Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

דק אלסטומרים סיליקון מורכב הסרט תרבית תאים ואפליקציות עור: ייצור ואפיון

Published: July 3, 2018 doi: 10.3791/57573
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 1,3, 1, 1,2, 1
1INM - Leibniz Institute for New Materials, 2Department of Materials Science and Engineering, Saarland University, 3University of Applied Sciences Kaiserslautern
* These authors contributed equally

Summary

פרוטוקול עבור תהליך הייצור של מבנים מרוכבים פולימריים סרט דק פו-טי של יאנג שונים מודולים או בעוביים מוצג. סרטים מיוצרים ללימודי תרבות תא מתקדם או דבקים העור.

Abstract

פרוטוקול זה, אנו מציגים שיטות כדי לפברק elastomer דק מרוכב הסרטים ליישומים תרבות מתקדמת תא לפיתוח של העור דבקים. שני-(dimethyl siloxanes) פולי שונים (PDMS, עור רך דביק (הסוכן המיוחד)), שימשו בחקירת עומק של השפעות ביולוגיות ומאפיינים דבק. הסרטים מרוכב מורכב שכבה גמישה גיבוי וציפוי העליון דבק. שתי שכבות יוצרו על ידי הרופא להב יישום הטכניקה. בחקירה נוכח, ההתנהגות דבק של הסרטים ללא הפרדות צבע נחקר פונקציה של עובי השכבה או וריאציה של האלסטיות של השכבה העליונה. האלסטיות של PDMS שונתה על ידי שינוי הבסיס אל crosslinker יחס ערבוב. בנוסף, העובי של הסוכן המיוחד סרטים מגוונים כ – 16 מיקרומטר על 320 µm. סריקה מיקרוסקופ אלקטרונים (SEM), מיקרוסקופ אופטי שימשו מדידות עובי. מאפייני elastomer סרטי דבק חזק תלויים עובי הסרט, האלסטיות של פולימרים, המשטח. לכן, נחקר אדהזיה נורמלי של הסרטים האלה על מצעים זכוכית מפגין משטחים חלק ומחוספס. משוך את הלחץ והעבודה של ההפרדה תלויות יחס ערבוב של אלסטומרים סיליקון.

בנוסף, העובי של הדבק עור רך הממוקמת מעל שכבה תומכת גיבוי מגוונים על מנת לייצר תיקונים עבור יישומים העור. Cytotoxicity, התפשטות והצמדות הסלולר fibroblasts מאתר L929 על סרטים PDMS (ערבוב יחס 10:1), הסוכן המיוחד סרטים (ערבוב יחס 50: 50) נערכו. אנו הראו כאן, בפעם הראשונה, השוואת לצד סרטים ללא הפרדות צבע רזה מיוצרים בשני פולימרים, להציג את החקירה של תכונותיהם ביולוגית, דבק.

Introduction

פרוטוקול זה, מוצגים נתונים היסטוריים שיטות לייצור סרטי elastomer דק. הטכניקה הנפוצה הרופא להב שימש לייצור של סרטים רזה ללא הפרדות צבע. הטכניקה הייצור בוצע foils polyethylenterephtalate (PET), המאפשר ייצור עוקבות של הסרטים האלה בקנה מידה גדול. הדגש של פרוטוקול זה הוא להערכת הפארמצבטית, מדויק ייצור של שכבות שונות של הסרטים ללא הפרדות צבע ונחישות המאפיינים ביולוגית והצמדות של התיקון הסופי ללא הפרדות צבע. Poly-(dimethylsiloxane) elastomer סיליקון (PDMS) נמצא בשימוש נרחב ביו טכנולוגיה, לרבות ייצור דבקים העור, מיקרופלואידיקה יישומי מחקר נוסף שדות1,2,3 ,4. לאחרונה, מחלקת נוספת של PDMS, שנקרא עור רך דבקים (אורית רובינשטיין) כבר הציג, במיוחד לעור עדין מליטה, בטל את הבחירה מליטה.

אורית רובינשטיין סיליקון הם אלסטומרים ויניל functionalized, שונות של פולימרים מקבילה על ידי העדר של חיזוק סיליקה5. דומה אחרים PDMS, הסוכן המיוחד של מודול האלסטיות ניתן להתאים במגוון רחב על ידי הכוח ויסות ריכוז מחדש או ריפוי הזמן6,7,8. שינוי זה האלסטיות של אלסטומרים סיליקון משפיע על תכונות דבק של החומר באופן משמעותי, יש גם השלכות עמוקות על תאים prokaryotic ו האיקריוטים תרבותי על פני9,10 , 11. במישור הביולוגי הסלולר, זה הוצג, כי התאים האיקריוטים להגיב על רמת האות התמרה חושית של אפנון של הגמישות מטריקס או עובי משטח9,10,12 13, ,14. לכן, קיים עניין רחב ביישומים התרבות התא של פולימרים עם תכונות מכניות tunable. חשוב לציין, האנרגיה משטח נמוך מהותית של אלסטומרים סיליקון מבוסס אינה מספקת תנאים אופטימליים תרבית תאים של התאים האיקריוטים. טיפול בחמצן פלזמה היא טכניקה בשימוש נרחב כדי להגדיל את PDMS משטח אנרגיה נמוכה באופן זמני, המוביל שיפור כוחו למשוך-off, ירד משטח ספיחה של מולקולות, בעוד במקביל לקידום מצורף, הפצת ו התפשטות התאים האיקריוטים15,16,17,18.

בנוסף לתכונות חומרים, הטופוגרפיה משטח משפיע באופן משמעותי אדהזיה הסלולר ועל האינטראקציה דבק בין שני חומרים19,20,21,22. חספוס פני השטח יש מספר השפעות על היווצרות הקשר בין שני משטחים: הפחתה של איזור המגע, גבוהה לאחסן אנרגיה אלסטית סביב asperities כמו גם השפעה על התפשטות סדק יכול לשנות את ההדבקה23, 24. הידבקות של קרום מודבק על העור האנושי הוא שדה יישום המתעוררים, למשל, הפצע תחבושות, קיבוע של אלקטרודות א או אחרים מכשירים אלקטרוניים שכאלו25,26,27, 28. כדי למדוד את ביצועי דבק של העצמי-דבקים ביחס טופוגרפיית השטח, מצעים זכוכית עם דרגות שונות של חספוס יכול לשמש אדהזיה נורמלי מידות8,21. כאן, שתי זכוכית סובסטרטים נבחרו לחקור את מאפייני הסרטים פולימר דביק. סרטים הראשון, משולב עם שכבה גיבוי PDMS על יחס ערבוב של חלקים במשקל 10 עד 1 מכוסה על ידי PDMS עם יחס ערבוב שונים מאופיינים. בשלב השני שכבה SSA דבק הוכן עם משקל שווה כמויות של שני הרכיבים, עם עובי הסרט על גבי סרט PDMS תמיכה.

Protocol

אזהרה: נא עיין כל גליונות נתונים גשמי בטיחות (MSDS) לפני השימוש. חלק הכימיקלים המשמשים פרוטוקול זה הינם חומרים מגרים, בחריפות רעילים ו/או מסרטנים. אנא השתמש כל נוהלי בטיחות המתאים בעת טיפול כימיקלים אלה. זה כולל את השימוש הנדסה (קבינט כימי) ובאופן אישי ציוד מגן (בטיחות משקפיים, כפפות, חלוק המעבדה, באורך מלא מכנסיים ונעליים סגורות). חלקים של ההליכים הבאים לערב התרבות של קו תא אנימלי. לכן, נא בצע את תקנות אבטחה ספציפי. פסולת כימית וביולוגית צריך להיות מסולק על פי כללים ספציפיים הלאומית ומוסדיים המלצות.

1. הכנת מבנים מרוכבים סרט דק אלסטומרים סיליקון

  1. הכנת פולימרים
    1. כדי להכין 1.1 גר' PDMS 10:1 יחס, מערבבים 1.0 g מתחם א' עם 0.1 גר' תרכובת B.
    2. מיקס, degase פולימרים קדם במיקסר במהירות-2350 סל ד תחת ואקום למשך 3 דקות.
    3. לשנות את יחס המונית בין מתחם A ו- B מתחם העריבה ו- 70:1. . תכינו אותם דומה השיטה המתוארת ב 1.1.2
    4. להכין 1g של הדבק עור רך (הסוכן המיוחד) ביחס של 50: 50. לכן מערבבים 0.5 g מתחם א' ו- 0.5 גר' תרכובת B כפי שמתואר 1.1.2.
  2. הכנת פוליפוני-(vinyl alcohol) (PVA) מצופה בנייר כסף לחיות מחמד
    1. להכין פתרון PVA 18% (w/w) במים על ידי הוספת PVA יונים מים ומערבבים למשך הלילה עם פגים. לאחסן את הפתרון הזה-4 מעלות צלזיוס.
    2. להכין סרטים רזה מפגין יעיל עובי 15 מיקרומטר עם הרופא להב יישום המכונה, באמצעות 100 מיקרומטר פער של הלהב והמהירות של 2.0 מ מ לשנייה.
    3. מקום מהסרטים בתנור ב 95 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
  3. הכנה של השכבה-הגיבוי של PDMS 10:1 יחס ערבוב על ידי הרופא להב הטכניקה
    1. השתמש מכונת יישום להב רופא מבוקרת באופן אוטומטי עבור הכנת הסרטים דק.
    2. לנקות את רדיד האלומיניום של PET עם 100% אלכוהול איזופרופיל ומניחים אותו על פני השטח של אזור יישום הרופא להב.
    3. למקם את הרופא להב על גבי מסכל ולהתאים את העובי עם המיקרו מיצוב ברגים. ייצור של השכבות רטוב, להחיל עוביים של מיקרומטר 60, 100 מיקרומטר, מיקרומטר 200, 500 מיקרומטר.
    4. למלא הפולימר 10:1 PDMS מוכן בשלב 1.1 לתוך המאגר של הלהב הרופא עם מזרק אחד. להתחיל תנועה של הלהב עם מהירות של 2.0 מ מ/s.
    5. להסיר את הסרט חיית המחמד עם הציפוי 10:1 מהמכונה ולמקם אותו בתנור לשעה ב 95 מעלות צלזיוס, ממוקם בחדר מפגין לחות בין 40% ל- 65%.
    6. לנקות את הרופא להב עם מגבות אלכוהול איזופרופיל ונייר.
    7. חזור על הליך זה עבור כל בעוביים הנדרשים.
  4. הכנה של השכבה העליונה של PDMS ב יחס ערבוב שונים על ידי הרופא להב הטכניקה
    1. הסר פסים דקים של צדי אורך הסרט הבסיסית עם האזמל או גילוח כדי לאפשר מיקום וחלונות של הלהב הרופא על מסכל את חיית המחמד.
    2. בצע את שלבים פרוטוקול 1.3.3 כדי 1.3.6. עובי הרטוב מיושם עבור הסרט הוא 160 מיקרומטר.
    3. חזור על הליך זה עבור הייצור של שני סרטים עצמאיים לכל עם אחר יחס ערבוב המרכיבים PDMS (העריבה ו- 70:1). לאחסן את הסרטים בטמפרטורת החדר (כ – 22 ° C ו- לחות של בין 40 ל- 65%) בפטרי מרובע כדי למנוע זיהום ואבק.
  5. הכנת סרטים ללא הפרדות צבע רזה מפגין בעוביים שונים של השכבה 50: 50. הסוכן המיוחד
    1. להכין סרטים 10:1 PDMS בתור גיבוי-שכבה, כפי שמתואר בשלב 1.3 לפני.
    2. בצע את שלבים פרוטוקול 1.4.1 ו 1.4.2 להפקת הסרטים האלה. השתמש SSA יחס ערבוב של 50: 50, מייצרים סרט עם עובי רטוב של 40 מיקרומטר.
    3. חזור על הפעולות לכל עוביים רטוב נוסף של: 120 מיקרומטר, מיקרומטר 300, 500 מיקרומטר.

2. רגיל אדהזיה מדידות באמצעות מצעים עם חספוס פני שטח שונים

  1. הכנה ואפיון של סובסטרטים זכוכית עם חספוס פני שטח שונים
    1. השתמש גליל זכוכית בקוטר 2 מ מ כמו מצע' החלקה'.
    2. כדי לייצר את בלו 'המצע קשה' כלי לחיתוך זכוכית חתיכה עם הממד של בערך 4 x 4 מ מ שקופית זכוכית חלבית. השתמש בלוח יד של יהלומים מחוספסים כדי לקבל שטח מעגלי של 3 מ מ קוטר.
    3. לצרף את הזכוכית אלומיניום חרוט עם דבק UV, להאיר את זה בבית הבליעה תאורה UV למשך 3 דקות.
    4. לקבוע הרדיוס של פני השטח של המצע עם מיקרוסקופ אופטי. לחשב את השטח לפי הנוסחה A = πr2.
    5. לקבוע את החספוס פרמטר R Rz (על פי: DIN EN ISO 4287, ASME B46.1) עם profilometer העט האלקטרוני.
    6. מוספית המצע על הבמה מדגם של profilometer ולהביא את הטיפ (יהלום, סטנדרט: 2 מיקרומטר/60 °) במגע עם הדוגמה.
    7. להקליט את הפרופיל החספוס של מהירות של 0.3 מ מ/s, באורך של 1 מ מ.
    8. כדי לנתח את פני השטח הטופוגרפי, מידת שטח בדיוק 1 מ2 עם profilometer עט אלקטרוני, שמפעילה התוכנה המשוייכת.
      הערה: profilometer מופעל על ידי מחשב חיצוני. המחזיק הוא זז מ מ 0.001 בכיוון y לאחר תזוזה של 1 מ מ מתמלאת ב- x כיוון. שנרשמו. RS3 הקובץ מיובא Surfcom מפה מומחה תוכנה ליצירת תמונות תלת-ממד.
  2. מדידת אדהזיה נורמלי סרטים רזה מיוצרים PDMS או הסוכן המיוחד
    1. השתמש סכין גילוח כדי לחתוך את הסרטים על מסכל את חיית המחמד לחתיכות קטנות עם שטח של ס מ 4.0 על2 ומקום שלהם על כוס להחליק עם דבק UV. יאיר עם UV אור למשך 3 דקות.
    2. הר המדגם פולימריים על המחזיק לדוגמה.
    3. לנקות את המצע משטח בעדינות עם אתנול ויבש עם גז חנקן.
    4. לצרף את המצע זכוכית, שמגרד את חרוט אלומיניום, לתא המטען.
    5. השתמש בטבלה tiltable (מד זווית) כדי ליישר המשטחים במדויק על-ידי התאמת זווית הטיה המצע מתקרב הסרט פולימריים. כדי לעשות זאת, להביא את המצע באופן ידני עם הסרט. לשנות את זווית הטיה עד יישור מקביל לחלוטין של שני המשטחים אחד לשני, דמיינו ידי תמונות מצלמות, מתקבל.
      הערה: תא המטען מחובר אל השולחן tiltable. מנסרה מזכוכית ממוקם מתחת המדגם, כפי שמוצג באיור 4, המאפשר ויזואליזציה של איזור המגע עם שתי מצלמות ומאפשר את היישור של המצע על הסרט פולימר.
    6. הזז המצע השטח סרטים פולימריים עד הלחץ preload של kPa ± 5 13 מושגת (איור 4).
    7. הפעל את חבילת התוכנה מתוכנת מותאם אישית בכתב LabView כדי לקבוע שהפרמטרים הנדרשים מדידה כגון להחזיק מהירות הגישה/הכחשה וזמן. החסימה זמן tהחזק הוא 1 השני, הגישה והוא ניתוק מהירות 30 מיקרומטר/s ו- 10 מיקרומטר/s בהתאמה.
    8. לבצע מדידות אדהזיה על שלוש דוגמאות מיוצרים עצמאית, שישה מקומות שונים על פני כל הסרט.
  3. ניתוח נתונים וחישוב של גורמים מכניים מרכזיים: למשוך את הלחץ והעבודה של ההפרדה.
    1. לחשב את הלחץ Equation 1 על-ידי חלוקת שנרשמו לכפות על ידי האזור המצע שלS.
      Equation 2
    2. לקבוע למשוך את הלחץ, אשר מתואר הערך המרבי של מתח רגיל.
      Equation 3
    3. לקבל את Δs הזחה על-ידי חיסור של מיקום ההתחלה שלsהמשטר מתיחה0 s מיקום הדגימהסוף איפה בטל מליטה הושלמה. מגדירים את תחילת המשטר מתיחה s0 = 0.
      Equation 4
    4. לתקן את הערכים מדודה של העמדה לדוגמה על ידי הציות מערכת C לפי המשוואה הבאה:
      Equation 5
    5. שילוב עקומת הלחץ-תזוזה בין s0 ו- sסוף על מנת לחשב את העבודה של הפרדה.
      Equation 6
  4. החישוב של גורמים מרכזיים מכני באמצעות תוכנה לחישובים מתמטיים מקור.
    1. לייבא את קובץ מוקלט. dat מדידה אדהזיה בודדת בטבלת המקור. הפרמטרים אשר נרשמות הם זמן, מיקום הדגימה וכוח. הוסף פרמטרים אלה בעמודות A (זמן), B (מיקום הדגימה) ו- C (כוח).
    2. כדי לקבוע את הערך ריק, ממוצע כ- 20 ערכים מדידה של הכוח לפני שתפנה אל הסרט פולימר. שם הזה הערך הממוצע Fקיזוז , ולהדביק אותה בתוך טור ד
    3. לחשב את הרקע מתוקן כוח F * לפי המשוואה הבאה
      Equation 7
      ולהוסיף את המשוואה הזו, כפי שמוצג להלן, לתוך עמודה א
      Equation 8
    4. להגדיר את תחילת המשטר מתיחה כמו אפס הזחה, קרי, s0 = 0. לכן, לקבוע s0 , מהמסיכה זה העקירה בטור ב', לשמור אותו בעמודה f:
      Equation 9
    5. יתר על כן, לתקן את מיקום הדגימה על-ידי הציות המכונה. תיקון זה מבוצע בעמודה הוספה ג המשוואה הבאה לתוך עמודה G
      Equation 10
    6. לחשב את הלחץ בעמודה הבאה ה לכן, לחלק את הכוח באזור המצע. להוסיף את המשוואה הבאה
      Equation 11
      כאשר A הוא שטח הפנים של סובסטרטים זכוכית מ מ2 (שנקבע ב- 2.1).
    7. לחשב את העבודה של הפרדה מן הערכים מתח ותזוזה. לכן, מגרש העקירה לאורך ציר ה-x ואת הלחץ לאורך ציר ה-y. לשלב את הגרף הזה מ- s0 sסוף איפה sסוף מוגדר העקירה שבו הלחץ מתיחה מחזירה אפס, כלומר ניתוק מלא התקיים. כדי לשלב את התרשים, בחר בפונקציה לשלב. להוסיף הערכים המחושבים לעמודות אני, ג'יי

3. אפיון של הסרטים על-ידי סריקת מיקרוסקופ אלקטרונים (SEM), מיקרוסקופיה אופטית

  1. מיקרוסקופ אופטי
    1. עם סכין גילוח לגזור את הסרט פולימריים לחתיכות קטנות (כ 0.25 ס מ2) וחבר אותם לקצה של זכוכית. המקום השקופית זכוכית אנכית חוקיים תחת מיקרוסקופ זקוף, למדוד את העובי של הסרט חתך הרוחב.
      הערה: השתמש מטרה X 20 (NA = 0.45, ברזולוציה תיאורטי ב 800 nm של 1.1 מיקרומטר) כדי למדוד ערכי עובי הסרט ≤ כ 20 מיקרומטר. סרט עובי בטווח של 20 מיקרומטר עד 50 מיקרומטר להשתמש מטרה X 10 (NA = 0.30, ברזולוציה תיאורטי ב 800 nm של 1.6 מיקרומטר) ולהשתמש לסרט עובי ≥ 50 מיקרומטר מטרה X 5 (נה = 0.15, ברזולוציה תיאורטי ב 800 nm של 3.3 מיקרומטר).
  2. החקירה SEM
    1. לחתוך את נייר חיית המחמד, לצרף מדגם של 2 ס מ2 זכוכית ומניחים אותו אנכית למנגנון clamping בתוך ≤ מחזיק הדגימה 2 מ מ מתחת לפני השטח העליון של בעל.
    2. בחר של מתח ההאצה של 10 kV, גלאי אלקטרונים backscattered (BSD), בתנאי ואקום נמוך (60 Pa).
    3. התאם את המוקד, הגדלה, הבהירות והחדות של התמונות.
    4. בחר מועד רכישת התמונה של 28 s עם רזולוציה של 1024 x 2048 פיקסלים.
    5. הסר את בעל מדגם ב- SEM.

4. ביולוגי החקירה

  1. תא שגרתית התרבות של L929 תאים
    1. השתמש בשורת תאי פיברובלסט מאתר L929 לחקירה. התרבות התאים הבזליים Rosewell פארק אנדרטת המכון (RPMI) 1640 בינוני, בתוספת 10% סרום שור בעובר ו פניצילין סטרפטומיצין und ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 T75 תא תרבות מבחנות. המעבר את התאים על זרימה של 70-80%.
    2. עבור תא passaging, להסיר את המדיום על ידי השאיפה ולשטוף עם סידן, מגנזיום פוספט חינם מאגר (DPBS- / -) ב-30 s תחת זרימה שכבתית בארון. לאחר מכן דגירה התאים עם 2 מ של Accutase, פתרון האנזים עם הפרוטאוליטי ואת הפעילות collagenolytic של עד 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2.
    3. ודא ניתוק של תאים מפני השטח הבקבוק התרבות התא עם מיקרוסקופ לעומת זאת שלב.
    4. הוסף 8 מ של סרום המכיל בינוני לתוך הבקבוק ואת העברת התליה תא צינור תגובה 15 מ"ל.
    5. לקחת מדגם µL 10, התליה תא ומערבבים עם 10 µL של Trypan Blue.
    6. לקבוע את מספר הטלפון עם תא נויבאואר, לחשב את המספר הכולל של תאים.
      התראה: Trypan Blue הוא רעיל, לכן ייעוץ MSDS, ביצוע הפרוצדורות חובה תיאר את MSDS, לובש של הגנה על ביטחונם האישי המתאים וטיפול תחת ארון כימי נדרש. איסוף פסולת עבור התצהיר פסולת כימית.
      הערה: תאים חיוביים Trypan Blue צבועים בכחול, המציין ממברנות הסלולר ללא פגע.
    7. מעבר הבא, תרבות 5 x 10 תאים5 בבקבוקון תרבות תא סטרילית חדשה עם 10 מ"ל של מדיום חדש. על תנאי הניסוי, תרבות 3 x 105 תאים הלוחות טוב 6 תאים 6 x 104 מכל קידוח של צלחת טוב 24, המכיל דוגמאות פולימריים (פרוטוקול שלב 4.2).
  2. הכנת סרטים ללא הפרדות צבע עבור ניסויים התרבות התא.
    1. בלו חתיכות יחיד של סרטים של הממדים הרצויים מיוצר בשלב פרוטוקול 1.4 ו- 1.5 מהשכבה תומכת PET עם האזמל, מקום עם פינצטה על גבי משטח זכוכית שער גולשת מפגין בקוטר של 12 מ"מ. מניחים את הדגימות הבארות של 2 4. ובכן צלחת.
    2. עבור cytotoxicity קביעה וספירה תא, אל תסיר את הסרטים מסכל את חיית המחמד. חתך מעגלי תחומי כ 9.4 ס מ2, בהשתלבות בצורה מסודרת הבארות יחיד של צלחת טוב 6, מן הסרטים מיוצר 1.4 ו- 1.5, למקם אותם לתוך הבארות של צלחת התרבות תאים.
    3. לטבול את הדגימות פולימר יונים H2O עבור ≥ 30 דקות.
      הערה: הדגימות הפולימרים עשוי להיות מחוטא ע י autoclaving. לכן, להסיר את כל הדגימות המכיל פולימר המנות התרבות תאים, למקם אותם בתוך כוס, צלחת פטרי. עיקור מתבצע ב החיטוי בבר 2.05 כעשרים דקות בטמפרטורה של 121 מעלות צלזיוס.
  3. טיפול פלזמה של פולימרים
    1. למקם את הסרטים אשר מחוברים לסכל את חיית המחמד או זכוכית עגולים שער גולשת (מתוצרת 4.2.1) בתוך התא התגובה של המכשיר פלזמה.
    2. סגור את המכסה ותתפנו מפה עד בלחץ של 1.6 x 10-2 mbar
    3. לבצע טיפול פלזמה למשך 3 דקות.
    4. לאוורר את החדר התגובה ולמקם דוגמאות 24 טוב או 6 מנות טוב לחקירות התרבות תאים נוספים.
    5. השתמש דוגמא אחת לקביעת זווית מגע מים מד זווית. לכן, להזיז את המזרק קרוב לפני השטח פולימריים, באמצעות חבילת התוכנה ולמקם טיפת מים 3 µL מעל פני השטח. חשב את זווית מגע של מים סטטי עם התוכנה מד זווית.
  4. מכתים, מיקרוסקופ
    1. להכין את התאים כפי שמתואר בשלב 4.1.7 ותרבות בתלת-ממד ב- CO 37 ° C ו-5%2.
    2. לכידת תמונות חדות שלב של תאים תרבותי במשך שלושה ימים על בתולי-פלזמה מטופלים סרטים זמן קצר לפני קיבוע.
    3. להכין PBS בתוספת 0.2% טריטון-X-100. לאט לאט פיפטה µL 200 של הפתרון מניות לתוך 100 מ של PBS (PBS-T).
    4. להכין פתרון paraformaldehyde/PBS 4% (PFA/PBS-T).
      התראה: Paraformaldehyde הוא רעיל, לכן ייעוץ MSDS, ביצוע חובה הפרוצדורות המתוארות MSDS והוא לובש של הגנה על ביטחונם האישי המתאים וטיפול תחת ארון כימי נדרש.
    5. להכין פתרון BSA/PBS-T 5%.
    6. הסר המדיום על ידי שאיפה תחת הזרם פרופריה בארון. להוסיף PBS הבארות כדי להסיר שאריות בינוני.
    7. להעביר את הצלחת ארון כימי והחלף PBS µL 400 של הפתרון מחברים/PBS במשך 25 דקות בטמפרטורת החדר.
    8. הסר את הפתרון מחברים/PBS הבארות יחיד, תשטוף היטב עם PBS ארבע פעמים. לחכות 3 דק. בין שלב לשלב הכביסה ולאסוף הפתרונות לסילוק פסולת כימית. שימוש לצלחת ישירות, או לשמור אותם ב 4 º C.
    9. להוסיף 5% אלבומין שור (BSA) / PBS-T לבארות דגירה עבור 60 דקות ב RT לחסום אתרי קישור לא ספציפי.
    10. האחות הפתרון להחליף אותו phalloidin מצומדת כדי אלקסה-488 (דילול 1:160) / PBS-T פתרון בתוספת 0.2% טריטון-X-100.
      התראה: Phalloidin-488 רעיל, לכן ייעוץ MSDS, ביצוע חובה הפרוצדורות המתוארות MSDS והוא לובש של הגנה על ביטחונם האישי המתאים וטיפול תחת ארון כימי נדרש.
    11. כיסוי לצלחת עם נייר אלומיניום ו תקופת דגירה זה של 3 h ב- RT או לילה ב 4 º C.
    12. האחות הפתרון ולשטוף שלוש פעמים עם PBS. המתן 3 דק. בין שלב לשלב הכביסה. לאסוף את הפתרונות לסילוק פסולת כימית.
    13. להכין פתרון של µL 1 של צבע Hoechst 33342 (במניה פתרון 1 מ"ג/מ"ל). לדילול 1:1000 פיפטה 1 µL של Hoechst לצבוע 3334 ל- 1 מ של PBS-T ומערבבים היטב. להוסיף 300 µL של הפתרון Hoechst 33342 לצבוע הבארות, תקופת דגירה של 10 דקות ב RT בחושך.
      התראה: צבע Hoechst 33342 הוא ריאגנט intercalating DNA ותיאר ולכן פוטנציאל מוטגן, לכן ייעוץ MSDS, ביצוע הפרוצדורות חובה MSDS, לובש של הגנה על ביטחונם האישי המתאים, טיפול תחת הקבינט כימית נדרשת.
    14. האחות הפתרון ולשטוף את הדגימות ארבע פעמים עם PBS. המתן 3 דקות בין שלב לשלב הכביסה. לאסוף את הפתרון לסילוק פסולת כימית.
    15. להטבעת, בזהירות להסיר את הסרטים מהמשטח תרבות ומניחים על משטח זכוכית מיקרוסקופ. להוסיף 20-40 µL בינוני ההטבעה מסיס מים הסרט וצרף תגית חדשה של כיסוי זכוכית עגול למעלה באמצעות לחץ קל.
    16. לבצע הדמיה עם מיקרוסקופ זריחה. מסננים לצורך תאורה: אלקסה-488 יש מקסימום של עירור 496 פליטה nm ומקסימום מתרחשת 519 ננומטר. לכן, הצבע פליטה הוא ירוק. Hoechst 33342 צבע trihydrochlorid trihydrate ומורכבת עם ה-DNA יש עירור של פליטה מורכבות הדנ א המרבי 355 ננומטר, מקסימום מתרחשת ב- 465 nm.
  5. Cytotoxicity קביעת ונחישות של מספר הטלפון הנייד
    1. לבצע את הניסוי עם תאים גדלו ב 6 צלחות טוב מוכן בשלב 4.3 ותאים מוכן בשלב 4.1.7. התרבות התאים במשך 3 ימים-CO 37 ° C ו-5%2. עבור הפקד חיובית, השתמש תאים שגודלו על התא תרבות מטופלים פוליסטירן משטח, המכיל אין סרטים פולימריים. על רקע נחישות (מצב שלילי), השג בינוני באר ללא תאים.
      הערה: בינוני יכולות להילקח גם מתאי טוב המכיל תרבותי על פני התא תרבות מטופלים פוליסטירן.
    2. לפי מספר דוגמאות ניסיוני תווית 15 מ"ל צינורות.
    3. להוסיף 40 µL של טריטון X-100 0.9% המכיל פתרון PBS לפקד חיובית, מערבבים היטב עם טיפ µL 1000. המתן כ 3 דקות.
    4. מבלי להסיר את התאים מחוברים אל פני השטח, תשאף האמצעי כל דוגמאות, כולל דוגמאות המבושלות 4.5.3 ולהעביר המדיום הצינורות 15 מ"ל. להוסיף 3 מ"ל של DPBS- / - הבארות יחיד ולאחסן את הצלחות זרימה שכבתית ארון לקביעת מספר הסלולרי כפי שמתואר 4.5.9.
    5. צנטריפוגה ב 200 x g במשך 3 דקות ולהסיר 1 מ"ל של תגובת שיקוע לקביעת פעילות LDH. מאחסנים צינורות 15 מ"ל המכיל תאים, שנותרו בינוני תחת זרימה שכבתית ארון.
    6. עבור וזמינותו צלחות טוב 96 שחור עם תחתית שטוחה משמשים. להוסיף 50 µL של ריאגנט CytoTox-אחד µL 50 של מדגם בינונית, מערבבים היטב עבור 30 s.
    7. כיסוי לצלחת עם נייר אלומיניום ולאחסן למשך 10 דקות ב- RT.
    8. להוסיף 25 µL של הפתרון להפסיק מכל קידוח ולהקליט את עוצמת קרינה פלואורסצנטית בקורא צלחת זריחה. לנער את הצלחת. בשביל 10 s לזהות את האות זריחה עם אורך גל עירור של 520 ננומטר, אורך גל של פליטה של 560 ננומטר. להימנע בועות אוויר.
    9. לקביעת וביופסיה מספר התא DPBS- / - מן הבארות של צלחת תרבות מפרוטוקול צעד 4.5.4 ולהוסיף את הפתרונות תגובה 15 מ"ל הצינורות המכילים את supernatants שנאסף מספר שלב פרוטוקול 4.5.5.
    10. Centrifuge הצינור תגובה 15 מ"ל ב 200 x g למשך 3 דקות, תשאף תגובת שיקוע. להוסיף 0.5 מ של טריפסין/EDTA, תקופת דגירה של 10 דקות ב 37 º C.
    11. להוסיף 2 מ של טריפסין/EDTA ב הבארות של הצלחת, תקופת דגירה של – 10 דקות ב 37 ° C כדי לנתק תאים מן הסרטים פולימריים.
    12. התליה תא מועבר הצינור תגובה 15 מ"ל ממספר שלב 4.6.10. בנוסף, לשטוף את הצלחות נמרצות עם נסיוב-בינוני.
    13. Centrifuge הדגימות ב g x 200 למשך 3 דקות, וארוקן את תגובת שיקוע והוסף נסיוב-בינוני עד הצינור.
    14. לקבוע את מספר הסלולר כפי שתואר בשלבים 4.1.5 ו 4.1.6.

Representative Results

בניסויים הראשונים, PDMS סרטים עם עובי משתנה ולא קבוע ערבוב יחס של 10:1 יוצרו על סרטי PET (איור 1). בגלל עובי השכבה גיבוי יכולים להשפיע באופן משמעותי הקשיחות וטיפול המאפיינים של הסרטים מורכב כולו, בניסויים הראשונית סרטים יחיד בין 13 ± 2 מיקרומטר 296 מיקרומטר 13 ± היו מיוצרים (איור 1). . זה ידוע, כי במהלך הצטמקות תהליך ריפוי סרטים פולימריים מתרחשת. עבור הסרטים הדק, הבחנו בהבדל של 78% ± 3.1% בין תנאי נרפא ורטובה. עבור הסרטים העבה ביותר, הצטמקות של 40.9% ± 2.6% כבר זיהתה (איור 1).

עבור היישומים הוצג פרוטוקול זה, סרטים צריך באופן ידני להסיר את נייר הכסף של חיית המחמד. זיהינו כי סרטים רזה במיוחד קשה להתמודד עם מלקחיים, לעיתים קרובות נהרסים בתהליך זה. לכן, אנחנו חקר השפעת דק פולי-(ויניל אלכוהול) ציפוי כשכבה תומכת. PVA בעל מנדנד גבוה, והוא ניתן להסיר בקלות עקב מסיסות המים שלה ביישומים במורד הזרם. הציפוי PVA יש עובי של 17 מיקרומטר, ולכן סרטים PDMS מצופה על גבי שכבה זו מעט רזה בהשוואה לסרטים ללא הציפוי PVA (נתונים לא מוצג). במיוחד התמקדות במאפיינים טיפול, אנו מסיקים, כי רק הסרט הדק דורש סרט PVA תומכת להסרה מן מסכל את חיית המחמד.

עובי הסרט יעיל של בערך 40 µm נבחר לניסויים נוספים. עבור הפקת סרטים ללא הפרדות צבע, יחס ערבוב של PDMS היה ומגוונות 10:1 העריבה וכדי 70:1 ומוחלים על גבי הסרט PDMS polymerized קודם לכן עם הרופא להב טכניקה (איור 2 א). מלבד היחס בין 10:1, הסרטים שונים יכול להיות מכובד בעליל על ידי מיקרוסקופ אופטי עם דיוק המתאימה. לבדיקה מיקרוסקופית הסרטים היו חותכים עם איזמל, צמוד לקצה של שקופית מזכוכית. יחס ערבוב גבוה יותר של השכבה העליונה הופיעו באופן חזותי בהירים יותר על התמונות מיקרוסקופיים לעומת היחס 10:1 של השכבה גיבוי (איור 2B). בנוסף, מיקרוסקופ אלקטרונים סורק שימש לשיקוף דוגמאות בהגדלה גדולה של 860 X (איור 2C). הבדל ברור הנצפה בהירות בין שני הסרטים PDMS, מתוצרת גבוה יותר יחס ערבוב הוכר, לעומת היחס בין 10:1. ההליך חיתוך משאיר סימני, גלוי תמונות SEM (איור 2B). בהתבסס על תוצאות אלו, העובי הכולל ממוצע של הסרטים ללא הפרדות צבע היה מיקרומטר 112 ± 5.0 מיקרומטר (איור דו-ממדי).

בניסויים נוספים המאפיינים אדהזיה של הסרטים האלה שנקבע עם כוח נורמלי אדהזיה מדידות באמצעות זכוכית שונים שני מצעים (איור 3). המצע' חלקות' בעל מרקם פני השטח של חספוס רשע אריתמטי R של מיקרומטר ± 0.0002 0.013, כלומר שיא-אל-עמק Rz של ± 0.004 0.12 מיקרומטר (איור 3 א). המצע 2 (GS2, כמנהל קשוח) הציג בערכי חספוס 0.338 ± 0.021 מיקרומטר (R) ו 2.055 ± 0.017 מיקרומטר (Rz) (איור 3B). עם הממוצע חושבה רדיוס בשנת 2.1.4 שפני השטח של המצע 'חלקות' היה 3.2 מ מ2 ואילו המצע 'קשה' פני שטח של 6.07 מ מ2 .

עם מצעים שני אלה, נקבע את ההתנהגות דבק של סרטים שונים. שני פרמטרים נבחרים כדי לתאר את המאפיינים דבק של הסרטים: את משוך את הלחץ σמקסימום ועל עבודתו של ההפרדה Wספט. בכל תהליך של מליטה, מליטה מבטל את המיקום מדגם s ואת הכוח נורמלי F נרשמים. התוצאות מיוצגים בתעלת מתח-הזחה (איור 4).

על פרשנות נכונה של תוצאות הניסוי, יש חשיבות ליישור במדויק את המצע השטח סרטים פולימריים. גם מכונת הציות של המכשיר מדידה חייב להיחשב על מנת לתקן את המנוע. במהלך המדידה הכוח יישומית מעשים לא סמך המדגם, אלא גם על חלקים אחרים של המכשיר בדיקה. לכן, כל אחד שני מצעים לוחצות שקופית מזכוכית עם הלחץ compressive של kPa ± 5 13. כדי למדוד את התאימות, העקומה עומס נלקחת בחשבון, דהיינו, החלק של עקומת כוח-הזחה שבו שני משטחים באים במגע עד מיקום הדגימה לאן הגיע הכוח preload המדויק. המדרון הדדיים של העקומה שווה להציות מכונת ג הערך המחושב עבור C הוא 0.12 מיקרומטר/mN.

בניסוי הראשון נותחו סרטים עם יחס ערבוב שונים של PDMS (איור 5). עבור הסרטים ללא הפרדות צבע, בעובי ואת היחס ערבוב של השכבה גיבוי, מיוצרים של PDMS 10:1 נשמר קבוע. עובי השכבה העליונה גם נשמר קבוע עם ערך של 65 מיקרומטר. הגבוהה ביותר למשוך את הלחץ של 109 ± 27.6 kPa נקבע עם המצע זכוכית חלקה על הסרט 10:1 PDMS (איור 5A). גידול של יחס ערבוב מוביל ירידה של הלחץ משיכה-off כדי ± 76.7 17 kPa עבור יחס ערבוב העריבה ± 41.4 17 kPa עבור היחס 70:1. עם הלחץ המצע משיכה-off זכוכית קשה של 22 ± 2.2 kPa נקבע על הסרט 10:1 PDMS. באופן כללי, העבודה של ההפרדה היה דומה בין שני מצעים זכוכית, למשל., 1.4 ± 0.6 J/m2 על הסרט הדק שהושג עם המצע חלקה של 1.84 פאונד ± 0.7 J/m2 על הסרט הדק שהושג עם המצע קשה ( איור 5B).

בשלב הבא, הפקת סרטים רזה עבור יישומים העור, תרבית תאים יישומים כבר בחנו (איור 6). הסוכן המיוחד 50: 50 שימש לייצור השכבה העליונה של הסרטים ללא הפרדות צבע. PDMS 10:1 יחס ערבוב עם עובי של – 40 µm שימש כשכבה גיבוי. בניגוד הניסויים הקודם מתואר באיור5, עובי השכבה העליונה היו מגוונים, ואילו יחס ערבוב נשמר קבוע (איור 6A). הסוכן המיוחד נבחר בשל תכונותיו דבק ביישומים מעורבים מצורף משטחים עם חספוס פני שטח גבוהה, במיוחד העור האנושי, באמצעות המלצת היצרנים ערבוב יחס 50: 50,5,8. האפידרמיס האנושי הנו חספוס פני שטח גבוהה. בהתאם לגיל אנטומי או האזור שלעומק רשע חספוס פני השטח (RZ) בין 48 מיקרומטר מיקרומטר 71 כבר דיווח29. עור עדינה ובטוחה אדהזיה חשוב, הייחוד לעור רגיש של neonates או בקושי מחדש עור של הזקנים. רטוב בעוביים שונים החל 40 µm, 120 מיקרומטר, מיקרומטר 300 ועד 500 מיקרומטר הוחלו (איור 6A). תלוי בעובי רטוב, העובי הכולל של הסרטים ללא הפרדות צבע משתנה בין 51 מיקרומטר 344 מיקרומטר (איור 6B). לאחר ריפוי, הפרדות צבע נתווספו את גב היד של מתנדב (איור 6C). עוביים סרטים שונים מראים בבירור הבדלים במאפייני ההסתגלות שלהם על החספוס של העור (איור 6C). סרטים רזה (50 מיקרומטר, בעובי 100 מיקרומטר) להציג שיעור גבוה של הסתגלות הקמטים בעור לעומת הסרטים עבה (220 מיקרומטר, עובי הכולל 340 מיקרומטר). תוצאות אלה מציינים כי ניתן להפיק סרטים ללא הפרדות צבע עם מגוון רחב של עוביים דווקא עם הטכניקה להב רופא יישומית.

אדהזיה הניסויים בוצעו עם הסרטים האלה ללא הפרדות צבע (איור 7). תלוי בעובי של הסרט העליון SSA, הבחנו ירידה של הלחץ משיכה-off עם עובי הסרט הולך וגדל. הגבוהה ביותר למשוך את הכוח של kPa 133 ± 36.6 נמדדה על המצע חלקה (איור 7 א). הנמוך המשיכה-הנחה-הלחץ של kPa ± 4 18 הושג עם המצע קשה על הסרט העבה ביותר. מעניין לציין השוואה בין שני מצעים מגלה את ההבדל קיפול 2.7 על הסרטים הדק (איור 7 א). עם עובי הסרט הולך וגדל, במיוחד על הסרטים העבה ביותר אין הבדל מדהים היה נצפות (איור 7 א). עם המצע חלקה עבודה של הפרדה בין 1.8 ± 0.8 J/m2 זוהה על הסרט מציג עובי סך של – 100 מיקרומטר, ולאחריו ירידה התלויים של עובי הסרט (עובי מיקרומטר 220: ± 0.6 1.6 J/m2 ו- 330 מיקרומטר: 1.3 ± 0.4 J/m2 , (איור 7 ב)). העבודה של ההפרדה נמדד עם סובסטרטים קשה היה באופן כללי מעט נמוכה לעומת המצע חלקה (100 מיקרומטר עובי: ± 0.6 1.63 J/m2; 220 מיקרומטר עובי: 1.1 ± 0.6 J/m2 ו- 330 מיקרומטר: 1.0 ± 0.2 J/m2 (איור 7 ב )).

בנוסף, מנגנון ניתוק הוקלט במהלך המדידות (איור 7C). קוויטציה הקטן נצפתה על הסרט הדק, בזמן ההופעה של האצבע כמו סדקים היה נצפות על הסרטים עבה (איור 7C).

המדידות בוצעו בתוך חודש אחד לאחר הייצור של הסרטים. עם זאת, יציבות ושימור התכונות המכאניות של הסרטים אלסטי עשוי להיות מושפע גורמים סביבתיים, לרבות טמפרטורה ולחות. כפי שמתואר בשלב פרוטוקול 1.4.3, הסרטים אוחסנו על טמפרטורת החדר והלחות של 40-65%. כדי למנוע מהם זיהום, אבק, הסרטים שהם אוחסנו בתוך פלסטיק צלחות פטרי בחושך. כדי לחקור את יציבות לטווח ארוך, מדידות אדהזיה ונחישות עובי של הסוכן המיוחד 50: 50 סרטים בוצעו כ- 4 חודשים אחרי פבריקציה נוספת. אין השפעה ניכרת על עובי הסרט, למשוך את מתח העבודה של הפרדה זוהתה לאחר אחסון. לדוגמה, למשוך את הלחץ של הסוכן המיוחד הסרטים ללא הפרדות צבע מיוצר עם עובי רטוב של 120 מיקרומטר SSA ועובי רטוב של 100 מיקרומטר PDMS היה kPa ± 6 46.6 ועל עבודתו של ההפרדה 1627 ± 592 mJ/m2 אחרי פבריקציה נוספת. כ- 4 חודשים לאחר הייצור, למשוך את הלחץ של kPa ± 5.4 48.8 ועבודה של הפרדת 1666 ± 723 mJ/m2 נקבע. בנוסף, זמן קצר לאחר הייצור, העובי הכולל של הסרטים האלה היה מיקרומטר ± 13.9 103.3 ואחרי אחסון 98.1 ± 9.1 מיקרומטר.

ב עוד ניסויים PDMS 10:1, הסוכן המיוחד 50: 50 סרטים ללא הפרדות צבע עם עובי סך של-105 מיקרומטר שימשו כתא תרבות מצעים (איור 8). סרטים ללא הפרדות צבע שיוצרו ב פרוטוקול שלב מספר 1 יכול להיות בקלות להסיר את נייר הכסף חיית המחמד וחותכים במידות הדרושות ובצורות גיאומטריות. יתר על כן, כאשר והקפדה על סרטים נוקשה משטח, למשל זכוכית, סרטים מרובות מוצגים מודולים של יאנג שונים יכול להיות מצורף לצד, ייתכן יהיה ממוקם בתוך טוב יחיד של צלחת התרבות תאים. סרטים יכול להיות מצורף אל פני השטח פוליסטירן ישירות מבלי coverslip נוספים. כמו כן, סרטים יכול להיות מותאם משטחים שונים, מבנה גיאומטרי, כמו צינורות או טבעות, המאפשר מחקרים לא בר השגה עם חומרים תרבות תא קונבנציונלי. בניסויים שבוצעו מתואר באיור 8 סרטים ללא הפרדות צבע על חיית המחמד רדיד מוקמו ישירות לתוך התא תרבות צלחות או סרטים להסיר את נייר הכסף חיית המחמד והניח על זכוכית שער גולשת. עבור התנאים ניסיוני, פולימרים מסוימים שטופלו עם אוויר פלזמה כדי להגביר את האנרגיה השטח חינם שלהם. באופן כללי, בעל זווית מגע של מים של 115° לפני טיפול פלזמה PDMS, והוא הופך להיות מאוד הידרופיליות (מים זווית מגע < 30°) aftertreatment8. טיפול פלזמה הופך את השטח מסתיימים ואסטמה ומקילה על ההחזקה של התאים האיקריוטים. תלוי זמן טיפול ועוצמה השטח פולימר משתנה, הצגת תואר גבוה יותר של חספוס, גם קראק עשויים להופיע. מיד לאחר הטיפול, הוא ציין תהליך השחזור הידרופובי. כפי שמתואר תחת פרוטוקול שלב 4.3.5 מד זווית שימש כדי לקבוע את זוויות הקשר מים סטטי. לכן, פולימרים שהוצבו ב- ddH2O עבור 1 h לאחר הטיפול פלזמה אוויר נותחו לאחר מכן. טיפול פלזמה מופחתת באופן משמעותי את זווית מגע של מים (PDMS זהובים: 117.0 ± 2.2°; . הסוכן המיוחד וטהור: 127.9 ± 5.6°; PDMS פלזמה: 18.0 ± 7.2°; הסוכן המיוחד פלזמה: 29.3 ± 11.5 °).

עבור מדגם הטבעה של הרכבה מימית הוחל בינוני. אם בכל נקודת זמן הדגימות צורך להסיר שוב, ניתן להציב את דגימות של מים המכילים פטרי בן לילה. בסופו של דבר, ניתן להסיר את פתקי הכיסוי לניתוח נוסף.

הקובץ המצורף ההתנהגות ואת המורפולוגיה של תאי L929 נזרע במשך 3 ימים על סרטים ללא הפרדות צבע 50: 50 PDMS, הסוכן המיוחד נקבע על ידי מיקרוסקופ לעומת זאת שלב ואחרי צביעת עם פלורסצנטיות מצומדת phalloidin-488 וצבע Hoechst 33342 (איור 8). ייבוא תמונות עם מיקרוסקופ לעומת זאת שלב מומלץ מאוד, במיוחד עבור פולימרים אינם מטופלים עם פלזמה. עקב הדבקה הסלולר חלש על משטחים פולימרים אלה תאים בודדים או אגרגטים בקלות מנותקים, שמסבך פרשנות נכונה של שיטות ניתוח עוקבות.

תאים נזרע על פולימרים הבתוליים מוצגים מצורף המסכן. סלולרי הפצת התנהגות (8A1 ו- C1) בזמן טפט confluent נצפתה עבור תאים תרבותי על משטחים פלזמה מטופלים (8B1 ו- D1) . היווצרות של אגרגטים הסלולר ולהתנתקות מפני השטח הוכרז יותר על משטחים בתוליים. ויזואליזציה של אקטין חוטים לאחר קיבוע עם 4% paraformaldehyde חשף כמה תאים נודדים לתוך הפריפריה של הסלולר מצרפי, נביעה של בליטות lamellipodia בסרטים וטהור PDMS, הסוכן המיוחד 50: 50 ללא הפרדות צבע (דמות 8A2 ו- C2, חצים). אין הבדלים משמעותיים איכותי יכול להיות שנצפו בעת השוואת שני חומרים פולימריים. בתור הערה צדדית, נראה כי פחות כמות של אגרגטים הסלולר נכחו 50: 50. הסוכן המיוחד לעומת PDMS. גם, מצרפי מחובר למשטחים על 50: 50. הסוכן המיוחד הופיע שיותר משוטחים (8C איור 1). כצפוי, טיפול עם פלזמה אוויר משופרת מצורף הסלולר, המתפשט על שני המשטחים באופן משמעותי, שמוביל להיווצרות בליטות lamellipodia יוצא מן הכלל, confluent חד שכבתי (איור 8 ב'2 ו-2 8D).

שחרורו של LDH אחרי 3 ימים של תרבות שימש אינדיקטור לקביעת ציטוטוקסיות אפקטים (איור 9 א). באופן כללי, LDH רמות היו דומות עבור תאים תרבותי על שני חומרים פולימריים, עם פחות מ- 5% cytotoxicity (PDMS זהובים: 2.8 ± 2.0%; הבתוליים. הסוכן המיוחד 50: 50: 4.5 ± 3.6%; פלזמה שטופלו PDMS: 3.4 ± 1.5%; פלזמה יחס 50: 50. הסוכן המיוחד: 3.4 ± 1.6%). תוצאות אלה הן להשוות נתונים שהוצגו במחקר שלנו שפורסמו בעבר התמקדות החקירה של שני אלסטומרי. 8 כדי לתת תוקף נוסף תוצאות וזמינותו LDH, מבחן הדרה כחול trypan בוצעה. בנוסף, האוכלוסייה התא כולו נקבע כדי להציג את ההבדלים בפעילות ההפצה (איור 9B). באופן כללי פחות מ- 5% נספרו תאים חיוביים Trypan Blue (PDMS זהובים: 2.4 ± 0.3%; הבתוליים. הסוכן המיוחד 50: 50: 3.8 ± 2.5%; פלזמה שטופלו PDMS: פלזמה 1.3% ± 0.74 יחס 50: 50. הסוכן המיוחד: 0.95 ± 1.6%).

Figure 1
איור 1: הכנת PDMS סרטים על פולי-(vinyl alcohol) (PVA) מצופה רדיד חיית המחמד: תהליך ייצור PDMS סרטים עם עובי משתנה על רדיד חיית המחמד הוחל כדי לקבוע הפארמצבטית וטיפול ביצועים (A). עוביים של סרטי PDMS נותחו עם מיקרוסקופ אופטי לאחר ריפוי ב 95 ° C (B). N = 3 באופן עצמאי יוצר סרטים נותחו. מ בכל סרט, נבחרו שלושה מיקומים שונים, גזור, 3 עמדות על כל מדגם נותחו (k = 27). קווי שגיאה לייצג סטיית תקן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: הכנת סרטים ללא הפרדות צבע של PDMS המבושלות יחס ערבוב שונים: סרטים ללא הפרדות צבע מפגין יחס ערבוב שונים של הבסיס (רכיב A) כדי crosslinker (רכיב B) של PDMS יוצרו על ידי הרופא להב טכניקה. השכבה העליונה המורכבת PDMS, היחס 10:1 (רכיב A:B), העריבה ו 70:1 הוחלו על גבי סרט 10:1 PDMS כבושה בעבר (A). לאחר ריפוי עוקבות ב 95 ° C עובי של הסרטים ללא הפרדות צבע נותחה על ידי מיקרוסקופ אופטי (B) ואלקטרון סריקה (C). N = 3 ניסויים עצמאית היו שבוצעה וניתח עם מיקרוסקופ אופטי (D). טופס לכל סרט מתוצרת עצמאי, נבחרו שלושה מיקומים שונים, גזור ועמדות 3 על כל דגימות נותחו (k = 27). קווי שגיאה לייצג סטיית תקן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: קביעת חספוס בפני השטח הטופוגרפי של סובסטרטים שני המשמש את המידות אדהזיה: שני מצעים זכוכית בעלי חספוס פני שטח שונים מאופיינים. ניתוח שלושה profilometric תלת-ממדי של פני השטח בוצע על המצע 'חלקות' GS (A1), המצע 'קשה' גרם (B1). עקומות קו בודד המתאימה מתוארים ב A2 ו- B2). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4: עקרון המדידות אדהזיה רגיל: התקנה מותאמת אישית לבנות שימש לאפיין את מאפייני אדהזיה הדגימות פולימר. הגדרת מדידה מתואר ב- (א), יוצגו פרטים ב (B). לניתוח מדידה, נקבע מתח של עיקול זמן מתח (C). עבודה של הפרדה נקבע על-ידי שילוב של העקומה מתח-תזוזה בין send ו- s0 (D). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5: קביעת מאפייני אדהזיה סרטים ללא הפרדות צבע עם יחס ערבוב שונים של PDMS: משוך את הלחץ (A) והעבודה של הפרדת הסרטים מורכב מיוצרים של PDMS 10:1 יחס ערבוב, העריבה, 70:1 (B) נמדדו. לניתוח, 'החלקה' זכוכית המצע (GS) בתערוכה של R = 0.013 מיקרומטר ו מצע זכוכית 'קשה' (גר) עם R = 0.338 מיקרומטר שימשו. N = 3 באופן עצמאי יוצר סרטים נותחו. מ בכל סרט, נבחרו שתי חתיכות, שלוש עמדות שונות על כל מדגם נותחו (k = 18). קווי שגיאה לייצג סטיית תקן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 6
איור 6: הכנת סרטים ללא הפרדות צבע של הסוכן המיוחד עם עובי משתנה: הסוכן המיוחד 50: 50 הוחל על גבי סרט 10:1 PDMS כבושה בעבר (A). בעוביים שונים רטוב של שכבה זו ועד 40 500 µm הוחלו ונחקר העובי לאחר ריפוי עם מיקרוסקופ אופטי (B). מצורף של הסרטים לחלק האחורי של מתנדבים היד מוצגים כי סרטים עם עובי סך של – 100 מיקרומטר (סרט #2) תאמו היטב המראה המחוספס של העור (C). עובי השכבות יחיד ואת עובי הסרטים משולב הכולל מוצגים באיור 6B. עבור ניתוח n = 3 דגימות מיוצרים באופן עצמאי נמדדו עם מיקרוסקופ אופטי. מ בכל סרט, נבחרו שלושה מיקומים שונים, גזור, 3 עמדות על כל מדגם נותחו (k = 27). קווי שגיאה לייצג סטיית תקן. סרגל קנה מידה 6 ג מתאר כ – 1 ס מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 7
איור 7: קביעת המאפיינים אדהזיה של סרטים ללא הפרדות צבע של הדבק עור רך: סרטים רזה ללא הפרדות צבע של הסוכן המיוחד השכבה העליונה, PDMS 10:1 כשכבת גיבוי יוצרו. עובי השכבה העליונה היו מגוונים בין 50 ו-330 מיקרומטר. למשוך את הלחץ (A) ועבודה של הפרדה (B) של הסרטים מרוכב נמדד עם מצעים זכוכית שונים שני נותחו (מצע זכוכית 'חלק' (אלף) בתערוכה של R = 0.013 מיקרומטר ו מצע זכוכית 'קשה' (גר) עם R = מיקרומטר 0.338). תמונות למופת של מנגנוני ניתוק הם דמיינו ב- C. עבור ניתוח נתונים n = 3 ניסויים מיוצרים באופן עצמאי נותחו. מ בכל סרט, נבחרו שתי חתיכות, שלוש עמדות שונות על כל מדגם נותחו (k = 18). קווי שגיאה לייצג סטיית תקן. סרגלי קנה מידה 7 ג' מתארים 0.5 מ מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 8
איור 8: מורפולוגיה הסלולר של L929 fibroblasts תרבותי על סרטים רזה: היו תרבותי fibroblasts מאתר L929 במשך 3 ימים על הסרטים דקים המיוצרים PDMS (A1, A2, B1, B2) או הסוכן המיוחד (C1 C2, D1, D2). כדי להגדיל את hydrophilicity של משטחים אוויר פלזמה הטיפול היה לבצע (B1 B2, D1, D2). גודל ברים D1 ו- D2 מתארים 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 9
איור 9: קביעה של התפשטות cytotoxicity וסלולר: מצפני אפקטים ציטוטוקסיות והתפשטות הסלולר, תאים L929 היו נזרע במשך שלושה ימים על PDMS 10:1, הסוכן המיוחד סרטים ללא הפרדות צבע של 50: 50. שחרורו של לקטט דהידרוגנאז (LDH) נקבע על ידי assay פעילות LDH וגילה פחות מ-5% cytotoxicity (א). המספר הכולל לאחר תקופת טיפוח הוערכה לאחר מדריך לספור את התאים עם תא נויבאואר (B). N = 3 באופן עצמאי ביצע ניסויים נותחו. קווי שגיאה לייצג סטיית תקן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Discussion

העיצוב של מבנים מרוכבים מאפשרת התאמת פשוטה תכונות החומר, כגון מודול האלסטיות או העובי של הדגימות. האלסטיות של PDMS ניתן לשנות ביעילות על ידי שינוי היחס ערבוב בין שני מרכיביה או ייצור של תערובות באמצעות30,אלסטומר סיליקון שונים31במגוון רחב. השיטות המתואר אינם מוגבלים של PDMS בשימוש החקירה הנוכחית, אך במיוחד את הביצועים דבק חזק תלוי בסוג ספציפי משמש. שלב קריטי בתוך פרוטוקול זה הוא תהליך הייצור של הסרטים ללא הפרדות צבע (איור 1). זה הוצג כי עובי של הסרטים משפיעה באופן משמעותי את אופן הפעולה של הידבקות של הסרטים על מצעים שונים, כולל עור (איור 5 , איור 6). בנוסף, עובי הסרט זמן וטמפרטורה במהלך תהליך הייבוש משפיע על תכונות החומר32. לכן, פרמטרים כמו העובי של השכבות פולימריים צריך להיות בזהירות הותאם לאמת.

ניתוח של המאפיינים דבק של הסרטים דק בוצעה עם כוח נורמלי אדהזיה מדידות באמצעות שני מצעים זכוכית עם חספוס פני שטח שונים עד רה = 0.338 מיקרומטר (איור 3). באופן כללי, חספוס משפיע באופן משמעותי את הידבקות של משטחים, במיוחד של חומר אלסטי33,34. המראה המחוספס של זכוכית יכולים להיות מגוונים בקלות על ידי שפשוף עם נייר זכוכית בגדלים שונים בקשיחות, לכן מתן אפשרות הזיוף של סובסטרטים מפגין חספוס גבוה יותר ערכים21. בנוסף, חומרים אחרים, לדוגמה שרף אפוקסי יכול לשמש לייצור מצעים15,35. ייתכן אסטרטגיית שינוי חשוב של פרוטוקול שהוצגו. לדוגמה, אם סובסטרטים מפגין אנרגיות חינם משטח שונים הדרושים או ספציפיים נדרשים topographies. . משוך את הלחץ והעבודה של הפרדה בין הסרטים דק מתוצרת PDMS, הסוכן המיוחד נותחו עם מלכודת לפי הזמנה (אדהזיה מאקרוסקופית מדידה התקן (MAD, איור 4)). 36 אופטי היישור של סובסטרט, indenter הוא שלב קריטי לניתוח של תוצאות המדידה. לכן, כוונון של זווית הטיה צריכה להתבצע עם מד זווית, מדויק ככל האפשר. אפשר להשיג בדייקנות די בהבאת באופן ידני את המצע במגע עם המשטח הסרט עד איש קשר אופקי מושגת.

בפרוטוקול הנוכחי הזמן נשמר קבוע בשנייה אחת (איור 5 , איור 7). במיוחד עבור החקירה הביצועים דבק של הקרום על משטח מחוספס המצע, הרחבה של הזמן מספק מידע נוסף. לדוגמה, עלייה בלחץ משיכה-off עם הגדלת זמן כבר דווח על8. בנוסף המדידות שבוצעו בפרוטוקול הנוכחי, שיטות אחרות, לדוגמה קליפת בדיקות יכול להתבצע, המאפשרת חקירה מקיפה של ביצועי אדהזיה37.

המאפיינים דבק של סרטים ללא הפרדות צבע מציג סרטים שונים בעוביים של הדבק העור הרך היו נחושים (איור 7). התוצאות שלנו עולים בקנה אחד עם נתונים שפורסמו, להראות את זה ירידה של עובי הסרט להוביל גידול של הלחץ משיכה-off של הכליאה, קרי, היחס בין המצע קוטר עובי הסרט, עולה38,39 . בהתבסס על תוצאות אלה ואת הנתונים מתואר איור7, אנו מסיקים סרטים ללא הפרדות צבע עם עובי סך של – 100 מיקרומטר (עובי השכבה הסוכן המיוחד של – 60 מיקרומטר המוחלים על סרט PDMS עם עובי של – 40 µm) התערוכה אדהזיה חיוביות p מאפייני על משטחים קשים.

לאחר מכן, בוצעו ניסויים הקשורים אפיון ביולוגי על סרטים ללא הפרדות צבע וטהור וטיפל פלזמה סרטים ללא הפרדות צבע (איור 8). טיפול פלזמה אלסטומרים סיליקון היא טכניקה שימושית לעיתים קרובות, תכליתי כדי להגדיל את מאפייני הידרופילית משטחים וקידום מצורף הסלולר וסלולר הפצת40,41. סיליקונים ידועה רעילות נמוכה, biostability גבוהה אך עשוי להכיל מונומרים שיורית או זרזים אשר עשויים להשפיע על תהליכים פיזיולוגיים, המוביל גם42,cytotoxicity43. הניסויים מתנהל הבחנו פחות מ 5% cytotoxicity באמצעות שחרור LDH אינדיקטור ואת וזמינותו אי-הכללה של Trypan Blue. בפרוטוקול שהוצגו, הסלולר האוכלוסייה, לרבות אגרגטים הסלולר מנותק טופס שהשטח נותחה לניתוח התפשטות (איור 9B). שינוי של הפרוטוקול יכול לייצר יותר הבדיל תוצאות. עבור כל דגימה, תגובת שיקוע המכילות צבירות הסלולר מנותקת יכול להיות הועבר צינור התגובה נפרדים, לא בשילוב עם התאים enzymatically להסיר מן השטח פולימר. זה לאפשר את ההערכה המדויקת של תאים מחוברת אל פני השטח ולחשוף בסופו של דבר החלטה מפורטת יותר של השפעת פולימרים על תהליך אדהזיה הסלולר. בנוסף לשיטות immunocytochemical המובאים כאן, תאים עשוי להיות שנקטפו לחקירה עם שיטות immunoblot, המאפשר הערכה כמותית מפורטת של ביטוי חלבון.

לסיכום, הקמנו תנאי הייצור לייצור של סרטים ללא הפרדות צבע אלסטומריים רזה עבור יישומים במחקר התרבות התא מתקדם. בנוסף, אלה סרטים רזה בעלי הסתגלות גבוהה העור חספוס, המאפשרת עיצוב מתוחכם של העור דבקים.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

מרטין Danner הוא הודה על סיועו בהכנת הדגימות והקמת תא לתרבות הליכים. המחברים רוצה להודות Biesterfeld Spezialchemie GmbH (המבורג, גרמניה), רוברט Radsziwill במיוחד עבור תמיכה שוטפת ודיונים. המחקר שהוביל את התוצאות הללו קיבלה מימון של המועצה האירופית למחקר תחת תכנית המסגרת השביעית (FP/2007-2013) ERC גרנט הסכם של האיחוד האירופי ש 340929.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Propanol, 97% Stockmeier Chemie 1000452610000 Isopropanol
Abrasive diamnod hand pad Bohle MO 5007522 Grit: 220
Accutase Capricorn Scientific ACC-1B
Albumin Fraktion V Roth 0163.2 BSA
Alexa Fluor 488 Phalloidin ThermoFischer Scientific A12379 highly toxic
Aquamount Polysciences 18606-20 water soluble mounting medium
CytoTox-ONE Homogeneous Membrane Integrity Assay Promega G7890
DPBS, without Ca2+, Mg2+ ThermoFischer Scientific 14190094
Fetal bovine serum gold GE Health Care Life Science A15-151 FBS
Goniometer OCA35 Dataphysics for the determination of the static water contact angle
Hoechst Dye 33342 Sigma-Aldrich B1155-100MG bisBenzimide H 33342 trihydrochloride, highly toxic
Microscope Axiovert 25 Zeiss Microscope used for cell culture documentation
Microscope Eclipse LV100ND Nikon Microscope used for film thickness determination
Paraformaldehyde, aqueous solution 16% Electron Microscopy Sciences RT 15710 electron microscopy grade
penicillin und streptomycin solution Sigma-Aldrich P4333-100ML
Phenom XL Scanning Electron Microscope (SEM) Phenom
Poly-(vinyl alcohol) 4-88, MW 31000 Sigma-Aldrich 81381-1KG Mowiol 4-88
Poly-dimethyl siloxanes, Sylgard 184 Dow Corning (400)000108351397 PDMS
RPMI 1640 basal medium ThermoFischer Scientific 21875034
soft skin adhesive (SSA) Dow Corning (400)000108251792 MG 7-9800 Soft Skin Adhesive (SSA)
speed mixer DAC 600.2 VAC-P Hauschild
stylus profilomter Zeiss Model: SURFCOM 1500SD3
Tecan Infinite M200 pro Tecan fluorescence plate reader
Triton X 100 Calbiochem 648466
Trypan Blue solution Sigma-Aldrich T8154-100ML highly toxic
Trypsin/EDTA solution PAN-Biotech P10-023500 0.05% Trypsin, 0.02% EDTA in PBS
UV glue Bohle BO MV76002 medium viscosity

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lloyd, A. W., Faragher, R. G. A., Denyer, S. P. Ocular biomaterials and implants. Biomaterials. 22, 769-785 (2001).
  2. Zhang, M., Wu, J., Wang, L., Xiao, K., Wen, W. A simple method for fabricating multi-layer PDMS structures for 3D microfluidic chips. Lab Chip. 10, 1199-1203 (2010).
  3. Kwak, M. K., Jeong, H. E., Suh, K. Y. Rational design and enhanced biocompatibility of a dry adhesive medical skin patch. Adv. Mater. 23, 3949-3953 (2011).
  4. Gun Park, D., Chul Shin, S., Won Kang, S., Tae Kim, Y. Development of flexible self adhesive patch for professional heat stress monitoring service. Conf. Proc. IEEE Eng. Med. Biol. Soc. 4, 3789-3792 (2005).
  5. Thomas, X. Silicone Adhesives in Healthcare Applications. Dow corning Lit. , (2013).
  6. Fuard, D., Tzvetkova-Chevolleau, T., Decossas, S., Tracqui, P., Schiavone, P. Optimization of poly-di-methyl-siloxane (PDMS) substrates for studying cellular adhesion and motility. Microelectron. Eng. 85, 1289-1293 (2008).
  7. Wang, Z., Volinsky, A. A., Gallant, N. D. Crosslinking effect on polydimethylsiloxane elastic modulus measured by custom-built compression instrument. J. Appl. Polym. Sci. 131, 41050 (2014).
  8. Fischer, S. C. L., Kruttwig, K., Bandmann, V., Hensel, R., Arzt, E. Adhesion and cellular compatibility of silicone-based skin adhesives. Macromol. Mater. Eng. , 1-11 (2017).
  9. Martina, D., Creton, C., Damman, P., Jeusette, M., Lindner, A. Adhesion of soft viscoelastic adhesives on periodic rough surfaces. Soft Matter. 8, 5350-5357 (2012).
  10. Brown, X. Q., Ookawa, K., Wong, J. Y. Evaluation of polydimethylsiloxane scaffolds with physiologically-relevant elastic moduli: Interplay of substrate mechanics and surface chemistry effects on vascular smooth muscle cell response. Biomaterials. 26, 3123-3129 (2005).
  11. Song, F., Ren, D. Stiffness of cross-linked poly(dimethylsiloxane) affects bacterial adhesion and antibiotic susceptibility of attached cells. Langmuir. 30, 10354-10362 (2014).
  12. Buxboim, A., Rajagopal, K., Brown, A. E. X., Discher, D. E. How deeply cells feel: methods for thin gels. J. Phys. Condens. Matter. 22, 194116 (2010).
  13. Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. -L. Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate. Science. 310, 1139-1143 (2005).
  14. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix Elasticity Directs Stem Cell Lineage Specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
  15. Roth, J., et al. Surface functionalization of silicone rubber for permanent adhesion improvement. Langmuir. 24, 12603-12611 (2008).
  16. Thiébaud, P., Lauer, L., Knoll, W., Offenhäusser, A. PDMS device for patterned application of microfluids to neuronal cells arranged by microcontact printing. Biosens. Bioelectron. 17, 87-93 (2002).
  17. Tourovskaia, A., Figueroa-Masot, X., Folch, A. Differentiation-on-a-chip: a microfluidic platform for long-term cell culture studies. Lab Chip. 5, 14-19 (2005).
  18. Peterson, S. L., McDonald, A., Gourley, P. L., Sasaki, D. Y. Poly(dimethylsiloxane) thin films as biocompatible coatings for microfluidic devices: Cell culture and flow studies with glial cells. J. Biomed. Mater. Res. - Part A. 72, 10-18 (2005).
  19. Wan, Y., et al. Nanotextured substrates with immobilized aptamers for cancer cell isolation and cytology. Cancer. 118, 1145-1154 (2012).
  20. Ross, A. M., Jiang, Z., Bastmeyer, M., Lahann, J. Physical aspects of cell culture substrates: Topography, roughness, and elasticity. Small. 8, 336-355 (2012).
  21. Barreau, V., et al. Fibrillar Elastomeric Micropatterns Create Tunable Adhesion Even to Rough Surfaces. Adv. Funct. Mater. 26, 4687-4694 (2016).
  22. Briggs, G. A. D., Briscoe, B. J. The effect of surface topography on the adhesion of elastic solids. J. Phys. D. Appl. Phys. 10, 2453-2466 (1977).
  23. Dapp, W. B., Lücke, A., Persson, B. N. J., Müser, M. H. Self-affine elastic contacts: Percolation and leakage. Phys. Rev. Lett. 108, 1-4 (2012).
  24. Putignano, C., Carbone, G., Dini, D. Mechanics of rough contacts in elastic and viscoelastic thin layers. Int. J. Solids Struct. 69, 507-517 (2015).
  25. Laulicht, B., Langer, R., Karp, J. M. Quick-release medical tape. Proc. Natl. Acad. Sci. 109, 18803-18808 (2012).
  26. Kim, T., Park, J., Sohn, J., Cho, D., Jeon, S. Bioinspired, Highly Stretchable, and Conductive Dry Adhesives Based on 1D-2D Hybrid Carbon Nanocomposites for All-in-One ECG Electrodes. ACS Nano. 10, 4770-4778 (2016).
  27. Adamietz, I. A., et al. Effect of self-adhesive, silicone-coated polyamide net dressing on irradiated human skin. Radiat. Oncol. Investig. 2, 277-282 (1994).
  28. White, R. Evidence for atraumatic soft silicone wound dressing use. Wounds UK. 1, 104-109 (2005).
  29. Quan, M. B., Edwards, C., Marks, R. Non-invasive in vivo techniques to differentiate photodamage and ageing in human skin. Acta Derm. Venereol. 77, 416-419 (1997).
  30. Brown, X. Q., Ookawa, K., Wong, J. Y. Evaluation of polydimethylsiloxane scaffolds with physiologically-relevant elastic moduli: Interplay of substrate mechanics and surface chemistry effects on vascular smooth muscle cell response. Biomaterials. 26, 3123-3129 (2005).
  31. Palchesko, R. N., Zhang, L., Sun, Y., Feinberg, A. W. Development of Polydimethylsiloxane Substrates with Tunable Elastic Modulus to Study Cell Mechanobiology in Muscle and Nerve. PLoS One. 7, e51499 (2012).
  32. Johnston, I. D., McCluskey, D. K., Tan, C. K. L., Tracey, M. C. Mechanical characterization of bulk Sylgard 184 for microfluidics and microengineering. J. Micromechanics Microengineering. 24, 35017 (2014).
  33. Persson, B. N. J., Gorb, S. The effect of surface roughness on the adhesion of elastic plates with application to biological systems. J. Chem. Phys. 119, 11437 (2003).
  34. Peressadko, A. G., Hosoda, N., Persson, B. N. J. Influence of surface roughness on adhesion between elastic bodies. Phys. Rev. Lett. 95, 1-4 (2005).
  35. Purtov, J., et al. Measuring of the hardly measurable: adhesion properties of anti-adhesive surfaces. Appl Phys A. 111, 183-189 (2013).
  36. Kroner, E., Blau, J., Arzt, E. Note: An adhesion measurement setup for bioinspired fibrillar surfaces using flat probes. Rev. Sci. Instrum. 83, 16101 (2012).
  37. Sun, S., Li, M., Liu, A. A review on mechanical properties of pressure sensitive adhesives. Int. J. Adhes. Adhes. 41, 98-106 (2013).
  38. Webber, R. E., Shull, K. R., Roos, A., Creton, C. Effects of geometric confinement on the adhesive debonding of soft elastic solids. Phys. Rev. E. 68, 21805 (2003).
  39. Creton, C., Lakrout, H. Micromechanics of flat-probe adhesion tests of soft viscoelastic polymer films. J. Polym. Sci. Part B Polym. Phys. 38, 965-979 (2000).
  40. Tan, S. H., Nguyen, N. -T., Chua, Y. C., Kang, T. G. Oxygen plasma treatment for reducing hydrophobicity of a sealed polydimethylsiloxane microchannel. Biomicrofluidics. 4, 32204 (2010).
  41. Kim, B., Peterson, E. T. K., Papautsky, I. Long-term stability of plasma oxidized PDMS surfaces. Conf. Proc. IEEE Eng. Med. Biol. Soc. 7, 5013-5016 (2004).
  42. Briganti, E., et al. Silicone based polyurethane materials: A promising biocompatible elastomeric formulation for cardiovascular applications. J. Mater. Sci. Mater. Med. 17, 259-266 (2006).
  43. Regehr, K. J., et al. Biological implications of polydimethylsiloxane-based microfluidic cell culture. Lab Chip. 9, 2132 (2009).

Tags

ביולוגיה התפתחותית גיליון 137 poly(di-methylsiloxane) סרט דק ללא הפרדות צבע אלסטומרים דבקים העור הדבקות תרבית תאים
דק אלסטומרים סיליקון מורכב הסרט תרבית תאים ואפליקציות עור: ייצור ואפיון
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Boyadzhieva, S., Fischer, S. C. L.,… More

Boyadzhieva, S., Fischer, S. C. L., Lösch, S., Rutz, A., Arzt, E., Kruttwig, K. Thin Film Composite Silicon Elastomers for Cell Culture and Skin Applications: Manufacturing and Characterization. J. Vis. Exp. (137), e57573, doi:10.3791/57573 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter