Summary
यहां हम एक प्रोटोकॉल है कि ऊतकवैज्ञानिक और Candida albicans intradermal इंजेक्शन के बाद त्वचा के नमूनों की आणविक विश्लेषण की अनुमति देता है का वर्णन । इस प्रोटोकॉल त्वचा के संरचनात्मक अखंडता का कहना है और ऊतक के स्थानीयकरण के लिए अनुमति देता है निवासी या नव भर्ती प्रतिरक्षा कोशिकाओं के रूप में अच्छी तरह के रूप में रोगज़नक़ वितरण ।
Abstract
त्वचा शरीर का एक अत्यंत विस्तारित अंग है और, इस बड़ी सतह के कारण, यह लगातार सूक्ष्मजीवों के संपर्क में है । त्वचा को नुकसान आसानी से dermis जो, बारी में, खून में रोगजनकों के प्रसार में परिणाम कर सकते में संक्रमण के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । समझ कैसे प्रतिरक्षा प्रणाली बहुत प्रारंभिक चरण में संक्रमण लड़ता है और कैसे मेजबान रोगजनकों को खत्म कर सकते है एक महत्वपूर्ण कदम के लिए भविष्य उपचारात्मक उपायों के लिए आधार निर्धारित है । यहां हम Candida albicans संक्रमण है कि प्रक्रियाओं है कि एक संक्रमण के दौरान जल्दी हो कल्पना कर सकते है की एक मॉडल का वर्णन, सहित जब रोगज़नक़ उपकला बाधा पारित कर दिया है, साथ ही प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया सी. albicans द्वारा बटोरा आक्रमण. हम ऊतकवैज्ञानिक विश्लेषण प्रदर्शन है कि प्रतिरक्षा कोशिकाओं है कि त्वचा के रूप में अच्छी तरह से उपस्थिति और रोगज़नक़ के स्थानीयकरण घुसपैठ दिखाने के लिए इस संक्रमण मॉडल का इस्तेमाल किया । संक्रमण के बाद एकत्र नमूने आरएनए निष्कर्षण के लिए संसाधित किया जा सकता है ।
Introduction
मानव शरीर सूक्ष्मजीवों की एक अत्यंत उच्च संख्या के साथ कवर किया जाता है । त्वचा की सतह प्रति वर्ग सेंटीमीटर1के लगभग १,०००,००० बैक्टीरिया का वास है । यह संख्या, तथापि, सूक्ष्मजीवों कि त्वचा उपनिवेश करता की पूर्ण विविधता को प्रतिबिंबित नहीं करता है । बैक्टीरिया के अलावा, मानव शरीर श्लैष्मिक और त्वचा स्तर2में दोनों जीवित रहने के लिए सक्षम है, जो सी. albicansसहित कई कवक प्रजातियों, द्वारा बृहदांत्र है ।
हाल के वर्षों में, फंगल संक्रमण के साथ निदान लोगों का प्रतिशत भारी वृद्धि हुई है । यह मुख्य रूप से प्रतिरक्षा व्यक्तियों, यानी, एचआईवी पॉजिटिव रोगियों और रोगियों कि प्रत्यारोपण के बाद या तो कीमोथेरेपी या immunosuppressive दवाओं के माध्यम से चला गया है की अधिक संख्या के कारण है3। एक निगरानी संयुक्त राज्य अमेरिका, Wisplinghoff एट अल में प्रदर्शन किया अध्ययन में दिखाया गया है कि nosocomial खून संक्रमण के ९.५% Candida प्रजातियों की वजह से थे4। फंगल संक्रमण की वृद्धि हुई घटना के कारण, और विशेष रूप से Candida प्रजातियों के ऊंचा प्रतिशत के कारण खून के संक्रमण के दौरान पाया, समझ कैसे इस रोगज़नक़ प्रतिरक्षा प्रणाली के नियंत्रण से बच जाता है अत्यंत महत्वपूर्ण.
C. albicans एक dimorphic कवक है जो विभिन्न रूपात्मक रूपों जैसे खमीर, blastospores, pseudohyphae, और hyphae पर्यावरणीय स्थितियों के आधार पर5में बढ़ता है । अपने hyphal रूप में, सी albicans अपनी सर्वोच्च इनवेसिव क्षमता से पता चलता है और उपकला6घुसना करने की क्षमता है ।
C. albicans संक्रमण कई प्रायोगिक दृष्टिकोण का उपयोग कर अध्ययन किया गया है । संक्रमण का सबसे आम मॉडल सी. albicans खमीर7की नसों में इंजेक्शन है । हालांकि, इस मॉडल को ध्यान में सभी प्रक्रियाओं है कि कवक से पहले होने के लिए खून में फैल प्रबंधन नहीं ले करता है । एक अंय मॉडल उपकला पर आक्रमण करने के लिए C. albicans की क्षमता का लाभ लेता है । इस विधि, भी रेत कागज8मॉडल के रूप में जाना जाता है, Gaspari एट अल द्वारा विकसित किया गया था १९९८9में, और रेत कागज का उपयोग करने के लिए त्वचा abrade, इस प्रकार सी albicansलागू करने से पहले परत corneum को नष्ट करने के होते हैं । इस प्रक्रिया कवक उपकला घुसना, इस प्रकार इस रोगज़नक़ की आक्रामक क्षमताओं के विश्लेषण को सक्षम करने की अनुमति देता है । अंत में, जठरांत्र संबंधी10 और श्वसन तंत्र11 के लिए संक्रमण के अंय मॉडलों के विभिंन अध्ययनों में इस्तेमाल किया गया है ।
एक घाव के गठन (के रूप में रेत कागज मॉडल में) प्रतिरक्षा कोशिका भर्ती और सक्रियण सहित कई रास्ते, के सक्रियकरण का कारण बनता है, ताकि चिकित्सा प्रक्रिया को बढ़ावा देने के लिए12। यह या तो बदल या मुखौटा प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया विशेष रूप से रोगज़नक़ के खिलाफ प्राप्त कर सकते हैं, इस प्रकार परिणाम को पाने के लिए अग्रणी ।
यहां हम त्वचा संक्रमण की एक विधि का वर्णन है कि प्रारंभिक घाव गठन से बचा जाता है और एक बेसल भड़काऊ वातावरण की प्रेरण । बरकरार उपकला संरचना को बनाए रखने के लिए, हम सीधे गहरी derma में अपने hyphal रूप में सी. albicans इंजेक्षन. हालांकि एक भी इंजेक्शन हल्के सूजन को बाहर कर सकते हैं, सूजन की मात्रा सीमित है और रेत कागज मॉडल में के रूप में एक खुले घाव के गठन की तुलना में प्रतिबंधित है । दृष्टिकोण है कि हम यहां वर्णन कवक संक्रमण और प्रसार के लिए प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के अध्ययन की अनुमति देता है जबकि अत्यधिक और पूर्व मौजूदा भड़काऊ यांत्रिक क्षति की वजह से पर्यावरण से परहेज ।
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Protocol
सभी प्रक्रियाओं को संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) के तहत अनुमोदित किया गया था और बच्चों के अस्पताल में पशु संसाधन विभाग के पर्यवेक्षण के तहत संचालित (आर्क) बोस्टन बच्चों के अस्पताल में या इतालवी द्वारा अनुमोदित किया गया स्वास्थ्य मंत्रालय और मिलानो-Bicocca विश्वविद्यालय में संस्थागत पशु देखभाल समिति के तहत प्रदर्शन किया ।
१. प. albicans तयारी
- Culture C. albicans, तनाव CAF3-113, अमीर माध्यम युक्त ट्यूबों में (खमीर निकालने peptone डेक्सट्रोज (YEPD), 1% (डब्ल्यू/वी) खमीर निकालने, 2% (डब्ल्यू/वी) Bacto peptone, 2% (डब्ल्यू/वी) ग्लूकोज) uridine के साथ पूरक (५० मिलीग्राम/एल) 25 डिग्री सेल्सियस पर । इन शर्तों के तहत, C. albicans एक खमीर के रूप में बढ़ता है ।
नोट: अन्य सी. albicans उपभेदों का उपयोग किया जा सकता है, जैसे नैदानिक अलग सी. albicans तनाव SC531413. के बाद से हम हाल ही में प्रदर्शित किया है कि अल्सरेटिव प्रक्रिया जंमजात प्रतिरक्षा प्रणाली के सक्रियण से प्रेरित है14, सैद्धांतिक रूप से हर ग. albicans तनाव है कि दोनों अपने सेल दीवार घटकों और संरचना का कहना है, साथ ही hyphal अनुमानों उत्पंन करने की क्षमता, इस्तेमाल किया जा सकता है । - एक सेल काउंटर विश्लेषक का उपयोग कर सेलुलर एकाग्रता गिनती से संस्कृति की निगरानी.
- फसल संस्कृति जब यह 8 x 106 कोशिकाओं के एक एकाग्रता तक पहुंचता है/ वैकल्पिक रूप से,६००आयुध डिपो को मापने के लिए एक spectrophotometer का उपयोग करें ।
नोट: आमतौर पर, एक मूल्य के आयुध डिपो६०० = 1 3 x 107 कोशिकाओं के एक खमीर एकाग्रता से मेल खाती है/एमएल, लेकिन अनुमापन की सिफारिश की है । - YEPD-uridine माध्यम में संस्कृति reसस्पेंड, एक बफर एजेंट के रूप में HEPES (५० मिमी, पीएच ७.५) का उपयोग कर और hyphae गठन के लिए प्रेरित करने के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति की मशीन । 100X आवर्धन पर एक खुर्दबीन के नीचे hyphal गठन की जाँच करें । Hyphal गठन ३७ डिग्री सेल्सियस पर संवर्धन के बाद 5 एच दिखाई दे रहा है; हालांकि, hyphal प्रतिशत कुल संस्कृति के लगभग ९५% तक पहुंच जाता है जब ३७ डिग्री सेल्सियस पर मशीन के बाद 16 ज कोशिकाओं का उपयोग करें ।
- आगे hyphal एकाग्रता में तैयारी को समृद्ध करने के लिए, 5 मिनट के लिए ३,३०० x g पर संस्कृति के aliquots के केंद्रापसारक । supernatant को त्यागें और 1 x 108 hyphae/एमएल की एकाग्रता पर बाँझ पंजाब में गोली reसस्पेंड ।
2. डीप अधययन इंजेक्शन
- 24 एच संक्रमण की प्रक्रिया से पहले, चूहों anesthetize के एक intraperitoneal इंजेक्शन के साथ ketamine (८०-१०० मिलीग्राम/किग्रा) और xylazine (10 मिलीग्राम/, और फिर एक इलेक्ट्रिक क्लिपर का उपयोग कर चूहों की पार्श्व दाढ़ी ।
नोट: किसी भी प्रक्रिया संज्ञाहरण को शामिल करने के बाद, एक हीटिंग लैंप के तहत चूहों जगह जब तक वे कुशलता से बरामद किया है । - शेविंग प्रक्रिया के कारण किसी भी सूजन से बचने के लिए 24 ज के लिए चूहों को आराम करें ।
- 24 ज हजामत बनाने की प्रक्रिया के बाद, चूहों anesthetize के एक intraperitoneal इंजेक्शन के साथ ketamine (८०-१०० मिलीग्राम/kg) और xylazine (10 मिलीग्राम/
- पंजा पलटा जांच करने के लिए सुनिश्चित करें कि चूहों गहरी anesthetized हैं । पंजा पलटा कर मजबूती से पंजा चुटकी लेते हुए आकलन करें. यदि संज्ञाहरण प्राप्त होता है, पशु दर्द महसूस नहीं करता है और कदम नहीं है ।
- albicans hyphae गहरी derma में एक ०.३ मिलीलीटर इंसुलिन सिरिंज का उपयोग कर एक 30 जी एक्स 8 मिमी सुई के साथ एक अंतिम मात्रा में ५० µ l/इंजेक्शन, 5 x 106 hyphae/
- मुंडा पार्श्व की त्वचा खींच दो उंगलियों का उपयोग करने के लिए गहरी derma में सीधे मात्रा इंजेक्षन करने के लिए । सुई का सामना करना पड़ सुई के बेवल के साथ 10-15 ° के एक कोण के साथ डालें.
- इस कोण के साथ, रोगज़नक़ लगभग ३००-५०० µm की गहराई के साथ इंजेक्ट किया जाएगा । यह सुनिश्चित करने के लिए इंजेक्शन अच्छी तरह से किया जाता है, की जाँच करें कि इंजेक्शन मात्रा एक टक्कर है कि कुछ मिनट के बाद अवशोषित कर लेता है सुई रूपों.
नोट: इंजेक्शन के बाद बनाई गई टक्कर लगभग 1 सेमी2की होगी । यह क्षेत्र है कि या तो आणविक या ऊतकवैज्ञानिक विश्लेषण के लिए निर्दिष्ट समय बिंदु पर हटा दिया जाएगा है । - से कम 24 घंटे के समय अंक के लिए (अनुशंसित) एक मार्कर पेन के साथ संक्रमण के क्षेत्र निशान, इंजेक्शन के साथ बनाई गई टक्कर के बाद से कुछ ही मिनटों के लिए बनी हुई है, जिसके बाद यह अवशोषित हो जाती है । 24 घंटे या उससे अधिक के समय अंक के लिए, यह चरण आवश्यक नहीं है, क्योंकि या तो अल्सर या पुटी स्पष्ट रूप से दिखाई देगा ।
3. नमूना संग्रह और ऊतकवैज्ञानिक धुंधला के लिए तैयारी
- संस्थागत प्रक्रियाओं के अनुसार चूहों को Euthanize ।
- सर्जिकल संदंश का प्रयोग, इंजेक्शन साइट की सीमा पर त्वचा खींच, पहले मार्कर पेन से चिह्नित । सर्जिकल कैंची का प्रयोग, चिह्नित लाइन का पालन त्वचा काटने के द्वारा संक्रमित साइट उत्पाद ।
नोट: गोल टिप कैंची का उपयोग कर त्वचा को योनि से अलग करने के लिए सावधान रहना । - त्वचा के ऊपर का सामना करना पड़ त्वचा के आंतरिक पक्ष के साथ इष्टतम काटने तापमान (OCT) यौगिक से भरा एक डिस्पोजेबल बेस मोल्ड में विसर्जित कर दिया । यौगिक सफेद हो जाता है जब तक तरल नाइट्रोजन में नमूना फ्रीज. तरल नाइट्रोजन नमूने को कवर करने से पहले यह पूरी तरह से जम जाता है के रूप में यह नमूना नुकसान होगा मत देना ।
नोट: सावधानी! चरण ३.३ के दौरान, तरल नाइट्रोजन से सुरक्षा के लिए एक चेहरा ढाल पहनते हैं । - यदि नमूनों स्लाइड तैयार करने के लिए तुरंत इस्तेमाल नहीं कर रहे हैं, तेजी से उन पर दुकान-८० ° c ।
नोट: नमूनों पर-८० डिग्री सेल्सियस अनिश्चित काल तक संग्रहित किया जा सकता है ।
4. स्लाइड तैयार करना
- नमूने के केंद्र से शुरू प्रोटोकॉल के लिए स्लाइस तैयार करने के लिए छमाही में नमूना काटें ।
- एक cryostat के साथ 5-µm मोटे स्लाइस काटें ।
नोट: त्वचा के नमूनों के लिए, cryostat का तापमान-25 डिग्री सेल्सियस से अधिक नहीं होना चाहिए । एक उच्च तापमान एच के एक आंशिक पिघलने का कारण-OCT और इसलिए नमूने काटने की प्रक्रिया के दौरान सही स्थिति में नहीं रखा जाएगा । - स्लाइस लेने के लिए सकारात्मक रूप से चार्ज किए गए माइक्रोस्कोप स्लाइड्स का उपयोग करें.
- यदि एकत्र स्लाइस जल्द ही तैयारी के बाद इस्तेमाल नहीं कर रहे हैं, उन्हें-20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर. इस बिंदु पर, स्लाइसें-20 डिग्री सेल्सियस अनिश्चित काल तक संग्रहित किया जा सकता है ।
5. Hematoxylin और Eosin धुंधला
- 4 मिनट के लिए गिल के hematoxylin में विसर्जन द्वारा स्लाइड दाग. 5 मिनट के लिए नल का पानी चलाने में स्लाइड धो लो ।
- Eosin में विसर्जन द्वारा स्लाइड दाग 1 मिनट के लिए समाधान. नल के पानी को चलाने में 5 मिनट के लिए स्लाइड को धोएं । प्रोटोकॉल जारी रखने से पहले आसुत पानी का उपयोग कर स्लाइड कुल्ला ।
- इथेनॉल समाधान के प्रश्नपत्र में वृद्धि सांद्रता में विसर्जन द्वारा निर्जलीकरण (५०%, ७०%, ८०%, ९५%, १००%) । प्रत्येक इथेनॉल समाधान में 15 एस के लिए स्लाइड विसर्जित कर दिया ।
- एक ऊतकवैज्ञानिक क्लियरिंग एजेंट में विसर्जन के द्वारा कम से कम 2 मिनट के लिए स्लाइड साफ़ करें ।
- माउंट बढ़ते माध्यम और कवर फिसल जाता है का उपयोग कर स्लाइड ।
- एक 40X आवर्धन पर एक खुर्दबीन स्लाइड स्कैनर के साथ स्लाइड की छवियों को प्राप्त ।
६. मुलांच्या अम्ल-Schiff (प्राधान्य) दाग
- 1 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर ≥ ९९.५% एसीटोन के साथ स्लाइड ठीक करें. 1 मिनट के लिए नल के पानी को चलाने में स्लाइड धो लें ।
- 5 मिनट के लिए आवधिक एसिड समाधान (1 जी/डीएल) में विसर्जन द्वारा स्लाइड दाग. आसुत जल के 3 परिवर्तन में स्लाइड धो लो ।
- 15 मिनट के लिए Schiff के एजेंट में विसर्जन द्वारा स्लाइड दाग. 5 मिनट के लिए नल का पानी चलाने में स्लाइड धो लो ।
- 5 मिनट के लिए गिल के hematoxylin में विसर्जन द्वारा स्लाइड दाग. 30 एस के लिए नल का पानी चलाने में स्लाइड धो लें ।
- १००% इथेनॉल के 3 परिवर्तन में विसर्जन द्वारा स्लाइड निर्जलीकरण । हर बार 15 एस के लिए स्लाइड विसर्जित ।
- एक ऊतकवैज्ञानिक क्लियरिंग एजेंट में विसर्जन के द्वारा कम से कम 2 मिनट के लिए स्लाइड साफ़ करें ।
- माउंट बढ़ते माध्यम और कवर फिसल जाता है का उपयोग कर स्लाइड ।
- एक माइक्रोस्कोप स्लाइड स्कैनर के साथ स्लाइड की छवियों को प्राप्त ।
7. नमूना संग्रह और आरएनए निष्कर्षण के लिए तैयारी
- संस्थागत प्रक्रियाओं के अनुसार चूहों को Euthanize । त्वचा के नमूने के रूप में चरण ३.२ में निकालें ।
- एसिड guanidinium thiocyanate-phenol-क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण के लिए रिएजेंट के 1 मिलीलीटर के साथ एक 2 मिलीलीटर स्नैप-कैप ट्यूब में नमूने विसर्जित कर दिया ।
नोट: प्रोटोकॉल यहां रोका जा सकता है और नमूनों-८० डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है । - लगभग ०.२ सेमी2 सर्जिकल संदंश का उपयोग कर के टुकड़ों में नमूना काटें ।
नोट: सावधानी! आरएनए अलगाव के लिए अधिकांश एजेंट विषाक्त और mutagenic हैं । कदम ७.३ और ७.४ एक धुएं डाकू के तहत किया जाना चाहिए । - 20 मिनट के लिए 20 दोलनों की गति से एक मनका मिल के साथ नमूना तोड़ो/वैकल्पिक रूप से, एक यांत्रिक पॉटर इस्तेमाल किया जा सकता है ।
- त्वचा के बरकरार टुकड़े की उपस्थिति की तलाश के द्वारा नमूनों की प्रभावी homogenization की जांच करें । नमूने पूरी तरह से homogenized नहीं हैं, तो यह चरण दोहराएँ ।
- 1 मिनट के लिए १६,००० x g पर नमूने केंद्रापसारक । आरएनए निष्कर्षण के लिए supernatants रखें और गोली छोड़ें. यह चरण बालों और मलबे कि निष्कर्षण कॉलम ब्लॉक सकता है को खत्म करने के लिए किया जाता है ।
- आरएनए शुद्धीकरण कॉलम14का उपयोग कर शाही सेना निष्कर्षण के साथ आगे बढ़ें ।
- आरएनए शुद्धि और एकाग्रता का आकलन करने के लिए एक spectrophotometer का प्रयोग करें । आरएनए अर्क सीडीएनए तैयारी के लिए तुरंत इस्तेमाल नहीं कर रहे हैं, तो-८० डिग्री सेल्सियस पर नमूनों की दुकान.
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Representative Results
सीधे गहरी derma में रोगज़नक़ के इंजेक्शन के माध्यम से, ऊतक की संरचनात्मक आकृति बरकरार रहती है (आंकड़ा 1a) ।
त्वचा संरचनात्मक अखंडता के रखरखाव के संक्रमण के स्थल पर प्रतिरक्षा कोशिकाओं और उनके स्थानीयकरण का पता लगाने की अनुमति देता है । उच्च आवर्धन चित्रा 1b में दिखाया गया है कि फोड़ा मुख्य रूप से polymorphonuclear ल्यूकोसाइट्स (PMCs) है कि संक्रमण की साइट के लिए अपनी संशोधन द्वारा रोगज़नक़ के प्रसार शामिल से बना है पता चलता है । इस तरह के न्यूट्रोफिल के रूप में PMCs की भर्ती, फोड़ा के गठन की अनुमति देता है, इस प्रकार ऊतक14के भीतर कवक के प्रसार से परहेज । उच्च आवर्धन (चित्रा 1C, घ) कैसे फोड़ा के आसपास के क्षेत्रों में भी PMCs में समृद्ध कर रहे हैं दिखाओ ।
संरचनात्मक अखंडता को बनाए रखने के द्वारा, संक्रमण के दौरान रोगज़नक़ के स्थानीयकरण निर्धारित किया जा सकता है । albicansकी कोशिका दीवार में polysaccharides की उन्नत सामग्री का लाभ उठाते हुए, रोगज़नक़ की पहचान के क़दम धुंधला का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया था, जो कवक के लिए एक बैंगनी-रानी रंग देता है । जैसा कि चित्रा 2aमें दिखाया गया है, क़दम दाग स्पष्ट रूप से पता चलता है कि रोगज़नक़ फोड़ा,14granulocytes की भर्ती द्वारा गठित अंदर सीमित है । C. albicans उच्च आवर्धन (चित्रा b) पर स्पष्ट रूप से दिखाई देता है, और यह गल और प्रतिरक्षा कोशिकाओं से घिरा हुआ प्रतीत होता है ।
ऊपर वर्णित विधि का प्रयोग, संक्रमण प्रक्रिया और फलस्वरूप सूजन समय के बाद किया जा सकता है । बहुत शुरुआत में, प्रतिरक्षा कोशिका भर्ती एक फोड़ा के गठन की ओर जाता है (चित्रा 1a और चित्रा 3ए) । जब त्वचा ऊतक के विश्लेषण अप करने के लिए लंबे समय तक था ४८-७२ ज, त्वचा संरचनाओं के विघटन और एक निशान के गठन visualized था (चित्र बी, सी) । इस संरचना के गठन चिकित्सा चरण है कि रोगज़नक़14के निष्कासन के बाद के कारण है ।
प्रक्रिया है कि एक अल्सर के गठन की ओर जाता है संक्रमण के बाद कई दिनों के लिए पीछा किया जा सकता है । के रूप में चित्रा 4a, C57BL/जंगली-प्रकार चूहों में दिखाया गया है कि समय के साथ बढ़ जाती है एक अल्सरेटिव प्रक्रिया प्रदर्शित करते हैं । चूहों के लगभग ७०-८०% संक्रमण के बाद एक अल्सर ७२ एच के गठन दिखा । प्रयोगात्मक परिवर्तनशीलता के कारण, हर प्रयोग में कम से कम 8 चूहों का प्रयोग किया जाना चाहिए । सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए, यह प्रत्येक अल्सर स्कोर के लिए एक न्यूनतम 8-10 चूहों का उपयोग करने के लिए सिफारिश की है, तो विभिन्न पादी या उपचार की तुलना. इस मामले में, यहां तक कि छोटे मतभेदों को दिखाई जानी चाहिए । अल्सरेटिव प्रक्रिया के गाये चित्र चित्रा 4Bमें दिखाए जाते हैं । विशिष्ट उपचार या आनुवंशिक कमी पर, अल्सर के गठन को कम किया जा सकता है और/या निष्प्रभाव14। कुछ मामलों में, अल्सर के बजाय, एक पुटी का गठन, चित्र 4cमें सचित्र के रूप में है ।
Hematoxylin और Eosin और क़दम दाग के अलावा, स्लाइड या तो विशिष्ट सेलुलर मार्करों के लिए या अंय immunohistochemical दाग के साथ बेहतर कल्पना के लिए दाग हो सकता है: कोलेजन फाइबर; cytokine/chemokines ऊतक के भीतर स्थान; और प्रतिरक्षा कोशिका पहचान और स्थानिक वितरण ।
ऊतकवैज्ञानिक तैयारी के अलावा, नमूनों का उपयोग आणविक विश्लेषणों के लिए भी किया जा सकता है । पूरे इंजेक्शन साइट, ऊतकवैज्ञानिक की तैयारी के लिए के रूप में, और आरएनए निष्कर्षण के लिए संसाधित किया जा सकता है । आरएनए ऊतक से निष्कर्षण रोगज़नक़ के साथ संक्रमण के दौरान विनियमित अध्ययन और उन जीनों की पहचान की अनुमति देता है । संभावना आणविक विश्लेषण के लिए नमूनों की प्रक्रिया करने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण है, साथ में ऊतकवैज्ञानिक विश्लेषण के लिए बेहतर प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के प्रकार की विशेषता के लिए रोगज़नक़ और उसके विनियमन के दौरान जल्दी और देर चरणों के दौरान । चैलेंज के बाद14.
चित्रा 1: त्वचा आकृति विज्ञान और सेलुलर स्थानीयकरण का रखरखाव । (क) सभी परतें संरक्षित हैं । उपकला, adipocytes, और मांसपेशियों की कोशिकाओं को आसानी से पहचानने योग्य हैं. (ख) Polymorphonuclear ल्यूकोसाइट्स (तीरों के साथ प्रकाश डाला) फोड़ा के भीतर पहचाना जा सकता है । (सी, डी) उच्च आवर्धन फोड़ा आसपास के क्षेत्र में polymorphonuclear ल्यूकोसाइट्स (तीर) की उपस्थिति दिखाते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 2: सी. albicansकी पहचान । (क) सी. albicans क़दम दाग के साथ ऊतक के भीतर पता लगाया जा सकता है । (ख) बेहतर कवक कल्पना करने के लिए उच्च आवर्धन, बैंगनी में दाग, फोड़ा अंदर सिमटा । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 3: भड़काऊ प्रक्रिया का पालन करें । (क) सी. albicans इंजेक्शन द्वारा संधारणित भड़काऊ प्रक्रिया के आरंभ में, granulocytes को रोगज़नक़ को सीमित करने के लिए एक फोड़ा बनाने के लिए भर्ती किया जाता है । (ख, ग) एक अल्सर के गठन कवक के निष्कासन के लिए आवश्यक है । हीलिंग ऊतक त्वचा की संरचनात्मक अखंडता में परिवर्तन की विशेषता है और एक निशान के गठन के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 4: अल्सर के कैनेटीक्स । (क) अल्सरेटिव प्रक्रिया संक्रमण के बाद पहले दिनों के दौरान वृद्धि का एक रुझान अनुवर्ती । ७२ एच संक्रमण के बाद, चूहों के ७०-८०% संक्रमण के स्थल पर एक अल्सर से पता चलता है. 16 C57BL/6 जंगली प्रकार के जानवरों का इस्तेमाल किया गया । (ख) संक्रमण के बाद ४८ एच विकसित किए गए अल्सर के तराने चित्र । (ग) संक्रमण के बाद पुटी गठन के उदाहरण के चित्र । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
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Discussion
यहां हम सी. albicans संक्रमण की एक विधि का वर्णन करने के लिए भड़काऊ प्रक्रिया है कि गहरी derma में कवक प्रवेश द्वार पर शुरू की है अध्ययन ।
हालांकि त्वचा फोड़ा गठन सी albicans संक्रमण15पर एक अपेक्षाकृत दुर्लभ घटना है, सीधे कवक के इंजेक्शन गहरी derma में न केवल कवक चालित फोड़ा गठन के अध्ययन की अनुमति देता है, लेकिन यह भी विशिष्ट प्रतिरक्षा का विश्लेषण कोशिकाओं है कि कवक फैल शामिल करने के लिए भाग । विधि यहां वर्णित के साथ, यह प्रतिरक्षा कोशिकाओं के बीच बातचीत का अध्ययन करने के लिए संभव है, साथ ही प्रतिरक्षा कोशिकाओं है कि कवक प्रसार को नियंत्रित करने के लिए महत्वपूर्ण हैं की भर्ती, जबकि यांत्रिक क्षति या घाव के लिए किसी भी भड़काऊ प्रतिक्रिया से परहेज गठन. दरअसल, उपकला संरचना बरकरार रखने के लिए संभावना एक घर्षण के रूप में एक यांत्रिक उत्तेजना की वजह से एक भड़काऊ वातावरण के विकास से बचने के लिए महत्वपूर्ण है । १९९४16में पोली Matzinger द्वारा पहली बार के लिए theorized के रूप में, नुकसान का संकेत, वास्तव में कर सकते हैं, एक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को सक्रिय करने और, नतीजतन, शक्तिशाली प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया रोगज़नक़ द्वारा बटोरा प्रभावित ।
नुकसान जुड़े आणविक पैटर्न (स्पंज) मृत कोशिकाओं से उत्पन्न कर सकते हैं, लेकिन वे भी तनाव की स्थिति के तहत जारी किया जा सकता है । चूंकि इन संकेतों ऊतक क्षति की स्थितियों में उत्पादन किया जा सकता है, एक घाव के गठन एक हाइपर भड़काऊ वातावरण के कारण भी एक संक्रमण के संदर्भ से पहले होगा । विधि हम नम की रिहाई की सीमा का वर्णन किया है और इस तरह के तत्वों को प्राप्त करने की उपस्थिति कम कर देता है ।
इसके अलावा, सीधे गहरी derma में एक रोगज़नक़ के इंजेक्शन एक पद्धति है कि न केवल कवक संक्रमण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन यह भी जीवाणु चुनौतियों के लिए । एक अंय रोगज़नक़ दोनों त्वचा और खून के संक्रमण के मामलों की एक उंनत संख्या के लिए जिंमेदार है Staphylococcus aureus4। हम हाल ही में दिखाया गया है कि कैसे इस प्रोटोकॉल भी एक महत्वपूर्ण उपकरण एस aureus संक्रमण14अध्ययन करने के लिए है । विशेष रूप से, aureus क्लिनिक में शरीर17के कई जिलों में फोड़े फार्म करने की क्षमता के लिए जाना जाता है । गहरी derma में एस aureus के इंजेक्शन फोड़े के गठन की ओर जाता है, इस प्रकार एक ही समय में बहुत जल्दी एस aureus मुठभेड़ से प्रेरित घटनाओं के अध्ययन के रूप में के रूप में अच्छी तरह से प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं की भागीदारी है कि उपचार के लिए नेतृत्व को सक्षम करने चरण.
अंत में, पद्धति का एक और महत्वपूर्ण विशेषता यहां वर्णित है कि एक बरकरार उपकला संरचना के रखरखाव के लिए histologically प्रतिरक्षा कोशिकाओं के स्थानीयकरण और अलग रास्ते है कि हो सकता है के सक्रियकरण का विश्लेषण करने की संभावना देता है स्थानिक compartmentalized. इन प्रायोगिक शर्तों के तहत, वास्तव में, त्वचा के विभिंन संरचनात्मक संरचनाओं को बदल नहीं रहे है और दोनों प्रतिरक्षा कोशिकाओं और भड़काऊ मध्यस्थों एक सटीक स्थान में visualized किया जा सकता है ।
इस विधि का उपयोग प्रतिरक्षा कोशिकाओं के स्थानिक वितरण को बरकरार रखता है इसलिए बेहतर कवक और बैक्टीरियल त्वचा संक्रमण के दौरान प्रत्येक सेलुलर प्रकार की भूमिकाओं को समझने के लिए आदर्श है ।
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
FG ला Ricerca सुल कांसरो (़ 2016Id. 18842), Cariplo फाउंडेशन (ग्रांट 2014-0655), और Fondazione Ricerca प्रति ला Biomedica (FRRB) के अनुसार Associazione Italiana प्रति समर्थित है ।
IZ NIH अनुदान 1R01AI121066 द्वारा समर्थित है-01A1, 1R01DK115217, HDDC P30 DK034854 अनुदान, हार्वर्ड मेडिकल स्कूल मिल्टन पाया, CCFA वरिष्ठ अनुसंधान पुरस्कार (४१२७०८), Eleanor और मील के किनारे 50 वीं वर्षगांठ फैलोशिप कार्यक्रम, और Cariplo फाउंडेशन ( 2014-0859) ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| PBS | Euroclone | ECB4053L | warm in 37 °C bath before use |
| H-OCT compound | histo-line laboratories | R0030 | |
| Gill's Hematoxilyn | histo-line laboratories | 09-178-2 | |
| Eosin Y solution, alcoholic | histo-line laboratories | 09-209-05 | |
| Ethanol absolute | scharlau | ET00232500 | |
| Citro-HISTOCLEAR | histo-line laboratories | R0050 | |
| Eukitt, mounting medium | bio-optica | ||
| Acetone | sigma-aldrich | 179124 | |
| PAS staining system | sigma-aldrich | 395B-1KT | |
| Bacto Peptone | BD | 211677 | |
| Bacto Yeast Extract | BD | 212750 | |
| D(+)-Glucose anhydrous for molecular biology | Applichem PanReac | 50-99-7 | |
| Uridine | Merck Millipore | 8451 | |
| HEPES | Applichem PanReac | A1070,0500 | |
| Safe-Lock tubes 2 mL | eppendorf | 30121597 | |
| TRIzol Reagent | Life Technologies | 15596018 | Toxic, corrosive and mutagen. Use all precaution needed |
| Rneasy Mini Kit | QIAGEN | 74104 | |
| liquid nitrogen | Wear eye protection | ||
| Instrument | |||
| Coulter Counter-Particle Count | Beckman Coulter | ||
| Centrifuge 5415 R | eppendorf | ||
| MC 3000 Microtome Cryostat | histo-line laboratories | ||
| TissueLiser | QIAGEN | ||
| Materials | |||
| 0.3 ml Insulin Syringe with a 30G x 8mm needle | BD | 324826 | |
| Surgical forceps | |||
| Surgical scissors | |||
| Base mould disposable | histo-line laboratories | 2781 | |
| Positively charged bio microscope slides | bio-optica | 09-2000 | |
| Cover slips 24 x 50 mm | thermo scientific | 11911998 |
References
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