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Developmental Biology

पतली फिल्म समग्र सिलिकॉन सेल संस्कृति और त्वचा अनुप्रयोगों के लिए Elastomers: विनिर्माण और लक्षण वर्णन

Published: July 3, 2018 doi: 10.3791/57573
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 1,3, 1, 1,2, 1
1INM - Leibniz Institute for New Materials, 2Department of Materials Science and Engineering, Saarland University, 3University of Applied Sciences Kaiserslautern
* These authors contributed equally

Summary

बहुलक पतली फिल्म मिश्रित संरचनाओं के निर्माण की प्रक्रिया के लिए एक प्रोटोकॉल या तो अलग है युवा moduli या मोटाई रखने प्रस्तुत किया है । फिल्मों उंनत सेल संस्कृति अध्ययन के लिए या त्वचा चिपकने के रूप में उत्पादित कर रहे हैं ।

Abstract

इस प्रोटोकॉल में, हम उंनत सेल संस्कृति अनुप्रयोगों के लिए पतली elastomer समग्र फिल्मों के निर्माण के लिए और त्वचा चिपकने के विकास के लिए तरीकों वर्तमान । दो अलग पाली-(dimethyl siloxanes) (PDMS और नरम त्वचा चिपकने वाला (SSA)), जैविक प्रभाव और चिपकने वाली विशेषताओं की गहराई से जांच के लिए इस्तेमाल किया गया है । कंपोजिट फिल्मों एक लचीला समर्थन परत और एक चिपकने वाला शीर्ष कोटिंग से मिलकर बनता है । दोनों परतों डॉक्टर ब्लेड आवेदन तकनीक द्वारा निर्मित किया गया है । वर्तमान जाँच में समग्र फिल्मों के चिपकने वाले व्यवहार की जाँच की गई है, परत मोटाई के एक समारोह के रूप में या शीर्ष परत के जवान की मापांक की भिन्नता है. crosslinker मिश्रण अनुपात को आधार से अलग करके PDMS की युवतियों की मापांक को बदल दिया गया है. इसके अलावा एसएसए फिल्मों की मोटाई लगभग 16 µm से लगभग ३२० µm तक विविध रही है । स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (SEM) और ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी मोटाई माप के लिए इस्तेमाल किया गया है । elastomer फिल्मों के चिपकने वाले गुण फिल्म मोटाई, युवा की मापांक बहुलक और सतह विशेषताओं पर दृढ़ता से निर्भर करते हैं । इसलिए, चिकनी और किसी न किसी सतहों का प्रदर्शन कांच सब्सट्रेट पर इन फिल्मों के सामान्य आसंजन जांच की गई है । खींचो तनाव और जुदाई का काम सिलिकॉन elastomers के मिश्रण अनुपात पर निर्भर हैं ।

इसके अतिरिक्त, नरम त्वचा चिपकने वाला एक सहायक समर्थन परत के शीर्ष पर रखा की मोटाई क्रम में त्वचा अनुप्रयोगों के लिए पैच का उत्पादन करने के लिए विविध किया गया है । PDMS फिल्मों (मिश्रण अनुपात 10:1) और एसएसए फिल्मों (मिश्रण अनुपात 50:50) पर L929 murine fibroblasts के Cytotoxicity, प्रसार और सेलुलर आसंजन आयोजित किया गया है । हम यहां दिखाया गया है, पहली बार के लिए, दोनों पॉलिमर से निर्मित पतली समग्र फिल्मों की ओर तुलना द्वारा पक्ष और उनके जैविक और चिपकने वाला गुण की जांच वर्तमान ।

Introduction

इस प्रोटोकॉल में, पतली elastomer फिल्मों के निर्माण के लिए विस्तृत तरीकों प्रस्तुत कर रहे हैं । पतली समग्र फिल्मों के उत्पादन के लिए व्यापक रूप से उपलब्ध डॉक्टर ब्लेड तकनीक का इस्तेमाल किया गया है । विनिर्माण तकनीक पॉलीएथीलीनटरफैटेलेट (पीईटी) पन्नियों पर प्रदर्शन किया गया है, बड़े पैमाने पर इन फिल्मों के बाद उत्पादन को सक्षम करने के. इस प्रोटोकॉल का जोर reproducibility के मूल्यांकन, समग्र फिल्मों और अंतिम समग्र पैच के जैविक और आसंजन गुणों के निर्धारण के विभिंन परतों के सटीक निर्माण है । सिलिकॉन elastomer पाली-(dimethylsiloxane) (PDMS) बड़े पैमाने पर त्वचा चिपकने वाले, microfluidics अनुप्रयोगों और अतिरिक्त अनुसंधान क्षेत्रों के उत्पादन सहित जैव चिकित्सा प्रौद्योगिकी के क्षेत्र में प्रयोग किया जाता है1,2,3 ,4. हाल ही में, PDMS के एक अंय उपवर्ग, तथाकथित नरम त्वचा चिपकने वाले (SSAs) शुरू किया गया है, कोमल त्वचा संबंध और de-संबंध के लिए विशेष रूप से ।

सिलिकॉन SSAs elastomers कार्यात्मक vinyl हैं, एनालॉग पॉलिमर से अलग सिलिका5मजबूत के अभाव द्वारा । अन्य PDMS के लिए इसी तरह, एसएसए के Young's मापांक क्रॉस-लिंकर एकाग्रता या समय6,7,8का इलाज नियमन द्वारा एक विस्तृत श्रृंखला में अनुकूलित किया जा सकता है । सिलिकॉन elastomers के युवा मापांक में यह परिवर्तन महत्वपूर्ण सामग्री के चिपकने वाला गुण को प्रभावित करता है और prokaryotic और eukaryotic कोशिकाओं पर भी गहरा परिणाम है सतह9,10 पर कल्चरित , 11. सेलुलर जैविक स्तर पर, यह दिखाया गया था, कि eukaryotic कोशिकाओं संकेत transduction स्तर मैट्रिक्स लोच या सतह9,10,12 की मोटाई का एक मॉडुलन करने के लिए पर प्रतिक्रिया ,13,14. इसलिए, स्वरित्र यांत्रिक गुणों के साथ बहुलक के सेल संस्कृति अनुप्रयोगों में एक व्यापक रुचि मौजूद है । महत्वपूर्ण बात, सिलिकॉन आधारित elastomers के आंतरिक रूप से कम सतह ऊर्जा eukaryotic कोशिकाओं के सेल संस्कृति के लिए इष्टतम स्थिति प्रदान नहीं करता है । ऑक्सीजन प्लाज्मा उपचार के लिए एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया तकनीक PDMS कम सतह ऊर्जा को अस्थाई रूप से बढ़ाने के लिए अग्रणी है, इसके पुल से ताकत की वृद्धि के लिए प्रमुख, अणुओं की सतह सोखना की कमी हुई, जबकि समानांतर में लगाव को बढ़ावा देने, प्रसार और eukaryotic कोशिकाओं के प्रसार15,16,17,18.

सामग्री गुणों के अलावा, सतह स्थलाकृति काफी सेलुलर आसंजन और दो सामग्रियों के बीच चिपकने वाला संपर्क19,20,21,22को प्रभावित करता है । सतह किसी न किसी दो सतहों के बीच संपर्क गठन पर कई प्रभाव पड़ता है: संपर्क क्षेत्र की कमी, उच्च संग्रहीत लोचदार asperities आसपास के रूप में के रूप में अच्छी तरह से दरार प्रचार पर प्रभाव चिपकने वाला शक्ति23बदल सकते है ऊर्जा, 24. मानव त्वचा के लिए स्वयं चिपकने वाली फिल्मों के आसंजन एक उभरते आवेदन क्षेत्र है, जैसे, घाव ड्रेसिंग, ईसीजी इलेक्ट्रोड या अन्य पहनने योग्य इलेक्ट्रॉनिक उपकरणों के निर्धारण25,26,27, २८. स्थलाकृति सतह के संबंध में स्वयं चिपकने वाले प्रदर्शन को मापने के लिए, किसी न किसी की डिग्री बदलती के साथ कांच सब्सट्रेट सामान्य आसंजन माप में इस्तेमाल किया जा सकता8,21. यहां, बहुलक फिल्मों के चिपकने वाले गुणों की जांच करने के लिए दो गिलास सब्सट्रेट चुना गया है । सबसे पहले, 10 से 1 वजन विभिंन मिश्रण अनुपात के साथ PDMS द्वारा कवर भागों की एक मिश्रण अनुपात में एक PDMS समर्थन परत के साथ समग्र फिल्मों विशेषता थे । एक दूसरे चरण में एक चिपकने वाला SSA परत दोनों घटकों के बराबर वजन मात्रा के साथ और एक सहायक PDMS फिल्म के शीर्ष पर अलग फिल्म मोटाई के साथ तैयार किया गया था ।

Protocol

सावधानी: उपयोग से पहले सभी प्रासंगिक सामग्री सुरक्षा डाटा शीट (MSDS) से परामर्श करें । इस प्रोटोकॉल में प्रयुक्त रसायनों में से कुछ अड़चन, तीव्रता से विषाक्त और/ इन रसायनों को संभालते समय सभी उपयुक्त सुरक्षा प्रथाओं का उपयोग करें । यह इंजीनियरिंग (रासायनिक कैबिनेट) और व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (सुरक्षा चश्मा, दस्ताने, लैब कोट, पूर्ण लंबाई पैंट और बंद पैर के जूते) का उपयोग भी शामिल है । निंनलिखित प्रक्रियाओं के भाग एक पशु सेल लाइन की संस्कृति शामिल है । इसलिए, कृपया विशिष्ट सुरक्षा नियमों का पालन करें । रासायनिक और जैविक अपशिष्ट को विशिष्ट राष्ट्रीय और संस्थागत नियमों और सिफारिशों के अनुसार निपटाने की जरूरत है.

1. सिलिकॉन Elastomeric तनु फिल्म कंपोजिट संरचनाओं की तैयारी

  1. पॉलिमर की तैयारी
    1. 10:1 अनुपात में PDMS के १.१ ग्राम तैयार करने के लिए, यौगिक बी के ०.१ ग्राम के साथ एक यौगिक के १.० ग्राम मिश्रण ।
    2. मिश्रण और एक गति मिक्सर में पूर्व पॉलिमर degase 3 मिनट के लिए निर्वात के तहत २३५० rpm पर ।
    3. यौगिक एक और यौगिक बी के बीच जन अनुपात 45:1 और 70:1 को बदलें । उंहें तैयार 1.1.2 में वर्णित विधि के समान ।
    4. नरम त्वचा चिपकने वाला के 1 जी तैयार (SSA) 50:50 के अनुपात में । इसलिए 1.1.2 में वर्णित कंपाउंड बी के ०.५ g को एक और ०.५ ग्राम मिलाएं ।
  2. पाली की तैयारी-(vinyl शराब) (PVA) लेपित पालतू पंनी
    1. पानी में एक 18% (डब्ल्यू/डब्ल्यू) PVA समाधान तैयार PVA को जोड़कर पानी में और एक चुंबकीय सरगर्मी के साथ रातोंरात मिश्रण । इस समाधान को 4 ° c पर संग्रहीत करे ।
    2. पतली फिल्मों डॉक्टर ब्लेड आवेदन मशीन के साथ 15 µm की एक प्रभावी मोटाई का प्रदर्शन, ब्लेड के १०० µm गैप और लगभग २.० mm का एक वेग का उपयोग कर तैयार/
    3. 15 मिनट के लिए ९५ ° c पर एक ओवन में फिल्मों प्लेस ।
  3. डॉक्टर ब्लेड तकनीक द्वारा PDMS 10:1 मिश्रण अनुपात के समर्थन परत की तैयारी
    1. पतली फिल्मों की तैयारी के लिए एक स्वचालित रूप से नियंत्रित डॉक्टर ब्लेड आवेदन मशीन का प्रयोग करें ।
    2. १००% isopropanol के साथ पीईटी पंनी साफ और यह डॉक्टर ब्लेड आवेदन क्षेत्र की सतह पर जगह है ।
    3. पंनी के शीर्ष पर डॉक्टर ब्लेड प्लेस और माइक्रो पोजीशनिंग शिकंजा के साथ मोटाई समायोजित करें । गीला परतों के निर्माण के लिए, ६० µm, १०० µm, २०० µm और ५०० µm की मोटाई लागू होते हैं ।
    4. PDMS 10:1 बहुलक एक एकल उपयोग सिरिंज के साथ डॉक्टर ब्लेड के जलाशय में १.१ कदम में तैयार भरें । लगभग २.० mm/एस के वेग के साथ ब्लेड की आवाजाही शुरू करें ।
    5. मशीन से लागू 10:1 कोटिंग के साथ पीईटी फिल्म निकालें और यह ९५ डिग्री सेल्सियस पर 1 ज के लिए एक ओवन में जगह, ४०% और ६५% के बीच आर्द्रता का प्रदर्शन एक कमरे में स्थित है ।
    6. isopropanol और कागज तौलिए के साथ डॉक्टर ब्लेड साफ ।
    7. सभी आवश्यक मोटाई के लिए इस कार्यविधि को दोहराएँ ।
  4. डॉक्टर ब्लेड तकनीक द्वारा विभिन्न मिश्रण अनुपात में PDMS के शीर्ष परत की तैयारी
    1. एक स्केलपेल या उस्तरा ब्लेड के साथ अंतर्निहित फिल्म की लंबाई पक्षों की पतली धारियों को दूर करने के लिए स्थान की अनुमति और पालतू पंनी पर डॉक्टर ब्लेड की फिसलने ।
    2. 1.3.6 करने के लिए 1.3.3 प्रोटोकॉल चरणों का पालन करें । गीली मोटाई फिल्म के लिए लागू १६० µm है ।
    3. PDMS घटकों (45:1 और 70:1) के अन्य मिश्रण अनुपात के साथ प्रत्येक दो स्वतंत्र फिल्मों के उत्पादन के लिए इस प्रक्रिया को दोहराएँ. कमरे के तापमान पर फिल्मों की दुकान (लगभग 22 डिग्री सेल्सियस और एक आर्द्रता में ४० और ६५%) के बीच स्क्वायर पेट्री व्यंजन में उंहें संदूषण और धूल से रोकने के लिए ।
  5. SSA 50:50 परत की अलग मोटाई प्रदर्शन पतली समग्र फिल्मों की तैयारी
    1. १.३ चरण में पहले वर्णित के रूप में PDMS 10:1 फिल्मों को एक समर्थन परत के रूप में तैयार करें ।
    2. इन फिल्मों का उत्पादन करने के लिए प्रोटोकॉल चरणों 1.4.1 और 1.4.2 का पालन करें । 50:50 के मिश्रण अनुपात में एसएसए का प्रयोग करें और ४० µm की एक गीली मोटाई के साथ एक फिल्म का निर्माण ।
    3. के अतिरिक्त गीला मोटाई के लिए प्रक्रिया को दोहराएँ: १२० µm, ३०० µm, ५०० µm.

2. विभिन्न सतह किसी न किसी के साथ सब्सट्रेट का उपयोग सामान्य आसंजन माप

  1. तैयारी और अलग सतह किसी न किसी के साथ ग्लास सब्सट्रेट के लक्षण वर्णन
    1. एक ' चिकनी सब्सट्रेट ' के रूप में 2 मिमी व्यास के साथ एक ग्लास सिलेंडर का प्रयोग करें ।
    2. एक गिलास कटर के साथ ' किसी न किसी सब्सट्रेट ' उत्पाद निर्माण करने के लिए एक ठंढ गिलास स्लाइड से के बारे में 4x4 mm के आयाम के साथ एक टुकड़ा । लगभग 3 मिमी व्यास का एक परिपत्र क्षेत्र प्राप्त करने के लिए एक घर्षण हीरे हाथ पैड का प्रयोग करें ।
    3. यूवी गोंद के साथ एक एल्यूमीनियम शंकु को कांच देते है और यह 3 मिनट के लिए यूवी दीप्ति चैंबर में रोशन ।
    4. एक ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप के साथ सब्सट्रेट की सतह क्षेत्र की त्रिज्या का निर्धारण. सूत्र के अनुसार क्षेत्र की गणना करें A = πr2.
    5. किसी न किसी पैरामीटर ra और rz (के अनुसार: DIN EN ISO ४२८७, ASME b 46.1) एक स्टाइलस profilometer के साथ निर्धारित करें ।
    6. profilometer के नमूना मंच पर सब्सट्रेट प्रत्यय और टिप (हीरा, मानक: 2 µm/60 डिग्री) नमूना के साथ संपर्क में लाने के लिए ।
    7. ०.३ mm/s और 1 मिमी की लंबाई के वेग के साथ किसी न किसी प्रोफ़ाइल रिकॉर्ड ।
    8. सतह स्थलाकृति का विश्लेषण करने के लिए, एक स्टाइलस profilometer, संबद्ध सॉफ्टवेयर द्वारा संचालित के साथ ठीक 1 मिमी2 के एक क्षेत्र को मापने ।
      नोट: profilometer किसी बाहरी कंप्यूटर द्वारा संचालित है । 1 मिमी के एक विस्थापन एक्स दिशा में पहुंच गया है के बाद धारक y दिशा में ०.००१ mm द्वारा स्थानांतरित कर दिया है । दर्ज की गई । RS3 फ़ाइल 3 डी छवियों को बनाने के लिए Surfcom मानचित्र विशेषज्ञ सॉफ्टवेयर में आयात किया जाता है ।
  2. PDMS या एसएसए से निर्मित पतली फिल्मों की सामान्य आसंजन माप
    1. के बारे में ४.० cm2 के एक क्षेत्र के साथ छोटे टुकड़ों में पीईटी पंनी पर फिल्मों में कटौती और उंहें यूवी गोंद के साथ एक गिलास स्लाइड पर जगह के लिए एक उस्तरा ब्लेड का प्रयोग करें । 3 मिनट के लिए यूवी प्रकाश के साथ रोशन ।
    2. नमूना धारक पर बहुलक नमूना माउंट ।
    3. इथेनॉल और नाइट्रोजन गैस के साथ सूखे के साथ धीरे सब्सट्रेट सतह साफ ।
    4. कांच सब्सट्रेट संलग्न, एल्यूमीनियम शंकु के लिए घुड़सवार, लोड सेल करने के लिए.
    5. झुकाव तालिका का प्रयोग करें (goniometer) ठीक बहुलक फिल्म आ सब्सट्रेट के झुकाव कोण का समायोजन करके सतहों संरेखित करने के लिए । आदेश में ऐसा करने के लिए, इस फिल्म के साथ संपर्क में स्वयं सब्सट्रेट लाओ । दोनों सतहों के एक पूरी तरह से समानांतर संरेखण जब तक झुकाव कोण बदलें, कैमरा छवियों के द्वारा visualized, प्राप्त की है ।
      नोट: लोड कक्ष झुका हुआ तालिका से कनेक्टेड है । एक गिलास चश्मे नमूना नीचे स्थित के रूप में चित्रा 4में दिखाया गया है, दो कैमरों के साथ संपर्क क्षेत्र के दृश्य की अनुमति और बहुलक फिल्म पर सब्सट्रेट के संरेखण को सक्षम करने.
    6. 13 ± 5 केपीए के एक प्रीलोड तनाव जब तक बहुलक फिल्म सतह के लिए कदम सब्सट्रेट (चित्रा 4) हासिल की है ।
    7. ऐसे पकड़ो समय और दृष्टिकोण के रूप में आवश्यक माप मापदंडों को नियंत्रित करने के लिए LabView में लिखा कस्टम क्रमादेशित सॉफ्टवेयर पैकेज शुरू/ पकड़ समय टीपकड़ 1 सेकंड है, दृष्टिकोण और टुकड़ी वेग है 30 µm/एस और 10 µm/
    8. तीन स्वतंत्र निर्मित नमूनों पर और प्रत्येक फिल्म की सतह पर छह विभिन्न स्थानों पर आसंजन माप प्रदर्शन करते हैं ।
  3. डेटा विश्लेषण और मुख्य यांत्रिक कारकों की गणना: पुल से तनाव और जुदाई का काम ।
    1. सब्सट्रेट क्षेत्र एक Equation 1 एसद्वारा दर्ज की शक्ति को विभाजित करके तनाव की गणना.
      Equation 2
    2. पुल बंद तनाव है, जो सामांय तनाव के अधिकतम मूल्य के रूप में वर्णित है निर्धारित करते हैं ।
      Equation 3
    3. तन्य शासन के प्रारंभ की स्थिति के घटाव द्वारा विस्थापन Δs प्राप्त करें0 नमूना स्थिति एसअंत से जहां de-बांड पूरा किया गया है । s0 = 0 के रूप में तन्यता शासन की शुरुआत को परिभाषित करें ।
      Equation 4
    4. निम्न समीकरण के अनुसार सिस्टम अनुपालन C द्वारा नमूना स्थिति की मापी मान को सही करें:
      Equation 5
    5. जुदाई के काम की गणना करने के क्रम में एस0 और एसअंत के बीच तनाव-विस्थापन वक्र एकीकृत ।
      Equation 6
  4. गणितीय कंप्यूटिंग सॉफ्टवेयर मूल का उपयोग कर मुख्य यांत्रिक कारकों की गणना ।
    1. एक मूल तालिका में एक एकल आसंजन माप से रिकॉर्डेड. dat फ़ाइल आयात करें । दर्ज किए गए पैरामीटर्स समय, नमूना स्थिति और बल हैं । स्तंभ A (समय), B (नमूना स्थिति) और C (बल) में इन पैरामीटर्स को संमिलित करें ।
    2. रिक्त मान का निर्धारण करने के लिए, बहुलक फिल्म से संपर्क करने से पहले बल के औसत के बारे में 20 माप मूल्यों । इस औसत मान Fऑफ़सेट को नाम दें और इसे स्तंभ D में चिपकाएं ।
    3. पृष्ठभूमि की गणना सही बल च * निंनलिखित समीकरण के अनुसार
      Equation 7
      और इस समीकरण को संमिलित करें, जैसा कि नीचे दिखाया गया है, स्तंभ E में ।
      Equation 8
    4. शूंय विस्थापन, अर्थात्,0 = 0 के रूप में तन्य शासन की शुरुआत को परिभाषित करें । इसलिए, s0 निर्धारित करें और इसे स्तंभ B में विस्थापन से घटाएं और इसे स्तंभ F में सहेजें:
      Equation 9
    5. इसके अलावा, मशीन अनुपालन द्वारा नमूना स्थिति सही है । यह सुधार स्तंभ g में किया जाता है । स्तंभ g में निंन समीकरण संमिलित करें
      Equation 10
    6. अगले कॉलम में तनाव की गणना एच. इसलिए, सब्सट्रेट क्षेत्र द्वारा बल विभाजित । निंन समीकरण संमिलित करें
      Equation 11
      जहां एक मिमी2 में ग्लास सब्सट्रेट की सतह क्षेत्र है (२.१ में निर्धारित) ।
    7. तनाव और विस्थापन मूल्यों से जुदाई के काम की गणना । इसलिए, एक्स धुरी और वाई धुरी के साथ तनाव के साथ विस्थापन साजिश । एस0 से एसअंत में इस ग्राफ को एकीकृत जहां एसअंत विस्थापन के रूप में परिभाषित किया गया है जिस पर तंयता तनाव शूंय को रिटर्न, यानी पूर्ण टुकड़ी जगह ले ली । ग्राफ को एकीकृत करने के लिए, एकीकृत समारोह का चयन करें । परिकलित मानों को स्तंभों में जोड़ें I और J.

3. इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (SEM) और ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी स्कैनिंग द्वारा फिल्मों का लक्षण वर्णन

  1. ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी
    1. के साथ एक उस्तरा ब्लेड छोटे टुकड़ों (लगभग ०.२५ cm2) में बहुलक फिल्म में कटौती और उंहें एक गिलास स्लाइड के किनारे करने के लिए देते हैं । एक सीधा खुर्दबीन के नीचे कांच स्लाइड खड़ी केंद्रित प्लेस और फिल्म पार अनुभाग की मोटाई को मापने ।
      नोट: 20X उद्देश्य का उपयोग करें (NA = ०.४५, १.१ µm के ८०० एनएम पर सैद्धांतिक संकल्प) लगभग ≤ 20 µm की फिल्म मोटाई मूल्यों को मापने के लिए । ५० तक 20 µm की सीमा में एक फिल्म मोटाई के लिए µm एक 10x उद्देश्य का उपयोग करें (na = ०.३०, १.६ µm के ८०० एनएम पर सैद्धांतिक संकल्प) और एक फिल्म मोटाई ≥ ५० µm एक 5x उद्देश्य का उपयोग करें (na = ०.१५, सैद्धांतिक संकल्प ८०० समुद्री मील की दूरी पर ३.३ µm) ।
  2. SEM जांच
    1. पीईटी पंनी काट और लगभग 2 सेमी2 का एक गिलास स्लाइड करने के लिए एक नमूना देते है और यह नमूना धारक के अंदर clamping तंत्र को खड़ी जगह ≤ धारक की शीर्ष सतह के नीचे 2 मिमी ।
    2. का चयन करें एक त्वरण वोल्टेज की 10 केवी, backscattered इलेक्ट्रॉन डिटेक्टर (बीएसडी) और कम वैक्यूम शर्तों (६० Pa) ।
    3. ध्यान, आवर्धन, चमक और छवियों के विपरीत समायोजित करें ।
    4. १०२४ x २०४८ पिक्सेल के संकल्प के साथ 28 एस के एक छवि अधिग्रहण समय चुनें ।
    5. SEM से नमूना धारक निकालें ।

4. जैविक जांच

  1. L929 कोशिकाओं की नियमित सेल संस्कृति
    1. जांच के लिए murine fibroblast सेल लाइन L929 का उपयोग करें । संस्कृति Rosewell पार्क मेमोरियल इंस्टीट्यूट (RPMI) १६४० बेसल मध्यम, में 10% भ्रूण गोजातीय सीरम और पेनिसिलिन und streptomycin के साथ पूरक ३७ डिग्री सेल्सियस, 5% सह T75 सेल संस्कृति कुप्पी में2 में कोशिकाओं । लगभग ७०% के संगम पर कोशिकाओं को ८०% तक गद्यांश करें ।
    2. सेल passaging के लिए, आकांक्षा द्वारा मध्यम निकालें और कैल्शियम के साथ धोने-और एक लामिना प्रवाह कैबिनेट के तहत 30 एस के लिए मैग्नीशियम मुक्त फॉस्फेट बफर (DPBS-/ बाद में Accutase के 2 मिलीलीटर, proteolytic और collagenolytic गतिविधि के साथ एक एंजाइम समाधान ३७ ° c, 5% CO2पर 5 मिनट के लिए के साथ कोशिकाओं गर्मी ।
    3. कोशिका संस्कृति कुप्पी सतह से एक चरण कंट्रास्ट माइक्रोस्कोप के साथ कोशिकाओं की टुकड़ी की पुष्टि करें ।
    4. कुप्पी में सीरम युक्त मध्यम के 8 मिलीलीटर जोड़ें और एक 15 मिलीलीटर प्रतिक्रिया ट्यूब करने के लिए सेल निलंबन स्थानांतरण ।
    5. सेल सस्पेंशन से 10 µ l का नमूना लें और Trypan Blue के 10 µ l के साथ मिलाएं ।
    6. एक Neubauer चैंबर के साथ सेलुलर संख्या का निर्धारण और कोशिकाओं की कुल संख्या की गणना.
      चेतावनी: Trypan नीला विषाक्त है, इसलिए MSDS परामर्श, अनिवार्य MSDS में वर्णित प्रक्रियाओं के बाद, उचित व्यक्तिगत सुरक्षा संरक्षण और एक रासायनिक कैबिनेट के तहत हैंडलिंग के पहनने की आवश्यकता है । रासायनिक अपशिष्ट जमाव के लिए अपशिष्ट इकट्ठा ।
      नोट: Trypan नीले सकारात्मक कोशिकाओं नीले रंग के हैं, गैर बरकरार सेलुलर झिल्ली का संकेत है ।
    7. अगले बीतने के लिए, संस्कृति 5 x 10 नए माध्यम के 10 मिलीलीटर के साथ एक नया बाँझ सेल संस्कृति कुप्पी में5 कोशिकाओं । प्रायोगिक शर्तों के लिए, संस्कृति 3 x 105 अच्छी तरह से प्लेटों और 6 x 104 कोशिकाओं में 24 अच्छी तरह से प्लेट के प्रत्येक अच्छी तरह से, पॉलिमर के नमूनों (प्रोटोकॉल कदम ४.२) युक्त 6 कोशिकाओं ।
  2. सेल कल्चर प्रयोगों के लिए कंपोजिट फिल्मों की तैयारी ।
    1. उत्पाद शुल्क प्रोटोकॉल चरण १.४ में निर्मित वांछित आयामों की फिल्मों के एकल टुकड़े और एक स्केलपेल के साथ पालतू सहायक परत से १.५ और ग्लास कवर की सतह पर चिमटी के साथ जगह 12 मिमी का व्यास का प्रदर्शन पटका । नमूनों को एक-2 के कुएं में रखें 4 अच्छी तरह से थाली ।
    2. cytotoxicity निर्धारण और सेल काउंटिंग के लिए, पालतू पन्ना से फिल्मों को न निकालें । लगभग ९.४ cm2के परिपत्र क्षेत्रों में कटौती, बड़े करीने से एक 6 अच्छी तरह से थाली के एकल कुओं में, फिल्मों से १.४ और १.५ में उत्पादित और उंहें एक सेल संस्कृति की थाली के कुओं में जगह ।
    3. ≥ 30 मिनट के लिए3O में बहुलक नमूनों विसर्जित कर दिया ।
      नोट: बहुलक नमूनों autoclaving द्वारा निष्फल हो सकता है । इसलिए, सेल संस्कृति व्यंजन से सभी बहुलक युक्त नमूनों को हटाने और उंहें एक गिलास पेट्री पकवान के अंदर जगह है । नसबंदी १२१ डिग्री सेल्सियस के तापमान पर 20 मिनट के लिए २.०५ बार में एक आटोक्लेव में किया जाता है ।
  3. पॉलिमर के प्लाज्मा उपचार
    1. फिल्मों जो पीईटी पंनी पर या गोल कांच कवर फिसल जाता है (4.2.1 में निर्मित) प्लाज्मा डिवाइस की प्रतिक्रिया कक्ष के अंदर पर संलग्न हैं ।
    2. ढक्कन बंद करें और १.६ x 10-2 mbar के एक दबाव तक पहुंच गया है जब तक खाली ।
    3. 3 मिनट के लिए प्लाज्मा उपचार करते हैं ।
    4. आगे सेल संस्कृति की जांच के लिए या तो 24 अच्छी तरह से या 6 अच्छी तरह से व्यंजन में प्रतिक्रिया चैंबर और जगह नमूने हवादार ।
    5. एक goniometer के साथ पानी के संपर्क कोण निर्धारण के लिए एक नमूना का प्रयोग करें । इसलिए, सिरिंज बहुलक सतह के पास ले जाएँ, सॉफ्टवेयर पैकेज का उपयोग कर और सतह के शीर्ष पर 3 µ l पानी की एक बूंद जगह. goniometer सॉफ्टवेयर के साथ स्थिर जल संपर्क कोण की गणना ।
  4. धुंधला और माइक्रोस्कोपी
    1. ३७ डिग्री सेल्सियस और 5% सह2पर 3 डी के लिए चरण 4.1.7 और संस्कृति में वर्णित के रूप में कोशिकाओं को तैयार करें ।
    2. कब्जा के चरण विषम कोशिकाओं के विपरीत चित्र प्राचीन और प्लाज्मा पर तीन दिनों के लिए प्रसंस्कृत का इलाज किया फिल्मों शीघ्र ही निर्धारण से पहले ।
    3. तैयार पंजाब ०.२% ट्राइटन-एक्स-१०० के साथ पूरक । धीरे पिपेट २०० (पंजाब-टी) के १०० मिलीलीटर में शेयर समाधान के µ एल ।
    4. एक 4% paraformaldehyde/पंजाबियों समाधान (पीएफए/
      चेतावनी: Paraformaldehyde विषाक्त है, इसलिए MSDS परामर्श, अनिवार्य MSDS में वर्णित प्रक्रियाओं के बाद और उचित व्यक्तिगत सुरक्षा संरक्षण और हैंडलिंग के एक रसायन कैबिनेट के तहत की आवश्यकता है ।
    5. एक 5% BSA/पंजाब-टी समाधान तैयार करें ।
    6. लेमिना फ्लो कैबिनेट के तहत आकांक्षा द्वारा माध्यम निकालें । मध् यम अवशेषों को हटाने के लिए पंजाबियों को कुएं में डालें ।
    7. एक रासायनिक कैबिनेट के लिए प्लेट स्थानांतरण और पीएफए/पंजाब के समाधान के साथ पंजाब के कमरे के तापमान पर 25 मिनट के लिए µ एल की जगह ।
    8. पीएफए/पंजाबियों समाधान एक कुएं से हटा दें, ध्यान से चार बार पंजाबियों के साथ धो । प्रत्येक धुलाई चरण के बीच 3 मिनट रुको और रासायनिक अपशिष्ट निपटान के लिए समाधान इकट्ठा । सीधे प्लेट का उपयोग करें, या 4 डिग्री सेल्सियस पर यह स्टोर ।
    9. जोड़ें 5% गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (BSA)/PBS-T कुओं और आरटी पर ६० मिनट के लिए मशीन के लिए विशिष्ट बाइंडिंग साइटों को ब्लॉक ।
    10. महाप्राण समाधान और यह एक phalloidin संयुग्मित के साथ बदलें Alexa-४८८ (1:160 कमजोर पड़ने)/PBS-T समाधान ०.२% ट्राइटन-एक्स-१०० के साथ पूरक ।
      चेतावनी: Phalloidin-४८८ विषाक्त है, इसलिए MSDS परामर्श, अनिवार्य MSDS में वर्णित प्रक्रियाओं का पालन और उचित व्यक्तिगत सुरक्षा संरक्षण और हैंडलिंग के एक रसायन कैबिनेट के तहत की आवश्यकता है ।
    11. एल्यूमीनियम पंनी के साथ प्लेट को कवर और आरटी में 3 ज या रात 4 डिग्री सेल्सियस पर के लिए यह गर्मी ।
    12. समाधान महाप्राण और पंजाबियों के साथ तीन बार धो लें । प्रत्येक धुलाई चरण के बीच 3 min. रुको । रासायनिक अपशिष्ट निपटान के लिए समाधान एकत्र करें ।
    13. Hoechst डाई ३३३४२ (शेयर समाधान 1 मिलीग्राम/एमएल) के 1 µ एल का एक समाधान तैयार करें । एक 1:1000 कमजोर पड़ने के लिए पिपेट 1 µ एल के Hoechst डाई ३३३४ के लिए 1 मिलीलीटर-टी और मिश्रण अच्छी तरह से । Hoechst डाई ३३३४२ कुओं के लिए समाधान के ३०० µ एल जोड़ें और अंधेरे में आरटी पर 10 मिनट के लिए मशीन ।
      चेतावनी: Hoechst डाई ३३३४२ एक डीएनए intercalating एजेंट है और इसलिए संभावित mutagenic, इसलिए MSDS परामर्श, अनिवार्य MSDS में वर्णित प्रक्रियाओं के बाद और उचित व्यक्तिगत सुरक्षा संरक्षण और हैंडलिंग के एक के तहत पहनने केमिकल कैबिनेट की आवश्यकता है ।
    14. समाधान महाप्राण और पंजाबियों के साथ चार बार नमूने धो लें । प्रत्येक धुलाई चरण के बीच 3 मिनट प्रतीक्षा करें । रासायनिक अपशिष्ट निपटान के लिए समाधान इकट्ठा ।
    15. एंबेडिंग के लिए, ध्यान से संस्कृति की सतह से फिल्मों को हटाने और उंहें एक खुर्दबीन ग्लास स्लाइड पर जगह है । इस फिल्म के लिए पानी में घुलनशील एंबेडिंग मध्यम के 20 से ४० µ एल जोड़ें और एक नया परिपत्र ग्लास कवर पर्ची के ऊपर थोड़ा दबाव का उपयोग कर देते हैं ।
    16. एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के साथ इमेजिंग प्रदर्शन । फिल्टर रोशनी के लिए आवश्यक: Alexa-४८८ ४९६ एनएम पर एक उत्तेजना अधिकतम है और अधिकतम उत्सर्जन ५१९ एनएम पर होता है । इसलिए, उत्सर्जन रंग हरा है । Hoechst डाई ३३३४२ trihydrochlorid trihydrate डीएनए के साथ परिसर में ३५५ एनएम पर एक उत्तेजना अधिकतम है और अधिकतम डीएनए जटिल उत्सर्जन ४६५ एनएम पर होता है ।
  5. Cytotoxicity निर्धारण एवं प्रकोष्ठ संख्या का निर्धारण
    1. 6 अच्छी तरह से चरण ४.३ में तैयार प्लेटों में उगाया कोशिकाओं के साथ प्रयोग और चरण 4.1.7 में तैयार की कोशिकाओं को निष्पादित करें । संस्कृति 3 दिनों के लिए ३७ ° c और 5% सह2पर कोशिकाओं । सकारात्मक नियंत्रण के लिए, कोशिकाओं है कि एक सेल संस्कृति polystyrene सतह का इलाज पर बड़े हो गए का उपयोग करें, कोई बहुलक फिल्मों युक्त । पृष्ठभूमि निर्धारण (नकारात्मक शर्त) के लिए, एक अच्छी तरह से कोशिकाओं के बिना माध्यम से प्राप्त करें ।
      नोट: मध्यम भी सेल संस्कृति polystyrene सतह का इलाज पर संस्कृति से युक्त अच्छी तरह से कोशिकाओं से लिया जा सकता है ।
    2. प्रायोगिक नमूनों की संख्या के अनुसार लेबल 15 मिलीलीटर ट्यूबों ।
    3. एक ०.९% ट्राइटन एक्स-१०० के सकारात्मक नियंत्रण के लिए पंजाब के समाधान से युक्त ४० µ एल जोड़ें और एक १००० µ एल टिप के साथ जोरदार मिश्रण । लगभग 3 मिनट के लिए रुको ।
    4. सतह से जुड़ी कोशिकाओं को हटाने के बिना, 4.5.3 में तैयार नमूनों सहित सभी नमूनों से मध्यम महाप्राण और 15 मिलीलीटर ट्यूबों के माध्यम हस्तांतरण । DPBS के 3 मिलीलीटर जोड़ें-/- एकल कुओं के लिए और 4.5.9 में वर्णित के रूप में सेलुलर नंबर के निर्धारण के लिए लामिना फ्लो कैबिनेट के तहत प्लेटों की दुकान ।
    5. 3 मिनट के लिए २०० x g पर केंद्रापसारक और LDH गतिविधि दृढ़ संकल्प के लिए supernatant के 1 मिलीलीटर निकालें । 15 मिलीलीटर लामिना प्रवाह कैबिनेट के तहत कोशिकाओं और शेष मध्यम युक्त ट्यूबों की दुकान ।
    6. परख के लिए एक काले ९६ फ्लैट नीचे के साथ अच्छी तरह से प्लेटें किया जाता है । नमूना माध्यम के ५० µ एल के लिए CytoTox-एक रिएजेंट के ५० µ एल जोड़ें और 30 एस के लिए अच्छी तरह से मिश्रण ।
    7. आर टी पर 10 मिनट के लिए एल्यूमीनियम पंनी और स्टोर के साथ प्लेट कवर ।
    8. एक अच्छी तरह से रोकने के समाधान के 25 µ एल जोड़ें और एक प्रतिदीप्ति प्लेट रीडर के साथ प्रतिदीप्ति तीव्रता रिकॉर्ड । 10 एस के लिए थाली शेक और ५२० एनएम के एक उत्तेजना तरंग दैर्ध्य और ५६० एनएम के उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य के साथ प्रतिदीप्ति संकेत का पता लगाने । हवा के बुलबुले से बचें ।
    9. DPBS-/- प्रोटोकॉल चरण 4.5.4 से संस्कृति प्लेट के कुओं से महाप्राण सेल संख्या के निर्धारण के लिए और 15 मिलीलीटर प्रतिक्रिया ट्यूब प्रोटोकॉल चरण संख्या 4.5.5 में एकत्र supernatants युक्त करने के लिए समाधान जोड़ें ।
    10. 3 मिनट और महाप्राण supernatant के लिए २०० x g पर 15 मिलीलीटर प्रतिक्रिया ट्यूब केंद्रापसारक । Trypsin/EDTA के ०.५ मिलीलीटर जोड़ें और ३७ डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए मशीन ।
    11. Trypsin/EDTA में से 2 मिलीलीटर जोड़ें थाली के कुओं पर और लगभग 10 मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस में बहुलक फिल्मों से कोशिकाओं को अलग करने के लिए मशीन ।
    12. सेल सस्पेंशन को स्टेप नंबर 4.6.10 से 15 एमएल रिएक्शन ट्यूब पर ट्रांसफर किया गया है । इसके अतिरिक्त, तेजी से सीरम युक्त माध्यम से प्लेटें धो लें ।
    13. 3 मिनट के लिए २०० x g पर नमूने केंद्रापसारक, supernatant महाप्राण और ट्यूब के माध्यम से युक्त सीरम जोड़ने ।
    14. चरण 4.1.5 और 4.1.6 में वर्णित के रूप में सेलुलर संख्या निर्धारित करें ।

Representative Results

पहले प्रयोगों में, अलग मोटाई और 10:1 के निरंतर मिश्रण अनुपात के साथ PDMS फिल्मों पीईटी फिल्मों (चित्रा 1) पर निर्मित किया गया है । क्योंकि समर्थन परत की मोटाई काफी कठोरता और पूरी समग्र फिल्मों के गुणों को संभालने प्रभावित कर सकते हैं, प्रारंभिक प्रयोगों में 13 ± 2 µm और २९६ ± 13 µm के बीच एकल फिल्मों (चित्रा 1) का निर्माण किया गया । यह अच्छी तरह से जाना जाता है, कि बहुलक फिल्मों के इलाज की प्रक्रिया सिकुड़ने के दौरान होता है । पतली फिल्मों के लिए, हम गीले और ठीक शर्तों के बीच ७८% ± ३.१% का अंतर मनाया । मोटी फिल्मों के लिए, ४०.९% ± २.६% के सिकुड़ने का पता लगाया गया है (चित्रा 1) ।

इस प्रोटोकॉल में प्रस्तुत आवेदनों के लिए, फिल्मों को मैन्युअल रूप से पालतू पन्ना से हटा दिया जाना चाहिए । हम मांयता है कि विशेष रूप से पतली फिल्मों संदंश के साथ संभाल मुश्किल है और अक्सर इस प्रक्रिया के दौरान नष्ट कर रहे हैं । इसलिए, हम एक पतली पाली के प्रभाव की जांच की-(vinyl शराब) एक सहायक परत के रूप में कोटिंग । PVA एक उच्च कठोरता के पास है और आसानी से बहाव अनुप्रयोगों में अपने पानी घुलनशीलता के कारण हटाया जा सकता है । एप्लाइड PVA कोटिंग लगभग 17 µm की एक मोटाई है और इसलिए PDMS फिल्मों की तुलना में इस परत के शीर्ष पर लेपित थोड़ा पतले है PVA कोटिंग के बिना फिल्मों के लिए (नहीं दिखाया गया डेटा) । विशेष रूप से हैंडलिंग संपत्तियों पर ध्यान केंद्रित, हम निष्कर्ष निकालना, कि केवल पतली फिल्म पालतू पंनी से हटाने के लिए एक सहायक PVA फिल्म की आवश्यकता है ।

लगभग ४० µm की एक प्रभावी फिल्म मोटाई आगे सभी प्रयोगों के लिए चुना गया था । समग्र फिल्मों के उत्पादन के लिए, PDMS के मिश्रण अनुपात 10:1 से 45:1 और 70:1 के लिए विविध और डॉक्टर ब्लेड तकनीक (चित्रा 2a) के साथ पहले से बहुलक PDMS फिल्म के शीर्ष पर लागू किया गया था । 10:1 अनुपात के अपवाद के साथ, विभिन्न फिल्मों स्पष्ट रूप से उपयुक्त परिशुद्धता के साथ ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी द्वारा प्रतिष्ठित किया जा सकता है. सूक्ष्म विश्लेषण के लिए फिल्मों एक स्केलपेल और एक गिलास स्लाइड के किनारे से जुड़ी के साथ काट रहे थे । उच्च परत के मिश्रण अनुपात नेत्रहीन समर्थन परत के 10:1 अनुपात (चित्रा बी) की तुलना में सूक्ष्म छवियों पर उज्जवल दिखाई दिया । इसके अलावा, स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के बारे में 860X (चित्रा 2c) के एक आवर्धन पर छवि नमूनों के लिए इस्तेमाल किया गया था । दो PDMS फिल्मों के बीच चमक में एक स्पष्ट रूप से चौकस अंतर, उच्च मिश्रण अनुपात में निर्मित 10:1 अनुपात के विपरीत, मांयता प्राप्त था । काटने की प्रक्रिया के निशान छोड़ देता है, SEM चित्र (चित्रा बी) में दिखाई । इन परिणामों के आधार पर समग्र फिल्मों की औसत समग्र मोटाई ११२ µm ± ५.० µm (चित्रा 2d) थी ।

आगे के प्रयोगों में इन फिल्मों के आसंजन गुण सामान्य बल आसंजन दो अलग गिलास सब्सट्रेट (चित्रा 3) का उपयोग कर माप के साथ निर्धारित किया गया है. ' चिकनी सब्सट्रेट ' एक अंकगणित मतलब किसी न किसी के साथ एक सतह बनावट के पास आर केएक ०.०१३ ± ०.०००२ µm और एक मतलब पीक करने वाली घाटी आर ०.१२ ± ०.००४ µm केजेड (3 ए आंकड़ा) । सब्सट्रेट 2 (GS2, रफ के रूप में नामित) ०.३३८ ± ०.०२१ (आरए) µm और २.०५५ ± ०.०१७ µm (आरजेड) (चित्रा 3 बी) के किसी न किसी मूल्यों का प्रदर्शन किया । 2.1.4 में प्राप्त मतलब त्रिज्या के साथ ' चिकनी ' सब्सट्रेट की सतह क्षेत्र ३.२ मिमी2 था, जबकि ' रफ ' सब्सट्रेट के लिए ६.०७ मिमी2 की सतह क्षेत्र की गणना की गई है.

इन दो सब्सट्रेट के साथ, विभिन्न फिल्मों के चिपकने वाला व्यवहार निर्धारित किया गया है । दो मापदंडों फिल्मों के चिपकने वाले गुणों का वर्णन करने के लिए चुना जाता है: पुल से तनाव σमैक्स और जुदाई डब्ल्यूसितंबरका काम । बांड और de-बांड की पूरी प्रक्रिया के दौरान नमूना स्थिति एस और सामांय बल एफ दर्ज कर रहे हैं । परिणाम एक तनाव-विस्थापन वक्र (चित्रा 4) में प्रतिनिधित्व कर रहे हैं ।

प्रयोगात्मक परिणामों की सही व्याख्या के लिए, यह महत्व का है सही बहुलक फिल्म सतह के लिए सब्सट्रेट संरेखित करें । इसके अलावा, माप युक्ति के मशीन अनुपालन के लिए विस्थापन को सही करने के लिए विचार किया जाना चाहिए । माप के दौरान लागू किया गया बल केवल नमूने पर नहीं, बल्कि परीक्षण डिवाइस के अन्य भागों पर भी कार्य करता है. इसलिए, दो सब्सट्रेट के प्रत्येक 13 ± 5 केपीए के एक संपीड़न तनाव के साथ एक गिलास स्लाइड के खिलाफ दबाया जाता है । अनुपालन को मापने के लिए, लोड वक्र खाते में लिया जाता है, यानी, बल-विस्थापन वक्र के भाग जहां दो सतहों नमूना स्थिति जहां सटीक प्रीलोड बल तक पहुंच गया है करने के लिए संपर्क में आते हैं । वक्र के पारस्परिक ढलान मशीन अनुपालन सी के बराबर है । C के लिए परिकलित मान ०.१२ µm/

PDMS के विभिन्न मिश्रण अनुपात के साथ पहली प्रयोग फिल्मों में विश्लेषण किया गया (चित्रा 5). समग्र फिल्मों के लिए, मोटाई और समर्थन परत के मिश्रण अनुपात, PDMS 10:1 के निर्मित लगातार रखा गया था । ऊपर की परत की मोटाई भी ६५ µm के एक मूल्य के साथ लगातार रखा गया था । १०९ ± २७.६ केपीए के उच्चतम pull-ऑफ तनाव PDMS 10:1 फिल्म (चित्रा 5) पर चिकनी कांच सब्सट्रेट के साथ निर्धारित किया गया था । मिश्रण अनुपात की वृद्धि 45:1 मिश्रण अनुपात और 70:1 अनुपात के लिए ४१.४ ± 17 केपीए के लिए ७६.७ ± 17 केपीए करने के लिए पुल से तनाव की कमी की ओर जाता है । के साथ किसी न किसी गिलास सब्सट्रेट 22 ± २.२ केपीए के एक पुल से तनाव PDMS 10:1 फिल्म पर निर्धारित किया गया था । सामांय में, जुदाई का काम दोनों कांच सब्सट्रेट के बीच तुलनीय था, जैसे, १.४ ± ०.६ जे/2 पतली फिल्म पर चिकनी सब्सट्रेट और १.८४ ± ०.७ जे के साथ प्राप्त की पतली फिल्म पर किसी न किसी सब्सट्रेट के साथ प्राप्त चित्रा 5B).

अगले, त्वचा अनुप्रयोगों के लिए पतली फिल्मों के उत्पादन और सेल संस्कृति अनुप्रयोगों के लिए (6 चित्रा) का पता लगाया गया है । एसएसए 50:50 कंपोजिट फिल्मों के टॉप लेयर प्रोडक्शन के लिए इस्तेमाल किया गया है । लगभग ४० µm की मोटाई के साथ एक 1:10 मिश्रण अनुपात में PDMS एक समर्थन परत के रूप में इस्तेमाल किया गया है । चित्रा 5में चित्रित पिछले प्रयोगों के विपरीत, शीर्ष परत की मोटाई अलग किया गया था, जबकि मिश्रण अनुपात लगातार (चित्रा 6A) रखा गया था. SSA क्योंकि उच्च सतह किसी न किसी, विशेष रूप से मानव त्वचा के साथ सतहों लगाव शामिल अनुप्रयोगों में अपने चिपकने वाला गुण का चयन किया गया है, मिश्रण अनुपात 50:505,8के निर्माताओं की सिफारिश का उपयोग कर । मानव एपिडर्मिस एक उच्च सतह किसी न किसी के पास । उंर और संरचनात्मक क्षेत्र पर निर्भर करता है एक मतलब सतह असहजता गहराई (आरजेड) ४८ µm और ७१ µm के बीच29बताया गया है । सुरक्षित और कोमल त्वचा आसंजन महत्वपूर्ण है, नवजात शिशुओं की संवेदनशील त्वचा या शायद ही बुजुर्गों की त्वचा को पुनः उत्पंन करने के लिए ख़ासियत । विभिन्न गीली मोटाई से लेकर ४० µm, १२० µm, ३०० µm से ५०० µm (फिगर 6A) लागू किए गए. गीली मोटाई के आधार पर कंपोजिट फिल्मों की कुल मोटाई ५१ µm और ३४४ µm (फिगर घमण्ड) के बीच बदलती है । इलाज के बाद कंपोजिट एक स्वयंसेवी के हाथ (फिगर 6C) के पीछे से जुड़ गया है । विभिन्न फिल्मों की मोटाई स्पष्ट रूप से उनके अनुकूलन गुणों में त्वचा की किसी न किसी (चित्रा 6C) में मतभेद दिखा । पतली फिल्मों (५० µm और १०० µm कुल मोटाई) मोटी फिल्मों की तुलना में त्वचा झुर्रियों के लिए अनुकूलन की एक उच्च दर प्रदर्शित (२२० µm और ३४० µm कुल मोटाई) । इन परिणामों से संकेत मिलता है कि मोटाई की एक विस्तृत श्रृंखला के साथ समग्र फिल्मों ठीक लागू चिकित्सक ब्लेड तकनीक के साथ उत्पादन किया जा सकता है ।

इन समग्र फिल्मों (चित्रा ७) के साथ आसंजन प्रयोगों का प्रदर्शन किया गया. SSA शीर्ष फिल्म की मोटाई के आधार पर, हम फिल्म मोटाई में वृद्धि के साथ पुल बंद तनाव की कमी मनाया है । १३३ ± ३६.६ केपीए के उच्चतम pull-ऑफ बल चिकनी सब्सट्रेट (चित्रा 7A) पर मापा गया था. सबसे कम पुल से 18 ± 4 केपीए के तनाव मोटा फिल्म पर किसी न किसी सब्सट्रेट के साथ प्राप्त किया गया था । दिलचस्प बात यह है कि दोनों सब्सट्रेटों के बीच एक तुलना में एक २.७ गुना अंतर है जो पतली फिल्मों (चित्रा 7A) पर प्रकट होता है । बढ़ती फिल्म मोटाई के साथ, विशेष रूप से मोटी फिल्मों कोई उल्लेखनीय अंतर पर चौकस (चित्रा 7A) था । चिकनी सब्सट्रेट १.८ ± ०.८ जे/एम2 की जुदाई का एक काम के साथ लगभग की कुल मोटाई का प्रदर्शन फिल्म पर पता चला था । १०० µm, एक फिल्म मोटाई निर्भर कमी (२२० µm मोटाई: १.६ ± ०.६ j/एम2 और ३३० µm: १.३ ± ०.४ j/ (चित्रा 7B)). किसी न किसी सब्सट्रेट के साथ मापा जुदाई का काम सामान्य में चिकनी सब्सट्रेट की तुलना में थोड़ा कम था (१०० µm मोटाई: १.६३ ± ०.६ j/एम2; २२० µm मोटाई: १.१ ± ०.६ j/एम 2 और ३३० µm: १.० ± ०.२ j/एम2 (चित्रा 7B )).

इसके अतिरिक्त माप (फिगर 7C) के दौरान टुकड़ी तंत्र को रिकॉर्ड किया गया । छोटी cavitation पतली फिल्म पर मनाया गया था, जबकि दरार की तरह उंगली की उपस्थिति मोटी फिल्मों (चित्रा 7C) पर चौकस था ।

फिल्मों के निर्माण के बाद एक महीने के भीतर माप प्रदर्शन किया गया है । हालांकि, स्थिरता और लोचदार फिल्मों के यांत्रिक गुणों के संरक्षण पर्यावरण कारकों द्वारा प्रभावित हो सकता है, तापमान और आर्द्रता सहित. प्रोटोकॉल चरण 1.4.3 में वर्णित के रूप में, फिल्मों कमरे के तापमान और ४०-६५% की आर्द्रता पर संग्रहित किया गया है । उन्हें प्रदूषित और धूल से बचाने के लिए फिल्मों में प्लास्टिक के पेट्री पकवानों को अंधेरे में संग्रहित किया गया है । लंबी अवधि के स्थायित्व की जांच करने के लिए, SSA 50:50 फिल्मों के आसंजन माप और मोटाई निर्धारण लगभग चार महीने के निर्माण के बाद प्रदर्शन किया गया है । फिल्म मोटाई पर कोई बड़ा प्रभाव, तनाव से पुल और जुदाई का काम भंडारण के बाद पता लगाया गया है । उदाहरण के लिए, ssa कंपोजिट १२० µm ssa की एक गीली मोटाई और १०० µm PDMS की एक गीली मोटाई के साथ निर्मित फिल्मों की पुल बंद तनाव ४६.६ ± 6 केपीए और निर्माण के बाद जुदाई १६२७ ± ५९२ माइकल एम/ लगभग चार महीने के विनिर्माण के बाद, ४८.८ ± ५.४ केपीए के तनाव से एक पुल और १६६६ ± ७२३ एम सी के पृथक्करण का एक काम निर्धारित किया गया था । इसके अलावा, शीघ्र ही निर्माण के बाद, इन फिल्मों की कुल मोटाई १०३.३ ± १३.९ µm और भंडारण ९८.१ ± ९.१ µm के बाद किया गया था ।

आगे प्रयोगों में PDMS 10:1 और एसएसए 50:50 कंपोजिट फिल्मों के साथ कुल मोटाई लगभग १०५ µm सेल संस्कृति सब्सट्रेट (चित्रा 8) के रूप में इस्तेमाल किया गया है । प्रोटोकॉल चरण संख्या 1 में निर्मित कंपोजिट फिल्मों को पालतू पन्ना से आसानी से हटाया जा सकता है और आवश्यक आयामों और ज्यामितीय रूपों में कटौती की जा सकती है । इसके अलावा, जब एक कठोर सतह के लिए फिल्मों का पालन, उदाहरण के गिलास के लिए, कई फिल्मों के विभिंन युवा moduli प्रदर्शित पक्ष द्वारा पक्ष संलग्न किया जा सकता है और एक सेल संस्कृति की थाली की एक अच्छी तरह से अंदर रखा जाएगा । फिल्में सीधे एक अतिरिक्त coverslip के बिना polystyrene सतह से जुड़ी हो सकती हैं । इसके अलावा, फिल्मों अलग सतहों और ज्यामितीय संरचना के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, ट्यूबों या छल्ले की तरह, और पारंपरिक कोशिका संस्कृति सामग्री के साथ प्राप्त नहीं आगे के अध्ययनों को सक्षम करने से । पीईटी पंनी पर चित्रा 8 समग्र फिल्मों में चित्रित किया प्रयोगों में सीधे सेल संस्कृति प्लेटों या फिल्मों में रखा गया है पालतू पन्ना से हटा दिया गया है और ग्लास कवर पर रखा जाता है । प्रायोगिक स्थितियों के लिए, कुछ पॉलिमर एयर प्लाज्मा के साथ अपने मुक्त सतह ऊर्जा बढ़ाने के लिए इलाज किया गया है । सामांय में, PDMS प्लाज्मा उपचार से पहले लगभग ११५ डिग्री के एक जल संपर्क कोण के पास और अत्यधिक हाइड्रोफिलिक (जल संपर्क कोण < 30 °) aftertreatment8हो जाता है । प्लाज्मा उपचार सतह को संगत प्रदान करता है और eukaryotic कोशिकाओं के लगाव की सुविधा । उपचार के समय और तीव्रता के आधार पर बहुलक सतह बदल गया है, किसी न किसी के उच्च डिग्री प्रदर्शित करने और भी दरार दिखाई दे सकता है । उपचार के तुरंत बाद, एक hydrophobic वसूली प्रक्रिया मनाया जाता है । प्रोटोकॉल चरण 4.3.5 अंतर्गत वर्णित के रूप में एक goniometer स्थैतिक जल संपर्क कोण निर्धारित करने के लिए उपयोग किया गया था । इसलिए, पॉलिमर कि हवा प्लाज्मा उपचार के बाद 1 ज के लिए ddH2ओ में रखा गया है बाद में विश्लेषण किया गया । प्लाज्मा उपचार पानी संपर्क कोण काफी कम (PDMS प्राचीन: ११७.० ± २.२ °; एसएसए प्राचीन: १२७.९ ± ५.६ °; PDMS प्लाज्मा: १८.० ± ७.२ °; एसएसए प्लाज्मा: २९.३ ± ११.५ °) ।

नमूने के लिए एक जलीय बढ़ते मध्यम लागू किया गया है embedding । यदि किसी भी समय बिंदु पर नमूनों को फिर से हटाने की जरूरत है, नमूनों एक पानी में रखा जा सकता है पेट्री पकवान रातोंरात युक्त । अंततः, कवर स्लिप्स अतिरिक्त विश्लेषण के लिए हटाया जा सकता है ।

अनुलग्नक व्यवहार और L929 कोशिकाओं की आकृति विज्ञान PDMS और SSA पर 3 दिनों के लिए वरीयता प्राप्त 50:50 समग्र फिल्मों चरण कन्ट्रास्ट माइक्रोस्कोपी द्वारा निर्धारित किया गया है और प्रतिदीप्ति संयुग्मित phalloidin-४८८ और Hoechst डाई ३३३४२ (चित्रा 8) के साथ दाग के बाद. चरण कंट्रास्ट माइक्रोस्कोपी के साथ छवि अधिग्रहण अत्यधिक की सिफारिश की है, विशेष रूप से पॉलिमर प्लाज्मा के साथ इलाज नहीं के लिए । इन बहुलक सतहों के लिए कमजोर सेलुलर आसंजन के कारण एकल कोशिकाओं या समुच्चय आसानी से अलग कर रहे हैं, बाद में विश्लेषण के तरीकों की उलझी हुई सही व्याख्या ।

कोशिकाओं को प्राचीन पॉलिमर पर वरीयता प्राप्त गरीब लगाव और सेलुलर प्रसार व्यवहार प्रदर्शित (चित्रा 8A1 और c1) जबकि एक धाराप्रवाह monolayer कोशिकाओं प्लाज्मा पर कल्चरित के लिए मनाया गया इलाज सतहों (चित्रा 8B1 और D1) . सतह से सेलुलर समुच्चय और टुकड़ी का गठन अधिक प्राचीन सतहों पर स्पष्ट किया गया था । 4% के साथ निर्धारण के बाद actin रेशा के दृश्य paraformaldehyde कुछ कोशिकाओं सेलुलर समुच्चय और प्राचीन PDMS और एसएसए 50:50 समग्र फिल्मों पर lamellipodia दखलंदाजी के प्रक्षेप की परिधि में पलायन का पता चला (चित्रा 8A2 और C2, तीर). दोनों बहुलक सामग्री की तुलना करते समय कोई बड़ा गुणात्मक अंतर नहीं देखा जा सकता है । एक सुसाइड नोट के रूप में, ऐसा लगता है कि सेलुलर समुच्चय की एक कम राशि SSA 50:50 पर PDMS की तुलना में मौजूद थे । इसके अलावा, SSA 50:50 पर सतहों से जुड़ी समुच्चय अधिक चपटा (चित्रा 8C1) दिखाई दिया । के रूप में की उंमीद है, हवा प्लाज्मा के साथ उपचार में सुधार सेलुलर लगाव और दोनों सतहों पर फैल काफी, उल्लेखनीय lamellipodia की दखलंदाजी और एक धाराप्रवाह monolayer के गठन के लिए अग्रणी (चित्रा 8B2 और 8D2) ।

संस्कृति के 3 दिनों के बाद LDH के रिलीज साइटोटोक्सिक प्रभाव (चित्रा 9A) का निर्धारण करने के लिए एक संकेतक के रूप में इस्तेमाल किया गया था । सामांय में, LDH स्तरों दोनों बहुलक सामग्री पर प्रसंस्कृत कोशिकाओं के लिए तुलनीय थे, से कम 5% cytotoxicity (प्राचीन PDMS: २.८ ± २.०% के साथ; प्राचीन एसएसए 50:50:४.५ ± ३.६%; प्लाज्मा इलाज PDMS: ३.४ ± १.५%; प्लाज्मा स्वास्थ्यकर्मी एसएसए 50:50:३.४ ± १.६%) । इन परिणामों के दोनों elastomers की जांच पर ध्यान केंद्रित हमारे पहले प्रकाशित अध्ययन में प्रस्तुत आंकड़ों के लिए तुलनीय हैं । 8 LDH परख, एक trypan नीले अपवर्जन परीक्षण के परिणाम को मांय करने के लिए प्रदर्शन किया गया था । इसके अतिरिक्त, पूरे सेल जनसंख्या प्रसार गतिविधि (चित्रा 9B) में मतभेद प्रदर्शित करने के लिए निर्धारित किया गया था । सामांय में से कम 5% Trypan नीले सकारात्मक कोशिकाओं गिनी गई (प्राचीन PDMS: २.४ ± ०.३%; प्राचीन एसएसए 50:50:३.८ ± २.५%; प्लाज्मा इलाज PDMS: ०.७४ ± १.३% प्लाज्मा इलाज एसएसए 50:50:०.९५ ± १.६%) ।

Figure 1
चित्रा 1: पाली पर PDMS फिल्मों की तैयारी-(vinyl शराब) (PVA) लेपित पीईटी पंनी: एक पालतू पंनी पर अलग मोटाई के साथ PDMS फिल्मों के निर्माण के लिए प्रक्रिया reproducibility और हैंडलिंग प्रदर्शन (a) निर्धारित करने के लिए लागू किया गया था । PDMS फिल्मों की मोटाई ९५ डिग्री सेल्सियस (बी) में इलाज के बाद ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी के साथ विश्लेषण किया गया । N = 3 स्वतंत्र रूप से निर्मित फिल्मों का विश्लेषण किया गया । प्रत्येक फिल्म से, तीन विभिंन स्थानों का चयन किया गया, कट और प्रत्येक नमूने पर 3 पदों का विश्लेषण किया गया (k = 27) । त्रुटि पट्टियां मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करती हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: विभिन्न मिश्रण अनुपात में तैयार PDMS की समग्र फिल्मों की तैयारी: आधार के विभिंन मिश्रण अनुपात (घटक ए) crosslinker (PDMS के घटक बी) के प्रदर्शन कंपोजिट फिल्म डॉक्टर ब्लेड तकनीक द्वारा निर्मित किया गया । शीर्ष अनुपात 10:1 (घटक A:B), 45:1 और 70:1 में PDMS से मिलकर परत पहले ठीक PDMS 10:1 फिल्म (ए) के शीर्ष पर लागू किया गया । समग्र फिल्मों के ९५ डिग्री सेल्सियस मोटाई पर बाद में इलाज के बाद ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप (बी) और स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (सी) द्वारा विश्लेषण किया गया था । N = 3 स्वतंत्र प्रयोगों प्रदर्शन किया और ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी (डी) के साथ विश्लेषण किया गया । प्रत्येक स्वतंत्र निर्मित फिल्म के रूप में, तीन विभिन्न स्थानों को चुना गया, कटौती और प्रत्येक नमूने पर 3 पदों का विश्लेषण किया गया (k = 27). त्रुटि पट्टियां मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करती हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: आसंजन माप के लिए इस्तेमाल किया दो सब्सट्रेट के स्थलाकृतिक सतह किसी न किसी का निर्धारण: दो गिलास अलग सतह किसी न किसी प्रकार रखने के लक्षण थे । सतह के तीन आयामी profilometric विश्लेषण ' चिकनी ' सब्सट्रेट जी एस (A1) और ' रफ ' सब्सट्रेट जीआर (B1) पर किया गया था । इसी एकल लाइन घटता A2 और B2) में चित्रित कर रहे हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: सामान्य आसंजन माप के सिद्धांत: एक कस्टम निर्माण सेटअप बहुलक नमूनों की आसंजन गुणों की विशेषता के लिए इस्तेमाल किया गया था । माप सेटअप (A) में दर्शाया गया है और विवरण (B) में दिखाया गया है । माप विश्लेषण के लिए, तनाव एक तनाव समय वक्र (सी) से निर्धारित किया गया था । जुदाई का काम sअंत और एस0 (डी) के बीच तनाव-विस्थापन वक्र के एकीकरण के द्वारा निर्धारित किया गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: PDMS के विभिन्न मिश्रण अनुपात के साथ समग्र फिल्मों के आसंजन गुणों का निर्धारण: पुल से तनाव (क) और जुदाई का काम (ख) मिश्रण अनुपात में PDMS की निर्मित समग्र फिल्मों के 10:1, 45:1 और 70:1 मापा गया. विश्लेषण के लिए, एक ' चिकनी ' ग्लास सब्सट्रेट (जी एस) एक आरएक = ०.०१३ µm और आरए = ०.३३८ µm के साथ एक ' रफ ' ग्लास सब्सट्रेट (जीआर) का प्रदर्शन किया गया । N = 3 स्वतंत्र रूप से निर्मित फिल्मों का विश्लेषण किया गया । प्रत्येक फिल्म से, दो टुकड़ों को चुना गया था और प्रत्येक नमूने पर तीन विभिंन पदों का विश्लेषण किया गया (k = 18) । त्रुटि पट्टियां मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करती हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्रा 6: अलग मोटाई के साथ एसएसए की समग्र फिल्मों की तैयारी: SSA 50:50 पहले ठीक PDMS 10:1 फिल्म (ए) के शीर्ष पर लागू किया गया था । ४० से ५०० µm को लेकर इस परत के विभिंन गीला मोटाई लागू किया गया और ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी (बी) के साथ जांच के इलाज के बाद मोटाई । एक स्वयंसेवकों हाथ की पीठ के लिए फिल्मों की आसक्ति लगभग १०० µm (फिल्म #2) की कुल मोटाई के साथ कि फिल्मों त्वचा की किसी न किसी तरह के अनुरूप (सी) । एकल परतों की मोटाई और समग्र फिल्मों की कुल मोटाई में दिखाया गया है चित्रा घमण्ड। विश्लेषण के लिए n = 3 स्वतंत्र रूप से निर्मित नमूनों ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी के साथ मापा गया । प्रत्येक फिल्म से, तीन विभिंन स्थानों का चयन किया गया, कट और प्रत्येक नमूने पर 3 पदों का विश्लेषण किया गया (k = 27) । त्रुटि पट्टियां मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करती हैं । 6C में स्केल बार लगभग 1 सेमी दर्शाया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 7
चित्रा 7: नरम त्वचा चिपकने वाला की समग्र फिल्मों के आसंजन गुणों का निर्धारण: एक शीर्ष परत और PDMS 10:1 के रूप में एसएसए की पतली समग्र फिल्मों का समर्थन परत के रूप में निर्मित किया गया । शीर्ष परत की मोटाई ५० और ३३० µm के बीच अलग किया गया था । पुल से तनाव (क) और जुदाई का काम (ख) कंपोजिट फिल्मों के दो अलग गिलास सब्सट्रेट के साथ मापा विश्लेषण किया गया (एक ' चिकनी ' ग्लास सब्सट्रेट (जी एस) एक आर प्रदर्शन = ०.०१३ µm और एक ' रफ ' ग्लास सब्सट्रेट (जीआर) आरए = ०.३३८ µm) के साथ । टुकड़ी तंत्र की अनुकरणीय चित्रों सीमें कल्पना कर रहे हैं । डेटा विश्लेषण के लिए n = 3 स्वतंत्र रूप से निर्मित प्रयोगों का विश्लेषण किया गया. प्रत्येक फिल्म से, दो टुकड़ों को चुना गया था और प्रत्येक नमूने पर तीन विभिंन पदों का विश्लेषण किया गया (k = 18) । त्रुटि पट्टियां मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करती हैं । 7C में स्केल बार्स ०.५ मिमी दर्शाती है । इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 8
चित्र 8: L929 fibroblasts के सेलुलर आकृति विज्ञान पतली फिल्मों पर संस्कृतिया: L929 murine fibroblasts PDMS (A1, A2, B1, B2) या SSA (c1, C2, D1, D2) से निर्मित पतली फिल्मों पर 3 दिनों के लिए प्रसंस्कृत थे । हवा प्लाज्मा उपचार सतहों की hydrophilicity बढ़ाने के लिए (B1, B2, D1, D2) किया गया था । D1 और D2 में स्केल पट्टियां चित्रित १०० µm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 9
चित्र 9: cytotoxicity और सेलुलर प्रसार का निर्धारण: साइटोटोक्सिक इफेक्ट्स और सेलुलर प्रसार के निर्धारण के लिए, L929 कोशिकाओं PDMS 10:1 और एसएसए 50:50 समग्र फिल्मों पर तीन दिनों के लिए बीज लिया गया था । स्तनपान डिहाइड्रोजनेज (LDH) के रिलीज के एक LDH गतिविधि परख द्वारा निर्धारित किया गया था और कम से पता चला 5% cytotoxicity (A) । एक Neubauer चैंबर (बी) के साथ एक कोशिकाओं मैनुअल गिनती के बाद खेती की अवधि के बाद कुल सेल संख्या का आकलन किया गया था. N = 3 स्वतंत्र रूप से किए गए प्रयोगों का विश्लेषण किया गया. त्रुटि पट्टियां मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करती हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Discussion

कंपोजिट संरचनाओं के डिजाइन सामग्री संपत्तियों के सरल समायोजन, जैसे युवा मापांक या नमूनों की मोटाई के रूप में सक्षम बनाता है । PDMS के युवा मापांक प्रभावी रूप से या तो दो घटकों या मिश्रणों के निर्माण के बीच मिश्रण अनुपात फेरबदल द्वारा एक विस्तृत श्रृंखला में बदल सकता है एक अलग सिलिकॉन elastomer30,31का उपयोग कर सकते हैं । वर्णित विधियों PDMS वर्तमान जांच में उपयोग करने के लिए सीमित नहीं हैं, लेकिन विशेष रूप से चिपकने वाला प्रदर्शन उपयोग विशेष प्रकार पर दृढ़ता से निर्भर करता है । इस प्रोटोकॉल के भीतर एक महत्वपूर्ण कदम कंपोजिट फिल्मों (चित्रा 1) के निर्माण की प्रक्रिया है । इसमें दिखाया गया कि फिल्मों की मोटाई काफी हद तक विभिन्ना सब्सट्रेटों पर फिल्मों के आसंजन व्यवहार को प्रभावित करती है, जिसमें त्वचा (चित्रा ५ और चित्रा ६) शामिल हैं. फिल्म मोटाई, इलाज प्रक्रिया के दौरान समय और तापमान के अलावा सामग्री गुण३२को प्रभावित करता है । इसलिए, बहुलक परतों की मोटाई के रूप में मापदंडों को ध्यान से अनुकूलित और सत्यापित किया जाना है ।

पतली फिल्मों के चिपकने वाले गुणों का विश्लेषण सामान्य बल आसंजन के साथ प्रदर्शन किया गया था के साथ दो गिलास सब्सट्रेट का उपयोग कर अलग सतह किसी न किसी को रा अप करने के लिए = ०.३३८ µm (चित्रा 3). सामान्य तौर पर, विशेष रूप से लोचदार सामग्री३३,३४की सतहों के आसंजन, काफी हद तक प्रभावों । कांच की असहजता आसानी से अलग asperity आकार के सैड के साथ पीस द्वारा विविध किया जा सकता है, इसलिए उच्च किसी न किसी मान21प्रदर्शन सब्सट्रेट के निर्माण की अनुमति. इसके अलावा, अंय सामग्री, उदाहरण के लिए epoxy राल सब्सट्रेट के उत्पादन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है15,३५। यह प्रस्तुत प्रोटोकॉल की एक महत्वपूर्ण संशोधन रणनीति हो सकती है । उदाहरण के लिए, यदि विभिंन सतह मुक्त ऊर्जा का प्रदर्शन सब्सट्रेट आवश्यक है या विशिष्ट स्थलाकृति की आवश्यकता है । यहां, पुल बंद तनाव और पतली PDMS और एसएसए से निर्मित फिल्मों की जुदाई का काम एक कस्टम निर्मित सेटअप (macroscopic आसंजन माप उपकरण (पागल, चित्रा 4) के साथ विश्लेषण किया गया । ३६ सब्सट्रेट और फ्रॉम के ऑप्टिकल संरेखण माप परिणामों के विश्लेषण के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है. इसलिए, झुकाव कोण के समायोजन के लिए goniometer के साथ प्रदर्शन की जरूरत है, के रूप में संभव के रूप में सटीक । यह मैन्युअल रूप से एक क्षैतिज संपर्क हासिल की है जब तक फिल्म सतह के साथ संपर्क में सब्सट्रेट लाने के द्वारा पर्याप्त परिशुद्धता के साथ प्राप्त किया जा सकता है.

वर्तमान प्रोटोकॉल में पकड़ समय एक सेकंड में लगातार रखा गया था (5 चित्रा और चित्रा 7) । विशेष रूप से एक मोटा सब्सट्रेट सतह के लिए एक लोचदार फिल्म के चिपकने वाला प्रदर्शन की जांच के लिए, पकड़ समय का विस्तार अतिरिक्त जानकारी प्रदान करता है । उदाहरण के लिए, बढ़ती पकड़ समय के साथ पुल बंद तनाव में वृद्धि8बताया गया है । वर्तमान प्रोटोकॉल में प्रदर्शन किया माप के अलावा, अंय तरीकों, उदाहरण के लिए छील परीक्षण किया जा सकता है, आसंजन प्रदर्शन३७की एक और अधिक व्यापक जांच की अनुमति ।

कोमल त्वचा चिपकने वाली विभिंन फिल्म मोटाई का प्रदर्शन समग्र फिल्मों के चिपकने वाला गुण निर्धारित किया गया (चित्रा 7) । हमारे परिणाम प्रकाशित आंकड़ों के साथ लाइन में हैं, दिखा रहा है कि फिल्म मोटाई की कमी के लिए एक पुल के रूप में तनाव से वृद्धि के रूप में, अर्थात्, सब्सट्रेट व्यास और फिल्म मोटाई के बीच अनुपात, बढ़ जाती है३८,३९ . इन परिणामों और आंकड़ा 7में चित्रित आंकड़ों के आधार पर, हम लगभग की कुल मोटाई के साथ कि समग्र फिल्मों को समाप्त १०० µm (लगभग ६० µm की SSA परत की एक मोटाई लगभग ४० µm की मोटाई के साथ एक PDMS फिल्म के लिए लागू) प्रदर्शन अनुकूल आसंजन p किसी न किसी सतहों पर roperties ।

अगले, जैविक लक्षण वर्णन से संबंधित प्रयोगों प्राचीन समग्र फिल्मों और प्लाज्मा मिश्रित फिल्मों (8 चित्रा) इलाज पर प्रदर्शन किया गया है । सिलिकॉन elastomers के प्लाज्मा उपचार एक अक्सर लागू, बहुमुखी तकनीक सतहों के हाइड्रोफिलिक गुण बढ़ाने के लिए और सेलुलर लगाव और सेलुलर४०,४१प्रसार को बढ़ावा देने है । सिलिकॉन अच्छी तरह से उनके कम विषाक्तता और उच्च के लिए जाना जाता है, लेकिन अवशिष्ट मोनोमर या उत्प्रेरक जो शारीरिक प्रक्रियाओं को प्रभावित हो सकता है, यह भी cytotoxicity४२,४३करने के लिए अग्रणी होते हैं । आयोजित प्रयोगों में हम से कम 5% cytotoxicity एक संकेतक और एक Trypan नीले अपवर्जन परख के रूप में LDH रिहाई का उपयोग कर मनाया है । प्रस्तुत प्रोटोकॉल में, सेलुलर समुच्चय सहित पूरी सेलुलर आबादी, सतह के प्रसार विश्लेषण के लिए विश्लेषण किया गया है (चित्रा 9B) । प्रोटोकॉल का एक संशोधन अधिक विभेदित परिणामों का उत्पादन कर सकता है । प्रत्येक नमूने के लिए, supernatant युक्त सेलुलर समुच्चय एक अलग प्रतिक्रिया ट्यूब करने के लिए स्थानांतरित किया जा सकता है और बहुलक सतह से हटा enzymatically कोशिकाओं के साथ संयुक्त नहीं है । यह सतह से जुड़ी कोशिकाओं के सटीक आकलन की अनुमति है और अंततः सेलुलर आसंजन प्रक्रिया पर पॉलिमर के प्रभाव का एक अधिक विस्तृत निर्धारण प्रकट होता है । immunocytochemical यहां प्रस्तुत तरीकों के अलावा, कोशिकाओं immunoblot तरीकों के साथ जांच के लिए काटा जा सकता है, प्रोटीन अभिव्यक्ति की एक विस्तृत मात्रात्मक मूल्यांकन की अनुमति ।

सारांश में, हम उंनत सेल संस्कृति अनुसंधान में अनुप्रयोगों के लिए पतली elastomeric समग्र फिल्मों के उत्पादन के लिए विनिर्माण शर्तों की स्थापना की है । इसके अतिरिक्त, इन पतली फिल्मों त्वचा किसी न किसी के लिए उच्च अनुकूलन क्षमता के अधिकारी, त्वचा चिपकने के परिष्कृत डिजाइन को सक्षम करने ।

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

मार्टिन Danner नमूनों और सेल संस्कृति प्रक्रियाओं की स्थापना की तैयारी में उनकी सहायता के लिए स्वीकार किया है । लेखक Biesterfeld Spezialchemie GmbH (हैंबर्ग, जर्मनी), विशेष रूप से रॉबर्ट Radsziwill सतत समर्थन और विचार विमर्श के लिए शुक्रिया अदा करना चाहूंगा । इन परिणामों के लिए अग्रणी अनुसंधान यूरोपीय संघ के सातवें फ्रेमवर्क कार्यक्रम (FP/2007-2013)/ERC अनुदान समझौते n. ३४०९२९ के तहत यूरोपीय अनुसंधान परिषद से धन प्राप्त हुआ है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Propanol, 97% Stockmeier Chemie 1000452610000 Isopropanol
Abrasive diamnod hand pad Bohle MO 5007522 Grit: 220
Accutase Capricorn Scientific ACC-1B
Albumin Fraktion V Roth 0163.2 BSA
Alexa Fluor 488 Phalloidin ThermoFischer Scientific A12379 highly toxic
Aquamount Polysciences 18606-20 water soluble mounting medium
CytoTox-ONE Homogeneous Membrane Integrity Assay Promega G7890
DPBS, without Ca2+, Mg2+ ThermoFischer Scientific 14190094
Fetal bovine serum gold GE Health Care Life Science A15-151 FBS
Goniometer OCA35 Dataphysics for the determination of the static water contact angle
Hoechst Dye 33342 Sigma-Aldrich B1155-100MG bisBenzimide H 33342 trihydrochloride, highly toxic
Microscope Axiovert 25 Zeiss Microscope used for cell culture documentation
Microscope Eclipse LV100ND Nikon Microscope used for film thickness determination
Paraformaldehyde, aqueous solution 16% Electron Microscopy Sciences RT 15710 electron microscopy grade
penicillin und streptomycin solution Sigma-Aldrich P4333-100ML
Phenom XL Scanning Electron Microscope (SEM) Phenom
Poly-(vinyl alcohol) 4-88, MW 31000 Sigma-Aldrich 81381-1KG Mowiol 4-88
Poly-dimethyl siloxanes, Sylgard 184 Dow Corning (400)000108351397 PDMS
RPMI 1640 basal medium ThermoFischer Scientific 21875034
soft skin adhesive (SSA) Dow Corning (400)000108251792 MG 7-9800 Soft Skin Adhesive (SSA)
speed mixer DAC 600.2 VAC-P Hauschild
stylus profilomter Zeiss Model: SURFCOM 1500SD3
Tecan Infinite M200 pro Tecan fluorescence plate reader
Triton X 100 Calbiochem 648466
Trypan Blue solution Sigma-Aldrich T8154-100ML highly toxic
Trypsin/EDTA solution PAN-Biotech P10-023500 0.05% Trypsin, 0.02% EDTA in PBS
UV glue Bohle BO MV76002 medium viscosity

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विकास जीवविज्ञान अंक १३७ पाली (डि-methylsiloxane) तनु फिल्म कंपोजिट elastomers त्वचा चिपकने वाले आसंजन कोशिका संस्कृति
पतली फिल्म समग्र सिलिकॉन सेल संस्कृति और त्वचा अनुप्रयोगों के लिए Elastomers: विनिर्माण और लक्षण वर्णन
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Boyadzhieva, S., Fischer, S. C. L., Lösch, S., Rutz, A., Arzt, E., Kruttwig, K. Thin Film Composite Silicon Elastomers for Cell Culture and Skin Applications: Manufacturing and Characterization. J. Vis. Exp. (137), e57573, doi:10.3791/57573 (2018).

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