression and Function in mdx Mice. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 24, 564-569 (2016).
- El Refaey, M., et al. In Vivo Genome Editing Restores Dystrophin Expression and Cardiac Function in Dystrophic Mice. Circ Res. 121, 923-929 (2017).
- Tabebordbar, M., et al. In vivo gene editing in dystrophic mouse muscle and muscle stem cells. Science. 351, 407-411 (2016).
- Pozsgai, E. R., Griffin, D. A., Heller, K. N., Mendell, J. R., Rodino-Klapac, L. R. beta-Sarcoglycan gene transfer decreases fibrosis and restores force in LGMD2E mice. Gene therapy. 23, 57-66 (2016).
- Chicoine, L. G., et al. Plasmapheresis eliminates the negative impact of AAV antibodies on microdystrophin gene expression following vascular delivery. Mol Ther. 22, 338-347 (2014).
- Chicoine, L. G., et al. Vascular delivery of rAAVrh74.MCK.GALGT2 to the gastrocnemius muscle of the rhesus macaque stimulates the expression of dystrophin and laminin alpha2 surrogates. Mol Ther. 22, 713-724 (2014).
- Vouillot, L., Thelie, A., Pollet, N. Comparison of T7E1 and surveyor mismatch cleavage assays to detect mutations triggered by engineered nucleases. G3. 5, 407-415 (2015).
- Tsai, S. Q., et al. GUIDE-seq enables genome-wide profiling of off-target cleavage by CRISPR-Cas nucleases. Nat Biotechnol. 33, 187-197 (2015).
