Summary
هنا نقدم بروتوكول مفصلة للقيام في فيفو تحرير القلب الجينات في الفئران استخدام المؤتلف "أدينواسوسياتيد الفيروس" (راف)-بوساطة تسليم كريسبر. هذا البروتوكول يوفر استراتيجية علاجية واعدة لعلاج اعتلال عضلة القلب تندب في ضمور العضلات دوشين، ويمكن استخدامها لتوليد الدفع الخاصة بالقلب في الفئران بعد الولادة.
Abstract
النظام (كريسبر) تكرار متفاوت المسافات، إينتيرسباسيد بانتظام، وباختصار، المتناوب سهلت إلى حد كبير هندسة الجينوم في استزراع الخلايا والكائنات الحية من مجموعة متنوعة واسعة من الأنواع. كما تم استكشاف التكنولوجيا كريسبر كعلاجات جديدة لعدد من الأمراض التي تصيب الإنسان. بيانات إثبات المفهوم مشجعة جداً كما يتضح من الدراسات التي أجريت مؤخرا أن البرهنة على جدوى وفعالية النهج العلاجي القائم على تحرير الجينات لضمور العضلات دوشين (DMD) باستخدام نموذج مورين. على وجه الخصوص، قد مكن rh.74 النمط المصلي المسيطر المؤتلف الفيروسات المرتبطة بالغدة (راف) (rAAVrh.74) بالحقن الوريدي وداخل كفاءة تقديم القلب المكوّرات العنقودية الذهبية المرتبطة كريسبر البروتين 9 (SaCas9) واثنان دليل الكشف (جرنة) حذف منطقة الجينوم مع كودون المسخ في إكسون 23 جينات Dmd الماوس. يمكن أيضا استخدام هذا النهج نفسه لضرب الجينات من الاهتمام والدراسة وظيفة القلب في الفئران بعد الولادة عند جرنة صمم لاستهداف منطقة ترميز الجينات. في هذا البروتوكول، نعرض بالتفصيل كيفية هندسة المتجهات كريسبر rAAVrh.74 وكيفية تحقيق كفاءة عالية تسليم القلب في الفئران حديثي الولادة.
Introduction
متفاوت المسافات، إينتيرسباسيد بانتظام، قصيرة المتناوب تكرار (كريسبر) التكنولوجيا يمثل تقدما آخر في هندسة الجينوم وقد أحدثت ثورة في الممارسة الحالية لعلم الوراثة في الخلايا والكائنات الحية. التحرير على أساس كريسبر الجينوم يستخدم دليل واحد الحمض النووي الريبي (جرنة) لتوجيه endonuclease كريسبر المرتبطة مثل البروتينات المرتبطة كريسبر 9 (Cas9)، و Cpf1 إلى هدف الحمض النووي جينومي مكملة في التسلسل بروتوسباسير المشفرة بواسطة جرنة مع بروتوسباسير محددة عزر المتاخمة (بام)1،2. بام يختلف حسب الأنواع البكتيرية من الجينات Cas9 أو Cpf1. تسلم نوكلياسي Cas9 الأكثر استخداماً المستمدة من العقدية المقيّحة (SpCas9) تسلسل بام نج التي وجدت في المصب مباشرة من تسلسل الهدف في الحمض النووي، في ستراند غير المستهدفة. توليد بروتينات Cas9 و Cpf1 في الموقع المستهدف، وفاصل مزدوج-ستراند (جهاز تسوية المنازعات)، الذي يتم إصلاحه ثم عبر الجوهرية آليات إصلاح الحمض الخلوي بما في ذلك الانضمام إلى نهاية غير المتجانسة (نهيج) و مسارات الإصلاح الموجه من التماثل (HDR)3، 4. نظراً لغياب قالب الحمض النووي جزئ مثلى، جهاز تسوية المنازعات هو أساسا إصلاحه من قبل مسار نج عرضه للأخطاء، مما يمكن أن يسفر عن عمليات الإدراج أو الحذف (إينديلس) من النيوكليوتيدات التي تسبب الطفرات فراميشيفت إذا تم إنشاء هيئة تسوية المنازعات في الترميز المنطقة من5،الجينات6. وبالتالي، النظام كريسبر قد استخدمت على نطاق واسع مهندس الطفرات الخسارة من الدالة في مختلف النماذج الخلوية والكائنات الحية كلها، من أجل التحقيق في وظيفة الجينات. وعلاوة على ذلك، حفازة نشطة Cas9 و Cpf1 قد وضعت على ترانسكريبتيونالي وتعدل ابيجينيتيكالي التعبير عن الجينات الهدف7،8.
في الآونة الأخيرة، حزم SpCas9 و SaCas9 (مشتقة من المكوّرات العنقودية الذهبية) إلى نواقل الفيروسات المرتبطة بالغدة المؤتلف (راف) لتصحيح الجينات بعد الولادة في نموذج الحيوان للأمراض التي تصيب الإنسان، وخاصة دوشين ضمور العضلات (DMD)9،10،11،،من1213،،من1415. DMD هو العاشر مرتبطة المتنحية مرض قاتل الناجم عن الطفرات في الجينات إعلان الدوحة الوزاري ، الذي يشفر ديستروفين البروتين16،17، التي تؤثر على حوالي واحد في 3500 المواليد الذكور وفقا لفحص حديثي الولادة18 , 19-يتميز بضعف العضلات التدريجي والهزال. المرضى DMD عادة ما تفقد القدرة على المشي بين 10 و 12 سنة من العمر ويموتون بسبب فشل في الجهاز التنفسي و/أو القلب في سن 20-30 سنة20. جدير بالذكر أن تطور اعتلال عضلة القلب في > 90% من المرضى DMD ويمثل السبب الرئيسي الوفاة في إعلان الدوحة الوزاري المرضى21،22. على الرغم من أن ديفلازاكورت (العقاقير المضادة التهاب) واتيبليرسين (إكسون تخطي الطب لتخطي إكسون 51) مؤخرا تمت الموافقة على إعلان الدوحة الوزاري بالغذاء والدواء (FDA)23،24، أيا من هذه العلاجات تصحيح العيوب الوراثية على مستوى الحمض النووي الجينوم. الماوس mdx، الذي يحمل طفرة نقطة في إكسون 23 الجينات ديستروفين، قد استخدمت على نطاق واسع ك نموذج إعلان الدوحة الوزاري25. وعلاوة على ذلك، أثبتنا سابقا أن استعيد التعبير ديستروفين الوظيفية قبل الحذف في إطار من الحمض النووي الجينوم يغطي exons 21 و 22 و 23 في عضلات الهيكل العظمى من الفئران mdx استخدام التسليم Ad-SpCas9/جرنة العضلي9 ، وفي عضلات القلب mdx/أوتروفين+/-- الفئران باستخدام التسليم rAAVrh.74-SaCas9/جرنا عن طريق الحقن الوريدي وداخل26.
ونحن في هذا البروتوكول، تصف بالتفصيل كل خطوة في تحرير الجينات القلب بعد الولادة لاستعادة ديستروفين mdx/أوتروفين+/-- الفئران باستخدام ناقلات rAAVrh.74-SaCas9/جرنا، من تصميم جرنا إلى تحليل ديستروفين في المقاطع عضلة القلب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وأبقى على الحيوانات المستخدمة في هذا البروتوكول في "الدولة ولاية أوهايو جامعة مختبر الموارد الحيوانية" وفقا للمبادئ التوجيهية لاستخدام الحيوان. إذن جميع الدراسات الحيوانية برعاية الحيوان المؤسسية، واستخدام، ولجنة استعراض من جامعة ولاية أوهايو.
1-التصميم واستنساخ جرناس إلى "ناقل كريسبر"
- حدد جرناس 2 استهداف ديستروفين إنترون 20 و 23 (i20 و i23) إنترون SaCas9: i20: 5 '--ججكجتجااتكتكاتاك كاجاجت و i23: 5'--كاككجاتجاجاججااجتك كتجات (هو أبرز التسلسل بام والخط المائل).
ملاحظة: المواقع المستهدفة ل i20 و i23 حوالي 23 كيلو زوج قاعدي (kbp) بعيداً. لتعطيل جين ترميز، تسلسل جرناس هما استهداف exons مشتركة مع بام ننجررت ل SaCas9 (يفضل ننجات وننجتت وننجاجت) ويوصي بالمسافة داخل 20 kbp. - استخدم المعلمات التالية بكر أن يصلب أوليجوس جرنة (100 µmol/L) في 1 × الصلب المخزن المؤقت (5 × الصلب المخزون الاحتياطي يحتوي على 0.5 mol/L K-خلات، 150 mmol/لتر حبيس-كوه، 10 ملمول/لتر خلات ملغ، pH7.4): 95 درجة مئوية 10 دقيقة، دورات 90 من 95 إلى 59 درجة مئوية مع 0.4 درجة مئوية تنخفض كل دورة ل 20 s، دورات 90 من 59 إلى 32 درجة مئوية بانخفاض 0.3 درجة مئوية في كل دورة على 20 s، دورات 20 من 32 إلى 26 درجة مئوية بانخفاض 0.3 درجة مئوية في كل دورة على 20 ثانية.
- سد أوليجوس جرنة الملدن في pX601-CMV-SaCas9-mPA-U6-gRNA استخدام ليجاسى بساي والحمض النووي T4 في رد فعل واحد (0.5 ميليلتر الحمض النووي T4 ليجاسى، ميليلتر 1.5 10 x الحمض النووي T4 ليجاسى المخزن المؤقت، 1 ميليلتر، 1 ميليلتر 50 نانوغرام/ميليلتر pX601-CMV-SaCas9-mPA-U6-gRNA، أوليجوس 1 ميليلتر تعتيق بساي، 10 ميليلتر ddH2س )، مع شرط الرد التالي في cycler بكر: 5 دورات [37 ° ج 5 دقيقة و 16 ° ج 10 دقيقة]؛ 37 ° ج 20 دقيقة؛ 80 ° ج 5 دقيقة.
- تحويل المنتج ربط ميليلتر 15 إلى 30 ميليلتر الخلايا المختصة، لوحة الخلايا الموجودة في لوحة أجار مع 100 ميكروغرام/مل الأمبيسلّين، والثقافة في 37 درجة مئوية ح 24.
- التقاط المستعمرات والثقافة في المتوسط رطل التي تحتوي على 100 ميكروغرام/مل الأمبيسلّين عند 37 درجة مئوية، 250 دورة في الدقيقة في حاضنة شاكر ح 3-4 5-10.
- شاشة المستعمرات ببكر: 10 ميليلتر 2 x ميكس سيد بكر، 8 ميليلتر ddH2س، 1 ميليلتر كولاي الثقافة، التمهيدي 10 µmol/L U6 إلى الأمام ميليلتر 1، 1 ميليلتر i20 أو i23 جرنة التمهيدي العكسية. معلمات ركوب PCR: 95 درجة مئوية 5 دقيقة، دورات 35 95 درجة مئوية 30 ق، ق 61 درجة مئوية 30، 72 درجة مئوية 30 ثانية.
- تعد الثقافة 5 مل من استنساخ إيجابية بإضافة 4 مل الطازجة رطل containing100 المتوسطة ميكروغرام/مل الأمبيسلّين، والثقافة بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية، 250 دورة في الدقيقة.
- تنقية بلازميد الحمض النووي باستخدام أدوات استخراج بلازميد المناسبة، والتحقق من بلازميد قبل سانغر التسلسل مع التمهيدي U6 إلى الأمام.
- الثقافة الخلايا C2C12 في دميم وتستكمل مع 10% FBS و 1% بكتيريا القلم حتى وصلت إلى كونفلوينسي ~ 70% لاختبار الجينات تحرير نجاعة البلازميدات.
- اليكتروبوراتي ما مجموعة 5 ميكروغرام SaCas9/جرنة بلازميد المخلوط بنسبة 1:1 المولى إلى خلايا 1 × 106 C2C12 وفقا للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة.
- بعد 48 ساعة بعد انتهاء تعداء، حصاد الخلايا C2C12 واستخراج الحمض النووي.
- استخدام 100 نانوغرام المجينية الحمض النووي كقالب لإجراء تفاعل PCR للماوس ديستروفين المكان: الأمام التمهيدي 5 '--جككااجكااكتكتجتا (1 ميليلتر 10 µmol/L)، عكس التمهيدي 5'--تتاتكككاكجتكاتجكا (1 ميليلتر 10 µmol/L)، 10 ميليلتر 2 × PCR الأخضر سيد ميكس، 7 ddH2O ميليلتر، 1 ميليلتر المجينية الحمض النووي ( 100 نانوغرام). استخدام PCR ركوب الدراجات الشروط تصل إلى 95 درجة مئوية 5 دقيقة، 35 دورات [s 95 درجة مئوية 30، 61 درجة مئوية 30 ق، ق 72 درجة مئوية 30]، 72 ° ج 2 دقيقة.
2-راف الإنتاج
- الثقافة الخلايا، بذور الخلايا AD293 على 20 إلى 40 من الأطباق 15 سم والحفاظ عليها في دميم وتستكمل مع 10% FBS و 1% بكتيريا القلم حتى وصلت إلى كونفلوينسي ~ 90% تعداء.
- والبلازميدات تمييع 3 مع 200 ميليلتر خفض متوسط مصل (لكل طبق): 1) 10 ميكروغرام فيلبر؛ بكسر ميكروغرام 2) 5 (rh.74 أو غيرها اللقاح) و 3) ما مجموعة 5 ميكروغرام من خليط pX601-i20 و pX601-i23 (نسبة 1:1). تنفيذ تعداء بولييثيلينيميني (جزيرة الأمير إدوارد) بالاختلاط مع 80 ميليلتر بي واحتضان في درجة حرارة الغرفة عن 10 دقيقة إضافة الخليط إلى الثقافات الخلية AD293 بطريقة دروبويسي.
- لإنتاج الفيروس إف، بعد ح 72 وظيفة تعداء، استخدام مكشطة خلية جمع كل من وسائل الإعلام والكريات خلية AD293 بالطرد المركزي في ز x 1100 لمدة 10 دقائق.
- ريسوسبيند الكريات الخلية في المخزن المؤقت لتحلل راف 15 مل (50 mmol/لتر قاعدة تريس، 150 mmol/لتر كلوريد الصوديوم، الأس الهيدروجيني 8.5) تليها 3 دورات تجميد أذاب مع التناوب حضانة في النتروجين السائل وحمام مائي 42 درجة مئوية. تخزين ليساتيس خلية في-80 درجة مئوية لتجهيزها مستقبلا إذا ما لم يتم معالجتها فورا.
- تصفية وسائل الإعلام الثقافة مع عامل تصفية 0.45 ميكرومتر وإضافة نسبة 40% PEG8000 2.5 مول/لتر كلوريد الصوديوم إلى تركيز نهائي من 8 في المائة. احتضان هذا الخليط في 4 درجات مئوية عن ح 1 وأجهزة الطرد المركزي في 1100 x ز لمدة 15 دقيقة.
- ريسوسبيند الكريات في المخزن المؤقت لتحلل راف والجمع ليساتيس الخلية من الخطوة 2-3، يليه العلاج بينزوناسي (50 U/mL) عند 37 درجة مئوية ح 1.
- الطرد المركزي في راف المعالجة بينزوناسي الذي يحتوي على خليط 1100 x ز لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية، وحفظ المادة طافية (إعداد راف النفط الخام).
3-راف تنقية وتركيز
- تحميل إعداد راف النفط الخام على تدرج إيوديكسانول في أنبوب أولتراسينتريفوجي بالترتيب التالي من الأعلى إلى الأسفل: النفط الخام إف ليستي (~ 15 مل)، 8 مل 15% إيوديكسانول، 6 مل 25% إيوديكسانول، 5 مل 40% إيوديكسانول، مل 5 58% إيوديكسانول. ملء حجم الفارغة المتبقية من الأنبوب إلى الأعلى باستخدام 1 x DPBS.
- الطرد المركزي هذه العينات في 230,000 س ز في دوار ultracentrifuge لمدة 120 دقيقة في 10 درجة مئوية، وجمع 3-4 مل الكسر التدرج 40% تحتوي على جزيئات راف مع إبرة 18 جرام.
- تمييع الجسيمات راف مع 1 x DPBS وأجهزة الطرد المركزي باستخدام وحدة تصفية الطرد المركزي (100 موكو كاتشين). كرر هذه الخطوة من أجل 3-5 مرات، وأخيراً يركز إعداد راف إلى 300-500 ميليلتر.
4-راف تيتيرينج
- استخراج الحمض النووي الجينومي من 2 ميليلتر تتركز راف، المتعجل مع 3 م ناواك في الإيثانول، وريسوسبيند في 20 ميليلتر ddH2o.
- الحصول على المنحنى القياسي كوانتيتيشن راف بالمسلسل تمييع بلازميد pX601: 1 × 109, 1 × 108،1 × 107، 1 × 106, 1 × 105 نسخ في كل 10 ميليلتر ddH2O. ديلوت راف تعامل دنيز عينات ك 01:10، 01:50 و 1: 100 و 1: 1000.
- تحديد عيار راف بالكمي PCR الوقت الحقيقي (قبكر) استخدام qPCR طقم وفقا لتعليمات الشركة المصنعة في نظام PCR الوقت الحقيقي: 1 ميليلتر 10 µmol/L لكل التمهيدي (5-جاتتككاجتكتككاككك و 5 '-تكككاككجت أكاكجككتاك)، 5 ميليلتر 2 x ميكس سيد بكر، 1 ميليلتر المخفف تشغيل عينات راف و 2 ميليلتر ddH2سين رد فعل مع المعلمات ركوب التالية: 95 ° ج 3 دقيقة، دورات 45 [95 ° ج 5 ثانية و 61 ° ج 20 ثانية].
5-في الوريد وحقن داخل rAAVrh.74-كريسبر في الأطفال حديثي الولادة mdx/أوتروفين+/-- الفئران
- شل في mdx/أوتروفين+/-- الماوس الجراء (اليوم 3) بوضع على الجليد لمدة 1 دقيقة، وإدارة ثم مع 1 × 1012 الجسيمات الفيروسية في 50 ميليلتر كل الماوس النظامية عن طريق اتباع نهج الرجعية-المداري أو حقنه داخل.
- السماح للفئران لاسترداد ومكان العودة إلى اقفاصها المنزل. في عشرة أسابيع بعد الإدارة راف، euthanize الفئران CO2 التعرض لجمع الأنسجة.
- الأداة الإضافية-تجميد الأنسجة للجينوم استخراج الحمض النووي والجيش الملكي النيبالي، واستخدام التبريد إيسوبينتاني في النتروجين السائل لتجميد الأنسجة مع درجة الحرارة المثلى قطع المركبة كريوسيكتيونينج.
6-تحليل الجينات المستهدفة تحرير النتائج
-
تحليل PCR الحمض النووي الجينومي
- عزل مجموعة الحمض النووي من أنسجة القلب mdx/أوتروفين+/-- الفئران تعامل مع أو بدون راف.
- استخدام البروتوكول نفسه في خطوة 1.12 لتحليل PCR.
-
RT-PCR تحليل التعبير ديستروفين
- استخراج الحمض النووي الريبي مجموع من أنسجة القلب مع عدة استخراج الحمض النووي الريبي عقب الدليل الخاص بالشركة المصنعة.
- لإجراء النسخ العكسي، قبل التعامل مع الجيش الملكي النيبالي إجمالي مع الدناز رناسي مجاناً واستخدام 5 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي تعامل كالقالب لتوليف كدنا حبلا الأول مع مجموعة النسخ العكسي.
- استخدام المنتج النسخ العكسي لتحليل RT-PCR التعبير ديستروفين مع الإشعال كدنا ديستروفين: 5 '--جكتاجاجتاتكااككاكاتكات و 5'--تجاجكتاكجتتتاتكك.
-
تقدير الجين التحرير فعاليتها بتحليل قبكر
- تقدير الجينات تحرير فعالية حسب الكمية RT-PCR للكشف عن الحد النصوص التي تحتوي على 22 إكسون استخدام التمهيدي إلى الأمام (إكسون 21): 5 '--تجتكاجكتكتكاجككتكاا، وعكس التمهيدي (إكسون 23): 5'--آآكتكتككتكاكاجتجتكاكت. استخدام جابده كجين مرجع مع التمهيدي إلى الأمام: 5 '--أجتجتكتككتجكجاكتك وعكس التمهيدي: 5'--جتجتككاججتتكتاكت.
- تشغيل PCR الكمي في الوقت الحقيقي (qPCR) استخدام qPCR طقم وفقا لتعليمات الشركة المصنعة في نظام PCR الوقت الحقيقي وشروط 2-الخطوة رد فعل: 95 ° ج 3 دقيقة، دورات 45 من 95 ° ج 5 ثانية و 61 ° ج 30 ثانية.
-
الفلورة تلطيخ لتحليل التعبير ديستروفين
- قطع الأنسجة المجمدة استخدام كريوستات بسمك 10 ميكرون. إصلاح الأجزاء المجمدة مع بارافورمالدهيد 4% في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
- أغسل x 2 مع برنامج تلفزيوني واحتضان مع حظر الحل (10% مصل الحصان) لح 1.
- احتضان جسم الأساسي مكافحة ديستروفين، في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها.
- يغسل الشرائح مع برنامج تلفزيوني 3 x 5 دقيقة واحتضان مع الأجسام المضادة الثانوية الفلورسنت (1: 500) في درجة حرارة الغرفة ح 1.
- تحميل الشرائح باستخدام المتوسط المتصاعدة مع DAPI والتصوير مع مجهر مقلوب [كنفوكل].
7-خارج الهدف تحليل الإنزيم T7E1
- التنبؤ بتصميم المواقع خارج الهدف المحتمل كريسبر على الإنترنت باستخدام أدوات مثل < http://crispr.mit.edu>.
- تضخيم مناطق الجينوم يغطي الأعلى 5-10 مواقع قبالة المستهدفة المحتملة ببكر: المجينية الحمض النووي 200 نانوغرام، مزيج PCR المخزن المؤقت 10 x ميليلتر 5 ميليلتر 1.5 10، 1 ميليلتر عالية الدقة بوليميراز الدنا µmol/L الإشعال إلى الأمام وعكس مواقع محددة، ضبط الحجم الإجمالي إلى 50 ميليلتر مع ddH2o.
- تشغيل منتجات PCR بالتفريد، واستخراج وتنقية الحمض النووي باستخدام مجموعة أدوات استخراج هلام. قياس تركيز استخدام الطيفية.
- تشجيع تشكيل هيتيرودوبليكس يشوه وإعادة الصلب أمبليكونس المنقي ببطء في 2.1 المخزن المؤقت باستخدام cycler بكر. استخدام نفس شروط ركوب الدراجات على النحو المفصل في الخطوة 1.2.
- هضم منتجات إعادة الملدنة لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع 0.5 ميليلتر T7E1 الإنزيم، وتحليل رد فعل بالتفريد استخدام 1-2% [اغروس] هلام.
ملاحظة: يمكن أيضا أن تحلل من حسب تسلسل العميقة الهادفة أمبليكونس.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وينبغي تقييم فعالية جرناس للحث على حذف المنطقة المستهدفة المجينية الحمض النووي في الثقافات الخلية قبل التعبئة والتغليف إلى راف للدراسات المجراة. وتحقيقا لهذه الغاية، جرناس وثوابت الإعراب عن SaCas9 كانت اليكتروبوراتيد في خلايا C2C12 والحمض النووي تم تحليلها بواسطة PCR مع الإشعال المرافقة المواقع المستهدفة (الشكل 1). منتج PCR ~ 500 bp يشير إلى نجاح حذف الهدف المجينية الحمض النووي الناجمة عن تحرير الجينات بينما الخلايا التحكم لا ينبغي أن تسفر عن عصابة نظراً للحجم الكبير للحمض النووي.
متى تأكدت نجاعة جرناس في الثقافات الخلية، يمكن تعبئتها في rAAVrh.74 أو الأنماط الأخرى (مثل AAV6، 8 أو 9، تظهر جميع الجينات القلب قوية التسليم) باستخدام تعداء المشارك والبلازميدات الثلاثة إلى خلايا AAV293. وجدنا أن من غير الضروري للإعداد الفردية راف اثنين جرناس اثنين، وبدلاً من ذلك، نحن مختلطة بنيات جرنة اثنين في نسبة مولى متساوية وتنتج إعداد واحد راف. تم تنقية الجزيئات الفيروسية راف استخدام تنبيذ فائق الكثافة المتدرجة والنقاء تم تحليلها من قبل الحزب الديمقراطي الصربي صفحة. سوف يسفر عن إعداد راف المنقاة العالية فقط ثلاثة نطاقات المقابلة لبروتينات قفيصه VP1 و VP2 و VP3، على التوالي، الحزب الديمقراطي الصربي في الصفحة كما هو مبين في الشكل 2.
تم حقن الجسيمات الفيروسية المنقاة rAAVrh.74 يوم الولدان 1-3 mdx/أوتروفين+/-- الفئران عن طريق حقن الرجعية-المداري أو داخل. ووجدنا كلا الأسلوبين عملت جيدا للقلب إيصال rAAVrh.74-كريسبر. حقن الفئران يمكن تحليلها للتعبير ديستروفين قبل الفلورة تلطيخ (الشكل 3) في 10 أسابيع عمر.
رقم 1: التحقق جرناس لتحرير SaCas9 بوساطة الجينات في الخلايا C2C12- وأظهر التفريد جل الممثل [اغروس] منتجات PCR الحمض النووي المستخرج من اليكتروبوراتيد C2C12 مع أو بدون SaCas9/جرناس. يشير السهم إلى المنتج بكر نتجت عن تحرير الجينات. جابده كمرجع. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: تحليل للجسيمات rAAVrh.74 من الحزب الديمقراطي الصربي صفحة. RAAVrh.74 المنقي الجسيمات الفيروسية تشغيل على الحزب الديمقراطي الصربي صفحة أظهرت ثلاثة نطاقات، المقابلة لبروتينات قفيصه ثلاثة من إف، VP1 (كاتشين 87)، VP2 (كاتشين 72) و VP3 (كاتشين 62)، على التوالي. يشير وجود هذه العصابات 3 فقط إلى نقاء عالية لإعداد راف دون تلويث البروتينات الخلوية الأخرى. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: الفلورة تلطيخ أبواب القلب من mdx/أوتروفين+/-- الفئران في 10 أسابيع بعد العلاج إف-SaCas9/جرناس- أظهرت الصور الفلورة الممثل التعبير عن ديستروفين (أحمر) وكافيولين-3 (الأخضر) في أقسام القلب WT، mdx/أوتروفين+/- وتعامل mdx/أوتروفين+/-- الفئران مع 1 × 1012 جيد جداً إف-SaCas9/جرنا النظامية. تم استخدام DAPI لتسمية الأنوية (أزرق). شريط الحجم: 100 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في هذا البروتوكول، ونحن بالتفصيل جميع الخطوات اللازمة لتحقيق في فيفو تحرير القلب الجينات في الفئران بعد الولادة باستخدام التسليم بوساطة rAAVrh.74 SaCas9 وهما جرناس. كما تمت الإشارة سابقا، يمكن استخدام هذا النهج لاستعادة تعبير ديستروفين في الفئران تندب كما هو موضح في العمل لدينا27، ولكن يمكن أيضا دراسات علم الوراثة العكسي السريع من الجينات المتصلة بالقلب في الفئران دون عملية طويلة النهج التقليدي بالضربة القاضية لتوليد وتولد نماذج الماوس خروج المغلوب.
من أجل تحقيق ارتفاع الجينات تحرير الكفاءة في الأنسجة المستهدفة، وهناك العديد من الخطوات الحاسمة لنضع في اعتبارنا: 1) فعالية SaCas9/جرنا الحث على حذف المستهدفة الحمض النووي يحتاج إلى التحقق من صحتها باستخدام خطوط الخلية المناسبة؛ 2) من المهم جداً لتحديد من سليم النمط المصلي المسيطر إف التي يمكن التوسط في مستوى عال لتوصيل الجينات في النسيج المستهدف و 3) تحديد مسار التسليم الأمثل إف ناقلات لنقل الجينات للأنسجة المرجوة.
في البروتوكول الحالي، المصممة SaCas9/جرناس تم تعبئتها في AAVrh.74 بدلاً من ذكرت سابقا AAV8 و AAV9 لتحرير Dmd الجينات12،28. AAVrh.74 المعروضات حوالي 93 ٪ التماثل إلى AAV829 وقد ثبت غير ممرضة وفعالة في ترانسدوسينج الهيكل العظمى والعضلات أطرافهم بعد عزل تسليم29،،من3031. نستخدم في هذا البروتوكول، ضخ الرجعية-المداري وداخل rh.74 في الفئران حديثي الولادة لنقل الجينات القلب. وجدنا أن إدارة الوليد rAAVrh.74 ذات كفاءة عالية لاستعادة تعبير ديستروفين في حوالي 30-40% من كارديوميوسيتيس في الفئران تلقي جرعة عالية من rAAVrh.74 (vg 1 × 1012 ). من المثير للاهتمام، وجدنا أن التعبير ديستروفين الهيكل العظمى والعضلات لا إنقاذ فعالة. هذا الأرجح سبب انتحاء منخفضة الهيكل العظمى والعضلات للنمط المصلي المسيطر rh.74 عندما تدار عن طريق الحقن الوريدي أو داخل، على الرغم من أن الدراسات السابقة أظهرت أن التسليم أطرافهم معزولة من rAAVrh.74 يمكن ترانسدوسي فعالية الفأر والقرد الهيكل العظمى العضلات29،،من3031. أيضا، عندما كانت تدار rAAVrh.74 في الفئران الكبار، لاحظنا كفاءة منخفضة جداً في استعادة ديستروفين التعبير. سيكون من المثير للاهتمام لتحديد الجرعة الحد الأدنى المطلوب لتحقيق عملية الإنقاذ ديستروفين أعلى. وعلاوة على ذلك، يمكن اختبار اللقاح وطرق التسليم الأخرى والمقارنة لتحقيق تحرير الجينات القلب الأمثل.
الحذف الناجحة من قطعة كبيرة من الدنا الجينومي يتطلب التسليم المتزامن من جرناس اثنين. لقد وجدنا أنه ليس من الضروري للقيام باستعدادات راف منفصلة اثنين لإيصال جرناس اثنين. في هذا البروتوكول، نحن ببساطة مختلطة والبلازميدات جرنة اثنين في مبلغ مساو أثناء تعداء لإنتاج راف، وهذا الجمع بين إنتاج راف وجد أن تكون فعالة في إيصال كلا جرناس. هذا النهج مجتمعة، ولذلك الاقتصاد في التكاليف والعمل وأوصى عند التسليم المتزامن لاثنين من جرناس مطلوبة.
في كثير من الحالات، قد يكون من الضروري لتحليل الجينات تحرير الكفاءة بالنهج الوراثية عندما لا يتوفر جسم جيد لمنتج الجين المستهدف. بيد أنها تمثل تحديا تقنيا دقة تحديد الجينات تحرير فعالية مع اثنين جرناس استهداف المكان نفسه حيث ستشمل المنتجات الجينات تحرير حذف تسلسل الهدف والهدف تسلسل انعكاس إينديلس الصغيرة على هدف واحد فقط الموقع. بدلاً من ذلك، أنها مفيدة ومجدية لقياس كفاءة حذف تسلسل المستهدفة المطلوبة كما هو الحال في حالتنا حيث يمكن قياسها كمياً الحد من النصوص التي تحتوي على exons 21-23 بالوقت الحقيقي RT-PCR.
في هذا البروتوكول، يصف لنا أيضا استخدام الإنزيم T7E1 والتنبؤ الحاسوبية لتحليل النشاط خارج الهدف المحتمل. للمقايسة تعمل بشكل جيد، من الضروري استخدام عالية دقة بوليميريز الحمض النووي. أيضا، أنها دائماً فكرة جيدة للتحضير لتجربة المراقبة سلبية (مثل مراقبة الحمض النووي المنتجات يضخم من الخلايا/الأنسجة دون تحرير الجينات، وتعامل بنفس الطريقة كعينات الاختبار) وتجربة المراقبة إيجابية (مثل معروفة عينة مع تحرير الجينات تتسم جيدا). ومع ذلك، أنها ملاحظة أن حد الكشف T7E1 والرزن حول 532، وبالتالي فإنه قد لا يكون يمكن كشفها بواسطة الإنزيم T7E1 إذا كان النشاط خارج الهدف أقل من 5 في المائة. يمكن استخدام دليل seq33 لتحليل النشاط خارج الهدف تحرير الجينات SaCas9/جرنا-بوساطة أونبياسيدلي. مواقع خارج الهدف المحددة من الإنزيم T7E1 والتنبؤ الحاسوبية و/أو النهج seq دليل يمكن قياسها كمياً كذلك للترددات إينديل عقب فيفو في تحرير الجينات بالتسلسل الفائق.
مجتمعة، وقد قدمنا أن نهج تحرير جينات القلب أمثل باستخدام rAAVrh.74. ويمكن اختبار هذا البروتوكول المعمول كذلك عكس الدراسات الوراثية والتطبيقات العلاجية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يوجد لا تعارض في المصالح.
Acknowledgments
ويدعم الولايات المتحدة المعاهد الوطنية للصحة المنح (R01HL116546 و R01 AR064241) الصحة الإنجابية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 555 goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | A-21428 | |
| Benzonase Nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | |
| Bio Safety Cabinets | Thermo Fisher Scientific | 1347 | 1300 Series A2 Class II, Type A2 |
| BsaI | New England BioLabs Inc | RO535S | |
| Competent cells | Agilent Technologies | 200314 | |
| Cell culture dishes, 150mm | Nest Scientific USA | 715001 | |
| Cryostat | Leica Biosystems | Leica CM3050S | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | MT10017CV | Corning cellgro |
| Dystrophin antibody | Spring Bioscience | E2660 | |
| Fast-Ion Midi Plasmdi Kits | IBI Scientific | IB47111 | |
| FBS | Thermo Fisher Scientific | 26-140-079 | |
| Filter Unit, 0.45μm | Thermo Fisher Scientific | 166-0045 | |
| GoTaq Master Mixes | Promega | M7122 | |
| High-speed plasmid mini kit | IBI Scientific | IB47102 | |
| Horse serum | Abcam | ab139501 | |
| Isotemp 2239 Water Bath | Thermo Fisher Scientific | 15-460-11Q | |
| Isotemp Heat Block | Thermo Fisher Scientific | 11-718 | |
| Inverted confocal microscope | Carl Zeiss Microscopy, LLC | LSM 780 | |
| LightCycler 480 instrument | Roche | 5015243001 | LightCycler 480 Instrument II |
| Large Capacity Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 46-910 | Thermo Scientific Sorvall RC 6 Plus |
| Microcentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75002445 | Sorvall Legend Micro 21R |
| Nanodrop spectrophotometers | Thermo Scientific | ND2000CLAPTOP | NanoDrop™ 2000/2000c |
| Oligos for i20-F | Integrated DNA Technologies | CACCgGGCGT TGAAATTCTCATTAC |
|
| Oligos for i20-R | Integrated DNA Technologies | AAAC GTAATGAGAATTTCAACGCCc; | |
| Oligos for i23-F | Integrated DNA Technologies | CACCgCACCGATGAGAGGG AAAGGTC |
|
| Oligos for i23-R | Integrated DNA Technologies | GACCTTTCCCTCTCATCGGTGc | |
| Oligos | Integrated DNA Technologies | ||
| OptiPrep Density Gradient Medium | Sigma-Aldrich | D1556-250ML | |
| OptiMEM | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
| PEG8000 | Sigma-Aldrich | 89510-1kg-F | |
| Polyethylenimine | Polysciences | 23966 | |
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | P2308 | |
| Quick-Seal centrifuge tube | Beckman Coulter Inc | 342414 | |
| QIAquick Gel Extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| Radiant SYBR Green Hi-ROX qPCR Kits | Alkali Scientific | QS2005 | |
| RevertAid RT Reverse Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific | K1691 | |
| Rotor | Beckman Coulter Inc | 337922 | Type 70Ti |
| T4 DNA ligase | New England BioLabs Inc | M0202S | |
| Thermal Cycler | Bio-rad | 1861096 | |
| TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter Inc | 8043-30-1192 | Optima le-80k |
| Ultra centrifugal filter unit | MilliporeSigma | UFC510096 | |
| VECTASHIELD Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories, Inc | H-1200 |
References
- Makarova, K. S., Koonin, E. V. Annotation and Classification of CRISPR-Cas Systems. Methods Mol Biol. 1311, 47-75 (2015).
- Zetsche, B., et al. Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system. Cell. 163, 759-771 (2015).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339, 819-823 (2013).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339, 823-826 (2013).
- Lieber, M. R. The mechanism of double-strand DNA break repair by the nonhomologous DNA end-joining pathway. Annual review of biochemistry. 79, 181-211 (2010).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature protocols. 8, 2281-2308 (2013).
- Zhang, X., Wang, J., Cheng, Q., Zheng, X., Zhao, G. Multiplex gene regulation by CRISPR-ddCpf1. Cell discovery. 3, 17018 (2017).
- Zhang, X. H., Tee, L. Y., Wang, X. G., Huang, Q. S., Yang, S. H. Off-target Effects in CRISPR/Cas9-mediated Genome Engineering. Molecular therapy. Nucleic acids. 4, e264 (2015).
- Xu, L., et al. CRISPR-mediated genome editing restores dystrophin expression and function in mdx mice. Mol Ther. 24, 564-569 (2015).
- Long, C., et al. Postnatal genome editing partially restores dystrophin expression in a mouse model of muscular dystrophy. Science. 351, 400-403 (2016).
- Long, C. Z., et al. Prevention of muscular dystrophy in mice by CRISPR/Cas9-mediated editing of germline DNA. Science. 345, 1184-1188 (2014).
- Nelson, C. E., et al. In vivo genome editing improves muscle function in a mouse model of Duchenne muscular dystrophy. Science. 351, 403-407 (2016).
- Ousterout, D. G. K., Thakore, A. M., Majoros, P. I., Reddy, T. E. W. H., Gersbach, C. A. Multiplex CRISPR/Cas9-based genome editing for correction of dystrophin mutations that cause Duchenne muscular dystrophy. Nat Commun. 6, 6244 (2015).
- Tabebordbar, M., et al. In vivo gene editing in dystrophic mouse muscle and muscle stem cells. Science. 351, 407-411 (2016).
- Bengtsson, N. E., et al. Muscle-specific CRISPR/Cas9 dystrophin gene editing ameliorates pathophysiology in a mouse model for Duchenne muscular dystrophy. Nat Commun. 8, 14454 (2017).
- Hoffman, E. P., Brown, R. H., Kunkel, L. M. Dystrophin: the protein product of the Duchenne muscular dystrophy locus. Cell. 51, 919-928 (1987).
- Nowak, K. J., Davies, K. E. Duchenne muscular dystrophy and dystrophin: pathogenesis and opportunities for treatment. EMBO reports. 5, 872-876 (2004).
- Mendell, J. R., et al. Evidence-based path to newborn screening for Duchenne muscular dystrophy. Annals of neurology. 71, 304-313 (2012).
- Mendell, J. R., Lloyd-Puryear, M. Report of MDA muscle disease symposium on newborn screening for Duchenne muscular dystrophy. Muscle Nerve. 48, 21-26 (2013).
- Spurney, C. F. Cardiomyopathy of Duchenne muscular dystrophy: current understanding and future directions. Muscle Nerve. 44, 8-19 (2011).
- Moriuchi, T., Kagawa, N., Mukoyama, M., Hizawa, K. Autopsy analyses of the muscular dystrophies. Tokushima J Exp Med. 40, 83-93 (1993).
- McNally, E. M. New approaches in the therapy of cardiomyopathy in muscular dystrophy. Annual review of medicine. 58, 75-88 (2007).
- Baker, D. E. Approvals, Submission, and Important Labeling Changes for US Marketed Pharmaceuticals. Hosp Pharm. 52, 306-307 (2013).
- Baker, D. E. Eteplirsen. Hosp Pharm. 52, 302-305 (2017).
- Sicinski, P., et al. The molecular basis of muscular dystrophy in the mdx mouse: a point mutation. Science. 244, 1578-1580 (1989).
- Xu, L., et al. CRISPR-mediated Genome Editing Restores Dystrophin Expression and Function in mdx Mice. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 24, 564-569 (2016).
- El Refaey, M., et al. In Vivo Genome Editing Restores Dystrophin Expression and Cardiac Function in Dystrophic Mice. Circ Res. 121, 923-929 (2017).
- Tabebordbar, M., et al. In vivo gene editing in dystrophic mouse muscle and muscle stem cells. Science. 351, 407-411 (2016).
- Pozsgai, E. R., Griffin, D. A., Heller, K. N., Mendell, J. R., Rodino-Klapac, L. R. beta-Sarcoglycan gene transfer decreases fibrosis and restores force in LGMD2E mice. Gene therapy. 23, 57-66 (2016).
- Chicoine, L. G., et al. Plasmapheresis eliminates the negative impact of AAV antibodies on microdystrophin gene expression following vascular delivery. Mol Ther. 22, 338-347 (2014).
- Chicoine, L. G., et al. Vascular delivery of rAAVrh74.MCK.GALGT2 to the gastrocnemius muscle of the rhesus macaque stimulates the expression of dystrophin and laminin alpha2 surrogates. Mol Ther. 22, 713-724 (2014).
- Vouillot, L., Thelie, A., Pollet, N. Comparison of T7E1 and surveyor mismatch cleavage assays to detect mutations triggered by engineered nucleases. G3. 5, 407-415 (2015).
- Tsai, S. Q., et al. GUIDE-seq enables genome-wide profiling of off-target cleavage by CRISPR-Cas nucleases. Nat Biotechnol. 33, 187-197 (2015).
