Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Tynn Film sammensatt Silicon elastomerer for cellekultur og huden programmer: produksjon og karakterisering

Published: July 3, 2018 doi: 10.3791/57573
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 1,3, 1, 1,2, 1
1INM - Leibniz Institute for New Materials, 2Department of Materials Science and Engineering, Saarland University, 3University of Applied Sciences Kaiserslautern
* These authors contributed equally

Summary

En protokoll for produksjonen av polymere tynnfilm kompositt-strukturer har forskjellige Youngs moduli eller tykkelser presenteres. Filmer er produsert for avansert celle kulturstudier eller som huden lim.

Abstract

I denne protokollen presenterer vi metoder for å dikte tynn elastomer sammensatt filmer for avansert celle kultur programmer og utvikling av huden lim. To forskjellige poly-(dimethyl siloxanes) (PDMS og myk hud lim (SSA)), har blitt brukt i dybden undersøkelse av biologiske effekter og lim egenskaper. Sammensatt filmene består av en fleksibel backing lag og en selvklebende topp belegg. Begge lag har blitt produsert av legen blad programmet teknikken. I stede etterforskningen, har selvklebende virkemåten til sammensatte filmer blitt undersøkt som en funksjon av lagtykkelse eller en variant av den unge modulus av det øverste laget. Den unge modulus av PDMS er blitt endret av varierende basen crosslinker blanding forhold. I tillegg tykkelsen på SSA filmer har vært varierte fra ca 16 µm til ca. 320 µm. skanning elektronmikroskop (SEM) og optiske mikroskopi er brukt for tykkelsen. Selvklebende egenskapene av elastomer filmer avhenger sterkt filmen tykkelsen, den unge modulus polymerer og overflate egenskaper. Derfor har vanlig vedheft av disse filmene på glass underlag viser glatt og røff flater blitt undersøkt. Trekk av stress og verk av separasjon er avhengig av miksing forholdet mellom silikon elastomerer.

I tillegg har tykkelsen av myk hud limet plasseres over en støttende backing lag vært variert for å produsere oppdateringer for huden programmer. Cytotoksisitet, spredning og mobilnettet vedheft av L929 murint fibroblaster PDMS filmer (blanding forhold 10:1) og SSA filmer (blanding forhold 50/50) er utført. Vi har vist her, for første gang, side ved side sammenligning av tynne sammensatt filmer produsert av både polymerer og presentere etterforskningen av deres biologiske- og selvklebende egenskaper.

Introduction

I denne protokollen presenteres detaljert metoder for produksjon av tynne elastomer filmer. Allment tilgjengelig legen blad teknikken er brukt for produksjon av tynne sammensatt filmer. Produksjon teknikk er utført på polyethylenterephtalate (PET)-folier, slik at etterfølgende produksjon av disse filmene i stor skala. Hovedvekten av denne protokollen er vurdering av reproduserbarhet, presis produksjon av ulike lag sammensatt filmer og fastsettelse av egenskapene biologiske og vedheft av siste sammensatt oppdateringen. Silikon-elastomer poly-(dimethylsiloxane) (PDMS) er mye brukt i biomedisinsk teknologi, inkludert produksjon av huden lim, microfluidics programmer og ytterligere forskning felt1,2,3 ,4. En underklasse av PDMS, såkalt myke huden lim (SSAs) har nylig vært innført, spesielt for mild hud bonding og de liming.

Silikon dirigeres til stedet er vinyl functionalized elastomerer, skiller seg fra tilsvarende polymerer ved fravær av forsterkende silica5. Ligner på andre PDMS, SSAS Youngs modul kan tilpasses i et bredt spekter av modulerende kryss-linker konsentrasjon eller herding tid6,7,8. Denne endringen i Youngs modul av silikon elastomerer påvirker selvklebende egenskapene til materialet betydelig og har dyptgripende konsekvenser på prokaryotic og eukaryotic celler kultivert på overflaten9,10 , 11. på biologiske cellenivå, ble det vist, at eukaryote celler svare på signaltransduksjon nivået på en modulering av matrix elastisitet eller tykkelse på overflaten9,10,12 ,13,14. Derfor bred interesse i celle kultur programmer av polymerer med tunable mekaniske egenskaper finnes. Viktigere, gir egentlig lav overflate energi av silikon basert elastomerer ikke optimale forhold for cellekultur av eukaryote celler. Oksygen plasma behandling er en mye brukt teknikk for å øke PDMS overflaten lavenergi midlertidig, fører til en forbedring av pull-off styrken, redusert overflaten adsorpsjon av molekyler, mens i parallell fremme vedlegg, sprer seg og spredning av eukaryote celler15,16,17,18.

I tillegg til egenskapene materialer påvirker i form betydelig mobilnettet vedheft og lim samspillet mellom to materialer19,20,21,22. Overflateruhet har flere effekter på kontakt dannelsen mellom to flater: reduksjon av kontakt området, høy lagret elastisk energi rundt asperities samt innflytelse på sprekk overføring kan endre limet styrke23, 24. Vedheft av selvklebende filmer til menneskelig hud er en nye programmet feltet, f.eks såret dressinger, fiksering av ECG elektrodene eller andre bærbare elektroniske enheter25,26,27, 28. For å måle ytelse selvklebende selvklebende i forhold til form, kan glass underlag med varierende grad av ruhet brukes i vanlig vedheft målinger8,21. Her er to glass underlag valgt å undersøke egenskapene lim polymer filmer. Første, sammensatt filmer med et PDMS backing lag en blanding mellom 10 til 1 vekt deler dekkes av PDMS med ulike blande forholdet var preget. Under det andre trinnet var et lim SSA lag forberedt med lik vekt mengder begge komponentene og med varierende filmen tykkelsen på en støttende PDMS film.

Protocol

Forsiktig: Se alle relevante sikkerhetsdatablader (MSDS) før bruk. Noen av kjemikaliene som brukes i denne protokollen er irritanter, akutt giftige og/eller kreftfremkallende. Bruk alle nødvendige sikkerhets praksis ved håndtering av kjemikaliene. Dette inkluderer bruk av engineering (kjemisk kabinett) og personlig verneutstyr (vernebriller, hansker, laboratoriefrakk, full lengde bukser og lukket-toe sko). Deler av følgende innebære kulturen i en dyr cellen linje. Derfor Følg bestemte biosafety regelverk. Kjemisk og biologisk avfall må avhendes i henhold til spesifikke nasjonale og institu regler og anbefalinger.

1. utarbeidelse av silisium cellegummi tynnfilm kompositt-strukturer

  1. Utarbeidelse av polymerer
    1. For å forberede 1.1 g PDMS i 10:1-forhold, bland 1.0 g av sammensatte med 0,1 g av sammensatte B.
    2. Blanding og degase de pre polymerer i en fart blandebatteri 2350 RPM under vakuum i 3 minutter.
    3. Endre masse forholdstallene mellom sammensatte og sammensatte B 45:1 og 70:1. Forberede dem ligner på metoden beskrevet i 1.1.2.
    4. Forberede 1 g av myk hud limet (SSA) i forholdet 50: 50. Derfor bland 0,5 g av sammensatte og 0,5 g av sammensatte B som beskrevet i 1.1.2.
  2. Utarbeidelse av poly-(vinyl alcohol) (PVA) belagt PET folie
    1. Forberede en 18% (w/w) PVA løsning i vann ved å legge til PVA deionisert vann og bland over natten med en magnetisk rørestang. Lagre denne løsningen på 4 ° C.
    2. Forberede tynne filmer viser en effektiv tykkelsen på 15 µm med legen blad programmet maskinen, med 100 µm gap av blad og en hastighet på ca. 2.0 mm/s.
    3. Plasser filmer i en ovn ved 95 ° C i 15 min.
  3. Utarbeidelse av backing-laget av PDMS 10:1 blanding forhold av legen blad teknikk
    1. Bruke en automatisk kontrollert legen blad programmet maskin for utarbeidelsen av de tynne filmene.
    2. Rengjør PET folien med 100% isopropanol og plassere den på overflaten av modulen legen blad.
    3. Plasser legen bladet på folien og justere tykkelsen med mikro posisjonering skruer. For produksjon av våt lag, gjelde tykkelser på 60 µm, 100 µm, 200 µm og 500 µm.
    4. Fyll PDMS 10:1 polymer forberedt i trinn 1.1 i reservoaret på legen bladet med en enkel bruk sprøyte. Start bevegelse av bladet med en hastighet av ca. 2.0 mm/s.
    5. Fjern PET filmen med brukte 10:1 belegget fra maskinen og plasser den i en ovn 1t ved 95 ° C, i et rom viser fuktighet mellom 40 og 65%.
    6. Rengjør legen bladet med isopropanol og papirhåndklær.
    7. Gjenta dette for alle nødvendige tykkelser.
  4. Utarbeidelse av det øverste laget av PDMS i forskjellige blandingsforhold av legen blad teknikk
    1. Fjerne tynne striper av lengde sidene av underliggende filmen med en skalpell eller barberblad til tillater plassering og skyve på bladet lege på PET folie.
    2. Fremgangsmåten protokollen 1.3.3 til 1.3.6. Våt tykkelse brukt for filmen er 160 µm.
    3. Gjenta denne fremgangsmåten for produksjon av to uavhengige filmer hver med en annen blande andelen PDMS komponentene (45:1 og 70:1). Lagre filmene ved romtemperatur (ca 22 ° C og en fuktighet mellom 40 og 65%) i kvadrat Petri retter å hindre dem fra forurensning og støv.
  5. Utarbeidelse av tynne sammensatt filmer viser ulike tykkelser av SSA 50/50 laget
    1. Forberede PDMS 10:1 filmer som backing-lag, som beskrevet før i trinn 1.3.
    2. Følg fremgangsmåten for protokollen 1.4.1 og 1.4.2 å produsere disse filmene. Bruk SSA i 50/50 blanding forholdet og produsere en film med en våt tykkelse på 40 µm.
    3. Gjenta dette for ekstra våt tykkelser på: 120 µm, 300 µm, 500 µm.

2. normal vedheft mål med underlag med forskjellige overflateruhet

  1. Forberedelse og karakterisering av glass underlag med forskjellige overflateruhet
    1. Bruke en glass sylinder med 2 mm diameter som en myk underlaget.
    2. Produsere 'grov substrat' avgiftsdirektoratet med et glass kutter et stykke med dimensjonen av ca 4 x 4 mm fra et frostet glass lysbilde. Bruke en slipende diamant hånd pad for å få et sirkulært område av ca. 3 mm diameter.
    3. Knytte glasset til en aluminium membran med UV lim og belyse det i UV lys kammeret i 3 minutter.
    4. Bestemme radius av areal på underlaget med en optisk mikroskop. Beregn arealet etter formelen A = πr2.
    5. Bestemme grovheten parameteren Ren og Rz (ifølge: DIN EN ISO 4287, ASME B46.1) med en smak profilometer.
    6. Påføre underlaget på utvalg scenen av profilometer og bringe spissen (diamant, standard: 2 µm/60 °) i kontakt med prøven.
    7. Registrere grovheten profilen med en hastighet på 0,3 mm/s og en lengde på 1 mm.
    8. Analysere overflaten drevet topografi, mål et område på nøyaktig 1 mm2 med en pekepenn profilometer, av den tilknyttede programvaren.
      Merk: Profilometer drives av en ekstern datamaskin. Abonnenten er forskjøvet 0,001 mm i y-retningen når en forskyvning av 1 mm er nådd i x retning. Det registrert. RS3-fil importeres i Surfcom kart ekspert programvare for å lage 3D-bilder.
  2. Normal vedheft måling av tynne filmer produsert av PDMS eller SSA
    1. Bruk et barberblad til å kutte filmene på PET folien i små biter med et areal ca 4.0 cm2 og plassere dem på et glass lysbilde med UV limet. Belyse med UV-lys for 3 min.
    2. Montere polymere prøven på prøven abonnenten.
    3. Rengjør underlaget overflate forsiktig med etanol og tørt med nitrogen gass.
    4. Fest glass underlaget, montert til aluminium kjeglen, til belastning-cellen.
    5. Bruke tabellen vippbart (goniometer) til å justere overflater nettopp ved å justere vinkel av underlaget nærmer polymere filmen. For å gjøre dette, bringe underlaget manuelt i kontakt med filmen. Endre vinkelen til en fullstendig parallellføring begge flater til hverandre, visualisert ved kameraer bildene, er oppnådd.
      Merk: Last cellen er koblet til tabellen vippbart. Et glass prisme ligger under prøven som vist i Figur 4, tillater visualisering av kontakt området med to kameraer og aktivere justeringen av underlaget på polymer film.
    6. Flytte underlaget polymere filmen overflaten til en preload stress 13 ± 5 kPa er oppnådd (Figur 4).
    7. Starte egendefinerte programmert programvarepakken skrevet i LabView kontroll nødvendig måling parameterne som holder tid og tilnærming/retraksjon hastighet. Hold tid ikkeholde er 1 sekund, tilnærming og løsgjøring hastighet er 30 µm/s og 10 µm/s henholdsvis.
    8. Utføre vedheft målinger på tre uavhengig produsert prøver og på seks forskjellige steder på hver film overflate.
  3. Dataanalysering og beregning av mekaniske nøkkelfaktorer: trekk av stress og verk av separasjon.
    1. Beregne stress Equation 1 ved å dele en kraft av underlaget området enS.
      Equation 2
    2. Bestemme trekk av stress, som er beskrevet som den maksimale verdien av normal stress.
      Equation 3
    3. Få forskyvning Δs ved subtraksjon av startposisjon strekk regimets0 fra prøven posisjon sslutten der de bånd er fullført. Definer starten av strekk regimet s0 = 0.
      Equation 4
    4. Korriger måleverdiene for eksempel plasseringen av systemet etterlevelse C etter denne formelen:
      Equation 5
    5. Integrere stress-forskyvning kurven mellom s0 og sslutten for å beregne et verk av separasjon.
      Equation 6
  4. Beregning av mekaniske nøkkelfaktorer bruker matematiske dataprogramvare opprinnelse.
    1. Importere innspilte .dat-fil fra en enkelt vedheft måling i en opprinnelse tabell. Parameterne som er registrert er tid, prøveposisjon og kraft. Sett inn parameterne i kolonne A (tid), B (prøveposisjon) og C (styrke).
    2. For å fastslå den tomme verdien, gjennomsnittlig 20 målingsverdiene av force før du kontakter polymer filmen. Navn denne gjennomsnittsverdien Fforskyvning og lime den inn i kolonne D.
    3. Beregne bakgrunnen korrigert tvinge F * etter følgende ligning
      Equation 7
      og sette inn formelen, som vist nedenfor, i kolonne E.
      Equation 8
    4. Definer starten av strekk regimet som null forskyvning, dvs, s0 = 0. Derfor bestemmer s0 og trekke det fra forskyvning i kolonne B og lagre den i kolonnen F:
      Equation 9
    5. Videre rette prøveposisjon ved maskin etterlevelse. Denne rettelsen utføres i kolonne G. Sett inn følgende formel i kolonne G
      Equation 10
    6. Beregne stress i den neste kolonnen H. Derfor dele makt fra området substrat. Sett inn følgende ligning
      Equation 11
      hvor er arealet av glass substrater i mm2 (bestemt i 2.1).
    7. Beregne et verk av separasjon fra stress og forskyvning verdiene. Derfor tegn forskyvning langs x-aksen og stress langs y-aksen. Integrere denne grafen fra s0 sslutten der sslutten er definert som forskyvning som strekk stress tilbake til null, dvs. full avdeling fant sted. Velg funksjonen integrere for å integrere grafen. Legge til de beregnede verdiene i kolonnene jeg og J.

3. karakterisering av filmer ved å skanne elektronmikroskop (SEM) og optiske mikroskopi

  1. Optisk mikroskopi
    1. Med et barberblad kuttet polymere filmen i små biter (ca. 0,25 cm2) og knytte dem til kanten av et glass lysbilde. Stedet av objektglass vertikalt orientert under en oppreist mikroskop og måle tykkelsen på filmen tverrsnitt.
      Merk: Bruk en 20 X målsetting (NA = 0.45, teoretisk oppløsning på 800 nm på 1,1 µm) til å måle film tykkelse verdier på ca ≤ 20 µm. For en film tykkelse i størrelsesorden 20 µm opptil 50 µm bruker et 10 X mål (NA = 0,30, teoretisk oppløsning på 800 nm i 1.6 µm) og for en film tykkelse ≥ 50 µm bruker en 5 X målsetting (NA = 0,15, teoretisk oppløsning på 800 nm på 3,3 µm).
  2. SEM etterforskning
    1. Klipp PET folien og feste et utvalg av ca 2 cm2 til et glass lysbilde og sett det loddrett til klem mekanismen inne prøven holderen ≤ 2 mm under toppen overflaten av abonnenten.
    2. Velg en akselerasjon spenning 10 kV, backscattered elektron detektor (BSD) og lav vakuum forhold (60 Pa).
    3. Justere fokus, forstørrelse, lysstyrke og kontrast i bildene.
    4. Velge en image vinningen tid på 28 s med en oppløsning på 1024 x 2048 piksler.
    5. Fjerne prøven holderen fra SEM.

4. biologisk etterforskning

  1. Rutinemessig celle kultur av L929 celler
    1. Bruke murine fibroblast celle linjen L929 for undersøkelse. Kultur cellene i Rosewell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 basale medium, supplert med 10% fosterets bovin serum og penicillin und streptomycin på 37 ° C, 5% CO2 i MT75 celle kultur flasker. Passasje cellene på en samløpet av ca 70 til 80%.
    2. For celle passaging, fjerne mediet av aspirasjon og vask med kalsium og magnesium gratis fosfatbuffer (DPBS- / -) for 30 s under en laminær strømning kabinett. Etterpå ruge cellene med 2 mL Accutase, en enzym løsning med proteolytisk og collagenolytic aktivitet for opptil 5 min på 37 ° C, 5% CO2.
    3. Kontroller avdeling av cellene fra celle kultur kolbe overflaten med fase kontrast mikroskop.
    4. Legge til 8 mL serum inneholder middels i flasken og overføre celle suspensjon slik 15 mL reaksjon.
    5. Ta en 10 µL prøve fra cellen suspensjon og bland med 10 µL Trypan blå.
    6. Fastslå det cellular antallet med en Neubauer kammer og beregne antall celler.
      FORSIKTIG: Trypan blå er giftig, derfor rådgivning HMS-Databladet, etter obligatorisk prosedyrene som er beskrevet i HMS-Databladet, iført av passende personlige sikkerhet beskyttelse og håndtering under en kjemisk skap kreves. Samle avfall til kjemisk avfall deponi.
      Merk: Trypan blå positiv celler, vises blå, indikerer ikke-intakt mobilnettet membraner.
    7. For den neste passasjen, kultur 5 x 105 celler i en ny sterilt celle kultur flasken 10 mL av nytt medium. For eksperimentelle forhold, kultur 3 x 105 cellene i 6 godt platene og 6 x 10-4 i hver brønn av 24 godt plate, som inneholder polymere prøver (protokollen trinn 4.2).
  2. Utarbeidelsen av sammensatte filmer for cellekulturer eksperimenter.
    1. Avgiftsdirektoratet enkeltdeler av filmene i ønsket dimensjoner produsert i protokollen trinn 1,4 og 1,5 fra PET støttende laget med en skalpell og sted med pinsett onto overflaten av glass cover følgesedler viser en diameter på 12 mm. sett prøvene i brønnene av 2 4 plate også.
    2. For cytotoksisitet besluttsomhet og celle teller, Fjern ikke filmene fra PET folien. Kuttet sirkulær områder av ca 9,4 cm2, passer pent inn i enkelt brønnene av en 6 godt plate, fra filmer produsert i 1,4 og 1,5 og plassere dem i brønnene av en celle kultur plate.
    3. Fordype polymer prøvene i deionisert H2O for ≥ 30 min.
      Merk: Polymere prøvene kan steriliseres med autoklavering. Derfor fjerne alle polymer med prøver fra celle kultur rettene, og plasser dem innenfor et glass Petriskål. Sterilisering utføres i en autoklav på 2,05 bar for 20 min ved en temperatur på 121 ° C.
  3. Plasma behandling av polymerer
    1. Plass filmer som er festet på PET folie eller runde glass cover slips (produsert i 4.2.1) inne reaksjon Mysteriekammeret plasma enheten.
    2. Lukk dekslet og evakuere til et trykk 1.6 x 10-2 mbar er nådd.
    3. Utføre plasma behandling for 3 min.
    4. Ventilere reaksjon kammeret og plasser prøver i 24 godt eller 6 godt retter for videre celle kultur undersøkelser.
    5. Bruk ett utvalg for vann kontakt vinkel vilje med en goniometer. Derfor flytter sprøyten nær polymere overflaten med programvarepakken og Plasser en dråpe 3 µL vann på overflaten. Beregne den statiske vann kontakt vinkelen med goniometer programvare.
  4. Flekker og mikroskopi
    1. Forberede celler som beskrevet i trinn 4.1.7 og kultur for 3 d på 37 ° C og 5% CO2.
    2. Ta fase kontrast bilder av celler kultivert i tre dager på uberørte- og plasma behandlet filmer like før fiksering.
    3. Forberede PBS med 0,2% Triton-X-100. Sakte Pipetter 200 µL av lager løsningen i 100 mL PBS (PBS-T).
    4. Forberede en 4% paraformaldehyde/PBS løsning (PFA/PBS-T).
      FORSIKTIG: Paraformaldehyde er giftige, derfor rådgivning HMS-Databladet, etter obligatorisk prosedyrene som er beskrevet i HMS-Databladet og iført av passende personlige sikkerhet beskyttelse og håndtering under en kjemisk regjering er nødvendig.
    5. Forbered en 5% BSA/PBS-T løsning.
    6. Fjerne mediet ved aspirasjon under lamina flyten kabinett. Legge til PBS brønnene fjerne middels rester.
    7. Overføre platen til en kjemisk skap og erstatte PBS med 400 µL av PFA/PBS løsningen for 25 minutter ved romtemperatur.
    8. Fjern PFA/PBS løsningen fra enkelt brønnene, nøye vask med PBS fire ganger. Vent 3 min. mellom hver vask trinn og samle løsninger for kjemiske avfallshåndtering. Bruke platen direkte eller lagre den på 4 ° C.
    9. Legge til 5% bovin serum albumin (BSA) / PBS-T fordelt og Inkuber for 60 min på RT blokkere uspesifikke bindende.
    10. Sug opp løsningen og erstatte den med en phalloidin konjugert til Alexa-488 (1:160 fortynning) / PBS-T løsning supplert med 0,2% Triton-X-100.
      FORSIKTIG: Phalloidin-488 er giftig, derfor rådgivning HMS-Databladet, etter obligatorisk prosedyrene som er beskrevet i HMS-Databladet og iført av passende personlige sikkerhet beskyttelse og håndtering under en kjemisk regjering er nødvendig.
    11. Dekk platen med aluminiumsfolie og ruge det 3 h på RT eller overnatting på 4 ° C.
    12. Sug opp løsningen og vask tre ganger med PBS. Vent 3 min. mellom hver vask trinn. Samle løsninger for kjemiske avfallshåndtering.
    13. Forberede en løsning av 1 µL Hoechst fargestoff 33342 (lagerløsning 1 mg/mL). For en 1:1000 fortynning pipette 1 µL av Hoechst fargestoff 3334 til 1 mL PBS-T og bland godt. Legger 300 µL av Hoechst fargestoff 33342 løsningen fordelt og ruge i 10 min på RT i mørket.
      FORSIKTIG: Hoechst fargestoff 33342 er en intercalating DNA-reagens og derfor potensielt mutagent, derfor rådgivning HMS-Databladet, følge obligatorisk fremgangsmåten beskrevet i HMS-Datablad og iført av passende personlige sikkerhet beskyttelse og håndtering en kjemisk kreves.
    14. Sug opp løsningen og vask prøvene fire ganger med PBS. Vent 3 minutter mellom hver vask trinn. Samle løsningen for kjemiske avfallshåndtering.
    15. For innebygging, nøye fjerne filmene fra kultur overflaten og plassere dem på et mikroskop glass lysbilde. Legge til 20 til 40 µL av vann løselig innebygging medium til filmen og koble en ny runde glass cover slip på toppen bruke lett trykk.
    16. Utføre bildebehandling med fluorescens mikroskop. Filtre nødvendig for belysning: Alexa-488 har en eksitasjon maksimal på 496 nm og maksimal utslipp skjer på 519 nm. Derfor er utslipp fargen grønn. Hoechst fargestoff 33342 trihydrochlorid trihydrate kompleksbundet med DNA har excitation maksimal 355 nm og maksimum DNA komplekse utslipp skjer på 465 nm.
  5. Cytotoksisitet besluttsomhet og fastsetting av celle nummer
    1. Utføre eksperimentet med celler dyrket i 6 bra plater i trinn 4.3 og celler i trinn 4.1.7. Kultur cellene for 3 dager på 37 ° C og 5% CO2. For positive kontroll, bruker du cellene som ble dyrket på en celle kultur behandlet polystyren overflate, som inneholder ingen polymere filmer. For bakgrunnen vilje (negative tilstanden), få medium fra et godt uten celler.
      Merk: Medium kan også hentes fra godt inneholder cellene kultivert på polystyren celleoverflaten kultur behandlet.
    2. Ifølge antall eksperimentelle prøver etiketten 15 mL rør.
    3. Legg 40 µL av en 0,9% Triton X-100 inneholder PBS løsning til positiv kontrollen og bland kraftig med 1000 µL tips. Vent ca 3 min.
    4. Uten å fjerne celler knyttet til overflaten, Sug opp mediet alle prøver, inkludert i 4.5.3 og overføre mediet til 15 mL rør. Legge til 3 mL DPBS- / - enkelt brønnene og lagre platene under laminær strømning kabinett for fastsettelse av det cellular antallet som beskrevet i 4.5.9.
    5. Sentrifuge 200 x g i 3 minutter og fjerne 1 mL av nedbryting for LDH aktivitet bestemmelse. Lagre 15 mL rør som inneholder cellene og gjenværende medium under laminær strømning kabinett.
    6. En svart 96 bra plater med flat bunn brukes for analysen. Legge til 50 µL av CytoTox-en reagens 50 µL for eksempel medium og bland godt for 30 s.
    7. Dekk platen med aluminiumsfolie og lagre for 10 min på RT.
    8. Legg til 25 µL av stopp løsning i hver brønn og registrere fluorescens intensiteten med en fluorescens plate leseren. Riste platen for 10 s og gjenkjenne fluorescens med en eksitasjon bølgelengden til 520 nm og et utslipp bølgelengden til 560 nm. Unngå luftbobler.
    9. For fastsettelse av celle nummer leveringstanken DPBS- / - fra brønnene på kultur plate fra protokollen gå 4.5.4 og legge løsninger til 15 mL reaksjon rør som inneholder supernatants i trinn Protokollnummer 4.5.5.
    10. Sentrifuge 15 mL reaksjon røret på 200 x g for 3 min og Sug opp nedbryting. Legg til 0,5 mL av Trypsin/EDTA og ruge i 10 min på 37 ° C.
    11. Legg 2 mL Trypsin/EDTA på fordelt av platen og ruge på ca 10 min på 37 ° C koble celler fra polymere filmer.
    12. Cellen suspensjon overføres til 15 mL reaksjon røret fra Trinnummeret 4.6.10. I tillegg vask platene kraftig med serum som inneholder mediet.
    13. Sentrifuge prøvene 200 x g for 3 min, Sug opp nedbryting og legge serum som inneholder mediet til røret.
    14. Avgjøre det cellular antallet som beskrevet i trinn 4.1.5 og 4.1.6.

Representative Results

I de første eksperimentene, har PDMS filmer med varierende tykkelse og konstant miksing forholdet 10:1 blitt produsert på PET filmer (figur 1). Fordi tykkelsen på backing lag kan betydelig påvirke produsert stivhet og egenskaper av hele sammensatte filmer, de første eksperimenter enkelt filmer fra 13 ± 2 µm og 296 ± 13 µm var (figur 1). Det er godt kjent, at herding prosessen svinn polymer filmer oppstår. For de tynneste filmene observerte vi en forskjell på 78% ± 3,1% mellom våt og kurert. For de tykkeste filmene oppdaget krymping av 40,9% ± 2,6% er (figur 1).

Filmer må fjernes manuelt fra PET folien for programmene i denne protokollen. Vi anerkjent at spesielt tynne filmer er vanskelig å håndtere med tang og er ofte ødelagt under denne prosessen. Derfor undersøkt vi påvirkning av en tynn poly-(vinyl alkohol) belegg som et støttende lag. PVA har en høy stivhet og kan enkelt fjernes på grunn av dets vannløselighet i nedstrøms programmer. Anvendt PVA belegget har en tykkelse på ca. 17 µm og derfor PDMS filmer belagt på dette laget er litt tynnere sammenlignet med filmer uten PVA belegget (data ikke vist). Spesielt fokusere på egenskapene håndtering, konkluderer vi, at bare tynneste filmen krever en støttende PVA film for fjerning fra PET folien.

En effektiv filmen tykkelse på ca 40 µm ble valgt for alle ytterligere eksperimenter. For produksjon av sammensatte filmer, var blande forholdet mellom PDMS varierte fra 10:1 45:1 og 70:1 og brukt over tidligere polymerized PDMS filmen med legen blad teknikk (figur 2A). Med unntak av 10:1-forhold kan forskjellige filmer være tydelig preget av optisk mikroskopi med passende presisjon. For mikroskopisk analyse var filmene kuttet med en skalpell og festet til kanten av et glass lysbilde. De høyere blandingsforhold av topplaget dukket opp visuelt lysere på mikroskopisk bildene sammenlignet med 10:1 forholdet mellom backing lag (figur 2B). I tillegg ble skanner elektronmikroskop brukt å image samples ved en forstørrelse av ca 860 X (figur 2C). En tydelig observerbare forskjell i lysstyrke mellom de to PDMS filmene, produsert i høyere blandingsforhold ble gjenkjent, i motsetning til 10:1-forhold. Kutte prosedyren forlater merker, synlig i SEM bilder (figur 2B). Basert på disse resultatene, var den gjennomsnittlige totale tykkelsen på sammensatte filmene 112 µm ± 5.0 µm (figur 2D).

Ytterligere eksperimenter er heftegenskaper av disse filmene klarert med normal force vedheft mål med to forskjellige glass underlag (Figur 3). 'Glatte underlaget' besitter en overflatestruktur med en aritmetiske middelverdi grovheten Ren av 0.013 ± 0.0002 µm og en mener topp-til-dalen Rz på 0,12 ± 0.004 µm (figur 3A). Substrat 2 (GS2, utpekt som grov) utstilt grovheten verdiene i 0.338 ± 0.021 (Ren) µm og 2.055 ± 0.017 µm (Rz) (figur 3B). Med gjennomsnitt beregnet radius innhentet i 2.1.4 areal på "glatt" underlaget var 3,2 mm2 mens av "grov" underlaget et areal på 6.07 mm2 .

Med disse to underlag, er selvklebende virkemåten til forskjellige filmer fastslått. To parametere er valgt for å beskrive egenskapene selvklebende filmer: de trekk av stress σmax og arbeidet separasjon Wseptember. Under hele prosessen med bånd og de liming av prøveposisjon registrert s og normal force F. Resultatene vises i en stress-forskyvning kurve (Figur 4).

For korrekt tolkning av eksperimentelle resultatene er det viktig å nøyaktig justere underlaget polymere filmen overflaten. Også må maskinen kompatibilitet for måling enheten vurderes for å korrigere forskyvning. Under målingen fungerer anvendt styrken ikke bare på prøven, men også på andre deler av testing enheten. Derfor, hver av de to underlag presses mot et glass lysbilde med kompresjons vekt av 13 ± 5 kPa. For å måle etterlevelse, er Last kurven tatt hensyn, dvs. delen av kraft-forskyvning kurven hvor to flatene kommer i kontakt til prøveposisjon hvor nøyaktig preload styrken er nådd. Gjensidige skråningen av kurven er lik maskinen etterlevelse C. Den beregnede verdien for C er 0,12 µm/mN.

I det første eksperimentet filmer med forskjellige blandingsforhold av PDMS ble analysert (figur 5). For sammensatte filmene, ble tykkelsen og miksing andelen støtte laget, produsert av PDMS 10:1 holdt konstant. Tykkelsen på det øverste laget ble også holdt konstant til en verdi av 65 µm. Høyeste pull-off stress 109 ± 27.6 kPa identifiserte med glatt barometer substrate på PDMS 10:1 film (figur 5A). En økning av miksing forhold fører til en nedgang på pull-off stress å 76.7 ± 17 kPa for 45:1 blande forholdet og 41.4 ± 17 kPa for 70:1 forholdet. Med grov glass substrat en pull-off stress 22 ± var 2.2 kPa bestemt på PDMS 10:1 film. Generelt, et verk av separasjon var sammenlignbar mellom begge glass underlag, f.eks., 1,4 ± 0,6 J/m2 på den tynneste filmen innhentet med glatte underlaget og 1.84 ± 0,7 J/m2 på den tynneste filmen oppnådd med grov underlaget ( Finne 5B).

Neste, produksjon av tynne filmer for huden programmer og cellekultur programmer har vært utforsket (figur 6). SSA 50/50 har blitt brukt for topplag produksjon av sammensatte filmene. PDMS i en 1:10 blanding forhold med en tykkelse på ca. 40 µm har blitt brukt som et backing lag. I motsetning til tidligere eksperimentene avbildet i figur 5, tykkelsen på det øverste laget var variert, mens miksing forholdet ble holdt konstant (figur 6A). SSA er valgt på grunn av selvklebende egenskapene i programmer som involverer vedlegg overflater med høy overflateruhet, spesielt menneskelig hud, bruker produsentens anbefaling av miksing forholdet 50/505,8. Menneskelige overhuden besitter en høy overflateruhet. Avhengig av alder og anatomisk rapportert regionen en mener overflateruhet dybde (RZ) mellom 48 µm og 71 µm har vært29. Sikker og skånsom huden vedheft er viktig particularity mot følsom hud nyfødte eller knapt regenerere huden av eldre. Ulike våt tykkelser alt fra 40 µm, 120 µm, 300 µm til 500 µm ble brukt (figur 6A). Avhengig av våt tykkelsen varierer totalt tykkelsen på sammensatte filmene mellom 51 µm og 344 µm (figur 6B). Etter herding, sammensatt har blitt festet til baksiden av en volunteer hånd (figur 6C). Forskjellige filmer tykkelser viser tydelig forskjeller i tilpasning egenskapene til råhet av huden (figur 6C). Tynne filmer (50 µm og 100 µm total tykkelse) viser en høy grad av tilpasning til huden rynker forhold til tykkere filmene (220 µm og 340 µm total tykkelse). Disse resultatene indikerer at sammensatt filmer med en rekke tykkelser kan produseres presist med anvendt legen blad teknikken.

Vedheft eksperimenter ble utført med disse sammensatt filmer (figur 7). Avhengig av tykkelsen av SSA topp filmen, har vi observert en nedgang på pull-off stress med økende filmen tykkelse. Den høyeste pull-off kraften av 133 ± 36,6 kPa ble målt på glatte underlaget (figur 7A). Laveste pull-off-stress 18 ± 4 kPa ble oppnådd med grov underlaget på tykkeste filmen. Interessant avslører en sammenligning mellom begge underlag en 2,7 fold forskjell på de tynneste filmene (figur 7A). Med økende filmen tykkelse, spesielt på de tykkeste filmene var ingen bemerkelsesverdige forskjellen observerbare (figur 7A). Med glatte underlaget et verk av separasjon av 1,8 ± 0,8 J/m2 ble oppdaget på filmen viser total tykkelse på ca. 100 µm, etterfulgt av en film tykkelse avhengige nedgang (220 µm tykkelse: 1.6 ± 0,6 J/m2 og 330 µm: 1,3 ± 0,4 J/m2 (Figur 7B)). Et verk av separasjon målt med grov substrater var generelt litt lavere i forhold til glatte underlaget (100 µm tykkelse: 1,63 ± 0,6 J/m2; 220 µm tykkelse: 1.1 ± 0,6 J/m2 og 330 µm: 1.0 ± 0,2 J/m2 (figur 7B )).

I tillegg ble avdeling mekanismen innspilt under målinger (figur 7C). Liten kavitasjon ble observert på tynneste filmen, mens utseendet på finger som sprekker var observerbare på tykkere filmene (figur 7C).

Målinger har utført innen en måned etter produksjon av filmer. Stabilitet og bevaring av de mekaniske egenskapene elastisk filmer kan imidlertid påvirkes av miljømessige faktorer, inkludert temperatur og fuktighet. Som beskrevet i protokollen trinn 1.4.3, er filmene lagret i romtemperatur og en fuktighet på 40-65%. For å hindre er dem fra forurensning og støv, filmene lagret i plast Petri retter i mørket. For å undersøke den langsiktige stabilitet, vedheft målinger og tykkelse fastsettelse av SSA har 50/50 filmer utført ca fire måneder etter fabrikasjon. Ingen stor innflytelse på filmen tykkelse, pull-off stress og verk av separasjon er oppdaget etter lagring. For eksempel var pull-off stress SSA sammensatt filmene produsert med en våt tykkelse på 120 µm SSA og våt tykkelse på 100 µm PDMS 46,6 ± 6 kPa og arbeidet med separasjon 1627 ± 592 mJ/m2 etter fabrikasjon. Ca. fire måneder etter produksjon, ble pull-off vekt av 48.8 ± 5.4 kPa og et verk av separasjon av 1666 ± 723 mJ/m2 bestemt. I tillegg, etter produksjon, totalt tykkelsen på disse filmene ble 103.3 ± 13,9 µm og etter lagring 98,1 ± 9.1 µm.

I ytterligere eksperimenter PDMS 10:1 og SSA 50/50 sammensatt filmer med en total tykkelse på ca 105 µm har blitt brukt som celle kultur underlag (Figur 8). Sammensatt filmer produsert i protokollen trinn nummer 1 kan lett fjernet fra PET folien og kuttet i ønsket dimensjon og geometriske former. Videre når følge filmene som rigid overflate, for eksempel glass, flere filmer som viser forskjellige Young's moduli kan knyttes side ved side og kan plasseres i en enkelt brønn av en celle kultur plate. Filmer kan knyttes til polystyren overflaten direkte uten en ekstra dekkglassvæske. Filmer kan også være tilpasset ulike overflater og geometriske struktur, som rør eller ringer, slik at videre studier ikke oppnåelig med konvensjonell celle kultur materialer. De utførte eksperimenter avbildet i Figur 8 sammensatt filmer på PET folie er plassert direkte i cellen kultur plater eller filmer har blitt fjernet fra PET folien og plasseres på glass cover slips. For eksperimentelle forhold, har noen polymerer blitt behandlet med luft plasma å øke deres gratis overflate energi. Generelt PDMS besitter en vann kontakt vinkel på ca 115° før plasma behandling og blir svært hydrofile (vann kontakt vinkel < 30°) aftertreatment8. Plasma behandling gjengir overflaten biokompatible og forenkler feste eukaryote celler. Avhengig av behandling tid og intensitet polymer overflaten endres, viser en høyere grad av ruhet og også sprekk kan vises. Umiddelbart etter behandling, er en hydrofobe gjenopprettingsprosessen observert. Som beskrevet under protokollen trinn 4.3.5 ble en goniometer brukt til å bestemme statisk vann kontakt vinkler. Derfor ble polymerer som er plassert i ddH2O 1t etter luft plasma behandling senere analysert. Plasma behandling vesentlig redusert vann kontakt vinkel (PDMS uberørte: 117.0 ± 2.2°; SSA uberørte: 127.9 ± 5,6 °; PDMS plasma: 18,0 ± 7,2 °; SSA plasma: 29.3 ± 11,5 °).

For eksempel bygge en vandig montering er medium brukt. Hvis på noe tidspunkt prøvene skal fjernes igjen, kan de plasseres i en vann som inneholder Petriskål over natten. Til slutt kan dekke papirlapper fjernes for ytterligere analyse.

Vedlegg og morfologi av L929 celler seeded for 3 dager på PDMS og SSA 50/50 sammensatt filmer er fastslått fase kontrast mikroskopi og etter farging med fluorescens konjugert phalloidin-488 og Hoechst fargestoff 33342 (Figur 8). Bildeopptak med fase kontrast mikroskopi er sterkt anbefalt, spesielt for polymerer ikke behandles med plasma. På grunn av svak mobilnettet vedheft til overflatene polymere er enkeltceller eller aggregater lett løsrevet, kompliserer riktig tolking av påfølgende analyse metoder.

Celler seeded på de uberørte polymerer vises dårlig vedlegg og cellular spre atferd (figur 8A1 og C1) mens en confluent monolayer ble observert for cellene kultivert på plasma behandlet overflater (figur 8B1 og D1) . Dannelsen av mobilnettet aggregater og løsgjøring fra overflaten var mer uttalt på uberørte overflater. Visualisering av utgangen filamenter etter fiksering med 4% paraformaldehyde avslørt cellene migrerer til periferien av mobilnettet aggregater og utstråling av lamellipodia utstikkende deler uberørte PDMS og SSA 50/50 sammensatt filmer (figur 8A2 og C2piler). Ingen store kvalitative forskjeller kan observeres mens sammenligne begge polymere materialer. Som en side note, det ser ut som et færre antall mobilnettet aggregater var til stede på SSA 50/50 sammenlignet med PDMS. Aggregater knyttet til overflater på SSA 50/50 opptrådte også, mer flat (Figur 8 c 1). Som forventet, forbedret behandling med luft plasma mobilnettet vedlegg og spre på både flater betydelig, fører til dannelse av utstikkende deler som bemerkelsesverdig lamellipodia og en confluent monolayer (figur 8B2 og 8D 2).

Utgivelsen av LDH etter 3 dager for kultur ble brukt som en indikator for å bestemme cytotoksiske effekter (tallet 9A). Generelt, LDH nivåene var sammenlignbare for cellene kultivert på begge polymere materialer, med mindre enn 5% cytotoksisitet (uberørte PDMS: 2,8 ± 2.0%, uberørte SSA 50/50: 4,5 ± 3,6%; plasma behandlet PDMS: 3,4 ± 1.5%, plasma behandlet SSA 50/50: 3,4 ± 1,6%). Disse resultatene er sammenlignbare med dataene presenteres i våre tidligere publisert studie fokuserer på etterforskningen av både elastomerer. 8 for å ytterligere validere resultatene av LDH analysen, en trypan blå utelukkelse test ble utført. I tillegg var hele cellen befolkningen bestemt på å vise forskjellene i spredning aktivitet (figur 9B). Generelt mindre enn 5% Trypan blå positiv celler ble regnet (uberørte PDMS: 2,4 ± 0,3%, uberørte SSA 50/50: 3,8 ± 2,5%, plasma behandlet PDMS: 0.74 ± 1,3% plasma behandlet SSA 50/50: 0,95 ± 1,6%).

Figure 1
Figur 1: klargjøring av PDMS filmer på poly-(vinyl alcohol) (PVA) belagt PET folie: Prosessen for produksjon PDMS filmer med varierende tykkelse på en PET folie ble brukt for å bestemme reproduserbarhet og håndtering ytelse (A). Tykkelser på PDMS filmene ble analysert med optisk mikroskopi etter 95 ° c (B). N = 3 uavhengig produsert filmer ble analysert. Fra hver film, tre forskjellige steder ble valgt, kutt og 3 posisjoner på hver prøve ble analysert (k = 27). Feilfelt representerer standardavvik. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: utarbeidelsen av sammensatte filmer av PDMS forberedt blande: Sammensatt filmer viser forskjellige blandingsforhold av base (komponent A) til crosslinker (komponent B) av PDMS ble produsert av legen blad teknikk. Det øverste laget bestående av PDMS i prosenter 10:1 (komponenten A:B), ble 45:1 og 70:1 brukt på en tidligere herdet PDMS 10:1 film (A). Etter påfølgende 95 ° c ble tykkelsen på sammensatte filmene analysert av optisk mikroskopi (B) og skanning elektronmikroskop (C). N = 3 uavhengige eksperimenter utført og analysert med optisk mikroskopi (D). Danne hver produsert filmen, tre forskjellige steder ble valgt, kutt og 3 posisjoner på hver prøver ble analysert (k = 27). Feilfelt representerer standardavvik. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: bestemmelse av topografiske overflateruhet av to underlagene brukes for vedheft målinger: To glass underlag besitter forskjellige overflateruhet var preget. Tre-dimensjonale profilometric analyse av overflaten ble utført på "glatt" underlaget GS (A1) og "grov" underlaget GR (B1). Tilsvarende enkeltlinje kurver er avbildet i A2 og B2). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: prinsippet av normal vedheft målinger: En tilpasset bygge oppsett ble brukt til å beskrive egenskapene vedheft av polymer prøvene. Måling oppsettet er avbildet i (A) og detaljer i (B). For måling analyse identifiserte stress fra en stress tid kurve (C). Verk av separasjon ble bestemt av integrering av stress-forskyvning kurven mellom sslutten og s0 (D). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: bestemmelse av heftegenskaper sammensatt filmer med forskjellige blandingsforhold av PDMS: Trekk av stress (A) og verk av separasjon (B) av sammensatte filmene produsert av PDMS i miksing prosenter 10:1, 45:1 og 70:1 ble målt. For analyse, en "glatt" glass substrat (GS) viser en Ren = 0.013 µm og en "grov" barometer substrate (GR) med Ren = 0.338 µm ble brukt. N = 3 uavhengig produsert filmer ble analysert. Fra hver film, to stykker ble valgt og tre ulike posisjoner på hver prøve ble analysert (k = 18). Feilfelt representerer standardavvik. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6: utarbeidelsen av sammensatte filmer av SSA med varierende tykkelse: SSA 50/50 ble brukt på en tidligere herdet PDMS 10:1 film (A). Forskjellige våt tykkelser på dette laget spenner fra 40 til 500 µm ble brukt og tykkelsen etter undersøkt med optisk mikroskopi (B). Vedlegg av filmene til baksiden av en frivillige hånden vist at filmer med en total tykkelse på ca. 100 µm (film #2) godt likedannet råhet av huden (C). Tykkelsen av enkelt lag og totale tykkelsen sammensatt filmer vises i figur 6B. For analyse n = 3 uavhengig produsert eksempler ble målt med optisk mikroskopi. Fra hver film, tre forskjellige steder ble valgt, kutt og 3 posisjoner på hver prøve ble analysert (k = 27). Feilfelt representerer standardavvik. Skala bar i 6C viser ca 1 cm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 7
Figur 7: bestemmelse av heftegenskaper sammensatt filmer av myk hud limet: Tynne sammensatt filmer av SSA som øverste laget og PDMS 10:1 som baksidematerialet laget ble produsert. Tykkelsen på det øverste laget var variert mellom 50 og 330 µm. Pull-off stress (A) og verk av separasjon (B) sammensatt filmer målt med to forskjellige glass underlag ble analysert (en "glatt" barometer substrate (GS) viser en Ren = 0.013 µm og en "grov" barometer substrate (GR) med Ren = 0.338 µm). Eksemplarisk bilder av avdeling mekanismene er visualisert i C. Data analyse n = 3 uavhengig produsert eksperimenter ble analysert. Fra hver film, to stykker ble valgt og tre ulike posisjoner på hver prøve ble analysert (k = 18). Feilfelt representerer standardavvik. Skala barer i 7C skildrer 0,5 mm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 8
Figur 8: Cellular morfologi av L929 fibroblaster kultivert på tynne filmer: L929 murint fibroblaster ble kultivert for 3 dager på de tynne filmene produsert av PDMS (A1, A2, B1, B2) eller SSA (C1, C2, D1, D2). Å øke hydrophilicity av overflater luft plasma behandling ble utført (B1, B2, D1, D2). Skala barer i D1 og D2 skildrer 100 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 9
Figur 9: bestemmelse av cytotoksisitet og cellular spredning: For bestemmelse av cytotoksiske effekter og mobilnettet spredning, var L929 celler frø i tre dager på PDMS 10:1 og SSA 50/50 sammensatt filmer. Utgivelsen av laktat dehydrogenase (LDH) ble bestemt av LDH aktivitet analysen og viste mindre enn 5% cytotoksisitet (A). Totalt celle nummer etter dyrking perioden ble vurdert etter manuell teller enkeltceller med en Neubauer kammer (B). N = 3 uavhengig utført eksperimenter ble analysert. Feilfelt representerer standardavvik. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Utformingen av kompositt-strukturer kan enkel justering av materielle egenskapene, for eksempel Youngs modul eller tykkelsen på prøvene. Den unge modulus av PDMS kan endres i en rekke effektivt endre blande forholdet mellom de to komponentene eller produksjon av blander med en annen silikon elastomer30,31. Metodene beskrevet er ikke begrenset til PDMS brukes i gjeldende etterforskningen, men spesielt selvklebende ytelsen avhenger sterkt bestemt brukes. Et viktig skritt i denne protokollen er produksjonen av sammensatte filmene (figur 1). Det ble vist at tykkelsen på filmene påvirker betydelig vedheft virkemåten til filmene på ulike underlag, inkludert hud (figur 5 og figur 6). I tillegg til filmen tykkelsen påvirker tid og temperatur under herding prosessen materialegenskaper32. Derfor må parametere som tykkelsen av polymere lagene være nøye tilpasset og bekreftet.

Analyse av selvklebende egenskapene til de tynne filmene ble utført med normal force vedheft mål med to glass underlag med forskjellige overflateruhet til Ra = 0.338 µm (Figur 3). Generelt, påvirker grovheten betydelig vedheft av overflater, spesielt av elastisk materiale33,34. Råhet av glass kan enkelt endres ved sliping med sandpapir forskjellige asperity størrelser, derfor tillater fabrikasjon av underlag viser høyere grovheten verdier21. I tillegg andre materialer, kan for eksempel epoxy harpiks brukes for produksjon av underlag15,35. Dette kan være en viktig endring strategi presentert protokollen. For eksempel hvis underlag viser ulike overflaten gratis energier er nødvendig eller spesifikke er topografi nødvendig. Her, ble pull-off stress og verk av separasjon av tynne filmer produsert av PDMS og SSA analysert med en spesialbygd oppsett (makroskopisk vedheft mål enhet (MAD, Figur 4)). 36 optisk justeringen av underlaget og indenter er et kritisk punkt for analyse av måleresultatene. Justering av vinkelen må derfor utføres med goniometer, så nøyaktig som mulig. Dette kan oppnås med tilstrekkelig presisjon ved manuelt å bringe underlaget i kontakt med filmen overflaten til en vannrett kontakt er oppnådd.

I gjeldende protokollen ble hold tid holdt konstant på ett sekund (figur 5 og figur 7). Spesielt for etterforskningen av selvklebende ytelsen til en elastisk film til en grov substrat overflate gir en forlengelse av hold tid ytterligere informasjon. For eksempel blitt en økning i pull-off stress med økende hold tid rapportert8. I tillegg til målene i det gjeldende protokollen, andre metoder, kan for eksempel skallet tester utføres, slik at en mer omfattende undersøkelse av vedheft ytelse37.

Selvklebende egenskapene sammensatt filmer viser annen film tykkelser av myk hud limet var bestemt (figur 7). Resultatene er i tråd med publiserte data, viser at en reduksjon av filmen tykkelsen føre til en økning på pull-off stress som confinement, dvs, forholdet mellom substrat diameter og filmen tykkelse øker38,39 . Basert på disse resultatene og dataene avbildet i figur 7, vi konkludere med at sammensatt filmer med en total tykkelse på ca. 100 µm (tykkelse på SSA laget av ca. 60 µm brukt en PDMS film med en tykkelse på ca. 40 µm) ha gunstige vedheft p egenskaper i røff flater.

Deretter eksperimenter relatert til biologiske karakterisering gjennomført på uberørte sammensatt filmer og plasma behandlet sammensatt filmer (Figur 8). Plasma behandling av silisium elastomerer er en ofte brukt, allsidige teknikk for å øke hydrofile egenskapene til overflater og fremme mobilnettet vedlegg og cellular spre40,41. Silikoner er kjent for deres lav giftighet og høy biostability, men kan inneholde rester monomerer eller katalysatorer som kan påvirke fysiologiske prosesser, fører også til cytotoksisitet42,43. I utført eksperimenter vi har observert mindre enn 5% cytotoksisitet bruker LDH utgivelsen som en indikator og en Trypan blå utelukkelse analysen. I presentert protokollen, hele mobilnettet befolkningen, inkludert mobilnettet aggregater frittliggende skjemaet overflaten er analysert for spredning analyse (figur 9B). En endring av protokollen kunne produsere flere forskjellige resultater. For hver prøve, kunne nedbryting inneholder frittstående mobilnettet aggregater overføres til en egen reaksjon rør og ikke sammen med celler enzymatisk fjernet fra polymer overflaten. Dette ville tillate nøyaktig vurdering av celler som er festet til overflaten og til slutt avslører en mer detaljert fastsettelse av påvirkning av polymerer på mobilnettet vedheft prosessen. I tillegg til metodene immunocytochemical presenteres her, kan celler høstes gransking med immunoblot metoder, gir en detaljert kvantitativ vurdering av protein uttrykk.

I sammendraget, har vi etablert produksjonsforhold for produksjon av tynne cellegummi sammensatt filmer for programmer i avansert kultur forskning. I tillegg har disse tynne filmer høyt tilpasning for å huden ruhet, aktivere sofistikert design av huden lim.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Martin Danner er anerkjent for hans hjelp forberede prøver og etablering av celle kultur prosedyrer. Forfatterne vil gjerne takke Nederland Spezialchemie GmbH (Hamburg, Tyskland), spesielt Robert Radsziwill for kontinuerlig støtte og diskusjoner. Forskningen førte til disse resultatene har mottatt finansiering fra europeiske forskningsråd under EUs syvende rammeprogram (FP/2007-2013) ERC Grant avtalen n. 340929.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Propanol, 97% Stockmeier Chemie 1000452610000 Isopropanol
Abrasive diamnod hand pad Bohle MO 5007522 Grit: 220
Accutase Capricorn Scientific ACC-1B
Albumin Fraktion V Roth 0163.2 BSA
Alexa Fluor 488 Phalloidin ThermoFischer Scientific A12379 highly toxic
Aquamount Polysciences 18606-20 water soluble mounting medium
CytoTox-ONE Homogeneous Membrane Integrity Assay Promega G7890
DPBS, without Ca2+, Mg2+ ThermoFischer Scientific 14190094
Fetal bovine serum gold GE Health Care Life Science A15-151 FBS
Goniometer OCA35 Dataphysics for the determination of the static water contact angle
Hoechst Dye 33342 Sigma-Aldrich B1155-100MG bisBenzimide H 33342 trihydrochloride, highly toxic
Microscope Axiovert 25 Zeiss Microscope used for cell culture documentation
Microscope Eclipse LV100ND Nikon Microscope used for film thickness determination
Paraformaldehyde, aqueous solution 16% Electron Microscopy Sciences RT 15710 electron microscopy grade
penicillin und streptomycin solution Sigma-Aldrich P4333-100ML
Phenom XL Scanning Electron Microscope (SEM) Phenom
Poly-(vinyl alcohol) 4-88, MW 31000 Sigma-Aldrich 81381-1KG Mowiol 4-88
Poly-dimethyl siloxanes, Sylgard 184 Dow Corning (400)000108351397 PDMS
RPMI 1640 basal medium ThermoFischer Scientific 21875034
soft skin adhesive (SSA) Dow Corning (400)000108251792 MG 7-9800 Soft Skin Adhesive (SSA)
speed mixer DAC 600.2 VAC-P Hauschild
stylus profilomter Zeiss Model: SURFCOM 1500SD3
Tecan Infinite M200 pro Tecan fluorescence plate reader
Triton X 100 Calbiochem 648466
Trypan Blue solution Sigma-Aldrich T8154-100ML highly toxic
Trypsin/EDTA solution PAN-Biotech P10-023500 0.05% Trypsin, 0.02% EDTA in PBS
UV glue Bohle BO MV76002 medium viscosity

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lloyd, A. W., Faragher, R. G. A., Denyer, S. P. Ocular biomaterials and implants. Biomaterials. 22, 769-785 (2001).
  2. Zhang, M., Wu, J., Wang, L., Xiao, K., Wen, W. A simple method for fabricating multi-layer PDMS structures for 3D microfluidic chips. Lab Chip. 10, 1199-1203 (2010).
  3. Kwak, M. K., Jeong, H. E., Suh, K. Y. Rational design and enhanced biocompatibility of a dry adhesive medical skin patch. Adv. Mater. 23, 3949-3953 (2011).
  4. Gun Park, D., Chul Shin, S., Won Kang, S., Tae Kim, Y. Development of flexible self adhesive patch for professional heat stress monitoring service. Conf. Proc. IEEE Eng. Med. Biol. Soc. 4, 3789-3792 (2005).
  5. Thomas, X. Silicone Adhesives in Healthcare Applications. Dow corning Lit. , (2013).
  6. Fuard, D., Tzvetkova-Chevolleau, T., Decossas, S., Tracqui, P., Schiavone, P. Optimization of poly-di-methyl-siloxane (PDMS) substrates for studying cellular adhesion and motility. Microelectron. Eng. 85, 1289-1293 (2008).
  7. Wang, Z., Volinsky, A. A., Gallant, N. D. Crosslinking effect on polydimethylsiloxane elastic modulus measured by custom-built compression instrument. J. Appl. Polym. Sci. 131, 41050 (2014).
  8. Fischer, S. C. L., Kruttwig, K., Bandmann, V., Hensel, R., Arzt, E. Adhesion and cellular compatibility of silicone-based skin adhesives. Macromol. Mater. Eng. , 1-11 (2017).
  9. Martina, D., Creton, C., Damman, P., Jeusette, M., Lindner, A. Adhesion of soft viscoelastic adhesives on periodic rough surfaces. Soft Matter. 8, 5350-5357 (2012).
  10. Brown, X. Q., Ookawa, K., Wong, J. Y. Evaluation of polydimethylsiloxane scaffolds with physiologically-relevant elastic moduli: Interplay of substrate mechanics and surface chemistry effects on vascular smooth muscle cell response. Biomaterials. 26, 3123-3129 (2005).
  11. Song, F., Ren, D. Stiffness of cross-linked poly(dimethylsiloxane) affects bacterial adhesion and antibiotic susceptibility of attached cells. Langmuir. 30, 10354-10362 (2014).
  12. Buxboim, A., Rajagopal, K., Brown, A. E. X., Discher, D. E. How deeply cells feel: methods for thin gels. J. Phys. Condens. Matter. 22, 194116 (2010).
  13. Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. -L. Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate. Science. 310, 1139-1143 (2005).
  14. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix Elasticity Directs Stem Cell Lineage Specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
  15. Roth, J., et al. Surface functionalization of silicone rubber for permanent adhesion improvement. Langmuir. 24, 12603-12611 (2008).
  16. Thiébaud, P., Lauer, L., Knoll, W., Offenhäusser, A. PDMS device for patterned application of microfluids to neuronal cells arranged by microcontact printing. Biosens. Bioelectron. 17, 87-93 (2002).
  17. Tourovskaia, A., Figueroa-Masot, X., Folch, A. Differentiation-on-a-chip: a microfluidic platform for long-term cell culture studies. Lab Chip. 5, 14-19 (2005).
  18. Peterson, S. L., McDonald, A., Gourley, P. L., Sasaki, D. Y. Poly(dimethylsiloxane) thin films as biocompatible coatings for microfluidic devices: Cell culture and flow studies with glial cells. J. Biomed. Mater. Res. - Part A. 72, 10-18 (2005).
  19. Wan, Y., et al. Nanotextured substrates with immobilized aptamers for cancer cell isolation and cytology. Cancer. 118, 1145-1154 (2012).
  20. Ross, A. M., Jiang, Z., Bastmeyer, M., Lahann, J. Physical aspects of cell culture substrates: Topography, roughness, and elasticity. Small. 8, 336-355 (2012).
  21. Barreau, V., et al. Fibrillar Elastomeric Micropatterns Create Tunable Adhesion Even to Rough Surfaces. Adv. Funct. Mater. 26, 4687-4694 (2016).
  22. Briggs, G. A. D., Briscoe, B. J. The effect of surface topography on the adhesion of elastic solids. J. Phys. D. Appl. Phys. 10, 2453-2466 (1977).
  23. Dapp, W. B., Lücke, A., Persson, B. N. J., Müser, M. H. Self-affine elastic contacts: Percolation and leakage. Phys. Rev. Lett. 108, 1-4 (2012).
  24. Putignano, C., Carbone, G., Dini, D. Mechanics of rough contacts in elastic and viscoelastic thin layers. Int. J. Solids Struct. 69, 507-517 (2015).
  25. Laulicht, B., Langer, R., Karp, J. M. Quick-release medical tape. Proc. Natl. Acad. Sci. 109, 18803-18808 (2012).
  26. Kim, T., Park, J., Sohn, J., Cho, D., Jeon, S. Bioinspired, Highly Stretchable, and Conductive Dry Adhesives Based on 1D-2D Hybrid Carbon Nanocomposites for All-in-One ECG Electrodes. ACS Nano. 10, 4770-4778 (2016).
  27. Adamietz, I. A., et al. Effect of self-adhesive, silicone-coated polyamide net dressing on irradiated human skin. Radiat. Oncol. Investig. 2, 277-282 (1994).
  28. White, R. Evidence for atraumatic soft silicone wound dressing use. Wounds UK. 1, 104-109 (2005).
  29. Quan, M. B., Edwards, C., Marks, R. Non-invasive in vivo techniques to differentiate photodamage and ageing in human skin. Acta Derm. Venereol. 77, 416-419 (1997).
  30. Brown, X. Q., Ookawa, K., Wong, J. Y. Evaluation of polydimethylsiloxane scaffolds with physiologically-relevant elastic moduli: Interplay of substrate mechanics and surface chemistry effects on vascular smooth muscle cell response. Biomaterials. 26, 3123-3129 (2005).
  31. Palchesko, R. N., Zhang, L., Sun, Y., Feinberg, A. W. Development of Polydimethylsiloxane Substrates with Tunable Elastic Modulus to Study Cell Mechanobiology in Muscle and Nerve. PLoS One. 7, e51499 (2012).
  32. Johnston, I. D., McCluskey, D. K., Tan, C. K. L., Tracey, M. C. Mechanical characterization of bulk Sylgard 184 for microfluidics and microengineering. J. Micromechanics Microengineering. 24, 35017 (2014).
  33. Persson, B. N. J., Gorb, S. The effect of surface roughness on the adhesion of elastic plates with application to biological systems. J. Chem. Phys. 119, 11437 (2003).
  34. Peressadko, A. G., Hosoda, N., Persson, B. N. J. Influence of surface roughness on adhesion between elastic bodies. Phys. Rev. Lett. 95, 1-4 (2005).
  35. Purtov, J., et al. Measuring of the hardly measurable: adhesion properties of anti-adhesive surfaces. Appl Phys A. 111, 183-189 (2013).
  36. Kroner, E., Blau, J., Arzt, E. Note: An adhesion measurement setup for bioinspired fibrillar surfaces using flat probes. Rev. Sci. Instrum. 83, 16101 (2012).
  37. Sun, S., Li, M., Liu, A. A review on mechanical properties of pressure sensitive adhesives. Int. J. Adhes. Adhes. 41, 98-106 (2013).
  38. Webber, R. E., Shull, K. R., Roos, A., Creton, C. Effects of geometric confinement on the adhesive debonding of soft elastic solids. Phys. Rev. E. 68, 21805 (2003).
  39. Creton, C., Lakrout, H. Micromechanics of flat-probe adhesion tests of soft viscoelastic polymer films. J. Polym. Sci. Part B Polym. Phys. 38, 965-979 (2000).
  40. Tan, S. H., Nguyen, N. -T., Chua, Y. C., Kang, T. G. Oxygen plasma treatment for reducing hydrophobicity of a sealed polydimethylsiloxane microchannel. Biomicrofluidics. 4, 32204 (2010).
  41. Kim, B., Peterson, E. T. K., Papautsky, I. Long-term stability of plasma oxidized PDMS surfaces. Conf. Proc. IEEE Eng. Med. Biol. Soc. 7, 5013-5016 (2004).
  42. Briganti, E., et al. Silicone based polyurethane materials: A promising biocompatible elastomeric formulation for cardiovascular applications. J. Mater. Sci. Mater. Med. 17, 259-266 (2006).
  43. Regehr, K. J., et al. Biological implications of polydimethylsiloxane-based microfluidic cell culture. Lab Chip. 9, 2132 (2009).

Tags

Utviklingspsykologi biologi problemet 137 poly(di-methylsiloxane) tynnfilm kompositt elastomerer hud lim vedheft cellekultur
Tynn Film sammensatt Silicon elastomerer for cellekultur og huden programmer: produksjon og karakterisering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Boyadzhieva, S., Fischer, S. C. L.,… More

Boyadzhieva, S., Fischer, S. C. L., Lösch, S., Rutz, A., Arzt, E., Kruttwig, K. Thin Film Composite Silicon Elastomers for Cell Culture and Skin Applications: Manufacturing and Characterization. J. Vis. Exp. (137), e57573, doi:10.3791/57573 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter