Summary
Qui forniamo un protocollo dettagliato per effettuare in vivo gene cardiaco editing nei topi utilizzando Virus ricombinante Adeno-Associated (rAAV)-mediate consegna di CRISPR. Questo protocollo offre una strategia terapeutica di promessa per il trattamento di cardiomiopatia distrofica nella distrofia muscolare di Duchenne e può essere utilizzato per generare specifico knockout in topi postnatali.
Abstract
Il sistema cluster, regolarmente intercapedine, breve, palindromico di ripetere (CRISPR) ha notevolmente facilitato ingegneria genoma in cellule coltivate e gli organismi viventi da una grande varietà di specie. La tecnologia CRISPR è stata esplorata anche come approcci terapeutici per un certo numero di malattie umane. Dati di prova sono molto incoraggianti, come esemplificato da studi recenti che dimostrano la fattibilità e l'efficacia di gene editing basato su approccio terapeutico per la distrofia muscolare di Duchenne (DMD) utilizzando un modello murino. In particolare, iniezione endovenosa ed intraperitoneale del rh.74 di sierotipo del virus adeno-associato ricombinante (rAAV) (rAAVrh.74) ha permesso la consegna efficiente cardiaca di Staphylococcus aureus CRISPR-collegata della proteina 9 (SaCas9) e due Guida RNAs (gRNA) per eliminare una regione genomica con un codone mutante nell'esone 23 del gene Dmd del mouse. Questo stesso approccio è utilizzabile anche per battere il gene di interesse e studiare la loro funzione cardiaca nei topi postnatali quando il gRNA è progettato per la regione di codificazione del gene. In questo protocollo, vi mostriamo nel dettaglio come ingegnere vector rAAVrh.74-CRISPR e come raggiungere altamente efficiente consegna cardiaca in topi neonatali.
Introduction
Il cluster, regolarmente intercapedine, breve palindromi ripetere (CRISPR) tecnologia rappresenta il più recente avanzamento in ingegneria del genoma e ha rivoluzionato la pratica corrente della genetica in cellule e degli organismi. Editing basato su CRISPR genomico utilizza una sola guida RNA (gRNA) per dirigere un'endonucleasi associata CRISPR come CRISPR-associated protein 9 (Cas9) e Cpf1 ad un target di DNA genomico che è complementare in sequenza la protospacer codificati da gRNA con un protospacer specifici motivi adiacenti (PAM)1,2. Il PAM varia a seconda della specie batterica del gene Cas9 o Cpf1. Il più comunemente usata nucleasi Cas9 derivata da Streptococcus pyogenes (SpCas9) riconosce una sequenza di PAM di NGG che si trova direttamente a valle della sequenza dell'obiettivo nel DNA genomico, sul filo del non-bersaglio. Presso il sito di destinazione, le proteine Cas9 e Cpf1 generano una rotture a doppio filamento (DSB), che sono poi ripristinata via intrinseci meccanismi di riparazione del DNA cellulari tra cui unirsi non-omologo fine (NHEJ) e riparazione omologia-diretto (HDR) vie3, 4. In assenza di un modello di DNA per ricombinazione omologa, il DSB è principalmente riparato da pathway NHEJ errori, che possono provocare gli inserimenti o eliminazioni (indels) di nucleotidi causando mutazioni frameshift, se l'organo di conciliazione sono stato creato nella codificazione regione di un gene5,6. Così, il sistema CRISPR è stato ampiamente utilizzato per progettare le mutazioni di perdita-de-funzione in vari modelli cellulari e interi organismi, al fine di studiare la funzione di un gene. Inoltre, il cataliticamente inattivo Cas9 e Cpf1 sono stati sviluppati per trascrizionalmente ed epigeneticamente modulare l'espressione di geni bersaglio7,8.
Più recentemente, sia SpCas9 e SaCas9 (derivato da Staphylococcus aureus) sono stati imballati in vettori ricombinanti virus adeno-associato (rAAV) per la correzione genica postnatale nel modello animale di malattie umane, in particolare, Duchenne distrofia muscolare (DMD)9,10,11,12,13,14,15. DMD è una malattia recessiva legata al X fatale causata da mutazioni nel gene DMD , che codifica per la proteina distrofina16,17, che interessa circa uno in 3500 nati maschi secondo screening neonatale18 , 19. è caratterizzata da debolezza muscolare progressiva e lo spreco. I pazienti DMD di solito perdono la capacità di camminare tra i 10 e i 12 anni di età e morire di insufficienza respiratoria e/o cardiaco all'età di 20-30 anni20. In particolare, la cardiomiopatia si sviluppa in > 90% dei pazienti DMD e rappresenta la principale causa di morte in pazienti DMD21,22. Anche se Deflazacort (un farmaco anti-infiammatorio) ed Eteplirsen (un esone che salta medicina per saltare essone 51) recentemente sono stati approvati per la DMD da Food and Drug Administration (FDA)23,24, nessuno di questi trattamenti correggere il difetto genetico a livello di DNA genomico. Il topo mdx, che trasporta una mutazione di punto all'esone 23 del gene della distrofina, è stato ampiamente usato come un DMD modello25. Inoltre, abbiamo in precedenza dimostrato che l'espressione di distrofina funzionale è stato restaurato da omissione in-struttura del DNA genomic che coprono gli essoni 21, 22 e 23 nella muscolatura scheletrica di topi mdx utilizzando intramuscolare annuncio-SpCas9/gRNA consegna9 e nei muscoli del cuore di topi mdx/utrofina+ /- mediante consegna di rAAVrh.74-SaCas9/gRNA endovenosa ed intraperitoneale26.
In questo protocollo, descriviamo in dettaglio ogni passo nel gene cardiaco postnatale di editing per ripristinare la distrofina in topi mdx/utrofina+ /- utilizzando rAAVrh.74-SaCas9/gRNA vettori, dalla progettazione di gRNA alla distrofina analisi nelle sezioni del muscolo di cuore.
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Protocol
Gli animali utilizzati in questo protocollo sono stati mantenuti a The Ohio State University laboratorio le risorse animali conformemente alle linee guida sull'uso degli animali. Tutti gli studi sugli animali sono stati autorizzati dal istituzionale Animal Care, uso e Comitato di revisione della Ohio State University.
1. progettazione e clonazione del gRNAs nel vettore CRISPR
- Selezionare 2 gRNAs targeting distrofina introne 20 e introne 23 (i20 e i23) per SaCas9: i20: 5'-GGGCGTTGAAATTCTCATTAC CAGAGT e i23: 5'-CACCGATGAGAGGGAAAGGTC CTGAAT (la sequenza di PAM è sottolineata e corsivo).
Nota: I siti di destinazione per i20 e i23 sono circa 23 kg coppia di basi (kbp) distanza. Per interrompere un gene che codifica, due gRNAs targeting degli esoni comuni con il PAM NNGRRT sequenza per SaCas9 (preferibilmente NNGAAT, NNGGGT e NNGAGT) e distanza all'interno di 20 kbp sono raccomandati. - Utilizzare i seguenti parametri PCR per temprare il gRNA oligos (100 µmol/L) in 1x tampone di ricottura (5 x ricottura scorte regolatrici contiene 0,5 mol/L K-acetato, 150 mmol/L HEPES-KOH, 10 mmol/L Mg-acetato, pH7.4): 95 ° C 10 min, 90 cicli di 95-59 ° C con un 0,4 ° C diminuire al ciclo per 20 s, 90 cicli di 59 a 32 ° C con una diminuzione di 0,3 ° C per ciclo per 20 s, 20 cicli di 32 a 26 ° C con una diminuzione di 0,3 ° C per ciclo per 20 s.
- Legare i oligos gRNA ricotto nella pX601-CMV-SaCas9-mPA-U6-gRNA utilizzando BsaI e T4 DNA ligasi in uno reazione (1 µ l 50 ng / µ l pX601-CMV-SaCas9-mPA-U6-gRNA, i oligos 1 µ l ricotto, buffer di 1,5 µ l 10 x T4 DNA ligasi, 0,5 µ l T4 DNA ligasi, 1 µ l BsaI, 10 µ l ddH2O ), con la seguente condizione di reazione in un cycler PCR: 5 cicli di [37 ° C 5 min e 16 ° C 10 min]; 37 ° C 20 min; 80 ° C 5 min.
- Trasformare il prodotto di legatura di 15 µ l in cellule competenti di 30 µ l, piatto le cellule nella piastra di agar con 100 µ g/mL di ampicillina e coltura a 37 ° C per 24 h.
- Prendere 5-10 colonie e cultura in LB medium contenente ampicillina 100 µ g/mL a 37 ° C, 250 giri/min in un incubatore agitatore per 3-4 h.
- Le colonie di PCR a schermo: 10 µ l 2 x mix master PCR, 8 µ l ddH2O, cultura di e. Coli 1 µ l, primer di 10 µmol/L U6-forward 1 µ l, 1 µ l i20 o i23 gRNA reverse primer. I parametri di ciclismo di PCR: 95 ° C 5 min, 35 cicli di 95 ° C 30 s, 61 ° C 30 s, 72 ° C 30 s.
- Preparare 5 mL coltura dei cloni positivi aggiungendo 4 mL fresco LB Media containing100 µ g/mL ampicillina e cultura durante la notte a 37 ° C, 250 giri/min.
- Purificare il plasmide DNA utilizzando il kit di estrazione del plasmide appropriato e verificare il plasmide di Sanger sequenziamento con il primer di U6-forward.
- Coltura di cellule C2C12 in DMEM completati con 10% FBS e 1% penna-Strep fino a raggiungere la confluenza di ~ 70% per le prove del gene efficacia dei plasmidi di editing.
- Electroporate un totale di 5 µ g SaCas9/gRNA miscela di plasmide in rapporto molare 1:1 in 1 x 106 C2C12 cellule secondo il protocollo del produttore.
- Dopo la post-trasfezione 48h raccolto le cellule C2C12 ed estrarre il DNA genomico.
- Uso 100 ng DNA genomico come modello per eseguire la reazione di PCR per locus distrofina del mouse: forward primer 5'-GGCCAAAGCAAACTCTGGTA (1 µ l 10 µmol/L), reverse primer 5'-TTTAATCCCACGTCATGCAA (1 µ l 10 µmol/L), 10 µ l 2 x il verde PCR master mix, 7 µ l ddH2O, (DNA genomico di 1 µ l 100 ng). Utilizzare la PCR ciclismo condizioni come 95 ° C 5 min, 35 cicli di [95 ° C 30 s, 61 ° C 30 s, 72 ° C 30 s], 72 ° C 2 min.
2. rAAV produzione
- Per la coltura delle cellule, le cellule di AD293 sui 20-40 di 15 cm piatti del seme e mantenere in DMEM completati con 10% FBS e 1% penna-Strep fino a raggiungere la confluenza di ~ 90% per la transfezione.
- Diluire 3 plasmidi con 200 µ l ridotto medio del siero (per ogni piatto): 1) 10 µ g pHelper; 2) 5 µ g pXR (rh.74 o altri sierotipi) e 3) un totale di 5 µ g di miscela pX601-i20 e pX601-i23 (rapporto 1:1). Eseguire polyethylenimine (PEI) transfezione mescolando con 80 µ l PEI e incubare a temperatura ambiente per 10 min. Aggiungi la miscela su colture cellulari AD293 in modo goccia a goccia.
- Per la produzione di virus AAV, dopo la trasfezione di 72 h post, usate un raschietto di cella per raccogliere sia i media e il pellet di cellule AD293 mediante centrifugazione a 1100 x g per 10 minuti.
- Risospendere il pellet cellulare in tampone di lisi rAAV 15 mL (50 mmol/L Tris Base, 150 mmol/L NaCl, pH 8.5) seguito da 3 cicli di gelo-disgelo con alternanza di incubazione in azoto liquido e bagnomaria a 42 ° C. Memorizzare i lisati cellulari a-80 ° C per l'elaborazione di futuri se non vengono elaborati immediatamente.
- Filtrare i terreni di coltura con un filtro da 0,45 µm e aggiungere un 40% PEG8000 2,5 mol/L NaCl a una concentrazione finale di 8%. Incubare la miscela a 4 ° C per 1 h e centrifugare a 1100 x g per 15 min.
- Risospendere il pellet in tampone di lisi rAAV e si combinano con i lisati cellulari dal punto 2.3, seguita da trattamento benzonase (50 U/mL) a 37 ° C per 1 h.
- Centrifugare il rAAV benzonase-trattati contenente miscela 1100 x g per 15 min a 4 ° C e salvare il surnatante (la preparazione rAAV grezzo).
3. rAAV purificazione e concentrazione
- Caricare la preparazione rAAV grezzo su una pendenza di iodixanol in un tubo di ultracentrifuga nel seguente ordine dall'alto verso il basso: greggio AAV lisato (~ 15 mL), 8 mL 15% Iodixanol, 6 mL 25% Iodixanol, 5ml 40% Iodixanol, 5ml 58% Iodixanol. Riempire il restante volume vuoto del tubo verso l'alto utilizzando 1 x DPBS.
- Centrifugare i campioni a 230.000 x g in un rotore ultracentrifuga per 120 min a 10 ° C e raccogliere 3-4 mL della frazione gradiente 40% contenenti le particelle rAAV con un ago da 18 G.
- Diluire le particelle rAAV con 1 x DPBS e centrifuga utilizzando l'unità filtro centrifugo (MWCO 100 kDa). Ripetere questo passaggio per 3 - 5 volte e finalmente concentrarsi la preparazione rAAV a 300-500 µ l.
4. rAAV titolazione
- Estrarre il DNA genomico da 2 µ l concentrato rAAV, precipitato con 3 M NaOAc in etanolo e risospendere in 20 µ l ddH2O.
- Per ottenere la curva standard per la quantificazione rAAV diluizione seriale del plasmide pX601: 1 x 109, 1x108,1 x 107, 1 x 106, 1 x 105 copie in ogni 10 µ l ddH2O. Diluire il rAAV dnaasi-trattati campioni come 01:10, 01:50, 1: 100 e 1: 1000.
- Determinare il titolo rAAV, mediante PCR quantitativa in tempo reale (qPCR), utilizzando qPCR Kit seguendo le istruzioni del produttore in un sistema Real-Time PCR: 1 µ l 10 µmol/L di ciascun primer (5'-GGATTTCCAAGTCTCCACCC e 5'-TCCCACCGT ACACGCCTAC), 5 µ l 2 x mix master di PCR, 1 µ l diluito rAAV campioni e 2 µ l ddH2O. eseguire la reazione con i seguenti parametri in bicicletta: 95 ° C 3 min, 45 cicli di [95 ° C 5 sec e 61 ° C 20 sec].
5. endovenoso e l'iniezione intraperitoneale di rAAVrh.74-CRISPR in neonatale mdx/utrofina+ /- topi
- Immobilizzare il mdx/utrofina+ /- cuccioli di topo (giorno 3) inserendo il ghiaccio per 1 min e quindi amministrare con 1 x 1012 particelle virali in 50 µ l per topo sistematicamente tramite un approccio retro-orbitale o un'iniezione intraperitoneale.
- Consentire i topi recuperare e rimettere nella loro casa gabbie. A dieci settimane dopo amministrazione di rAAV, eutanasia i topi di CO2 esposizione per la raccolta del tessuto.
- Snap-congelare tessuti per estrazione di DNA e RNA genomico e uso raffreddamento isopentano in azoto liquido per congelare i tessuti con temperatura ottimale di taglio composto per il criosezionamento.
6. l'analisi del Gene Target risultati di Editing
-
Analisi di PCR del DNA genomic
- Isolare il DNA genomico da tessuti del cuore dei topi mdx/utrofina+ /- trattato con o senza rAAV totale.
- Utilizzare lo stesso protocollo in 1.12 passo per l'analisi di PCR.
-
Analisi di RT-PCR dell'espressione di distrofina
- Estrarre RNA totale da tessuti del cuore con il kit di estrazione di RNA seguendo il manuale del produttore.
- Per eseguire la trascrizione inversa, pre-trattare il RNA totale con una dnasi RNAsi-libera e utilizzare 5 µ g di RNA trattato come il modello per la sintesi del cDNA del primo-filo con il kit di trascrizione inversa.
- Utilizzare il prodotto di trascrizione d'inversione per l'analisi di RT-PCR dell'espressione di distrofina con gli iniettori di cDNA di distrofina: 5'-GGCTAGAGTATCAAACCAACATCAT e 5'-TGGAGGCTTACGGTTTTATCC.
-
Stimare il gene editing efficacia da analisi qPCR
- Stimare il gene editing efficacia mediante RT-PCR quantitativa per rilevare la riduzione delle trascrizioni di esone contenente 22 utilizzando il primer forward (esone 21): 5'-TTGTCAGCTCTTCAGCCTCAAA e il primer reverse (esone 23): 5'-AAACTCTCCTTCACAGTGTCACT. Utilizzare Gapdh come un gene di riferimento con il primer forward: 5'-AGGTTGTCTCCTGCGACTTC e il reverse primer: 5'-GGTGGTCCAGGGTTTCTTACT.
- Eseguire la PCR quantitativa in tempo reale (qPCR), utilizzando la qPCR Kit seguendo le istruzioni del produttore in un sistema Real-Time PCR e le condizioni di reazione di 2-step: 95 ° C 3 min, 45 cicli di 95 ° C 5 sec e 61 ° C 30 sec.
-
Immunofluorescenza che macchia per analizzare l'espressione di distrofina
- Tagliare i tessuti congelati utilizzando un criostato ad uno spessore di 10 µm. Fix le sezioni congelate con paraformaldeide al 4% a temperatura ambiente per 15 min.
- Lavare 2 volte con PBS e incubare con blocco soluzione (10% di siero equino) per 1 h.
- Incubare l'anticorpo primario anti-distrofina, a 4 ° C durante la notte.
- Lavare i vetrini con PBS 3 x 5 min e incubare con anticorpi secondari fluorescenti (1: 500) a temperatura ambiente per 1 h.
- Montare le diapositive utilizzando il mezzo di montaggio con DAPI e imaging con un microscopio confocale invertito.
7. off-target analisi dall'analisi di T7E1
- Prevedere i potenziali siti di fuori bersaglio utilizzando il CRISPR online strumenti di progettazione come < http://crispr.mit.edu>.
- Amplificare le regioni genomiche che copre la parte superiore 5-10 siti potenziali di fuori bersaglio mediante PCR: genomic DNA 200 ng, 1 µ l ad alta fedeltà della polimerasi di DNA, 5 µ l 10X PCR Buffer mix, 1,5 µ l 10 µmol/L di site-specific primers forward e reverse, regolazione del volume totale di 50 µ l con ddH2O.
- Eseguire i prodotti PCR mediante elettroforesi, estrarre e purificare il DNA utilizzando un kit di estrazione del gel. Misurare la concentrazione utilizzando spettrofotometri.
- Promuovere la formazione di denaturazione e ri-ricottura gli ampliconi purificati lentamente nella 2.1 Buffer utilizzando un cycler PCR. Utilizzare le stesse condizioni di ciclismo come descritto al punto 1.2.
- I prodotti ri-Ricotti per 30 min a 37 ° C con enzima di T7E1 0,5 µ l di digerire e analizzare la reazione l'elettroforesi del gel dell'agarosi 1-2%.
Nota: Gli ampliconi possono essere analizzati anche da sequenziamento profondo mirato.
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Representative Results
L'efficacia di gRNAs per indurre l'eliminazione della regione di DNA genomica di destinazione dovrebbe essere valutata in colture di cellule prima del confezionamento in rAAV per studi in vivo. A tal fine, il gRNAs e il SaCas9 esprimenti costrutti erano individulamente in cellule C2C12 e il DNA genomico è stato analizzato mediante PCR con primers fiancheggianti i siti di destinazione (Figura 1). Un prodotto PCR di ~ 500 bp indica l'eliminazione di successo del DNA genomic destinazione derivanti dalla modifica di gene mentre le cellule di controllo non devono cedere una band a causa delle grandi dimensioni del DNA genomic.
Una volta confermata l'efficacia della gRNAs nelle colture cellulari, può essere confezionati in rAAVrh.74 o altri sierotipi (ad esempio AAV6, 8 o 9, tutti mostrando robusto cardiaco genico) utilizzando la co-transfezione di tre plasmidi nelle cellule AAV293. Abbiamo scoperto che non è necessario fare due singoli rAAV preparazione per le due gRNAs, invece, abbiamo mescolato i due costrutti gRNA in un rapporto molare uguale e prodotto una preparazione rAAV singolo. Le particelle virali rAAV sono state purificate mediante ultracentrifugazione di pendenza di densità e la purezza sono stata analizzata da SDS-PAGE. La preparazione altamente purificato rAAV produrrebbe solo tre bande corrispondenti alle proteine del capside VP1, VP2 e VP3, rispettivamente, su SDS-PAGE, come illustrato nella Figura 2.
Le particelle virali rAAVrh.74 purificata iniettate nel giorno 1-3 neonati di topi mdx/utrofina+ /- via iniezione retro-orbitale o intraperitoneale. Abbiamo trovato entrambi i metodi ha funzionati bene per consegna cardiaco di rAAVrh.74-CRISPR. I topi iniettati possono essere analizzati per l'espressione di distrofina dall'immunofluorescenza che macchia (Figura 3) a 10 settimane di età.
Figura 1: convalida di gRNAs per la modifica di SaCas9-mediata del gene in cellule C2C12. L'elettroforesi su gel di agarosio rappresentante ha mostrato i prodotti PCR del DNA genomico Estratto da individulamente C2C12 con o senza SaCas9/gRNAs. La freccia indica che il prodotto PCR è derivato dal gene di editing. GAPDH è servito come riferimento. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: analisi delle particelle rAAVrh.74 da SDS-PAGE. Le particelle virali purificate rAAVrh.74 eseguite su SDS-PAGE ha mostrato tre fasce, corrispondenti a tre proteine del capside di AAV, VP1 (87 kDa), VP2 (72 kDa) e VP3 (62 kDa), rispettivamente. La presenza di solo questi 3 bande indica l'elevata purezza della preparazione rAAV senza contaminare altre proteine cellulari. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Colorazione di immunofluorescenza delle sezioni cuore dai topi mdx/utrofina+ /- a 10 settimane dopo il trattamento di AAV-SaCas9/gRNAs. Le immagini rappresentative di immunofluorescenza hanno mostrato l'espressione della distrofina (rosso) e caveolina-3 (verde) nelle sezioni cuore del WT, mdx/utrofina+ /- e mdx/utrofina+ /- i topi trattati con 1 x 1012 vg AAV-SaCas9/gRNA sistemica. DAPI è stato usato per etichettare i nuclei (blu). Barra della scala: 100 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
In questo protocollo, abbiamo dettaglio tutti i passi necessari per raggiungere in vivo gene cardiaco modifica in topi postnatali utilizza il recapito rAAVrh.74-mediata di SaCas9 e due gRNAs. Come precedentemente osservato, questo approccio può essere utilizzato per ripristinare l'espressione di distrofina in topi distrofici come descritto nel nostro lavoro27, ma potrebbero anche permettere gli studi di genetica inversa rapida dei geni legati al cardiaco in topi senza il lungo processo della approccio tradizionale ad eliminazione diretta per generare e modelli di mouse di knockout di razza.
Al fine di ottenere alta gene editing efficiente nel tessuto bersaglio, ci sono diversi passaggi critici da tenere a mente: 1) l'efficacia del SaCas9/gRNA per indurre l'eliminazione del DNA genomico mirato deve essere convalidata utilizzando linee cellulari appropriate; 2) è molto fondamentale selezionare un sierotipo AAV adeguato che consente di mediare un elevato livello di trasduzione genica in tessuto bersaglio e 3) determinare il percorso di consegna ottimale di vettori di AAV per trasferimento del gene per il tessuto desiderato.
Nel protocollo attuale, il progettato SaCas9/gRNAs sono stati confezionati in AAVrh.74 piuttosto che precedentemente segnalato AAV8 e AAV9 per modificare il gene Dmd 12,28. AAVrh.74 esibisce circa il 93% omologia a AAV829 ed è stato indicato per essere efficace nella trasduzione del muscolo scheletrico e non patogeni segue isolati degli arti consegna29,30,31. In questo protocollo, usiamo retro-orbitale iniezione intraperitoneale di rh.74 in topi neonatali di trasferimento del gene cardiaco. Abbiamo trovato che l'amministrazione di neonato di rAAVrh.74 è altamente efficace per il ripristino dell'espressione di distrofina in circa 30-40% dei cardiomiociti in topi che ricevono un alto dosaggio di rAAVrh.74 (1 x 1012 vg). È interessante notare, abbiamo trovato che l'espressione di distrofina muscolo scheletrico non è stata salvata in modo efficace. Ciò è probabilmente dovuto il trofismo muscolare scheletrico basso del sierotipo rh.74 quando somministrato per via endovenosa o intraperitoneale, anche se gli studi precedenti hanno mostrato che consegna isolata del membro di rAAVrh.74 efficacemente possibile trasdurre mouse e scimmia scheletrica muscolo29,30,31. Inoltre, quando il rAAVrh.74 è stato amministrato in topi adulti, abbiamo osservato molto bassa efficienza nel ristabilimento dell'espressione di distrofina. Sarebbe interessante determinare il dosaggio minimo che è necessario per ottenere il salvataggio di distrofina più alto. Inoltre, altri sierotipi e metodi di consegna possono essere testati e rispetto per il raggiungimento ottimale gene cardiaco di editing.
Eliminazione di successo di un grosso pezzo di DNA genomico richiede la consegna simultanea di due gRNAs. Abbiamo trovato che non è necessario effettuare due distinti rAAV preparati per la consegna di due gRNAs. In questo protocollo, abbiamo semplicemente mescolato i due plasmidi gRNA una quantità uguale durante transfezione per rAAV produzione e la produzione combinata di rAAV è stata trovata per essere efficace nella realizzazione di entrambi gRNAs. Questo approccio combinato è, quindi, risparmio di costi e di manodopera e consigliato quando erogazione contemporanea di due gRNAs sono necessari.
In molti casi, può essere necessario analizzare il gene editing efficiente di approcci genetici quando un buon anticorpo non è disponibile per il prodotto del gene bersaglio. Tuttavia, è tecnicamente difficile quantificare con precisione il gene editing efficacia con due gRNAs stesso locus di targeting, poiché i prodotti del gene editing includerebbe delezione di sequenza bersaglio, inversione della sequenza di destinazione e piccolo indels ad un solo obiettivo sito. Invece, è più significativo e fattibile quantificare l'efficienza dell'eliminazione sequenza desiderata mirati come nel nostro caso dove la riduzione dei trascritti contenenti esoni 21-23 può essere quantificata mediante RT-PCR in tempo reale.
In questo protocollo, descriviamo anche l'uso di analisi T7E1 e predizione computazionale per analizzare l'attività fuori bersaglio potenziale. Per il dosaggio di lavorare bene, è necessario utilizzare una DNA polimerasi ad alta fedeltà. Inoltre, è sempre una buona idea per preparare per un esperimento di controllo negativo (ad es. prodotti di controllo del DNA amplificato da tessuti o le cellule senza gene editing e trattati allo stesso modo come i campioni di prova) e un esperimento di controllo positivo (ad es. un campione noto con ben caratterizzato gene editing). Tuttavia, è di notare che il limite di rilevazione del T7E1 assay è circa 5%32e così si potrebbe non essere rilevabile dall'analisi della T7E1 se l'attività fuori bersaglio è inferiore al 5%. Guida-seq33 può essere utilizzato composto analizzare l'attività fuori bersaglio della redazione gene SaCas9/gRNA-mediata. I siti fuori bersaglio identificati da T7E1 assay, predizione computazionale e/o approcci di guida-seq ulteriormente possono essere quantificati per frequenze di indel seguendo in vivo gene editing tramite sequenziamento ad alta velocità.
Presi insieme, abbiamo fornito un approccio editing ottimizzato gene cardiaco utilizzando rAAVrh.74. Questo protocollo stabilito può essere ulteriormente testato per applicazioni terapeutiche e gli studi di genetici inverso.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi esiste.
Acknowledgments
U.R. è supportato dagli Stati Uniti istituti nazionali di sovvenzioni di salute (R01HL116546 e AR064241 R01).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 555 goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | A-21428 | |
| Benzonase Nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | |
| Bio Safety Cabinets | Thermo Fisher Scientific | 1347 | 1300 Series A2 Class II, Type A2 |
| BsaI | New England BioLabs Inc | RO535S | |
| Competent cells | Agilent Technologies | 200314 | |
| Cell culture dishes, 150mm | Nest Scientific USA | 715001 | |
| Cryostat | Leica Biosystems | Leica CM3050S | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | MT10017CV | Corning cellgro |
| Dystrophin antibody | Spring Bioscience | E2660 | |
| Fast-Ion Midi Plasmdi Kits | IBI Scientific | IB47111 | |
| FBS | Thermo Fisher Scientific | 26-140-079 | |
| Filter Unit, 0.45μm | Thermo Fisher Scientific | 166-0045 | |
| GoTaq Master Mixes | Promega | M7122 | |
| High-speed plasmid mini kit | IBI Scientific | IB47102 | |
| Horse serum | Abcam | ab139501 | |
| Isotemp 2239 Water Bath | Thermo Fisher Scientific | 15-460-11Q | |
| Isotemp Heat Block | Thermo Fisher Scientific | 11-718 | |
| Inverted confocal microscope | Carl Zeiss Microscopy, LLC | LSM 780 | |
| LightCycler 480 instrument | Roche | 5015243001 | LightCycler 480 Instrument II |
| Large Capacity Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 46-910 | Thermo Scientific Sorvall RC 6 Plus |
| Microcentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75002445 | Sorvall Legend Micro 21R |
| Nanodrop spectrophotometers | Thermo Scientific | ND2000CLAPTOP | NanoDrop™ 2000/2000c |
| Oligos for i20-F | Integrated DNA Technologies | CACCgGGCGT TGAAATTCTCATTAC |
|
| Oligos for i20-R | Integrated DNA Technologies | AAAC GTAATGAGAATTTCAACGCCc; | |
| Oligos for i23-F | Integrated DNA Technologies | CACCgCACCGATGAGAGGG AAAGGTC |
|
| Oligos for i23-R | Integrated DNA Technologies | GACCTTTCCCTCTCATCGGTGc | |
| Oligos | Integrated DNA Technologies | ||
| OptiPrep Density Gradient Medium | Sigma-Aldrich | D1556-250ML | |
| OptiMEM | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
| PEG8000 | Sigma-Aldrich | 89510-1kg-F | |
| Polyethylenimine | Polysciences | 23966 | |
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | P2308 | |
| Quick-Seal centrifuge tube | Beckman Coulter Inc | 342414 | |
| QIAquick Gel Extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| Radiant SYBR Green Hi-ROX qPCR Kits | Alkali Scientific | QS2005 | |
| RevertAid RT Reverse Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific | K1691 | |
| Rotor | Beckman Coulter Inc | 337922 | Type 70Ti |
| T4 DNA ligase | New England BioLabs Inc | M0202S | |
| Thermal Cycler | Bio-rad | 1861096 | |
| TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter Inc | 8043-30-1192 | Optima le-80k |
| Ultra centrifugal filter unit | MilliporeSigma | UFC510096 | |
| VECTASHIELD Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories, Inc | H-1200 |
References
- Makarova, K. S., Koonin, E. V. Annotation and Classification of CRISPR-Cas Systems. Methods Mol Biol. 1311, 47-75 (2015).
- Zetsche, B., et al. Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system. Cell. 163, 759-771 (2015).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339, 819-823 (2013).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339, 823-826 (2013).
- Lieber, M. R. The mechanism of double-strand DNA break repair by the nonhomologous DNA end-joining pathway. Annual review of biochemistry. 79, 181-211 (2010).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature protocols. 8, 2281-2308 (2013).
- Zhang, X., Wang, J., Cheng, Q., Zheng, X., Zhao, G. Multiplex gene regulation by CRISPR-ddCpf1. Cell discovery. 3, 17018 (2017).
- Zhang, X. H., Tee, L. Y., Wang, X. G., Huang, Q. S., Yang, S. H. Off-target Effects in CRISPR/Cas9-mediated Genome Engineering. Molecular therapy. Nucleic acids. 4, e264 (2015).
- Xu, L., et al. CRISPR-mediated genome editing restores dystrophin expression and function in mdx mice. Mol Ther. 24, 564-569 (2015).
- Long, C., et al. Postnatal genome editing partially restores dystrophin expression in a mouse model of muscular dystrophy. Science. 351, 400-403 (2016).
- Long, C. Z., et al. Prevention of muscular dystrophy in mice by CRISPR/Cas9-mediated editing of germline DNA. Science. 345, 1184-1188 (2014).
- Nelson, C. E., et al. In vivo genome editing improves muscle function in a mouse model of Duchenne muscular dystrophy. Science. 351, 403-407 (2016).
- Ousterout, D. G. K., Thakore, A. M., Majoros, P. I., Reddy, T. E. W. H., Gersbach, C. A. Multiplex CRISPR/Cas9-based genome editing for correction of dystrophin mutations that cause Duchenne muscular dystrophy. Nat Commun. 6, 6244 (2015).
- Tabebordbar, M., et al. In vivo gene editing in dystrophic mouse muscle and muscle stem cells. Science. 351, 407-411 (2016).
- Bengtsson, N. E., et al. Muscle-specific CRISPR/Cas9 dystrophin gene editing ameliorates pathophysiology in a mouse model for Duchenne muscular dystrophy. Nat Commun. 8, 14454 (2017).
- Hoffman, E. P., Brown, R. H., Kunkel, L. M. Dystrophin: the protein product of the Duchenne muscular dystrophy locus. Cell. 51, 919-928 (1987).
- Nowak, K. J., Davies, K. E. Duchenne muscular dystrophy and dystrophin: pathogenesis and opportunities for treatment. EMBO reports. 5, 872-876 (2004).
- Mendell, J. R., et al. Evidence-based path to newborn screening for Duchenne muscular dystrophy. Annals of neurology. 71, 304-313 (2012).
- Mendell, J. R., Lloyd-Puryear, M. Report of MDA muscle disease symposium on newborn screening for Duchenne muscular dystrophy. Muscle Nerve. 48, 21-26 (2013).
- Spurney, C. F. Cardiomyopathy of Duchenne muscular dystrophy: current understanding and future directions. Muscle Nerve. 44, 8-19 (2011).
- Moriuchi, T., Kagawa, N., Mukoyama, M., Hizawa, K. Autopsy analyses of the muscular dystrophies. Tokushima J Exp Med. 40, 83-93 (1993).
- McNally, E. M. New approaches in the therapy of cardiomyopathy in muscular dystrophy. Annual review of medicine. 58, 75-88 (2007).
- Baker, D. E. Approvals, Submission, and Important Labeling Changes for US Marketed Pharmaceuticals. Hosp Pharm. 52, 306-307 (2013).
- Baker, D. E. Eteplirsen. Hosp Pharm. 52, 302-305 (2017).
- Sicinski, P., et al. The molecular basis of muscular dystrophy in the mdx mouse: a point mutation. Science. 244, 1578-1580 (1989).
- Xu, L., et al. CRISPR-mediated Genome Editing Restores Dystrophin Expression and Function in mdx Mice. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 24, 564-569 (2016).
- El Refaey, M., et al. In Vivo Genome Editing Restores Dystrophin Expression and Cardiac Function in Dystrophic Mice. Circ Res. 121, 923-929 (2017).
- Tabebordbar, M., et al. In vivo gene editing in dystrophic mouse muscle and muscle stem cells. Science. 351, 407-411 (2016).
- Pozsgai, E. R., Griffin, D. A., Heller, K. N., Mendell, J. R., Rodino-Klapac, L. R. beta-Sarcoglycan gene transfer decreases fibrosis and restores force in LGMD2E mice. Gene therapy. 23, 57-66 (2016).
- Chicoine, L. G., et al. Plasmapheresis eliminates the negative impact of AAV antibodies on microdystrophin gene expression following vascular delivery. Mol Ther. 22, 338-347 (2014).
- Chicoine, L. G., et al. Vascular delivery of rAAVrh74.MCK.GALGT2 to the gastrocnemius muscle of the rhesus macaque stimulates the expression of dystrophin and laminin alpha2 surrogates. Mol Ther. 22, 713-724 (2014).
- Vouillot, L., Thelie, A., Pollet, N. Comparison of T7E1 and surveyor mismatch cleavage assays to detect mutations triggered by engineered nucleases. G3. 5, 407-415 (2015).
- Tsai, S. Q., et al. GUIDE-seq enables genome-wide profiling of off-target cleavage by CRISPR-Cas nucleases. Nat Biotechnol. 33, 187-197 (2015).
