Summary
Nous décrivons ici un protocole qui permet l’analyse histologique et moléculaire des échantillons de peau après injection intradermique de Candida albicans . Ce protocole permet la localisation des cellules immunitaires tissulaires-résident ou nouvellement recrutés, mais aussi la distribution de l’agent pathogène et maintient l’intégrité structurale de la peau.
Abstract
La peau est un organe extrêmement étendu du corps et, en raison de cette grande surface, elle est exposée en permanence aux micro-organismes. Lésions cutanées peuvent facilement conduire à des infections dans le derme, ce qui peut, à son tour, entraîner la dissémination d’agents pathogènes dans la circulation sanguine. Comprendre comment le système immunitaire combat les infections au stade très précoce et comment l’hôte permet d’éliminer les agents pathogènes est une étape importante pour définir la base pour de futures interventions thérapeutiques. Nous décrivons ici un modèle d’infection de Candida albicans qui permet de visualiser les processus qui se produisent au début lors d’une infection, y compris lorsque l’agent pathogène a passé la barrière épithéliale, ainsi que la réponse immunitaire provoquée par le de c. albicans invasion. Nous avons utilisé ce modèle d’infection d’effectuer des analyses histologiques qui montrent les cellules immunitaires qui infiltrent la peau ainsi que la présence et la localisation de l’agent pathogène. Les échantillons prélevés après que l’infection peut être traitée pour l’extraction de l’ARN.
Introduction
Le corps humain est recouvert d’un nombre extrêmement élevé de micro-organismes. La surface de la peau est l’habitat de presque 1 million de bactéries par centimètre carré1. Sur ce nombre, cependant, ne reflète pas la grande variété de micro-organismes qui colonise la peau. En plus des bactéries, le corps humain est colonisé par plusieurs espèces de champignons dont c. albicans, qui est capable de survivre à la muqueuse et la peau niveau2.
Ces dernières années, le pourcentage de personnes atteintes d’infections fongiques a énormément augmenté. Ceci est principalement dû au nombre plus élevé de personnes immunodéprimées, c'est-à-dire, chez les patients VIH-positifs et les patients qui sont passés par une chimiothérapie ou immunosuppresseurs après transplantation3. Dans une étude de surveillance réalisée aux États-Unis, Wisplinghoff et coll. ont montré que 9,5 % des infections nosocomiales circulation sanguine ont été causés par les espèces de Candida 4. En raison de la présence accrue d’infections fongiques et notamment en raison du pourcentage élevé des espèces de Candida trouvés au cours de septicémies, comprendre comment ce pathogène échappe au contrôle du système immunitaire est extrêmement important.
C. albicans est un champignon dimorphique qui se développe sous différentes formes morphologiques comme levure, blastospores, pseudohyphes et les hyphes selon les conditions environnementales5. Dans sa forme mycélienne, c. albicans montre sa plus grande capacité de pouvoir envahissant et a la capacité de pénétrer l' épithélium6.
C. albicans infections ont été étudiées à l’aide de plusieurs approches expérimentales. Le modèle le plus courant d’infection est l’injection intraveineuse de c. albicans levure7. Toutefois, ce modèle ne prend pas en considération tous les processus qui se produisent avant que le champignon parvient à se propager dans la circulation sanguine. Un autre modèle tire parti de la capacité de c. albicans à envahir l’épithélium. Cette méthode, également connu sous le nom le papier sablé modèle8, a été développée par Gaspari et al. , 1998,9et consiste à l’aide de papier sablé frotter sur la peau, ce qui élimine la couche cornée avant l’application de c. albicans. Cette procédure permet au champignon de pénétrer dans l’épithélium, permettant ainsi l’analyse des capacités invasives de cet agent pathogène. Enfin, les autres modèles des infections pour la gastro-intestinal10 et respiratoires,11 ont été utilisés dans différentes études.
La formation d’une plaie (comme dans le modèle de papier sablé) entraîne l’activation de plusieurs voies, y compris le recrutement de cellules immunitaires et d’activation, afin de favoriser la guérison des processus12. Cela peut altérer ou masquer la réponse immunitaire provoquée spécifiquement contre l’agent pathogène, ce qui conduit à la confusion des résultats.
Nous décrivons ici une méthode d’infection de la peau qui évite la formation de la blessure initiale et l’induction d’un environnement inflammatoire basale. Pour maintenir la structure épithéliale intacte, on injecte directement c. albicans dans sa forme mycélienne dans le derme profond. Même si une seule injection peut déclencher l’inflammation bénigne, le montant de l’inflammation est limité et restreinte par rapport à la formation d’une plaie ouverte, comme dans le modèle de papier sablé. L’approche que nous décrivons ici permet l’étude de la réponse immunitaire à l’infection fongique et propagation tout en évitant l’environnement inflammatoire excessive et préexistant, causée par des lésions mécaniques.
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Protocol
Toutes les procédures ont été approuvés dans le Comité de l’emploi (IACUC) animalier institutionnel et exploités sous la supervision du ministère des ressources animales chez les enfants de l’hôpital (ARC) à l’hôpital pour enfants de Boston ou ont été approuvées par l’italien Ministère de la santé et réalisé par le Comité de protection des animaux institutionnelle à l’Université de Milan-Bicocca.
1. préparation de c. albicans
- La culture C. albicans, souche CAF3-113, dans des tubes contenant du milieu riche (levure extrait peptone dextrose (YEPD), extrait de levure 1 % (p/v), 2 % (p/v) de Bacto Peptone, 2 % (p/v) de glucose) additionné de l’uridine (50 mg/L) à 25 ° C. Dans ces conditions, c. albicans se développe comme une levure.
Remarque : Autres souches de c. albicans peuvent être utilisés, comme la clinique isoler la souche SC5314 de c. albicans 13. Étant donné que nous avons récemment démontré que le processus ulcéreuse est induit par l’activation du système immunitaire inné14, théoriquement chaque souche de c. albicans qui maintient ses composants de la paroi cellulaire et de la structure, ainsi que la capacité à l’origine des projections des hyphes, pourrait être utilisé. - Surveiller la culture en comptant la concentration cellulaire en utilisant un analyseur de compteur de cellules.
- Récolter la culture lorsqu’il atteint une concentration d’environ 8 x 106 cellules/mL. Vous pouvez également utiliser un spectrophotomètre pour mesurer l' OD600.
Remarque : Généralement, une valeur de OD600 = 1 correspond à une concentration de levure de 3 x 107 cellules/mL, mais le titrage est recommandé. - Remettre en suspension de la culture dans un milieu YEPD-uridine, utilisant HEPES (50 mM, pH 7,5) comme un agent tampon et incuber la culture à 37 ° C pour induire la formation d’hyphes. Vérifier la formation des hyphes sous un microscope grossissement X 100. Formation des hyphes est visible 5 h après mise en culture à 37 ° C ; Cependant, utiliser les cellules 16 h après incubation à 37 ° C, lorsque le pourcentage des hyphes atteint près de 95 % de la culture totale.
- D’enrichir encore la préparation à la concentration des hyphes, centrifugeuse aliquotes de la culture à 3 300 x g pendant 5 min. éliminer le surnageant et Resuspendre le culot dans du PBS stérile à une concentration de 1 x 108 hyphes/mL.
2. profondeur dermique Injection
- 24h avant la procédure de l’infection, anesthésier les souris avec une injection intrapéritonéale de kétamine (80-100 mg/kg) et de xylazine (10 mg/kg) et ensuite se raser le flanc des souris à l’aide d’une tondeuse électrique.
Remarque : Après toute procédure impliquant l’anesthésie, placez les souris sous une lampe chauffante jusqu'à ce qu’ils ont récupéré efficacement. - Reposer les souris pendant 24 heures afin d’éviter toute inflammation due au processus de rasage.
- 24h après l’intervention de rasage, anesthésier les souris avec une injection intrapéritonéale de kétamine (80-100 mg/kg) et de xylazine (10 mg/kg).
- Vérifier le réflexe de la patte pour s’assurer que les souris sont profondément anesthésiés. Évaluer le réflexe de la patte en pinçant fermement la patte. Si l’anesthésie est obtenu, l’animal ne sent pas de douleur et ne bouge pas.
- Injecter dans le derme profond à l’aide d’une seringue à insuline 0,3 mL avec une aiguille de 30 x 8 mm dans un volume final de 50 µL/injection, correspondant à 5 x 106 hyphes/injection, les hyphes de c. albicans .
- Tendre la peau du flanc rasé à l’aide de deux doigts pour injecter le volume directement dans le derme profond. Insérer l’aiguille à un angle de 10-15° avec le biseau de l’aiguille vers le haut.
- Avec cet angle, l’agent pathogène sera injecté avec une profondeur d’environ 300 à 500 µm. Afin d’assurer que l’injection est bien effectuée, vérifiez que le volume injecté forme une bosse qui est absorbé quelques minutes après l’injection.
Remarque : La bosse formée après que l’injection sera d’environ 1 cm2. Il s’agit de la zone qui sera supprimée au point de temps désigné pour l’analyse moléculaire ou histologique. - Pour des moments de moins de 24 h (recommandé), délimiter la zone d’infection avec un marqueur, puisque la bosse formée avec l’injection persiste pendant quelques minutes, après quoi il est absorbé. Pour les points de temps de 24h ou plus, cette étape n’est pas nécessaire, car un ulcère ou un kyste sera clairement visible.
3. exemple de prélèvement et la préparation pour la coloration histologique
- Euthanasier les souris selon les procédures institutionnelles.
- À l’aide de pinces chirurgicales, tirer la peau à la frontière du site injecté, précédemment marqué par le marqueur. À l’aide de ciseaux chirurgicaux, l’accise le site infecté en coupant la peau après la ligne tracée.
Remarque : Veillez à séparer la peau du péritoine à l’aide de ciseaux de pointe ogive. - Immerger la peau dans un moule jetable rempli de température de coupe optimale (OCT), composée de la face interne de la peau vers le haut. Congeler l’échantillon dans l’azote liquide jusqu'à ce que le composé devient blanc. Ne pas laisser l’azote liquide couvre l’échantillon avant il est complètement gelée que cela nuirait à l’échantillon.
Remarque : attention ! Au cours de l’étape 3.3, porter un écran facial de protection à l’azote liquide. - Si les échantillons ne sont pas utilisés immédiatement pour la préparation de la diapositive, rapidement les stocker à-80 ° C.
NOTE : Échantillons peuvent être conservés indéfiniment à-80 ° C.
4. préparation des lames
- Couper l’échantillon en deux pour préparer les tranches pour histologie à partir du centre de l’échantillon.
- Couper 5 µm tranches épaisses avec un cryostat.
Remarque : Pour les échantillons de peau, la température du cryostat ne doit pas être supérieure à-25 ° C. Une température plus élevée provoque une fusion partielle de la H-OCT et c’est pourquoi les échantillons ne seraient pas maintenus en bonne position au cours de la procédure de coupe. - Lames de microscope chargés positivement permet de recueillir les tranches.
- Si les tranches collectés ne servent pas peu de temps après la préparation, les stocker à-20 ° C. À ce stade, tranches peuvent être conservés à-20 ° C indéfiniment.
5. hématoxyline et éosine coloration
- Tacher les diapositives par immersion dans l’hématoxyline Gill pendant 4 min. laver les lames dans l’eau courante pendant 5 min.
- Tache de que les diapositives par immersion dans une solution d’éosine Y pendant 1 min. Lavez les diapositives dans la gestion de l’eau du robinet pendant 5 min. Rincer les diapositives à l’aide l’eau distillée avant de continuer le protocole.
- Déshydrater par immersion dans la série des concentrations croissantes de solutions éthanoliques (50 %, 70 %, 80 %, 95 %, 100 %). Plonger les lames pendant 15 s dans chaque solution d’éthanol.
- Désactivez les diapositives pendant au moins 2 min par immersion dans un commissionnaire histologique.
- Monter les diapositives à l’aide du milieu de montage et de lamelles.
- Acquisition d’images des diapositives avec un scanner de diapositives de microscope à un grossissement de X 40.
6. acide périodique-Schiff (PAS) une coloration
- Fixer les lames avec ≥99. 5 % acétone à température ambiante pendant 1 min. laver les lames dans l’eau courante pendant 1 min.
- Tacher les diapositives par immersion dans une solution acide périodique (1 g/dL) pendant 5 min. laver les diapositives de 3 changements d’eau distillée.
- Tacher les diapositives par immersion dans du réactif de Schiff pendant 15 min. laver les lames dans l’eau courante pendant 5 min.
- Tacher les diapositives par immersion dans l’hématoxyline Gill pour 5 min. laver les lames dans l’eau courante pendant 30 s.
- Déshydrater les diapositives par immersion dans 3 changements d’éthanol à 100 %. Plonger les lames pendant 15 s chaque fois.
- Désactivez les diapositives pendant au moins 2 min par immersion dans un commissionnaire histologique.
- Monter les diapositives à l’aide du milieu de montage et de lamelles.
- Acquisition d’images des diapositives avec un scanner de diapositives de microscope.
7. l’échantillon prélèvement et la préparation pour l’Extraction de l’ARN
- Euthanasier les souris selon les procédures institutionnelles. Enlever les échantillons de peau comme dans l’étape 3.2.
- Immerger les échantillons dans un tube à bouchon-pression 2 mL avec 1 mL de réactif pour l’extraction de thiocyanate-phénol-chloroforme guanidinium acide.
Remarque : Le protocole peut être suspendu ici et les échantillons peuvent être conservés à-80 ° C. - Couper l’échantillon en morceaux d’environ 0,2 cm2 à l’aide de pinces chirurgicales.
Remarque : attention ! La plupart des réactifs pour les ARN sont mutagènes et toxiques. Les étapes 7.3 et 7.4 doit se faire sous une hotte aspirante. - Briser l’échantillon avec un moulin à billes à une vitesse de 20 oscillations/s pendant 20 min. par ailleurs, un potier mécanique peut être utilisé.
- Vérifier l’homogénéisation efficace des échantillons en recherchant la présence de pièces intactes de la peau. Répétez cette étape si les échantillons ne sont pas complètement homogénéisées.
- Centrifuger les échantillons à 16 000 x g pendant 1 min. Gardez les surnageants pour extraction de l’ARN et jeter le culot. Cette étape est effectuée pour éliminer les cheveux et les débris qui pourraient bloquer les colonnes d’extraction.
- Procéder à l’extraction de l’ARN à l’aide de RNA purification colonnes14.
- Un spectrophotomètre permet d’évaluer la concentration et la purification de la RNA. Si RNA extraits ne sont pas utilisés immédiatement pour la préparation de la cDNA, stocker les échantillons à-80 ° C.
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Representative Results
Grâce à l’injection de l’agent pathogène directement dans le derme profond, la morphologie structurale du tissu reste intacte (Figure 1 a).
Le maintien de l’intégrité structurale de la peau permet la détection des cellules immunitaires et leur localisation sur le site de l’infection. Le grossissement supérieur illustré à la Figure 1 b révèle que l’abcès se compose principalement de polynucléaires (PMC) qui contiennent la propagation de l’agent pathogène par son confinement sur le site de l’infection. Recrutement de PMC, tels que les neutrophiles, permet la formation de l’abcès, évitant ainsi la propagation du champignon dans le tissu14. Grossissements (Figure 1, D) montrent comment les zones environnantes de l’abcès sont également enrichies en PMC.
En maintenant l’intégrité structurale, la localisation de l’agent pathogène pendant l’infection peut être déterminée. Profitant de la teneur élevée des polysaccharides dans la paroi cellulaire c. albicans, l’identification de l’agent pathogène a effectué un PAS de coloration, qui donne une couleur pourpre-magenta au champignon. Comme le montre la Figure 2 a, PAS de coloration montre clairement que l’agent pathogène est confiné à l’intérieur de l’abcès, formé par le recrutement de granulocytes14. C. albicans est bien visible au grossissement plus élevé (Figure 2 b), et il semble être entourées de cellules nécrotiques et immunitaires.
À l’aide de la méthode décrite ci-dessus, le processus d’infection et l’inflammation qui en résulte peuvent être suivis au fil du temps. Au tout début la cellule immunitaire recrutement conduit à la formation d’un abcès (Figure 1 a et Figure 3 a). Lorsque l’analyse du tissu cutané a été prolongée jusqu'à 48 à 72 heures, la perturbation de la structure de la peau et la formation d’une cicatrice a été visualisée (Figure 3 b, C). La formation de cette structure est due à la phase de guérison qui fait suite à l’expulsion de l' agent pathogène14.
Le processus qui conduit à la formation d’un ulcère peut être suivi pendant plusieurs jours après l’infection. Comme le montre la Figure 4 a, des souris C57BL/6 sauvage affichent un processus ulcéreuse qui augmente au fil du temps. Environ 70 à 80 % des souris montrent la formation d’un ulcère 72 h après l’infection. En raison de la variabilité expérimentale, au moins 8 souris doivent être utilisés dans chaque expérience. Pour l’analyse statistique, il est recommandé d’utiliser un minimum de 8-10 souris pour chaque partition d’une ulcération si comparant différents génotypes ou traitements. Dans ce cas, même les petites différences devraient être visibles. Photos illustratives du processus ulcéreuse sont indiquées dans la Figure 4 b. Lors de traitements spécifiques ou des déficiences génétiques, la formation de l’ulcère peut être réduite ou abrogée le14. Dans certains cas, au lieu de l’ulcère, un kyste est formé, comme illustré dans la Figure 4.
Autre que l’hématoxyline et éosine et PAS de coloration, les lames peuvent être colorés pour deux marqueurs cellulaires spécifiques ou avec autres salissures immunohistochimiques pour mieux visualiser : les fibres de collagène ; emplacement de cytokine/chimiokines dans les tissus ; et l’identité des cellules immunitaires et répartition spatiale.
Outre la préparation histologique, les échantillons peuvent être utilisés aussi pour les analyses moléculaires. Le site d’injection entière peut être excisé, en ce qui concerne les préparations histologiques et traité pour l’extraction de l’ARN. Extraction de l’ARN du tissu permet l’étude et l’identification de ces gènes surexprimés au cours de l’infection par l’agent pathogène. La possibilité de traiter les échantillons pour les analyses moléculaires est un outil important, ainsi qu’une analyse histologique, afin de mieux caractériser le type de réponse immunitaire provoquée contre l’agent pathogène et sa régulation durant les stades précoces et tardifs après le défi14.
Figure 1 : entretien de la localisation de morphologie et cellulaires de la peau. (A) tous les calques sont conservés. Épithélium, les cellules musculaires et les adipocytes sont facilement reconnaissables. (B) des leucocytes polynucléaires (mise en évidence avec des flèches) peuvent être identifiés au sein de l’abcès. (C, D) Grossissements montrent la présence de polynucléaires (flèches) dans la zone qui entoure l’abcès. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Identification de c. albicans. (A) c. albicans peuvent être détectées dans les tissus avec une coloration PAS. Un grossissement supérieur (B) pour mieux visualiser le champignon, coloré en violet, confinés à l’intérieur de l’abcès. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : le suivi du processus inflammatoire. (A) au tout début du processus inflammatoire provoqué par l’injection de c. albicans , granulocytes sont recrutés pour former un abcès pour confiner l’agent pathogène. (B, C) La formation d’un ulcère est nécessaire pour l’expulsion du champignon. Le tissu de cicatrisation est caractérisé par une altération de l’intégrité structurale de la peau et peut conduire à la formation d’une cicatrice. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : cinétique d’ulcération. (A) le processus ulcéreuse suit une tendance à la hausse durant les premiers jours après l’infection. 72 h après l’infection, 70 à 80 % des souris montre un ulcère au site d’infection. 16 C57BL/6 type sauvage animaux ont été utilisés. (B) photos illustratives des ulcères qui a mis au point 48 h après l’infection. (C) photos illustratives de la formation des kystes après l’infection. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Ici, nous avons décrit une méthode de l’infection à c. albicans pour étudier le processus inflammatoire qui est ouverte sur l’entrée fongique dans le derme profond.
Même si la formation d’abcès de peau est un événement relativement rare lors d’infection à c. albicans 15, injection du champignon directement dans le derme profond permet non seulement l’étude de la formation d’abcès axée sur les champignons, mais aussi l’analyse d’immunitaire spécifique cellules qui participent pour contenir la propagation de ce champignon. Avec la méthode décrite ici, il est possible d’étudier les interactions entre cellules immunitaires, ainsi que le recrutement des cellules immunitaires qui sont importants contrôler la propagation de ce champignon, tout en évitant toute réaction inflammatoire à des dégâts mécaniques ou une plaie formation. En effet, la possibilité de garder la structure épithéliale intact est importante d’éviter le développement d’un environnement inflammatoire causé par un stimulus mécanique, comme une abrasion. Comme sous-jacents pour la première fois par Polly Matzinger en 199416, dommages signaux peuvent, en fait, activer une réponse immunitaire et, par conséquent, fortement influencer la réponse immunitaire provoquée par le champignon pathogène.
Les profils moléculaires de dommages associés (DAMPs) peuvent provenir de cellules mortes, mais ils peuvent aussi être libérés dans des conditions de stress. Étant donné que ces signaux peut être produites en cas de lésion tissulaire, la formation d’une plaie provoquerait un environnement hyper inflammatoire avant même que le contexte d’une infection. La méthode que nous avons décrit limite la sortie de DAMPs et réduit ainsi la présence d’éléments de confusion.
Par ailleurs, l’injection d’un agent pathogène directement dans le derme profond est une méthodologie qui peut être utilisée non seulement pour les infections fongiques, mais aussi de défis bactériennes. Un autre agent pathogène responsable par un nombre élevé de cas de ces deux cutanée et bactériémies est Staphylococcus aureus4. Récemment, nous avons montré comment le présent protocole est également un outil important pour l’étude de S. aureus infection14. En particulier, S. aureus est connu en clinique pour sa capacité à forme abcès dans plusieurs districts des corps17. Injection de S. aureus dans le derme profond conduit à la formation d’abcès, permettant ainsi à la fois l’étude des événements très tôt conduit par S. aureus rencontrent ainsi que l’implication des réactions immunitaires qui mènent à la guérison phase.
Enfin, une autre caractéristique importante de la méthode décrite ici est que le maintien d’une structure épithéliale intacte donne la possibilité d’analyser histologiquement la localisation des cellules immunitaires et l’activation des voies distinctes qui peuvent être dans l’espace compartimenté. Dans ces conditions expérimentales, en fait, les différentes structures anatomiques de la peau ne soient pas modifiées et les cellules immunitaires et les médiateurs inflammatoires peuvent être visualisées dans un emplacement précis.
L’utilisation de cette méthode qui préserve la distribution spatiale des cellules immunitaires est donc idéale pour mieux comprendre les rôles de chaque type cellulaire au cours des infections fongiques et bactériennes de la peau.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
FG est pris en charge par l’Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (IG 2016Id.18842), Fondation Cariplo (Grant 2014-0655) et Fondazione Regionale per la Ricerca Biomedica (FRRB).
IZ est pris en charge par les NIH grant 1R01AI121066-01 a 1, 1R01DK115217, grant HDDC P30 DK034854, Harvard Medical School trouvé de Milton, CCFA Senior Research Awards (412708), l’Eleanor et le Miles rive 50e anniversaire du programme de bourses et la Fondation Cariplo ( 2014-0859).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| PBS | Euroclone | ECB4053L | warm in 37 °C bath before use |
| H-OCT compound | histo-line laboratories | R0030 | |
| Gill's Hematoxilyn | histo-line laboratories | 09-178-2 | |
| Eosin Y solution, alcoholic | histo-line laboratories | 09-209-05 | |
| Ethanol absolute | scharlau | ET00232500 | |
| Citro-HISTOCLEAR | histo-line laboratories | R0050 | |
| Eukitt, mounting medium | bio-optica | ||
| Acetone | sigma-aldrich | 179124 | |
| PAS staining system | sigma-aldrich | 395B-1KT | |
| Bacto Peptone | BD | 211677 | |
| Bacto Yeast Extract | BD | 212750 | |
| D(+)-Glucose anhydrous for molecular biology | Applichem PanReac | 50-99-7 | |
| Uridine | Merck Millipore | 8451 | |
| HEPES | Applichem PanReac | A1070,0500 | |
| Safe-Lock tubes 2 mL | eppendorf | 30121597 | |
| TRIzol Reagent | Life Technologies | 15596018 | Toxic, corrosive and mutagen. Use all precaution needed |
| Rneasy Mini Kit | QIAGEN | 74104 | |
| liquid nitrogen | Wear eye protection | ||
| Instrument | |||
| Coulter Counter-Particle Count | Beckman Coulter | ||
| Centrifuge 5415 R | eppendorf | ||
| MC 3000 Microtome Cryostat | histo-line laboratories | ||
| TissueLiser | QIAGEN | ||
| Materials | |||
| 0.3 ml Insulin Syringe with a 30G x 8mm needle | BD | 324826 | |
| Surgical forceps | |||
| Surgical scissors | |||
| Base mould disposable | histo-line laboratories | 2781 | |
| Positively charged bio microscope slides | bio-optica | 09-2000 | |
| Cover slips 24 x 50 mm | thermo scientific | 11911998 |
References
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