Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Thin Film sammansatta silikon elastomerer för cellodling och hud applikationer: tillverkning och karakterisering

Published: July 3, 2018 doi: 10.3791/57573
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 1,3, 1, 1,2, 1
1INM - Leibniz Institute for New Materials, 2Department of Materials Science and Engineering, Saarland University, 3University of Applied Sciences Kaiserslautern
* These authors contributed equally

Summary

Ett protokoll för tillverkningsprocessen av Polymera tunn film sammansatta strukturer som har antingen olika Youngs moduli eller tjocklekar presenteras. Filmerna produceras för avancerade cellkulturstudier eller som huden bindemedel.

Abstract

I detta protokoll presenterar vi metoder för att tillverka tunna elastomer sammansatta filmer för avancerad cell kultur tillämpningar och för utvecklingen av huden lim. Två olika poly-(dimethyl siloxanes) (PDMS och mjuk hudlim (SSA)), har använts för djup undersökning av biologiska effekter och självhäftande egenskaper. De sammansatta filmerna består av ett flexibelt stöd lager och en topp limbeläggning. Båda lagren har tillverkats av läkare blade ansökan teknik. I den nuvarande undersökningen, har självhäftande beteendet hos de sammansatta filmerna undersökts som en funktion av lagrartjockleken eller en variant av de Youngs modulus av det översta lagret. De Youngs modulus av PDMS har ändrats genom att variera basen till crosslinker blandningsförhållandet. Dessutom, tjockleken på SSA filmer har varit varierat från ca 16 µm till ca 320 µm. Scanning electron microscopy (SEM) och optisk mikroskopi har använts för tjocklek mätningar. De vidhäftande egenskaperna av elastomer filmer är starkt beroende av filmtjockleken, den Youngs modul av polymerer och ytegenskaper. Normala vidhäftning av dessa filmer på glas substrat uppvisar jämna och ojämna ytor har därför undersökts. Pull-off stress och arbete av separation är beroende av blandande förhållandet av silikonelastomerer.

Dessutom har tjockleken på mjuk hud limmet placerad ovanpå ett stödjande underlag lager varierats för att producera patchar för hud applikationer. Cytotoxicitet, spridning och cellulär adhesion av L929 murina fibroblaster på PDMS filmer (blandningsförhållande 10:1) och SSA filmer (blandning förhållandet 50: 50) har genomförts. Vi har visat här, för första gången, sida vid sida jämförelse av sammansatta tunnfilmer tillverkas av båda polymerer och presenterar utredningen av deras biologiska- och självhäftande egenskaper.

Introduction

I detta protokoll presenteras detaljerade metoder för tillverkning av tunna elastomer filmer. Allmänt tillgänglig läkare blade tekniken har använts för framställning av tunna sammansatta filmer. Tillverkningstekniken har utförts på polyethylenterephtalate (PET) omkullkastar, möjliggör tillverkning av dessa filmer i stor skala. Betoningen av detta protokoll är bedömningen av reproducerbarhet, exakt tillverkning av de olika lagren av de sammansatta filmerna och bestämning av de biologiska och vidhäftning slutliga sammansatta plåstret. Av silikon elastomer poly-(dimethylsiloxane) (PDMS) används flitigt i biomedicinsk teknik, inklusive produktion av huden lim, mikrofluidik program och ytterligare forskning fält1,2,3 ,4. En annan underklass av PDMS, så kallade mjuka hud lim (SSAs) har nyligen varit införda, särskilt för mild hud limning och de limning.

Silikon SSAs är vinyl functionalized elastomerer, skiljer sig från liknande polymerer av frånvaron av förstärkning kiseldioxid5. Liknar andra PDMS, SSAS Youngs modul kan anpassas i ett brett spektrum av modulerande cross-linker koncentration eller bota tid6,7,8. Denna förändring i Youngs modulus av silikonelastomerer drabbar de vidhäftande egenskaperna av materialet betydligt och har också djupgående konsekvenser på prokaryota och eukaryota celler odlade på ytan9,10 , 11. på biologiska cellnivå, det visades, att eukaryota celler svarar på signaltransduktion nivå på en modulering av matrix elasticitet eller tjocklek på den ytan9,10,12 ,13,14. Därför finns ett brett intresse för cell kultur tillämpningar av polymerer med avstämbara mekaniska egenskaper. Ännu viktigare, ger den egensäkra låg ytenergi av silikonelastomerer baserat inte optimala förhållanden för cellodling av eukaryota celler. Syre plasmabehandling är en allmänt använd teknik för att öka PDMS låg ytenergi tillfälligt, leder till en förbättring av pull-off styrka, minskade ytan adsorption av molekyler, medan parallellt främja fastsättning, sprida och spridning av eukaryota celler15,16,17,18.

Förutom material egenskaper påverkar ytans topografi avsevärt cellulär adhesion och självhäftande samspelet mellan två material19,20,21,22. Ytjämnhet har flera effekter på kontakt bildandet mellan två ytor: minskning av kontaktytan, hög lagrad elastisk energi kring asperities, liksom påverkan på spricka förökningen kan förändra den adhesive styrka23, 24. Vidhäftning av självhäftande filmer till mänsklig hud är en framväxande programfält, exempelvis sårförband, fixering av EKG-elektroder eller andra bärbara elektroniska enheter25,26,27, 28. För att mäta självhäftande self-lim i förhållande till ytan topografi, kan glas substrat med varierande grad av ojämnhet användas i normala vidhäftning mätningar8,21. Här, har två glas substrat valts att undersöka de vidhäftande egenskaperna av polymer filmerna. Första, sammansatta filmer med ett PDMS backing lager i 10 till 1 vikt delar omfattas av PDMS med olika blandningsförhållande blandande förhållandet karakteriserades. I ett andra steg förbereddes en självhäftande SSA skikt med lika vikt mängder både komponenter och med varierande filmtjocklek ovanpå en stödjande PDMS-film.

Protocol

Varning: Läs alla relevanta säkerhetsdatablad (MSDS) före användning. Några av de kemikalier som används i detta protokoll är irriterande, akut giftiga eller cancerframkallande. Använd alla lämpliga säkerhetsrutiner vid hantering av dessa kemikalier. Detta inkluderar användning av teknik (chemical skåp) och personlig skyddsutrustning (skyddsglasögon, handskar, labbrock, full längd byxor och stängd tå skor). Delar av följande procedurer involverar kulturen i ett djurs cellinje. Därför Följ de specifika biosäkerhet förordningarna. Kemiska och biologiska avfall måste kasseras enligt de specifika nationella och institutionella regler och rekommendationer.

1. beredning av silikon elastomer tunn Film sammansatta strukturer

  1. Beredning av polymerer
    1. För att förbereda 1,1 g av PDMS i förhållandet 10:1, blanda 1,0 g av förening A med 0,1 g av sammansatta B.
    2. Mix och degase före polymerer i en hastighet mixer på 2350 rpm under vakuum i 3 min.
    3. Ändra den massa kvoten mellan sammansatta A och förening B till 45:1 och 70:1. Förbereda dem liknar den metod som beskrivs i 1.1.2.
    4. Laga 1 g mjuk hud limmet (SSA) i förhållandet 50: 50. Därför blanda 0,5 g av förening A och 0,5 g förening B som beskrivs i 1.1.2.
  2. Beredning av poly-(vinyl alcohol) (PVA) belagd PET folie
    1. Förbereda en 18% (w/w) PVA lösning i vatten genom att lägga till PVA avjoniserat vatten och blanda över natten med en magnetisk omrörare. Här förvaras vid 4 ° C.
    2. Förbereda tunna filmer uppvisar en effektiv tjocklek 15 µm med läkare blade ansökan maskinen, med 100 µm gap av bladet och en hastighet av ca 2,0 mm/s.
    3. Placera filmerna i en ugn vid 95 ° C i 15 min.
  3. Förberedelse av stöd-lagret av PDMS 10:1 blandningsförhållande av läkare bladet teknik
    1. Använda en automatiskt kontrollerad läkare blade ansökan maskin för framställning av tunna filmer.
    2. Rengör den PET folien med 100% isopropanol och placera den på ytan av området läkare blad.
    3. Placera bladet läkare ovanpå folien och justera tjockleken med mikro positionering skruvar. För tillverkning av våt lager, applicera tjocklekar 60 µm, 100 µm, 200 µm och 500 µm.
    4. Fyll PDMS 10:1 polymeren bereddes i steg 1,1 in i reservoaren av läkare bladet med en spruta för engångsbruk. Starta rörelsen av bladet med en hastighet av ca 2,0 mm/s.
    5. Avlägsna den PET-filmen med tillämpad 10:1 beläggningen från maskinen och placera den i en ugn för 1 h vid 95 ° C, ligger i ett rum som uppvisar luftfuktighet mellan 40 och 65 procent.
    6. Rengöra läkare bladet med isopropanol och pappers handdukar.
    7. Upprepa proceduren för alla krävs tjocklekar.
  4. Beredning av det översta lagret av PDMS i olika blandning nyckeltal av läkare bladet teknik
    1. Ta bort tunna ränder längd sidorna av underliggande filmen med en skalpell eller rakblad att tillåta placering och soltak av läkare bladet på PET folien.
    2. Följ protokollstegen 1.3.3 till 1.3.6. Våta tjocklek tillämpas för filmen är 160 µm.
    3. Upprepa proceduren för produktion av två oberoende filmer varje med ett annat blandningsförhållande av PDMS komponenter (45:1 och 70:1). Lagra filmerna vid rumstemperatur (ca 22 ° C och vid en luftfuktighet mellan 40 och 65%) i kvadrat petriskålar att hindra dem från föroreningar och damm.
  5. Beredning av sammansatta tunnfilmer uppvisar olika tjocklekar av lagrets SSA 50: 50
    1. Förbereda PDMS 10:1 filmer som en stöd-lager, enligt innan steg 1.3.
    2. Följ protokollstegen 1.4.1 och 1.4.2 att producera dessa filmer. Använda SSA i blandande förhållandet 50: 50 och tillverkar en film med en våt tjocklek 40 µm.
    3. Upprepa proceduren för ytterligare våta tjockleken av: 120 µm, 300 µm, 500 µm.

2. normal vidhäftning mätningar använder substrat med olika ytjämnhet

  1. Förberedelse och karakterisering av glas substrat med olika ytjämnhet
    1. Använd en glas cylinder diameter 2 mm som 'smidig substrat'.
    2. Att tillverka 'grov substrat' punktskatt med ett glas fräs en bit med dimensionen av ca 4 x 4 mm från en frostad glasskiva. Använd en slipande diamond hand pad för att erhålla ett cirkulärt område på ca 3 mm i diameter.
    3. Tillmäter en aluminium kon med UV lim glaset och belysa det i UV belysning kammaren för 3 min.
    4. Bestämma radien av ytan av substratet med ett optiskt mikroskop. Beräkna området enligt formeln A = πr2.
    5. Fastställa strävhet parametern Ren och Rz (enligt: DIN EN ISO 4287, ASME B46.1) med en stylus profilometer.
    6. Anbringa substratet på prov scenen av profilometer och föra spetsen (diamond, standard: 2 µm/60 °) i kontakt med provet.
    7. Spela in grovhet profilen med en hastighet av 0,3 mm/s och en längd av 1 mm.
    8. För att analysera ytan drivs topografi, mäta ett område av exakt 1 mm2 med en stylus profilometer, av den tillhörande programvaran.
      Obs: Profilometer drivs av en extern dator. Innehavaren skiftas av 0,001 mm i y-riktningen en förskjutning av 1 mm har uppnåtts i x riktning. Det inspelade. RS3-fil importeras i Surfcom karta Expert programvara för att skapa 3D-bilder.
  2. Normala vidhäftning mätning av tunna filmer tillverkade av PDMS eller SSA
    1. Använd ett rakblad för att skära filmerna på PET folien i små bitar med en yta av ca 4,0 cm2 och placera dem på ett glas skjut med UV lim. Belysa med UV-ljus för 3 min.
    2. Montera polymera provet på provhållaren.
    3. Ren underlaget ytan försiktigt med etanol och torr med kvävgas.
    4. Fäst glassubstrat, monterade på aluminium konen, till BELASTNINGSCELLEN.
    5. Använda tabellen tiltable (goniometer) för att anpassa ytorna just genom att justera underlaget närmar sig polymera filmen tiltvinkel. För att göra detta, föra substratet manuellt i kontakt med filmen. Ändra lutningsvinkel tills en helt parallell justering av båda ytorna till varandra, visualiseras av kameror bilder, erhålls.
      Obs: Lastcell är ansluten till tabellen vinklingsbar. En glasprisma ligger nedanför provet som visas i figur 4, möjliggör visualisering av kontaktytan med två kameror och möjliggöra anpassning av substratet på polymerfilm.
    6. Flytta underlaget till polymera film ytan tills en förspänning stress 13 ± 5 kPa är uppnås (figur 4).
    7. Starta anpassade programmerade programpaketet skriven i LabView styra parametrarna krävs mätning som håller tid och strategi/infällning hastighet. I håll tid tHåll är 1 sekund, metoden och avlossning hastighet är 30 µm/s och 10 µm/s respektive.
    8. Utföra vidhäftning mätningar på tre oberoende tillverkade prover och på sex olika platser på varje film yta.
  3. Analys av data och beräkning av mekaniska nyckelfaktorer: pull-off stress och arbete av separation.
    1. Beräkna stress Equation 1 genom att dividera den inspelade tvinga genom området substrat enS.
      Equation 2
    2. Bestämma den pull-off stress, som beskrivs som det högsta värdet av den normala stressen.
      Equation 3
    3. Få den förskjutning Δs genom subtraktion av startpositionen för draghållfasthet regimens0 från provet position sslutet där de limning har genomförts. Definiera starten av draghållfasthet regimen som s0 = 0.
      Equation 4
    4. Korrigera uppmätta värdena i provposition genom att systemet C enligt följande ekvation:
      Equation 5
    5. Integrera stress-deplacement kurvan mellan s0 och sslutet för att beräkna arbetet av separation.
      Equation 6
  4. Beräkning av mekaniska faktorer med matematiska databehandling programvara ursprung.
    1. Importera den inspelade .dat-filen från en enda vidhäftning mätning i en ursprung-tabell. Parametrarna som registreras är tid, provposition och kraft. Infoga dessa parametrar i kolumnerna A (tid), B (provposition) och C (kraft).
    2. För att avgöra det tomma värdet, i genomsnitt ca 20 mätvärden i kraft innan du kontaktar polymerfilm. Namnge denna genomsnittliga värdet Foffset och klistra in den i kolumn D.
    3. Beräkna den bakgrundskorrigering kraft F * enligt följande ekvation
      Equation 7
      och infoga denna ekvation, som visas nedan, i kolumn E.
      Equation 8
    4. Definiera starten av draghållfasthet regimen som noll deplacement, dvs, s0 = 0. Därför fastställa s0 och subtrahera det från förskjutningen i kolumn B och spara den i kolumn F:
      Equation 9
    5. Dessutom korrigera prov läge av maskinens överensstämmelse. Denna korrigering utförs i kolumn G. infoga följande ekvation i kolumn G
      Equation 10
    6. Beräkna spänningen i nästa kolumn H. Därför dela kraften av området substrat. Infoga följande ekvation
      Equation 11
      där A är ytan av glas substrat i mm2 (bestäms i 2.1).
    7. Beräkna arbetet av separation från stress och deplacement värdena. Därför, rita förskjutningen längs x-axeln och stress längs y-axeln. Integrera denna graf från s0 till sslutet där sslutet definieras som förskjutningen som DRAGSPÄNNING återgår till noll, dvs full avlossning ägde rum. För att integrera grafen, välja funktionen integrera. Tillsätt de beräknade värdena i kolumnerna I och J.

3. karakterisering av filmerna av Scanning Electron Microscopy (SEM) och optisk mikroskopi

  1. Optisk mikroskopi
    1. Med ett rakblad skärs polymera filmen i små bitar (ca 0,25 cm2) och bifoga dem till kanten av en glasskiva. Plats i glas bilden vertikalt orienterade under en upprätt Mikroskop och mäta tjockleken på film tvärsnitt.
      Obs: Använd ett 20 X-objektiv (NA = 0,45, teoretiska upplösningen 800 nm 1,1 µm) att mäta film tjocklek värden ca ≤ 20 µm. För en film tjocklek i intervallet 20 µm upp till 50 µm använda ett 10 X-objektiv (NA = 0,30, teoretiska upplösningen 800 nm 1,6 µm) och för en film tjocklek ≥ 50 µm använder en 5 X-objektiv (NA = 0,15, teoretiska upplösningen 800 nm 3.3 µm).
  2. SEM utredning
    1. Skär PET folien och bifoga ett prov på ca 2 cm2 till en glasskiva och placera det vertikalt till fastspänning mekanismen inuti det prov innehavaren ≤ 2 mm under den övre ytan av innehavaren.
    2. Välj en acceleration spänning av 10 kV, bakåtspritt elektron detektor (BSD) och vakuum svagt (60 Pa).
    3. Justera fokus, förstoring, ljusstyrka och kontrast i bilderna.
    4. Välja en bild förvärv tid av 28 s med en upplösning på 1024 x 2048 pixlar.
    5. Ta bort provhållaren från SEM.

4. biologiska utredning

  1. Rutinmässiga cell kultur av L929 celler
    1. Använda murina fibroblast cell linje L929 för utredning. Odla cellerna i Rosewell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 basala medium, kompletterad med 10% fetalt bovint serum och penicillin und streptomycin vid 37 ° C, 5% CO2 i T75 cell kultur kolvar. Passagen cellerna på en sammanflödet av ca 70% till 80%.
    2. För cell passaging, ta bort mediet genom aspiration och tvätta med kalcium- och magnesium gratis fosfatbuffert (DPBS- / -) för 30 s under ett laminärt flöde skåp. Därefter Inkubera cellerna med 2 mL av Accutase, ett enzym lösning med proteolytiska och collagenolytic aktivitet för upp till 5 min vid 37 ° C, 5% CO2.
    3. Verifiera avlossning av cellerna från cellytan kultur kolv med fas kontrast Mikroskop.
    4. Tillsätt 8 mL serum-innehållande medium i kolven och överföring cellsuspensionen till en 15 mL reaktionsröret.
    5. Ta en 10 µL prov från cellsuspensionen och blanda med 10 µL Trypan blå.
    6. Bestäm ett mobiltelefonnummer med en Neubauer kammare och beräkna det totala antalet celler.
      Varning: Trypan blå är giftiga, därför consulting SDB, efter de obligatoriska förfaranden som beskrivs i SDB, bära lämplig personlig säkerhetsskydd och hantering under en kemisk skåp krävs. Samla in avfall för kemiska avfall nedfall.
      Obs: Trypan blå positiva celler är färgad blå, vilket indikerar icke-intakt cellulära membran.
    7. För nästa passage, kultur 5 x 105 celler i en ny steril cell kultur kolv med 10 mL nytt medium. För experimentella förhållanden, kultur 3 x 105 celler i de 6 plattorna och 6 x 104 celler i varje brunn av 24 väl plattan, som innehåller polymera prover (protokoll steg 4.2).
  2. Beredning av sammansatta filmer för cell kultur experiment.
    1. Punktskatt enstaka bitar av filmar av önskade dimensioner tillverkas i protokollet steg 1.4 och 1.5 från PET stödjande skiktet med en skalpell och plats med pincett på ytan av glas täckglas uppvisar en diameter på 12 mm. Placera proverna i brunnarna av 2 4 tallrik väl.
    2. För bestämning av cytotoxicitet och cell räkna, ta inte filmerna från PET folien. Skära cirkulära områden ca 9,4 cm2, passande prydligt i enstaka brunnar 6 väl platta, från filmerna produceras i 1.4 och 1.5 och placera dem i brunnar i en cell kultur platta.
    3. Fördjupa polymerprover i avjoniserat H2O för ≥ 30 min.
      Obs: Polymera proverna kan steriliseras i autoklav. Därför bort alla polymer innehållande prover från den cell kultur rätter och placera dem inuti ett glas petriskål. Sterilisering utförs i en autoklav på 2.05 bar 20 minuter vid en temperatur på 121 ° C.
  3. Plasmabehandling av polymerer
    1. Placera de filmer som är kopplade på PET folie eller runda glas täckglas (tillverkad i 4.2.1) inuti reaktionskammaren enhetens plasma.
    2. Stäng locket och evakuera tills ett tryck på 1.6 x 10-2 mbar uppnås.
    3. Utföra plasmabehandling för 3 min.
    4. Ventilera reaktionskammaren och placera prover i antingen 24 väl eller 6 väl rätter för ytterligare cell kultur utredningar.
    5. Använd ett prov för vattenbestämning kontaktvinkel med en goniometer. Därför flytta sprutan nära polymera ytan, med hjälp av programpaketet och placera en droppe 3 µL vatten ovanpå ytan. Beräkna statisk vatten kontakt vinkel med programvaran goniometer.
  4. Färgning och mikroskopi
    1. Förbereda celler som beskrivs i steg 4.1.7 och kultur för 3 d vid 37 ° C och 5% CO2.
    2. Fånga fas kontrast bilder av celler odlade i tre dagar på orörda- och plasma behandlas filmer strax före fixering.
    3. Förbereda PBS kompletteras med 0,2% Triton-X-100. Långsamt Pipettera 200 µL stamlösning i 100 mL PBS (PBS-T).
    4. Bered en 4% PARAFORMALDEHYD/PBS (PFA/PBS-T).
      FÖRSIKTIGHET: PARAFORMALDEHYD är giftiga, därför consulting SDB, efter de obligatoriska förfaranden som beskrivs i SDB och bära lämplig personlig säkerhetsskydd och hantering under en kemisk skåp krävs.
    5. Bered en 5% BSA/PBS-T.
    6. Ta bort mediet genom aspiration under lamina flödet skåp. Lägga till PBS i brunnarna att ta bort medium rester.
    7. Överföra plattan till en kemisk skåp och ersätta PBS med 400 µL av PFA/PBS lösningen i 25 minuter i rumstemperatur.
    8. Ta bort PFA/PBS lösningen från enstaka brunnar, noggrant tvätta med PBS fyra gånger. Vänta 3 min. mellan varje tvätt steg och samla lösningarna för kemisk avfallshantering. Använda plattan direkt eller förvara den vid 4 ° C.
    9. Lägg till 5% bovint serumalbumin (BSA) / PBS-T till brunnarna och inkubera i 60 min på RT att blockera ospecifikt bindningsställen.
    10. Aspirera lösningen och ersätta den med en phalloidin konjugerat till Alexa-488 (1:160 spädning) / PBS-T lösning kompletteras med 0,2% Triton-X-100.
      FÖRSIKTIGHET: Phalloidin-488 är giftiga, därför consulting SDB, efter de obligatoriska förfaranden som beskrivs i SDB och bära lämplig personlig säkerhetsskydd och hantering under en kemisk skåp krävs.
    11. Täcka plattan med aluminiumfolie och inkubera det i 3 h på RT eller över natten vid 4 ° C.
    12. Aspirera lösningen och tvätta tre gånger med PBS. Vänta 3 min. mellan varje tvätt steg. Samla lösningarna för kemisk avfallshantering.
    13. Bered en lösning av 1 µL Hoechst Dye 33342 (stamlösning 1 mg/mL). För en 1: 1000 utspädning pipett 1 µL av Hoechst färga 3334 till 1 mL PBS-T och blanda väl. Tillsätt 300 µL dye Hoechst 33342 lösningen i brunnarna och inkubera i 10 min vid RT i mörkret.
      FÖRSIKTIGHET: Hoechst Dye 33342 DNA intercalating reagens och därför potentiellt mutagena, därför konsulttjänster SDB, efter de obligatoriska förfarandena beskrivs i MSDS och bära lämplig personlig säkerhetsskydd och hantering en kemiska skåp krävs.
    14. Aspirera lösningen och tvätta av prov fyra gånger med PBS. Vänta 3 min mellan varje tvätt steg. Samla lösningen för kemisk avfallshantering.
    15. För att bädda in, försiktigt bort filmerna från kultur ytan och placera dem på ett objektglas av glas. Tillsätt 20 till 40 µL vatten lösliga inbäddning medium i filmen och bifoga ett nytt cirkulär glas täckglas på toppen med lätt tryck.
    16. Utföra imaging med fluorescens Mikroskop. Filter för belysning: Alexa-488 har en magnetisering maximal på 496 nm och maximalt utsläpp sker vid 519 nm. Därför är utsläpp färgen grön. Hoechst 33342 dye trihydrochlorid trihydrat komplexförening med DNA har en magnetisering maximum vid 355 nm och maximal DNA complex utsläpp sker vid 465 nm.
  5. Cytotoxicitet beslutsamhet och bestämning av antalet celler
    1. Utför experimentet med celler odlade i 6 plattor bereddes i steg 4,3 och celler som bereddes i steg 4.1.7. Odla cellerna i 3 dagar vid 37 ° C och 5% CO2. För den positiva kontrollen, Använd celler som odlades på en cell kultur behandlas polystyren yta, som innehåller polymera filmer. För bakgrunden bestämning (negativa tillstånd), erhålla medel från en brunn utan celler.
      Obs: Medium kan också tas från väl innehållande celler odlade på cellytan kultur behandlas polystyren.
    2. Beroende på antalet experimentprover etikett 15 mL rör.
    3. Tillsätt 40 µL en 0,9% Triton x-100 innehållande PBS lösning i den positiva kontrollen och blanda kraftigt med 1000 µL spets. Vänta ca 3 min.
    4. Utan att ta bort de celler som bifogas ytan, aspirera på medellång från alla prover, inklusive prover som förberett i 4.5.3 och överför mediet till 15 mL tuberna. Tillsätt 3 mL DPBS- / - de enda brunnarna och förvara plattorna under den laminärt flöden skåp för bestämning av ett mobiltelefonnummer som beskrivs i 4.5.9.
    5. Centrifugera 200 x g i 3 minuter och avlägsna 1 mL av supernatanten för LDH aktivitet bestämning. Lagra 15 mL rören som innehåller celler och återstående medel under den laminärt flöden skåp.
    6. För analysen används en svart 96 plattor med platt botten. Tillsätt 50 µL CytoTox-ett reagens i 50 µL prov medium och blanda väl i 30 s.
    7. Täcka plattan med aluminiumfolie och förvara i 10 min på RT.
    8. Tillsätt 25 µL av stopplösningen till varje brunn och registrera fluorescensintensiteten med en Plattläsare med fluorescens. Skaka plattan för 10 s och upptäcka fluorescens signalen med en magnetisering våglängd av 520 nm och emissionsvåglängden 560 nm. Undvika luftbubblor.
    9. För bestämning av den cell nummer aspirera på DPBS- / - från brunnarna av kultur plattan från protokollet steg 4.5.4 och Lägg till lösningarna 15 mL reaktionsrören som innehåller supernatanterna samlas i steg protokollnummer 4.5.5.
    10. Centrifugera 15 mL reaktionsröret vid 200 x g i 3 min och sug ut supernatant. Tillsätt 0,5 mL av Trypsin/EDTA och inkubera i 10 minuter vid 37 ° C.
    11. Tillsätt 2 mL av Trypsin/EDTA på till brunnarna av plattan och inkubera i ca 10 min vid 37 ° C att lossa cellerna från polymera filmerna.
    12. Cellsuspensionen överförs till 15 mL reaktionsröret från stegnumret 4.6.10 Hämta. Dessutom tvätta plattorna kraftigt med serum som innehåller medium.
    13. Centrifugera proverna vid 200 x g i 3 min, Aspirera supernatanten och lägga serum som innehåller medium till röret.
    14. Fastställa ett mobiltelefonnummer som beskrivs i steg 4.1.5 och 4.1.6.

Representative Results

I de första experimenten, har PDMS filmer med varierande tjocklek och konstant blandningsförhållande av 10:1 tillverkats på PET-film (figur 1). Eftersom tjockleken på uppbackning lagret kan kraftigt påverka manufactured styvheten och hantering egenskaperna för hela sammansatta filmer, i de inledande experiment som enda filmer mellan 13 ± 2 µm och 296 ± 13 µm var (figur 1). Det är väl känt, att under härdning processen krympning av Polymerplaster uppstår. I de tunnaste filmerna observerat vi en skillnad på 78% ± 3,1% mellan våt och botade villkor. För de tjockaste filmerna upptäckt krympning av 40,9% ± 2.6% har (figur 1).

För de program som presenteras i detta protokoll, behöver filmer avlägsnas manuellt från PET folien. Vi erkänt att särskilt tunna filmer är svårt att hantera med pincett och förstörs ofta under denna process. Därför, vi undersökte påverkan av en tunna poly (vinylalkohol) beläggning som ett stödjande lager. PVA besitter en hög styvhet och lätt kan tas bort på grund av dess vattenlöslighet i efterföljande program. Tillämpad PVA beläggningen har en tjocklek av ca 17 µm och därför PDMS filmer belagda ovanpå detta lager är lite tunnare jämfört med filmer utan PVA beläggning (inga data anges). Särskilt fokus på hanteringsegenskaper, vi dra slutsatsen, att endast den tunnaste filmen kräver en stödjande PVA-film för borttagning från PET folien.

En effektiv filmtjocklek ca 40 µm valdes för alla ytterligare experiment. För tillverkning av sammansatta filmer, var blandande förhållandet av PDMS varierade mellan 10:1 till 45:1 och 70:1 och appliceras ovanpå tidigare polymeriserat PDMS filmen med läkare bladet teknik (figur 2A). Med undantag för det 10:1-förhållandet, skulle de olika filmerna kunna tydligt skiljas med hjälp av optisk mikroskopi med lämpliga precision. För Mikroskopisk analys var filmerna skära med en skalpell och kopplat till kanten av en glasskiva. De högre blandning nyckeltal av det översta lagret verkade visuellt ljusare på mikroskopiska bilder jämfört med förhållandet 10:1 av lagrets stöd (figur 2B). Dessutom, användes svepelektronmikroskopi till bild prover vid förstoring ca 860 X (figur 2 c). En tydligt observerbara skillnad i ljusstyrka mellan de två PDMS-filmerna, tillverkas i högre blandning nyckeltal erkändes, i motsats till förhållandet 10:1. Förfarandet för styckning lämnar märken, synlig i SEM bilder (figur 2B). Baserat på dessa resultat, var den genomsnittliga totala tjockleken av sammansatta filmerna 112 µm ± 5,0 µm (figur 2D).

I ytterligare experiment har vidhäftning egenskaperna av dessa filmer bestämts med Normalkraft vidhäftning mätningar med två olika glas substrat (figur 3). 'Smidig substratet' äger en ytstruktur med en aritmetiska medelvärdet strävhet Ren 0,013 ± 0,0002 µm och en genomsnittlig topp-till-dal-Rz 0,12 ± 0,004 µm (figur 3A). Substratet 2 (GS2, betecknas som grov) ställde ut ojämnheter 0.338 ± 0,021 (Ren) µm och 2.055 ± 0,017 µm (Rz) värden (figur 3B). Med medelvärde har radie som erhållits i 2.1.4 yta 'jämn' substratet var 3,2 mm2 medan för 'grov' substratet en yta av 6.07 mm2 beräknats.

Med dessa två substrat, har självhäftande beteendet hos de olika filmerna fastställts. Två parametrar är valt att beskriva de vidhäftande egenskaperna av filmerna: den pull-off stress σmax och separation Wseparbete. Under hela processen för limning och de limning av provposition registreras s och normalastyrkan F. Resultaten är representerade i en stress-deplacement kurva (figur 4).

För en korrekt tolkning av experimentella resultat är det viktigt att korrekt anpassa substratet till polymera film ytan. Också, måste maskinen kompatibiliteten för mätning enheten att vara ansett för att korrigera förskjutningen. Under mätningen agerar tillämpad kraft inte enbart på prov, men också på andra delar av provanordningen. Därför, var och en av de två substratesna trycks mot en glasskiva med en tryckkraft stress 13 ± 5 kPa. För att mäta överensstämmelse, beaktas belastningskurvan, dvs. del av kurvan kraft-deplacement där två ytor kommer i kontakt upp till provet positionen där den exakta förspänning kraften uppnås. Ömsesidiga lutningen på kurvan motsvarar maskinens överensstämmelse C. Det beräknade värdet för C är 0.12 µm/mN.

I det första experimentet filmer med olika blandning nyckeltal av PDMS analyserades (figur 5). För sammansatta filmerna hölls tjockleken och mixningsförhållandet av lagrets uppbackning, tillverkade av PDMS 10:1 konstant. Tjockleken på det översta lagret var också hållas konstant med ett värde av 65 µm. Den högsta pull-off stressen 109 ± 27,6 kPa bestämdes med släta glassubstrat på PDMS 10:1 film (figur 5A). En ökning med mixningsförhållandet leder till en minskning av pull-off stress till 76,7 ± 17 kPa för 45:1 blandningsförhållande och 41,4 ± 17 kPa för den 70:1. Med grov glas substrat en pull-off stress 22 ± fastställdes 2,2 kPa på PDMS 10:1 film. I allmänhet arbetet av separation var jämförbara mellan båda glas substrat, t.ex., 1,4 ± 0,6 J/m2 på den tunnaste filmen erhålls med smidig substrat och 1,84 ± 0,7 J/m2 på den tunnaste filmen erhålls med grov substratet ( Figur 5B).

Nästa, produktion av tunna filmer för hud tillämpningar och för cellodling applikationer har utforskat (figur 6). SSA 50: 50 har använts för översta lagret tillverkning av sammansatta filmerna. PDMS i en 1:10 blandningsförhållande med en tjocklek av ca 40 µm har använts som ett stöd lager. I motsats till de tidigare experiment som avbildas i figur 5, tjockleken på det översta lagret varierades, medan mixningsförhållandet hölls konstant (figur 6A). SSA har valts på grund av dess vidhäftningsegenskaper i applikationer med anknytning till ytor med hög ytjämnhet, särskilt mänsklig hud, använder tillverkarna rekommendation av blandande baserat 50: 505,8. Mänskliga epidermis besitter en hög ytjämnhet. Beroende på ålder och anatomiska rapporterade region en genomsnittlig ytjämnhet djup (RZ) mellan 48 µm och 71 µm har varit29. Särdragen för den känsliga huden av nyfödda eller knappast säkert och skonsamt huden vidhäftning är viktigt, och regenererande hud för äldre. Olika våta tjocklekar alltifrån 40 µm, 120 µm, 300 µm till 500 µm tillämpades (figur 6A). Sammansatta filmerna totala tjocklek varierar beroende på den våta tjockleken, mellan 51 µm och 344 µm (figur 6B). Efter härdning, sammansatt har kopplats till baksidan av en volontär hand (figur 6 c). De olika filmer tjocklekar visar tydligt skillnaderna i deras anpassning egenskaper till ojämnheter på huden (figur 6 c). Tunna filmer (50 µm och total tjocklek av 100 µm) visar en hög grad av anpassning till hud rynkor jämfört med tjockare filmerna (220 µm och 340 µm totala tjocklek). Dessa resultat indikerar att sammansatta filmer med ett brett utbud av tjocklekar kan produceras med just tillämpad läkare blade tekniken.

Vidhäftning experimenten utfördes med dessa sammansatta filmer (figur 7). Beroende på tjockleken av SSA översta filmen, har vi observerat en minskning av pull-off stress med ökad skikttjocklek. Den högsta pull-off kraften 133 ± 36,6 kPa mättes på slät substratet (figur 7A). Den lägsta pull-off-stressen 18 ± 4 kPa erhölls med grov substratet på tjockaste filmen. En jämförelse mellan båda substrat visar intressant 2,7 gånger skillnad på tunnaste filmer (figur 7A). Med ökande filmtjocklek, särskilt på de tjockaste filmerna var ingen anmärkningsvärd skillnad observerbara (figur 7A). Med smidig substratet ett arbete av separation av 1,8 ± 0,8 J/m2 upptäcktes på filmen uppvisar en sammanlagd tjocklek av ca 100 µm, följt av en film tjocklek beroende minskning (220 µm tjocklek: 1,6 ± 0,6 J/m2 och 330 µm: 1,3 ± 0.4 J/m2 (Figur 7B)). Arbetet i separation mätt med de grova substratesna var i allmänhet något lägre jämfört med smidig substratet (100 µm tjocklek: 1,63 ± 0,6 J/m2; 220 µm tjocklek: 1,1 ± 0,6 J/m2 och 330 µm: 1,0 ± 0,2 J/m2 (figur 7B )).

Dessutom spelades avlossning mekanismen under mätningarna (figur 7 c). Lilla kavitation observerades på den tunnaste filmen, medan utseendet på finger som sprickor var observable på tjockare filmerna (figur 7 c).

Mätningar har utförts inom en månad efter tillverkning av filmerna. Dock påverkas stabilitet och bevarandet av de mekaniska egenskaperna av elastisk filmerna av miljöfaktorer, inklusive temperatur och luftfuktighet. Enligt protokollet steg 1.4.3, har filmerna förvarats i rumstemperatur och en luftfuktighet på 40-65%. För att förhindra har dem från föroreningar och damm, filmerna lagrats i petriskålar av plast i mörkret. För att undersöka den långsiktiga stabilitet, vidhäftning mätningar och tjocklek bestämning av SSA har 50: 50 filmer utförts ca fyra månader efter tillverkning. Ingen större påverkan på filmtjocklek, pull-off stress och arbete av separation har upptäckts efter lagring. Till exempel var pull-off stress av SSA sammansatta filmerna tillverkas med en våt tjocklek 120 µm SSA och en våt tjocklek av 100 µm PDMS 46,6 ± 6 kPa och arbetet med separation 1627 ± 592 mJ/m2 efter tillverkning. Ca fyra månader efter tillverkning, fastställdes en pull-off stress 48,8 ± 5.4 kPa och ett verk av separation av 1666 ± 723 mJ/m2 . I tillägg, kort efter tillverkning, totala tjocklek av dessa filmer var 103,3 ± 13,9 µm och efter lagring 98,1 ± 9,1 µm.

I ytterligare experiment PDMS 10:1 och SSA 50: 50 sammansatta filmer med en sammanlagd tjocklek av ca 105 µm har använts som cell kultur substrat (figur 8). Sammansatta filmer tillverkas i Protokollnummer steg 1 kan enkelt avlägsnas från PET folien och skär i mått och geometriska former. Dessutom när följer filmerna till en styv yta, till exempel glas, flera filmer som visar olika Youngs moduli kan fästas sida vid sida och kan placeras inuti en enda brunn cell kultur platta. Filmer kan kopplas till polystyren ytan direkt utan en extra täckglas. Filmerna kan också anpassas till olika ytor och geometriska struktur, som rör eller ringar, möjliggör ytterligare studier inte kan uppnås med konventionella cell kultur material. I de utförda experiment som avbildas i figur 8 sammansatta filmer på PET folie har placerats direkt i cell kultur plattor eller filmer har avlägsnats från PET folien och placeras på glas täckglas. För de experimentella förhållandena, har vissa polymerer behandlats med luft plasma att öka deras gratis ytenergi. I allmänhet PDMS äger en vatten kontakt vinkel av ca 115° före plasmabehandling och blir mycket hydrofila (vatten kontaktvinkel < 30°) efterbehandling8. Plasmabehandling återger ytan biokompatibelt och underlättar fastsättning av eukaryota celler. Beroende på behandlingstid och intensitet ändras polymer ytan, visar en högre grad av ojämnhet och också spricka kan visas. Omedelbart efter behandlingen observeras en hydrofoba återhämtningsprocessen. Som beskrivs under protokollet steg 4.3.5 var en goniometer används för att bestämma de statiska vatten kontakta vinklarna. Därför analyserades därefter polymerer som har placerats i ddH2O för 1 h efter luft plasmabehandling. Plasmabehandling minskat vatten kontakt vinkel betydligt (PDMS orörda: 117,0 ± 2,2 °; SSA orörda: 127,9 ± 5,6 °; PDMS plasma: 18,0 ± 7,2 °; SSA plasma: 29,3 ± 11,5 °).

För prov inbäddning en vattenlösning montering har medium tillämpats. Om vid någon tidpunkt måste proverna tas bort igen, kan exemplaren placeras i ett vatten som innehåller petriskål över natten. Så småningom, kan täckglas tas bort för ytterligare analys.

Den bifogade och morfologi av L929 celler seedade i 3 dagar på PDMS och SSA 50: 50 sammansatta filmer har bestämts av fas kontrast mikroskopi och efter färgning med fluorescens konjugerat phalloidin-488 och färgämne Hoechst 33342 (figur 8). Bild förvärv med fas kontrast mikroskopi rekommenderas, särskilt för polymerer som inte behandlas med plasma. På grund av den svaga cellulära vidhäftningen till dessa polymera ytor är enstaka celler eller aggregat enkelt fristående, komplicerande korrekt tolkning av efterföljande analysmetoder.

Celler som dirigeras till de orörda polymererna visas dålig fastsättning och cellular sprida beteende (figur 8A1 och C1) medan en konfluenta enskiktslager observerades för celler odlade på plasma behandlade ytor (figur 8B1 och D1) . Bildandet av cellulära aggregat och lossnar från ytan var mer uttalad på orörda ytor. Visualisering av aktin filament efter fixering med 4% PARAFORMALDEHYD avslöjade några celler migrerar in i peripheryen av cellulära aggregaten och emanation av lamellipodia utbuktningar på orörda PDMS och SSA 50: 50 sammansatta filmer (figur 8A2 och C2, pilar). Inga stora kvalitativa skillnader kunde observeras samtidigt jämföra båda polymera material. Som en sidoanteckning, det visar sig att en mindre mängd cellulära aggregat var närvarande på SSA 50: 50 jämfört med PDMS. Aggregaten bifogas ytorna på SSA 50: 50 medverkade också, mer tillplattad (figur 8 c 1). Som förväntat, förbättrade behandling med air plasma cellulära fastsättning och spridning på båda ytorna betydligt, vilket leder till bildandet av anmärkningsvärda lamellipodia utbuktningar och en konfluenta enskiktslager (figur 8B2 och 8 d 2).

Release av LDH efter 3 dagar av kultur var används som en indikator för att bestämma cytotoxiska effekter (figur 9A). I allmänhet, LDH nivåer var jämförbara för celler odlade på både polymera material, med mindre än 5% cytotoxicitet (orörda PDMS: 2,8 ± 2,0%, orörda SSA 50: 50: 4,5 ± 3,6%; plasma behandlas PDMS: 3,4 ± 1,5%; plasma behandlas SSA 50: 50: 3,4 ± 1,6%). Dessa resultat är jämförbara med uppgifterna i vår tidigare publicerade studie med fokus på utredning av båda elastomerer. 8 ytterligare validera resultaten av LDH analysen, en trypan blå utslagning testet utfördes. Dessutom hela cellen befolkningen var fast besluten att Visa skillnader i spridning aktivitet (bild 9B). I allmänhet mindre än 5% Trypan blå positiva celler räknades (orörda PDMS: 2,4 ± 0,3%; orörda SSA 50: 50: 3,8 ± 2,5%; plasma behandlas PDMS: 0,74 ± 1,3% plasma behandlas SSA 50: 50: 0,95 ± 1,6%).

Figure 1
Figur 1: förberedelse av PDMS filmer på poly-(vinyl alcohol) (PVA) belagd PET folie: Processen för att tillverka PDMS filmer av varierande tjocklek på en PET folie tillämpades för att fastställa reproducerbarhet och hantering prestanda (A). Tjockleken av PDMS filmerna analyserades med optisk mikroskopi efter härdning vid 95 ° C (B). N = 3 självständigt tillverkas filmerna analyserades. Från varje film, tre olika platser valdes, klippa och 3 positioner på varje prov analyserades (k = 27). Felstaplar representera standardavvikelse. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: förberedelse av sammansatta filmar av PDMS tillagas i olika blandning nyckeltal: Sammansatta filmer uppvisar olika blandning nyckeltal av basen (komponent A) till crosslinker (komponent B) av PDMS tillverkades av läkare bladet teknik. Det översta lagret består av PDMS i förhållandet 10:1: a: (komponent b), tillämpades 45:1 och 70:1 ovanpå en tidigare härdade PDMS 10:1 film (A). Efter efterföljande härdning vid 95 ° C analyserades tjocklek av sammansatta filmerna av optisk mikroskopi (B) och scanning electron microscopy (C). N = 3 oberoende experiment var utförs och analyseras med optisk mikroskopi (D). Bildar varje oberoende tillverkade film, tre olika platser valdes, klippa och 3 positioner på varje prov analyserades (k = 27). Felstaplar representera standardavvikelse. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: bestämning av topografiska ytjämnhet av de två substrat som används för vidhäftning mätningar: Två glas substrat som har olika ytjämnhet präglades. Tre dimensionell profilometric analys av ytan utfördes på 'jämn' substrat GS (A1) och 'grov' substratet GR (B1). Motsvarande rad kurvor skildras i A2 och B2). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: principen om de normala vidhäftning mått: En anpassade bygga setup användes för att karakterisera de vidhäftande egenskaperna polymer prover. Inställningen för mätning är avbildad i (A) och information visas i (B). För mätning analysen, var stress utifrån ett stress-tid-kurvan (C). Arbete av separation bestämdes genom en integration av den stress-deplacement kurvan mellan sslutet och s0 (D). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: bestämning av vidhäftningsegenskaper av sammansatta filmer med olika blandning nyckeltal av PDMS: Pull-off stress (A) och arbete av separation (B) av de sammansatta filmer som tillverkas av PDMS i blandande förhållandet 10:1, 45:1 och 70:1 mättes. För analysen, en 'jämn' glas substrat (GS) uppvisar en Ra = 0,013 µm och en 'grov' glassubstrat (GR) med Ren = 0.338 µm användes. N = 3 självständigt tillverkas filmerna analyserades. Från varje film, två stycken valdes och tre olika positioner på varje prov analyserades (k = 18). Felstaplar representera standardavvikelse. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6: beredning av sammansatta filmar av SSA med varierande tjocklek: SSA 50: 50 tillämpades ovanpå en tidigare härdade PDMS 10:1 film (A). Olika våta tjocklekar av detta skikt alltifrån 40 till 500 µm tillämpades och tjockleken efter härdning undersökas med optisk mikroskopi (B). Fastsättning av filmerna på baksidan av en frivilliga hand visas att filmer med en sammanlagd tjocklek av ca 100 µm (film #2) överensstämde väl till ojämnheter på huden (C). Tjockleken på de inre skikten och totala tjocklek av sammansatta filmerna visas i figur 6B. För analys n = 3 självständigt tillverkade prover mättes med optisk mikroskopi. Från varje film, tre olika platser valdes, klippa och 3 positioner på varje prov analyserades (k = 27). Felstaplar representera standardavvikelse. Skalstapeln i 6C skildrar ca 1 cm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 7
Figur 7: bestämning av vidhäftningsegenskaper av sammansatta filmar av mjuk hud limmet: Sammansatta tunnfilmer SSA som översta lagret och PDMS 10:1 som stöd lager var manufactured. Tjockleken på det översta lagret var varierade mellan 50 och 330 µm. Pull-off stress (A) och arbete av separation (B) av de sammansatta filmer mäts med två olika glas substrat analyserades ('jämn' glassubstrat (GS) uppvisar en Ren = 0,013 µm och en 'grov' glassubstrat (GR) med Ren = 0.338 µm). Exemplarisk bilder av avlossning mekanismerna visualiseras i C. För data analys n = 3 självständigt tillverkade experiment analyserades. Från varje film, två stycken valdes och tre olika positioner på varje prov analyserades (k = 18). Felstaplar representera standardavvikelse. Skala barer i 7C skildra 0,5 mm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 8
Figur 8: cellulär morfologi av L929 fibroblaster odlade på tunna filmer: L929 murina fibroblaster odlades i 3 dagar på de tunna filmer som tillverkats av PDMS (A1, A2, B1, B2) eller SSA (C1, C2, D1, D2). Att öka hydrophilicitet ytor luftbehandling plasma var utfört (B1, B2, D1, D2). Skala barer i D1 och D2 skildra 100 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 9
Figur 9: bestämning av cytotoxicitet och cellulär proliferation: För bestämning av cytotoxiska effekter och cellulär proliferation seedade L929 celler för tre dagar på PDMS 10:1 och SSA 50: 50 sammansatta filmer. Release av laktatdehydrogenas (LDH) bestämdes genom en LDH aktivitet haltbestämning och avslöjade mindre än 5% cytotoxicitet (A). Totala mobilnummer efter perioden odling bedömdes efter manuell räknar de enstaka cellerna med en Neubauer kammare (B). N = 3 självständigt utförde experiment analyserades. Felstaplar representera standardavvikelse. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Konstruktion av sammansatta strukturer möjliggör enkel justering av materialegenskaper, såsom Youngs modul eller tjockleken på proverna. De Youngs modulus av PDMS kan ändras effektivt i ett brett spektrum av antingen ändra mixningsförhållandet mellan de två komponenterna eller framställning av blandningar som använder en annan silikon elastomer30,31. Metoderna som beskrivs är inte begränsade till PDMS används i den nuvarande undersökningen, men speciellt självhäftande prestanda beror starkt på den specifika typ som används. Ett avgörande steg i detta protokoll är processen för tillverkning av sammansatta filmerna (figur 1). Det visades att tjockleken på filmerna avsevärt påverkar beteendet vidhäftning av filmerna på olika substrat, inklusive hud (figur 5 och figur 6). Förutom filmtjockleken påverkar tid och temperatur under härdningsprocessen de materialegenskaper32. Därför har parametrar som tjockleken på polymera lagren noga anpassas och verifierade.

Analysen av de vidhäftande egenskaperna av tunna filmer utfördes med Normalkraft vidhäftning mätningar med två glas substrat med olika ytjämnhet upp till Ra = 0.338 µm (figur 3). I allmänhet påverkar råhet avsevärt adhesionen av ytor, särskilt av elastiska material33,34. Ojämnheter på glas kan enkelt varieras genom slipning med sandpapper av olika ojämnhetstopparnas storlekar, därför möjliggör tillverkning av substrat som uppvisar högre strävhet värden21. I tillägg, andra material, kan till exempel epoxi användas för produktion av substrat15,35. Detta kan vara en viktig ändring strategi av protokollet presenteras. Till exempel om substrat uppvisar olika fria ytenergier behövs eller specifika krävs kretsmönster. Här, analyserades pull-off stress och arbete av separation av de tunna filmer som tillverkas av PDMS och SSA med en specialbyggd setup (makroskopisk vidhäftning hastighetsmätning enhet (MAD, figur 4)). 36 optisk anpassning av substrat och indenter är ett kritiskt steg för analys av mätresultaten. Justering av lutningsvinkel måste därför utföras med goniometer, så exakt som möjligt. Detta kan uppnås med tillräcklig precision genom att manuellt föra substratet i kontakt med film ytan tills en horisontell kontakt uppnås.

I det nuvarande protokollet hölls håll tiden konstant på en sekund (figur 5 och figur 7). Särskilt för undersökningen av en elastisk film till en yta med grov substrat självhäftande prestanda ger en förlängning av hold ytterligare information. Exempelvis har en pull-off stress med ökande spärrtiden ökat rapporterade8. Förutom de mätningar som utförs i det nuvarande protokollet, andra metoder, till exempel peel tester kan utföras, så att en mer omfattande utredning av vidhäftning prestanda37.

De vidhäftande egenskaperna av sammansatta filmer uppvisar olika film tjocklekar av mjuk hud limmet bestämdes (figur 7). Våra resultat är i linje med publicerade data, som visar att en minskning av film tjocklek leder till en ökning av pull-off stress som förlossningen, dvs, förhållandet mellan substrat diameter och film tjocklek, ökar38,39 . Baserat på dessa resultat och de uppgifter som avbildas i figur 7kan konstatera vi att sammansatta filmer med en sammanlagd tjocklek av ca 100 µm (en tjocklek av SSA lagret av ca 60 µm tillämpas på en PDMS-film med en tjocklek av ca 40 µm) uppvisar god vidhäftning p egenskaper på ojämna ytor.

Nästa, experiment relaterade till biologiska karakterisering har utförts på orörda sammansatta filmer och plasma behandlas sammansatta filmer (figur 8). Plasmabehandling av silikon elastomerer är en ofta tillämpas, mångsidig teknik att öka hydrofila egenskaper hos ytor och främja cellulära fastsättning och cellulära sprida40,41. Silikoner är väl kända för sin låg toxicitet och hög biostability men kan innehålla restmonomerer eller katalysatorer som kan påverka fysiologiska processer, leder också till cytotoxicitet42,43. I den genomförda experiment har vi observerat mindre än 5% cytotoxicitet med LDH release som en indikator och en Trypan blå utslagning assay. I protokollet presenteras, hela cellulära befolkningen, inklusive mobilt aggregat fristående form ytan har analyserats för spridning analys (bild 9B). En ändring av protokollet kunde producera mer differentierade resultat. För varje prov, kunde supernatanten innehållande fristående cellulära aggregat överföras till en separat reaktionsröret och inte kombineras med cellerna enzymatiskt avlägsnas från polymer ytan. Detta skulle tillåta den exakta bedömningen av celler som är kopplade till ytan och så småningom avslöja en närmare bestämning av påverkan av polymerer på cellulär adhesion processen. Utöver immunocytochemical metoder presenteras här, kan celler skördas för utredning med immunoblot metoder, som tillåter en detaljerad kvantitativ bedömning av proteinuttryck.

Sammanfattningsvis har vi etablerat tillverkning villkor för framställning av tunna elastomeriska sammansatta filmer för applikationer inom avancerad cell kulturforskning. Dessa tunna filmer äger dessutom hög anpassningsförmåga till hudens ojämnheter, möjliggör sofistikerad design av huden lim.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Martin Danner är erkänt för sin hjälp med att förbereda prover och fastställande av cell kultur förfaranden. Författarna vill tacka Biesterfeld Spezialchemie GmbH (Hamburg, Tyskland), särskilt Robert Radsziwill för kontinuerligt stöd och diskussioner. Den forskning som leder till dessa resultat har fått finansiering från Europeiska forskningsrådet under EU: s sjunde ramprogram (FP/2007-2013) ERC bidragsavtalet n. 340929.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Propanol, 97% Stockmeier Chemie 1000452610000 Isopropanol
Abrasive diamnod hand pad Bohle MO 5007522 Grit: 220
Accutase Capricorn Scientific ACC-1B
Albumin Fraktion V Roth 0163.2 BSA
Alexa Fluor 488 Phalloidin ThermoFischer Scientific A12379 highly toxic
Aquamount Polysciences 18606-20 water soluble mounting medium
CytoTox-ONE Homogeneous Membrane Integrity Assay Promega G7890
DPBS, without Ca2+, Mg2+ ThermoFischer Scientific 14190094
Fetal bovine serum gold GE Health Care Life Science A15-151 FBS
Goniometer OCA35 Dataphysics for the determination of the static water contact angle
Hoechst Dye 33342 Sigma-Aldrich B1155-100MG bisBenzimide H 33342 trihydrochloride, highly toxic
Microscope Axiovert 25 Zeiss Microscope used for cell culture documentation
Microscope Eclipse LV100ND Nikon Microscope used for film thickness determination
Paraformaldehyde, aqueous solution 16% Electron Microscopy Sciences RT 15710 electron microscopy grade
penicillin und streptomycin solution Sigma-Aldrich P4333-100ML
Phenom XL Scanning Electron Microscope (SEM) Phenom
Poly-(vinyl alcohol) 4-88, MW 31000 Sigma-Aldrich 81381-1KG Mowiol 4-88
Poly-dimethyl siloxanes, Sylgard 184 Dow Corning (400)000108351397 PDMS
RPMI 1640 basal medium ThermoFischer Scientific 21875034
soft skin adhesive (SSA) Dow Corning (400)000108251792 MG 7-9800 Soft Skin Adhesive (SSA)
speed mixer DAC 600.2 VAC-P Hauschild
stylus profilomter Zeiss Model: SURFCOM 1500SD3
Tecan Infinite M200 pro Tecan fluorescence plate reader
Triton X 100 Calbiochem 648466
Trypan Blue solution Sigma-Aldrich T8154-100ML highly toxic
Trypsin/EDTA solution PAN-Biotech P10-023500 0.05% Trypsin, 0.02% EDTA in PBS
UV glue Bohle BO MV76002 medium viscosity

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lloyd, A. W., Faragher, R. G. A., Denyer, S. P. Ocular biomaterials and implants. Biomaterials. 22, 769-785 (2001).
  2. Zhang, M., Wu, J., Wang, L., Xiao, K., Wen, W. A simple method for fabricating multi-layer PDMS structures for 3D microfluidic chips. Lab Chip. 10, 1199-1203 (2010).
  3. Kwak, M. K., Jeong, H. E., Suh, K. Y. Rational design and enhanced biocompatibility of a dry adhesive medical skin patch. Adv. Mater. 23, 3949-3953 (2011).
  4. Gun Park, D., Chul Shin, S., Won Kang, S., Tae Kim, Y. Development of flexible self adhesive patch for professional heat stress monitoring service. Conf. Proc. IEEE Eng. Med. Biol. Soc. 4, 3789-3792 (2005).
  5. Thomas, X. Silicone Adhesives in Healthcare Applications. Dow corning Lit. , (2013).
  6. Fuard, D., Tzvetkova-Chevolleau, T., Decossas, S., Tracqui, P., Schiavone, P. Optimization of poly-di-methyl-siloxane (PDMS) substrates for studying cellular adhesion and motility. Microelectron. Eng. 85, 1289-1293 (2008).
  7. Wang, Z., Volinsky, A. A., Gallant, N. D. Crosslinking effect on polydimethylsiloxane elastic modulus measured by custom-built compression instrument. J. Appl. Polym. Sci. 131, 41050 (2014).
  8. Fischer, S. C. L., Kruttwig, K., Bandmann, V., Hensel, R., Arzt, E. Adhesion and cellular compatibility of silicone-based skin adhesives. Macromol. Mater. Eng. , 1-11 (2017).
  9. Martina, D., Creton, C., Damman, P., Jeusette, M., Lindner, A. Adhesion of soft viscoelastic adhesives on periodic rough surfaces. Soft Matter. 8, 5350-5357 (2012).
  10. Brown, X. Q., Ookawa, K., Wong, J. Y. Evaluation of polydimethylsiloxane scaffolds with physiologically-relevant elastic moduli: Interplay of substrate mechanics and surface chemistry effects on vascular smooth muscle cell response. Biomaterials. 26, 3123-3129 (2005).
  11. Song, F., Ren, D. Stiffness of cross-linked poly(dimethylsiloxane) affects bacterial adhesion and antibiotic susceptibility of attached cells. Langmuir. 30, 10354-10362 (2014).
  12. Buxboim, A., Rajagopal, K., Brown, A. E. X., Discher, D. E. How deeply cells feel: methods for thin gels. J. Phys. Condens. Matter. 22, 194116 (2010).
  13. Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. -L. Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate. Science. 310, 1139-1143 (2005).
  14. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix Elasticity Directs Stem Cell Lineage Specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
  15. Roth, J., et al. Surface functionalization of silicone rubber for permanent adhesion improvement. Langmuir. 24, 12603-12611 (2008).
  16. Thiébaud, P., Lauer, L., Knoll, W., Offenhäusser, A. PDMS device for patterned application of microfluids to neuronal cells arranged by microcontact printing. Biosens. Bioelectron. 17, 87-93 (2002).
  17. Tourovskaia, A., Figueroa-Masot, X., Folch, A. Differentiation-on-a-chip: a microfluidic platform for long-term cell culture studies. Lab Chip. 5, 14-19 (2005).
  18. Peterson, S. L., McDonald, A., Gourley, P. L., Sasaki, D. Y. Poly(dimethylsiloxane) thin films as biocompatible coatings for microfluidic devices: Cell culture and flow studies with glial cells. J. Biomed. Mater. Res. - Part A. 72, 10-18 (2005).
  19. Wan, Y., et al. Nanotextured substrates with immobilized aptamers for cancer cell isolation and cytology. Cancer. 118, 1145-1154 (2012).
  20. Ross, A. M., Jiang, Z., Bastmeyer, M., Lahann, J. Physical aspects of cell culture substrates: Topography, roughness, and elasticity. Small. 8, 336-355 (2012).
  21. Barreau, V., et al. Fibrillar Elastomeric Micropatterns Create Tunable Adhesion Even to Rough Surfaces. Adv. Funct. Mater. 26, 4687-4694 (2016).
  22. Briggs, G. A. D., Briscoe, B. J. The effect of surface topography on the adhesion of elastic solids. J. Phys. D. Appl. Phys. 10, 2453-2466 (1977).
  23. Dapp, W. B., Lücke, A., Persson, B. N. J., Müser, M. H. Self-affine elastic contacts: Percolation and leakage. Phys. Rev. Lett. 108, 1-4 (2012).
  24. Putignano, C., Carbone, G., Dini, D. Mechanics of rough contacts in elastic and viscoelastic thin layers. Int. J. Solids Struct. 69, 507-517 (2015).
  25. Laulicht, B., Langer, R., Karp, J. M. Quick-release medical tape. Proc. Natl. Acad. Sci. 109, 18803-18808 (2012).
  26. Kim, T., Park, J., Sohn, J., Cho, D., Jeon, S. Bioinspired, Highly Stretchable, and Conductive Dry Adhesives Based on 1D-2D Hybrid Carbon Nanocomposites for All-in-One ECG Electrodes. ACS Nano. 10, 4770-4778 (2016).
  27. Adamietz, I. A., et al. Effect of self-adhesive, silicone-coated polyamide net dressing on irradiated human skin. Radiat. Oncol. Investig. 2, 277-282 (1994).
  28. White, R. Evidence for atraumatic soft silicone wound dressing use. Wounds UK. 1, 104-109 (2005).
  29. Quan, M. B., Edwards, C., Marks, R. Non-invasive in vivo techniques to differentiate photodamage and ageing in human skin. Acta Derm. Venereol. 77, 416-419 (1997).
  30. Brown, X. Q., Ookawa, K., Wong, J. Y. Evaluation of polydimethylsiloxane scaffolds with physiologically-relevant elastic moduli: Interplay of substrate mechanics and surface chemistry effects on vascular smooth muscle cell response. Biomaterials. 26, 3123-3129 (2005).
  31. Palchesko, R. N., Zhang, L., Sun, Y., Feinberg, A. W. Development of Polydimethylsiloxane Substrates with Tunable Elastic Modulus to Study Cell Mechanobiology in Muscle and Nerve. PLoS One. 7, e51499 (2012).
  32. Johnston, I. D., McCluskey, D. K., Tan, C. K. L., Tracey, M. C. Mechanical characterization of bulk Sylgard 184 for microfluidics and microengineering. J. Micromechanics Microengineering. 24, 35017 (2014).
  33. Persson, B. N. J., Gorb, S. The effect of surface roughness on the adhesion of elastic plates with application to biological systems. J. Chem. Phys. 119, 11437 (2003).
  34. Peressadko, A. G., Hosoda, N., Persson, B. N. J. Influence of surface roughness on adhesion between elastic bodies. Phys. Rev. Lett. 95, 1-4 (2005).
  35. Purtov, J., et al. Measuring of the hardly measurable: adhesion properties of anti-adhesive surfaces. Appl Phys A. 111, 183-189 (2013).
  36. Kroner, E., Blau, J., Arzt, E. Note: An adhesion measurement setup for bioinspired fibrillar surfaces using flat probes. Rev. Sci. Instrum. 83, 16101 (2012).
  37. Sun, S., Li, M., Liu, A. A review on mechanical properties of pressure sensitive adhesives. Int. J. Adhes. Adhes. 41, 98-106 (2013).
  38. Webber, R. E., Shull, K. R., Roos, A., Creton, C. Effects of geometric confinement on the adhesive debonding of soft elastic solids. Phys. Rev. E. 68, 21805 (2003).
  39. Creton, C., Lakrout, H. Micromechanics of flat-probe adhesion tests of soft viscoelastic polymer films. J. Polym. Sci. Part B Polym. Phys. 38, 965-979 (2000).
  40. Tan, S. H., Nguyen, N. -T., Chua, Y. C., Kang, T. G. Oxygen plasma treatment for reducing hydrophobicity of a sealed polydimethylsiloxane microchannel. Biomicrofluidics. 4, 32204 (2010).
  41. Kim, B., Peterson, E. T. K., Papautsky, I. Long-term stability of plasma oxidized PDMS surfaces. Conf. Proc. IEEE Eng. Med. Biol. Soc. 7, 5013-5016 (2004).
  42. Briganti, E., et al. Silicone based polyurethane materials: A promising biocompatible elastomeric formulation for cardiovascular applications. J. Mater. Sci. Mater. Med. 17, 259-266 (2006).
  43. Regehr, K. J., et al. Biological implications of polydimethylsiloxane-based microfluidic cell culture. Lab Chip. 9, 2132 (2009).

Tags

Utvecklingsbiologi fråga 137 poly(di-methylsiloxane) tunn film komposit elastomerer hud lim vidhäftning cellkultur
Thin Film sammansatta silikon elastomerer för cellodling och hud applikationer: tillverkning och karakterisering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Boyadzhieva, S., Fischer, S. C. L.,… More

Boyadzhieva, S., Fischer, S. C. L., Lösch, S., Rutz, A., Arzt, E., Kruttwig, K. Thin Film Composite Silicon Elastomers for Cell Culture and Skin Applications: Manufacturing and Characterization. J. Vis. Exp. (137), e57573, doi:10.3791/57573 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter