Summary
여기 우리 vivo 심장 유전자 재조합 Adeno-Associated 바이러스 (rAAV)를 사용 하 여 마우스에서 편집을 수행 하는 자세한 프로토콜 제공-CRISPR의 납품을 중재. 이 프로토콜 듀 켄 씨 근이 영양 증에서 dystrophic 심장 근육 병 증을 치료 하는 유망 치료 전략을 제공 하 고 출생 후 쥐에서 심장 관련 녹아웃을 생성 하는 데 사용할 수 있습니다.
Abstract
클러스터, 정기적으로 interspaced, 짧은, 구조 반복 (CRISPR) 시스템은 크게 배양된 세포에 다양 한 종의 생물 게놈 엔지니어링을 촉진 했다. CRISPR 기술 또한 인간의 질병의 숫자에 대 한 새로운 치료제로 탐험 되었습니다. 개념 증명 데이터는 매우 고무적인 타당성과 듀 켄 씨 근이 영양 증 (DMD) murine 모델을 사용 하 여에 대 한 편집 기반 치료 방법은 유전자의 효능을 설명 하는 최근 학문에 의해 exemplified입니다. 특히, 재조합 형 adeno 관련 바이러스 (rAAV) serotype rh.74 (rAAVrh.74)의 정 맥 및 복 주사 (SaCas9) 포도 상 구 균 CRISPR 관련 단백질 9의 효율적인 심장 배달 및 2 있었습니다. exon 23 마우스 Dmd 유전자에에서 돌연변이 codon 게놈 영역을 삭제 하려면 RNAs (gRNA) 안내. 이 같은 방법은 유전자의 관심 밖으로 노크 하는 gRNA 유전자의 코딩 지구를 대상으로 설계는 출생 후 마우스에 그들의 심장 기능을 공부도 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜에서 우리가 자세히 표시 rAAVrh.74 CRISPR 벡터 하는 방법 및 신생아 쥐에 고효율 심장 납품을 달성 하는 방법.
Introduction
클러스터, 정기적으로 interspaced, 짧은 구조 반복 (CRISPR) 기술 게놈 엔지니어링에서 가장 최근의 발전을 나타내고 세포와 유기 체 유전학의 현재 연습을 혁명을. CRISPR 관련 된 단백질 (Cas9) 9 등 CRISPR 관련 endonuclease 직접 단일 가이드 RNA (gRNA)을 이용 한다 CRISPR 기반 게놈 편집 하 고는 protospacer 시퀀스에 보완은 genomic DNA 대상에 Cpf1와 gRNA에 의해 인코딩 한 특정 protospacer 인접 한 모티브 (PAM)1,2. PAM은 Cas9 또는 Cpf1 유전자의 세균성 종에 따라 다릅니다. 연쇄 상 구 균 pyogenes (SpCas9)에서 파생 된 가장 일반적으로 사용 되 Cas9 nuclease NGG 비 대상 가닥에 genomic DNA에서 직접 대상 시퀀스의 다운스트림 발견 되는 팸 시퀀스를 인식 합니다. 대상 사이트에 Cas9 및 Cpf1 단백질 생성 등 비 동종 끝 결합 (NHEJ) 상 동 감독 수리 (HDR) 경로3내장 세포 DNA 수리 메커니즘을 통해 복구 다음, 이중 가닥 휴식 (DSB) 4. 동종 재결합에 대 한 DNA 템플렛의 부재, DSB는 주로 수리 삽입 또는 삭제 (indels)에서 발생할 수 있는 오류가 NHEJ 통로 DSB 코딩에서 만들어진 경우 frameshift 돌연변이 일으키는 뉴클레오티드의 6유전자5,지역. 따라서, CRISPR 시스템은 널리 사용 되었습니다 다양 한 휴대폰 모델 및 전체 유기 체에 있는 손실의 기능 돌연변이 하는 유전자의 기능을 조사 하기 위하여. 또한, 촉매로 비활성 Cas9 및 Cpf1 transcriptionally를 개발 되었습니다 그리고 epigenetically 조절 대상 유전자7,8의 표현.
더 최근에, SpCas9 및 SaCas9 ( 황색 포도상구균에서 파생 됨)는 패키지 재조합 형 adeno 관련 바이러스 (rAAV) 벡터 인간 질환의 동물 모델에서 출생 후 유전자 교정용으로 특히, 듀 켄 씨 근 위축 증 (DMD)9,10,11,12,13,,1415. DMD는 치명적인 X 연결 된 열성 질병 dystrophin 단백질16,17인코딩하는 DMD 유전자에 있는 돌연변이 기인한 신생아 심사18 에 따르면 약 3500에서 한 남성 출생에 영향을 미치는 , 19. 진보적인 근육 약점 그리고 낭비 특징 이다. DMD 환자는 일반적으로 20-30 년20의 나이 10 ~ 12 세 사이의 호흡기 또는 심장 실패의 다이 걸을 기능 손실. 특히, 심근에 개발 > DMD 환자와 나타냅니다 DMD 환자21,22에 죽음의 주요 원인의 90%. 비록 Deflazacort (항 염증 약물) 및 Eteplirsen (는 엑손 exon 51를 건너뛰는 데 약을 건너뛰는) 최근 승인 된 DMD에 대 한 식품 및 의약품 안전 청 (FDA)23,24, 이러한 치료의 게놈 DNA 수준에서 유전적 결함을 수정 합니다. Exon 23 dystrophin 유전자의 점 돌연변이 운반, mdx 마우스 DMD 모델25로 널리 사용 되었습니다. 또한, 우리 이전 기능 dystrophin 식 취재 exons 21, 22, 23 일 근육 광고-SpCas9/gRNA 배달9 사용 하 여 mdx 쥐의 골격 근육에서 게놈 DNA의 프레임 삭제에 의해 복원 된 시연 , 그리고 정 맥 및 복 rAAVrh.74-SaCas9/gRNA 배달26를 사용 하 여 mdx/utrophin/- 생쥐의 심장 근육에.
이 프로토콜에서 우리가 자세히 설명 출생 후 심장 유전자 dystrophin mdx/utrophin/- 생쥐 dystrophin 분석 심장 근육 섹션에 gRNA 디자인에서 rAAVrh.74-SaCas9/gRNA 벡터를 사용 하 여 복원 하려면 편집 모든 단계.
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Protocol
이 프로토콜에 사용 되는 동물의 오하이오 주립 대학 실험실 동물 자원에서 동물 사용 지침에 따라 유지 되었다. 모든 동물 연구 기관 동물 관리, 사용, 및 오하이오 주립 대학의 검토 위원회에 의해 승인 했다.
1. 디자인 및 CRISPR 벡터에 gRNAs의 복제
- SaCas9에 대 한 dystrophin intron 20과 intron 23 (i20 및 i23)를 대상으로 하는 2 gRNAs 선택: i20: 5'-GGGCGTTGAAATTCTCATTAC CAGAGT 및 i23: 5'-CACCGATGAGAGGGAAAGGTC CTGAAT (PAM 시퀀스는 밑줄을 표시 하 고 이탤릭체).
참고: i20 i23에 대 한 대상 사이트는 약 23 킬로 기본적인 쌍 (kbp) 멀리. 코딩 유전자 중단, 두 gRNAs NNGRRT 팸 일반적인 exons를 대상으로 SaCas9에 대 한 시퀀스 (선호 NNGAAT, NNGGGT 및 NNGAGT) 및 20 kbp 이내 거리는 것이 좋습니다. - 버퍼를 어 닐 링 x 1에서 다음 PCR 매개 변수 anneal gRNA oligos (100 µ / L)를 사용 (버퍼 재고를 어 닐 링 x 5 0.5 mol/L K-아세테이트, 150 mmol/L HEPES 포함-코, 10 mmol/L Mg-아세테이트, pH7.4): 95 ° C 10 분 당 0.4 ° c 95 ~ 59 ° C의 90 주기 감소 20 주기 s, 20 주기 당 0.3 ° C 감소와 59 ~ 32 ° C의 90 주기 s, 20 주기 당 0.3 ° C 감소와 32에 26 ° C의 20 주기 s.
- pX601-CMV-SaCas9-mPA-U6-gRNA로 단련된 gRNA oligos를 위하여 BsaI와 T4 DNA 리가 한 반응에 사용 하 여 (1 µ L 50 ng / µ L pX601-CMV-SaCas9-mPA-U6-gRNA, 1 µ L 단련 oligos, 1.5 µ L 10 x T4 DNA 리가 버퍼, 0.5 µ L T4 DNA 리가, 1 µ L BsaI, 10 µ L ddH2O ), PCR cycler에서 다음 반응 조건: 5 주기 [37 ° C 5 분 및 16 ° C 10 분]; 37 ° C 20 분; 80 ° C 5 분입니다.
- 15 µ L 결 찰 제품을 30 µ L 유능한 세포 변환, 100 µ g/mL 암 피 실린, 한 천 판에 24 h에 대 한 37 ° C에서 문화 셀 접시.
- 5-10 식민지와 100 µ g/mL 암 피 실린 37 ° c, 250 rpm 3-4 h 흔드는 인큐베이터에 들어 있는 LB 매체 문화를 선택 합니다.
- PCR에 의해 식민지 화면: 10 µ L 2 x PCR 마스터 믹스, 8 µ L ddH2O, 1 µ L 대장균 문화, 1 µ L 10 µ / L U6-앞으로 뇌관, 1 µ L i20 또는 i23 gRNA 역 뇌관. PCR 자전거 매개 변수: 95 ° C 5 분, 95 ° C 30 s, 61 ° C 30 초, 72 ° C 30 s의 35 주기.
- 추가 4 mL 신선한 파운드 중간 containing100 µ g/mL 암 피 실린, 고 37 ° C, 250 rpm에서 하룻밤 문화에 의해 긍정적인 클론의 5 mL 문화를 준비 합니다.
- 적절 한 플라스 미드 추출 키트를 사용 하 여 DNA 플라스 미드 정화 하 고 생어에 의해 플라스 미드를 확인 시퀀싱 U6-앞으로 뇌관.
- 10 %FBS 1% 보충 DMEM C2C12 셀 문화 펜-Strep 유전자는 플라스 미드의 효능 편집 테스트용 ~ 70 %confluency 도달할 때까지.
- Electroporate 5 µ g 1 x 106 C2C12 셀 제조업체의 프로토콜에 따라 1:1 어 금 니 비율에서 SaCas9/gRNA 플라스 미드 혼합물의 총.
- 48 h 후 transfection 후 C2C12 세포를 수확 하 고 게놈 DNA를 추출 합니다.
- 사용 100 ng genomic DNA 템플릿으로 마우스 dystrophin 로커 스에 대 한 PCR 반응을 수행 하: 전달 뇌관 5'-GGCCAAAGCAAACTCTGGTA (1 µ L 10 µ / L), 반전 뇌관 5'-TTTAATCCCACGTCATGCAA (1 µ L 10 µ / L), 10 µ L 2 녹색 PCR x 마스터 믹스, 7 µ L ddH2O, 1 µ L genomic DNA ( 100 ng). PCR를 사용 하 여 순환 조건 95 ° c 5 분, [95 ° C 30 s, 61 ° C 30 s, 72 ° C 30 s]의 35 주기 72 ° C 2 분.
2입니다. rAAV 생산
- 셀 문화, 15 cm의 20 ~ 40에 AD293 셀 씨 고 DMEM 10 %FBS 1% 보완 유지 펜-Strep transfection 대 ~ 90 %confluency 도달할 때까지.
- 200 µ L로 희석 3 플라스 미드 감소 (접시) 당 혈 청 매체: 1) 10 µ g pHelper; 2) 5 µ g pXR (rh.74 또는 다른 serotypes) 및 3) pX601-i20, pX601 i23 혼합물 (1:1 비율)의 5 µ g의 총. 80 µ L 페이와 혼합 하 여 polyethylenimine (페이) transfection를 수행 하 고 dropwise 방식에서 10 분 추가 AD293 세포 배양에 혼합물에 대 한 실 온에서 품 어.
- AAV 바이러스 생산, 72 h 게시물 transfection 후 10 분 동안 1100 x g에서 원심 분리 하 여 미디어와 AD293 셀 알 약을 수집 하 셀 스 크레이 퍼를 사용 합니다.
- 액체 질소와 42 ° C 물 탕에서 보육 교류 3 freeze-thaw 주기 다음 15 mL rAAV 세포의 용 해 버퍼 (50 mmol/L 트리 스 베이스, 150 mmol/L NaCl, pH 8.5)에 셀 펠 릿 resuspend 그들은 즉시 처리 되지 않는 경우 미래 처리를 위한-80 ° C에 세포 lysates를 저장 합니다.
- 0.45 μ m 필터와 문화 미디어를 필터링 하 고 추가 40% PEG8000 2.5 mol/L NaCl에에서 8%의 최종 농도. 1 시간에 4 ° C에 혼합물 그리고 15 분 동안 1100 x g에서 원심 분리기를 품 어.
- RAAV 세포의 용 해 버퍼에 산 탄을 resuspend 하 고 단계 2.3, 뒤에 1 시간 동안 37 ° C에서 benzonase (50 U/mL) 치료에서에서 세포 lysates 결합.
- 원심 benzonase 처리 rAAV 혼합물 1100 x g 4 ° C에서 15 분을 포함 하 고 상쾌한 (원유 rAAV 준비)를 저장 합니다.
3. rAAV 정화 및 농도
- 하단에는 다음 순서에 따라 ultracentrifuge 튜브에 iodixanol 그라데이션에 원유 rAAV 준비 위에서 로드: 원유 AAV lysate (~ 15 mL), 8 mL 15 %Iodixanol, 6 mL 25 %Iodixanol, 5 mL 40 %Iodixanol, 5 mL 58 %Iodixanol. 1 x DPBS를 사용 하 여 정상에 튜브의 나머지 빈 볼륨을 작성 합니다.
- 230000 x g 10 ° C에서 120 분 ultracentrifuge로 터에서에 샘플 원심을 3-4 mL 18 G 바늘 rAAV 입자를 포함 하는 40% 그라데이션 분수의를 수집 합니다.
- 1 x DPBS와 원심 분리기는 원심 필터 장치 (MWCO 100 kDa)를 사용 하 여 rAAV 입자를 희석. 대 한이 단계를 반복 3-5 시간 및 마지막으로 300-500 µ L rAAV 준비 집중.
4입니다. rAAV Titering
- 2 µ L 집중 rAAV, 에탄올에 3 M NaOAc와 20 µ L ddH2O. resuspend 촉진에서 게놈 DNA를 추출
- PX601 플라스 미드의 직렬 희석에 의해 rAAV 정량에 대 한 표준 곡선을 얻기: 1 x 109, 1 x 108,1 x 107, 1 x 106, 각 10 µ L ddH2O. Dilute DNAase 치료 rAAV 1 x 105 부 샘플 1:10, 1시 50분, 1: 100, 그리고 1:1000.
- 실시간 PCR 시스템에서 제조업체의 지시에 따라 정량 키트를 사용 하 여 실시간 양이 많은 PCR (정량)에 의해 rAAV titer 결정: 1 µ L 10 µ / L 각 뇌관의 (5'-GGATTTCCAAGTCTCCACCC 및 5'-TCCCACCGT ACACGCCTAC), 5 µ L PCR 마스터 믹스, 희석 1 µ L x 2 rAAV 샘플 및 2 µ L ddH2O. 자전거 매개 변수가 반응 실행: 95 ° C 3 분, 45의 주기 [95 ° C 5 초 61 ° C 20 초].
5. 정 맥 및 복 rAAVrh.74-CRISPR 신생아 mdx/utrophin/- 생쥐에 주입
- 1 분 동안 얼음에 배치 하 여 mdx/utrophin+ 마우스 새끼 (3 일)를 immobilize 하 고 1 x 1012 복고풍 궤도 접근 또는 복 주사를 통해 체계적으로 마우스 당 50 µ L에서 바이러스 성 입자와 관리.
- 복구 하 고 다시 자신의 집 새를 마우스 수 있습니다. RAAV 관리 후 10 주, 조직 컬렉션에 대 한 공동2 노출에 의해 쥐를 안락사.
- 스냅-동결 genomic DNA와 RNA 추출 및 사용 isopentane 최적의 절삭 온도와 조직 cryosectioning 복합 동결 액체 질소에 냉각에 대 한 조직.
6입니다. 결과 편집 대상 유전자의 분석
-
게놈 DNA PCR 분석
- Mdx/utrophin/- 생쥐의 심장 조직에서 게놈 DNA 치료 또는 rAAV 없이 총을 격리 합니다.
- 1.12 단계에서에서 동일한 프로토콜을 사용 하 여 PCR 분석에 대 한.
-
Dystrophin 식의 RT-PCR 분석
- 제조업체의 설명서에 따라 RNA 추출 키트와 함께 심장 조직에서 총 RNA를 추출.
- 반전 녹음 방송을 수행 하려면 미리 RNase 무료 DNase와 총 RNA를 치료 하 고 템플릿으로 처리 RNA의 5 µ g를 사용 하 여 반전 녹음 방송 장비를 가진 첫번째 물가 cDNA 합성에 대 한.
- 반전 녹음 방송 제품을 사용 하 여 dystrophin cDNA 뇌관으로 dystrophin 식의 RT-PCR 분석: 5'-GGCTAGAGTATCAAACCAACATCAT 및 5'-TGGAGGCTTACGGTTTTATCC.
-
정량 분석에 의해 효능을 편집 하는 유전자 예측
- 양적 RT-PCR exon 22 포함 된 성적 (exon 21) 앞으로 뇌관을 사용 하 여 감소를 감지 하 여 효능을 편집 하는 유전자 예측: 5'-TTGTCAGCTCTTCAGCCTCAAA, 그리고 역방향 뇌관 (exon 23): 5'-AAACTCTCCTTCACAGTGTCACT. 앞으로 뇌관 참조 유전자로 Gapdh 사용: 5'-AGGTTGTCTCCTGCGACTTC 및 역방향 뇌관: 5'-GGTGGTCCAGGGTTTCTTACT.
- 양이 많은 실시간 PCR (정량) 실시간 PCR 시스템과 2 단계 반응 조건에서 제조 업체의 지시에 따라 정량 키트를 사용 하 여 실행: 95 ° C 3 분, 95 ° C 5 sec와 61 ° C 30 초 45 주기.
-
면역 형광 분석 dystrophin 식 얼룩
- 잘라 냉동된 조직 두께 10 µ m. 수정에는 cryostat를 사용 하 여 15 분 동안 실 온에서 4 %paraformaldehyde 냉동된 섹션.
- PBS로 2 배를 세척 하 고 1 시간에 대 한 솔루션 (10% 말 혈 청) 차단으로 품 어.
- 안티 dystrophin 기본 항 체, 4 ° C 하룻밤에 품 어.
- PBS와 슬라이드를 씻어 3 × 5 분 및 1 시간에 대 한 실 온에서 형광 이차 항 체 (1: 500)를 품 어.
- DAPI를 장착 매체를 사용 하 여 거꾸로 confocal 현미경으로 이미징 슬라이드를 탑재 합니다.
7. 오프 대상 분석 T7E1 분석 결과
- 온라인 CRISPR를 사용 하 여 잠재적인 대상 오프 사이트 디자인 도구와 같은 예측 < http://crispr.mit.edu>.
- 게놈 지역 취재는 상위 5-10 잠재적인 대상 오프 사이트 PCR에 의해 증폭: genomic DNA 200, 1 µ L 고 충실도 DNA 중 합 효소, 5 µ L 10 x PCR 버퍼 믹스, 1.5 µ L 10와 50 µ L 총 볼륨 조정 사이트별 정방향 및 역방향 뇌관의 µ / L ddH2o.
- 전기 이동 법으로 PCR 제품을 실행 하 고 추출 젤 추출 키트를 사용 하 여 DNA를 정화. 광을 사용 하 여 농도 측정 합니다.
- 변성 시키기 및 다시 사용 하 여 PCR cycler 버퍼 2.1에서 천천히 정화 amplicons 어 닐 링에 의해 heteroduplex 형성을 촉진 합니다. 동일한 자전거 상태를 사용 하 여 단계 1.2에서에서 상술 된 대로.
- 0.5 µ L T7E1 효소, 37 ° C에서 30 분 동안 다시 단련된 제품을 소화 하 고 사용 하 여 1-2 %agarose 젤 전기 이동 법에 의해 반응 분석.
참고:는 amplicons 또한 타겟된 깊은 시퀀싱 하 여 분석할 수 있습니다.
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Representative Results
대상 게놈 DNA 영역 삭제를 유도 하는 gRNAs의 효능 vivo에서 학문을 위한 rAAV로 포장 하기 전에 셀 문화에서 평가 되어야 한다. 이 위해, gRNAs 및 SaCas9을 표현 구문 electroporated C2C12 세포로 되었고 대상 사이트 (그림 1) 측면 뇌관으로 PCR에 의해 게놈 DNA 분석. PCR 제품 ~ 500 bp 대상 게놈 DNA 유전자 제어 세포 게놈 DNA의 큰 크기로 인해 밴드 양보 하지 해야 하는 동안 편집에서 결과의 성공적인 삭제를 나타냅니다.
일단 세포 배양에는 gRNAs의 효능 확인 되었습니다, 그들은 AAV293 셀에 3 개의 플라스 미드 공동 transfection를 사용 하 여 rAAVrh.74 또는 (예: AAV6, 8 또는 9, 모든 보여주는 강력한 심장 유전자 배달) 다른 serotypes에 패키징할 수 있습니다. 우리는 두 개의 gRNAs에 대 한 두 개의 개별 rAAV 준비를 만들기 위해 필요 하지 않습니다, 대신, 우리 같은 어 금 니 비율에서 두 개의 gRNA 구조를 혼합 하 고 단일 rAAV 준비 생산을 발견. RAAV 바이러스 성 입자 밀도 그라데이션 ultracentrifugation를 사용 하 여 순화 했다 고 순도 SDS-PAGE로 분석 했다. 높게 순화 rAAV 준비 SDS 페이지 그림 2와 같이 각각, VP1, VP2, 및 VP3, capsid 단백질에 해당 하는 3 밴드 얻을 것 이다.
순화 rAAVrh.74 바이러스 성 입자는 복고풍 궤도 또는 복 주입을 통해 mdx/utrophin/- 생쥐의 1-3 신생아 하루에 주입 했다. 우리는 두 가지 방법 모두 rAAVrh.74 CRISPR의 심장 배달을 위해 근무 발견. 주입 된 쥐 dystrophin 식 면역 형광 염색 법 (그림 3)에 의해 나이의 10 주에 분석할 수 있습니다.
그림 1: gRNAs SaCas9 중재 하는 유전자는 C2C12 셀에서 편집의 유효성 검사. 대표 agarose 젤 전기 이동 법 electroporated C2C12 또는 SaCas9/gRNAs 없이에서 추출한 게놈 DNA의 PCR 제품을 보여주었다. 화살표는 PCR 제품에서 유전자 편집 결과 나타냅니다. Gapdh 참조로 제공 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: SDS 페이지 rAAVrh.74 입자의 분석. 순화 rAAVrh.74 바이러스 성 입자 SDS 페이지에서 실행 했다 3 개의 악대, AAV, VP1의 세 capsid 단백질에 해당 (87 kDa), VP2 (72 kDa) 및 VP3 (62 kDa), 각각. 이 3 밴드의 존재는 다른 세포질 단백질 오염 없이 rAAV 준비의 고 순도 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 면역 형광 검사는 mdx/utrophin/- 생쥐에서 심장 섹션의 얼룩이 지는 AAV-SaCas9/gRNAs 치료 다음 10 주. 대표적인 면역 형광 이미지 dystrophin (레드)와 caveolin-3 식 (녹색) mdx/utrophin+ WT의 심장 부분에 고 mdx/utrophin+ 마우스 1 x 1012 vg로 치료 AAV-SaCas9/gRNA 체계적으로. DAPI 핵 (파란색) 라벨을 사용 했다. 눈금 막대: 100 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
이 프로토콜에서 우리 vivo 심장 유전자 SaCas9 및 2 개의 gRNAs의 납품 rAAVrh.74 중재를 사용 하 여 출생 후 생쥐에서 편집을 달성 하는 데 필요한 모든 단계를 상세하게. 이전 지적,이 이렇게 dystrophic 쥐에서 dystrophin 식27의 우리의 작업 설명 된 대로 복원 사용할 수 있지만 그것은 또한 급속 한 반전 유전학 연구의 긴 과정 없이 쥐 심장 관련 유전자의 활성화 수는 생성 하 고 사육 녹아웃 마우스 모델 전통적인 녹아웃 접근.
편집 대상 조직에 효율성 높은 유전자를 달성 하기 위해 마음에 계속 몇 가지 중요 한 단계가 있다: 1) 타겟된 게놈 DNA의 삭제를 유도 하는 SaCas9/gRNA의 효능 적절 한 셀 라인;를 사용 하 여 유효성을 검사 하는 데 필요한 2) 그것은 매우 중요 한 대상 조직 및 3에 유전자 변환의 높은 레벨을 중재할 수 있는 적절 한 AAV serotype 선택 하) 원하는 조직에 유전자 전송 위한 AAV 벡터의 최적의 전송 경로 결정.
현재 프로토콜에서 설계 된 SaCas9/gRNAs AAVrh.74로 포장 했다 보다는 이전에 보고 된 Dmd 유전자12,28편집 하려면 AAV8 및 AAV9. AAVrh.74 전시 약 93% AAV829 에 상 동 표시 되었습니다 및 비 병원 성 및 골격 근육 시험에 효과적인 고립 된 다음 배달29,,3031사지. 이 프로토콜을 사용 하 여 신생아 쥐에 rh.74의 복고풍-궤도 복 주입 심장 유전자 전송을 위해. 우리는 rAAVrh.74의 신생아 관리 rAAVrh.74 (1 x 1012 vg)의 높은 복용량을 받을 쥐 cardiomyocytes의 약 30 ~ 40%에 dystrophin 식의 복원에 대 한 고효율 발견. 흥미롭게도, 우리는 골격 근육 dystrophin 식 효과적으로 구출 하지 되었다 발견. 이것은 정 맥 또는 복 주입을 통해 관리 될 때 rh.74 serotype의 낮은 골격 근육 차 있는 굴곡 운동으로 인해 이전의 연구 보여주었다 마우스와 원숭이 골격 rAAVrh.74의 고립 된 사지 배달 transduce 효과적으로 수 있습니다. 근육29,,3031 또한, rAAVrh.74는 성인 쥐에 투여 때 복원 dystrophin 식에서 매우 낮은 효율을 관찰 합니다. 그것은 가장 높은 dystrophin 구조를 달성 하는 데 필요한 최소 복용량을 결정 하기 위해 재미 있을 것. 또한, 다른 serotypes 및 전달 방법 테스트 고 최적의 심장 유전자 편집 달성에 대 한 비교.
큰 게놈 DNA의 성공적인 삭제 두 gRNAs의 동시 전달을 필요합니다. 우리는 그것은 2 개의 gRNAs를 제공 하기 위한 두 개의 별도 rAAV 준비 하는 데 필요한 발견. 이 프로토콜에서 우리는 단순히 rAAV 생산, transfection 동안 동일한 금액의 두 gRNA 플라스 미드를 혼합 하 고 rAAV의 결합된이 생산 모두 gRNAs에 효과가 발견 되었습니다. 결합 된이 접근은, 따라서, 비용 및 노동 절약 및 때 권장 두 gRNAs의 동시 전달이 필요.
많은 경우에, 그것은 좋은 항 체 대상 유전자 제품에 사용할 수 없는 경우 유전 접근 하 여 효율을 편집 하는 유전자를 분석 해야 합니다. 그러나, 그것은 기술적으로 정확 하 게 계량 효능 유전자 편집 제품 대상 시퀀스 삭제, 대상 순서 반전, 그리고 하나의 대상에서 작은 indels 포함 이후 같은 장소를 대상으로 하는 2 개의 gRNAs와 편집 진에 도전 사이트입니다. 대신, 그것은 더 많은 의미 있는 exons 21-23을 포함 된 성적 증명서의 감소 실시간 RT-PCR에 의해 계량 하는 수 있는 우리의 경우 원하는 타겟된 시퀀스 삭제의 효율성을 측정 가능.
이 프로토콜에서 우리는 또한 T7E1 분석 결과 및 잠재적인 대상 오프 활동을 분석 하는 계산 예측의 사용을 설명 합니다. 잘 작동 하도록 분석 결과 대 한 그것은 고 충실도 DNA 중 합 효소를 사용 하는 데 필요한입니다. 또한, 그것은 항상 부정적인 제어 실험에 대 한 준비 하는 것이 좋습니다 (예: 제어 DNA 유전자 편집 없이 세포/조직에서 증폭 제품과 같은 방식으로 테스트 샘플 처리)와 긍정적인 제어 실험 (예: 알려진된 샘플으로 잘 특징이 유전자 편집)입니다. 그러나, 참고는 532, 그리고 이렇게 그것에 대 한 분석 결과 T7E1의 검출 한계 되지 않을 수 있습니다 T7E1 분석 결과 의해 감지 대상 오프 활동 5% 미만인 경우의입니다. 가이드-seq33 unbiasedly 유전자 편집 SaCas9/gRNA-중재의 대상 오프 활동 분석에 사용할 수 있습니다. T7E1 분석 결과, 전산 예측 및 가이드-seq 접근에서 식별 된 대상 오프 사이트 수 더 indel 주파수 에 vivo 유전자 높 처리량 연속 편집에 따라 측정할 수 있습니다.
함께 찍은, 우리 rAAVrh.74를 사용 하 여 최적화 된 심장 유전자 편집 접근 제공. 이 설립된 프로토콜 추가 치료 응용 프로그램 및 역방향 유전자 연구에 대 한 테스트할 수 있습니다.
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Disclosures
관심의 없습니다 충돌 존재합니다.
Acknowledgments
상대습도 미국 (R01HL116546 및 R01 AR064241) 건강의 국가 학회에 의해 지원 됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 555 goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | A-21428 | |
| Benzonase Nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | |
| Bio Safety Cabinets | Thermo Fisher Scientific | 1347 | 1300 Series A2 Class II, Type A2 |
| BsaI | New England BioLabs Inc | RO535S | |
| Competent cells | Agilent Technologies | 200314 | |
| Cell culture dishes, 150mm | Nest Scientific USA | 715001 | |
| Cryostat | Leica Biosystems | Leica CM3050S | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | MT10017CV | Corning cellgro |
| Dystrophin antibody | Spring Bioscience | E2660 | |
| Fast-Ion Midi Plasmdi Kits | IBI Scientific | IB47111 | |
| FBS | Thermo Fisher Scientific | 26-140-079 | |
| Filter Unit, 0.45μm | Thermo Fisher Scientific | 166-0045 | |
| GoTaq Master Mixes | Promega | M7122 | |
| High-speed plasmid mini kit | IBI Scientific | IB47102 | |
| Horse serum | Abcam | ab139501 | |
| Isotemp 2239 Water Bath | Thermo Fisher Scientific | 15-460-11Q | |
| Isotemp Heat Block | Thermo Fisher Scientific | 11-718 | |
| Inverted confocal microscope | Carl Zeiss Microscopy, LLC | LSM 780 | |
| LightCycler 480 instrument | Roche | 5015243001 | LightCycler 480 Instrument II |
| Large Capacity Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 46-910 | Thermo Scientific Sorvall RC 6 Plus |
| Microcentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75002445 | Sorvall Legend Micro 21R |
| Nanodrop spectrophotometers | Thermo Scientific | ND2000CLAPTOP | NanoDrop™ 2000/2000c |
| Oligos for i20-F | Integrated DNA Technologies | CACCgGGCGT TGAAATTCTCATTAC |
|
| Oligos for i20-R | Integrated DNA Technologies | AAAC GTAATGAGAATTTCAACGCCc; | |
| Oligos for i23-F | Integrated DNA Technologies | CACCgCACCGATGAGAGGG AAAGGTC |
|
| Oligos for i23-R | Integrated DNA Technologies | GACCTTTCCCTCTCATCGGTGc | |
| Oligos | Integrated DNA Technologies | ||
| OptiPrep Density Gradient Medium | Sigma-Aldrich | D1556-250ML | |
| OptiMEM | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
| PEG8000 | Sigma-Aldrich | 89510-1kg-F | |
| Polyethylenimine | Polysciences | 23966 | |
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | P2308 | |
| Quick-Seal centrifuge tube | Beckman Coulter Inc | 342414 | |
| QIAquick Gel Extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| Radiant SYBR Green Hi-ROX qPCR Kits | Alkali Scientific | QS2005 | |
| RevertAid RT Reverse Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific | K1691 | |
| Rotor | Beckman Coulter Inc | 337922 | Type 70Ti |
| T4 DNA ligase | New England BioLabs Inc | M0202S | |
| Thermal Cycler | Bio-rad | 1861096 | |
| TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter Inc | 8043-30-1192 | Optima le-80k |
| Ultra centrifugal filter unit | MilliporeSigma | UFC510096 | |
| VECTASHIELD Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories, Inc | H-1200 |
References
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