Summary
Este artigo descreve uma metodologia detalhada de usando uma borracha de silicone radiopaco à base de chumbo para perfundir vasculatura murino para quantificação do diâmetro da aorta em um modelo do rato de aneurisma da aorta e dissecação.
Abstract
Dissecção e aneurisma da aorta está associadas com significativa morbi -mortalidade na população e pode ser altamente letais. Enquanto existem modelos animais de doenças da aorta, na vivo imagens da vasculatura tem sido limitada. Nos últimos anos, a tomografia micro-computadorizada (micro-CT) surgiu como uma modalidade preferencial para grandes e pequenos vasos de imagem in vivo e ex vivo. Em conjunto com um método de fundição vascular, com sucesso usamos micro-CT para caracterizar a frequência e a distribuição de patologia da aorta no β-aminopropionitrile-tratada C57/Bl6 ratos. Limitações técnicas deste método incluem variações na qualidade da perfusão introduzida por má preparação de animais, a aplicação de metodologias adequadas para quantificação de tamanho de navio e a não-capacidade de sobrevivência deste procedimento. Este artigo detalha uma metodologia para a perfusão intravascular de uma borracha de silicone radiopaco à base de chumbo para a caracterização quantitativa da aortopathy em um modelo do rato do aneurisma e dissecação. Além de visualizar a patologia da aorta, esse método pode ser usado para examinar outros leitos vasculares na vivo ou camas vascular removidas post-mortem.
Introduction
A incidência da dissecção da aorta é 3 casos por 100.000 por ano1. Dissecção aórtica e doenças aneurismática conta para mais de 10.000 mortes nos Estados Unidos a cada ano, respondendo por 1-2% de todas as mortes em países ocidentais2. Dissecação da aorta é iniciada por uma lágrima na camada da íntima do vaso com a propagação de sangue através das camadas da parede da aorta sob pressões fisiológicas. As pressões de pulso elevada do paciente estão associadas com um aumento da incidência de dissecção e complicações. Tensão de cisalhamento da parede aumentado está associado com a expansão da parede da aorta conduz a uma formação de aneurisma3,4. Consequências da dissecção da aorta incluem a oclusão do fluxo sanguíneo para órgãos distantes, incluindo o cérebro, rins, intestinos e os membros, a formação de aneurismas crônicos, ruptura ou morte5,6,7.
Neste momento, os processos bioquímicos e celulares envolvidos na iniciação e progressão dos aneurismas da aorta e as dissecções são ainda mal compreendidos. Reprodutíveis modelos animais de aneurisma da aorta e dissecação são a chave para a compreensão de sua fisiopatologia. Β-aminopropionitrile (BAPN) é um inibidor da lisil oxidase, que impede que o cross-linking de elastina e colágeno e foi mostrado para alterar significativamente a estrutura da matriz extracelular vaso parede e sua integridade biomecânica6, 8. Roedores tratados com BAPN tem sido utilizados como um modelo animal comum de aneurisma da aorta e dissecação9,10.
Modalidades de imagem vasculares são instrumentais em identificar a patologia vascular, confirmando a patência do vaso e avaliar perfusão de órgão. Recentemente, a microtomografia computadorizada (micro-CT) tem sido utilizada para estudar o sistema vascular de ratos e, da mesma forma, animais de porte. Ao contrário do osso, a imagem axial dos vasos sanguíneos pela tomografia computadorizada é limitada, como sangue intraluminal é inerentemente relativamente radiotransparente. Quando combinado com agentes de contraste intravascular, no entanto, o micro-CT permite reconstruções tridimensionais detalhadas de animais vasculatures para o estudo da patologia vascular anatômico macro11.
O agente de contraste selecionado (consulte a Tabela de materiais) é uma borracha de silicone radiopaco que contém o cromato de chumbo e sulfato de chumbo. Em cima de perfusão na presença de um catalisador, que endurece rapidamente para formar um elenco de vasculatura com mínimas alterações na arquitetura macroanatômico dos vasos, fazendo com que a vasculatura altamente radiopaco em contraste com os tecidos de fundo quando examinou-se radiograficamente. Este agente de contraste é vantajoso porque é fácil de manusear e evita a degradação do tecido e perda de navio devido à quebra, frequentemente associada com corrosão elenco vascular. Como cura com encolhimento mínimo12, embarcações de sangue permanecem patentes e permitam uma avaliação correcta da vasculatura-macro animal em experiências não-sobrevivência. Trabalhos anteriores tem utilizado com sucesso o contraste radiopaco do silicone de borracha em uma variedade de estudos com animais. Especificamente, foi mostrada aplicabilidade em Visualizar a coronária, glomerular, placentária e circulações cerebral11,12,13,14,15 . Neste trabalho, detalhamos a metodologia de punção ventricular esquerda aberta para a perfusão intravascular de borracha de silicone radiopaco à base de chumbo para caracterizar quantitativamente a patologia da aorta BAPN-induzido em um modelo do rato por micro-CT.
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Protocol
Protocolos para manuseio de animal foram aprovados pelo Comitê de uso da Universidade de Maryland, Baltimore (número de animais protocolo 0116024) e institucionais Cuidado Animal e conduzidos de acordo com as normas internacionais de AAALAC.
1. preparação dos reagentes
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Heparina
- Diluir 250 µ l de 1000 sulfato de heparina U/mL em 50 mL de fosfato tampão salino tornar-se uma concentração final de 5 U/mL.
- Aquecer o heparinizado (5 U/mL) tampão fosfato-salino, que irá substituir o sangue na vasculatura num banho de água situado a 37 ° C.
- Preparar a bomba de pressão controlada, conectando-se a tubagem necessária e 2 esvaziar seringas de 10 mL, 1 para o buffer de soro heparinizado e 1 para o agente de contraste.
- Encha o tubo com a solução salina tamponada de fosfato heparinizado morno e remover as bolhas de ar da tubulação da bomba de pressão.
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Agente de contraste
Nota: Consulte a Tabela de materiais para componentes do kit de agente de contraste.- Misture um composto pigmentado com um diluente para alcançar uma tintura 1:6, a proporção de diluente.
- Imediatamente antes do uso (etapa 2.3.12), adicione 200 µ l de um agente de cura para cada alíquota de 5 mL do composto pigmentado diluído e misture-os bem (4% em volume).
Nota: O fabricante informou que o tempo de trabalho é de 40 min. Como o agente de contraste de borracha de silicone começa a polimerizar 20 min após a adição do agente de cura, é importante preparar a solução imediatamente antes de sua infusão.
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Água potável BAPN
- Β-aminopropionitrile (BAPN), dissolva em água potável para criar uma concentração final de 3 g/L (adaptado de protocolos anteriormente descritos na literatura)9,16,17.
- Administrar a água potável que contêm BAPN a um grupo de ratos, uma vez que eles são 4 semanas de idade até o tempo de perfusão para micro-CT.
2. ato cirúrgico
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Preparação de animais
- Desmamar os ratos em 3 semanas de idade, mantê-las em um ciclo 12 h luz/12 h escuro e alimentá-los comer roedor padrão. Para o grupo BAPN-tratada, administre preparados na hora BAPN potável água para 16-26 semanas ad libitum. Fornece que os animais de controle com padrão bebendo água ad libitum.
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Técnica anestésica
Nota: 24 h antes da análise do CT, o procedimento a seguir é executada. Procedimentos cirúrgicos são promulgados para preparar a amostra para uma post-mortem perfusão intracardíaca.- Induzi uma anestesia através de um tanque de indução, com 100% O2 e 3% de isoflurano entregadas via um vaporizador de precisão. Após a indução da anestesia, descontinuar o isoflurano e lave a câmara com O2. Manter a anestesia com 2-2,5% de isoflurano e 1 L/min de O2 através de um cone de nariz.
- Anexe tanto a câmara de indução e a máscara para um limpador de carvão para a adsorção do gás waste para proteger o pessoal. Certifique-se de um plano anestésico adequado, demonstrando que não há resposta a estímulos nocivos (pitada de dedo do pé).
- Prepare um campo operatório consiste em uma bandeja cirúrgica e os instrumentos cirúrgicos necessários.
- Transferir o animal para o campo cirúrgico e posicioná-lo em prostração dorsal.
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Técnica operatória
- Usando a tesoura, faça uma incisão através da pele e tecidos moles da meio caminho entre a sínfise púbica para o entalhe do esterno, estendendo-se através da pele e tecidos moles sobrejacentes esterno.
- Usando a tesoura, crie um buraco no diafragma no processo xifoide para entrar na cavidade torácica.
- Use a tesoura para dissecar o diafragma da parede ventral do tórax, bilateralmente.
- Corte as cartilagens costais para separar as costelas do esterno na fronteira bem esternal.
- Aplicar uma fina pinça hemostática à ponta do esterno (perto do processo xifoide) e mover a pinça hemostática cranialmente para que ele seja posicionado na cabeça do rato. Isto fará com que retorne o Timo e o esterno, longe do coração, expondo o coração e grandes vasos para outra manipulação.
- Agudamente disse os anexos entre o coração e a parede torácica.
- Conectar a 27-IV cateter agulha de uma seringa pre-loaded com 10 mL de soro fisiológico heparinizado tamponado de fosfato (5 U/mL) e preencher todos os tubos com o buffer para remover as bolhas de ar dos tubos da bomba de pressão.
- Tenha cuidado ao preparar o fluido como bolhas na linha de líquido pode impedir o enchimento de embarcações menores. Limite o número de navios que são danificados durante a preparação de animais, como isso fará com que o agente de contraste vazar fora os vasos cortados, alterando o volume necessário para um enchimento completo e introdução de artefatos para a imagem final.
- Punção no ventrículo esquerdo com uma agulha de calibre 27 que é estabilizada com uma pinça de ângulo reto. Imediatamente faça uma incisão no ventrículo direito ou a veia cava inferior para drenar a solução de heparina e sangue.
Nota: A heparina é usada como anticoagulante para impedir que o sangue nos vasos de coagulação após a morte do animal. - Perfundir o animal a uma taxa constante de 2 mL por minuto usando uma bomba de seringa único. Observe o branqueamento visível dos órgãos. Continue a perfusão até o perfusato drenagem de circulação venosa está livre de sangue (cerca de 5-6 mL). Pare a bomba.
- Desconecte o tubo de cateter IV a seringa de 10 mL, tomando cuidado para não perturbar a posição da agulha no ventrículo esquerdo.
- Imediatamente após a sangria completa, separar a solução de agente de contraste em alíquotas de 5 mL e adicionar o agente de cura neste momento (consulte a etapa 1.2). Misture-os bem. Elaborar-se 5 mL da mistura de agente de contraste em uma seringa de 10 mL e perfundir o animal com ele.
- Para um enchimento completo dos vasos (artérias e veias), continue a infusão passou do ponto, quando pode ser visto saindo a solução venosa. Procure por sinais de uma bem sucedida perfusão, incluindo a visualização de um agente de elenco nas artérias coronárias, artérias pulmonares, intestino e fígada vasculatura.
- O agente de contraste vai curar após aproximadamente 20 min à temperatura ambiente. Após a cura, colher os órgãos individuais, conforme necessário e corrigi-los em formol tamponado a 10% neutro. Corrigi carcaças inteiras se as amostras não são usadas para o micro-CT varredura no dia seguinte. Se as carcaças forem usadas no dia subsequente, posicione-os em uma bandeja de metal e coloque-os em um refrigerador a 4 ° C, para curar durante a noite.
3. micro-CT varredura e parâmetros
Nota: Os parâmetros de aquisição de imagem específica será dependentes da máquina em uso.
- Adquira imagens de tomografia computadorizada de radiografia computadorizada de cada rato no dia seguinte a perfusão usando um scanner de micro-CT usando uma tensão de tubo de raio x de 55 kVp, uma corrente de 150 mA, um fator de ampliação do sistema de 2.19 e CCD câmera pixel binning factor 2. Isso resulta em um tamanho de pixel eficaz de 29 µm.
- Coloque a carcaça do mouse em decúbito dorsal sobre a mesa do micro-CT scanner e obter um olheiro verificação de raio-x.
- O detector de campo de visão de 57,4 mm (axial) x 37,1 mm (transaxial) focar o torso para a imagem de toda a extensão da aorta.
- Adquira 180 projeções de imagem com um incremento de rotação de 2 graus e uma vez por projeção de 2800 ms.
- Reconstruir as imagens usando um algoritmo de Fernandez modificado; o tamanho de voxel reconstruído é 29 x 29 x 29 µm3 (fatia espessura = 29 µm) usando a visualização 3D Multimodal plug-in para o software usado aqui.
4. pós-processamento e transformação
- Converta os dados de CT para um formato DICOM usando o software apropriado.
- Analise as imagens para identificar se um aneurisma estava presente. Medir o diâmetro do eixo menor no ponto mais largo do arco aórtico, aorta torácica, a descer e aorta abdominal como descrito anteriormente18 (Figura 1).
Nota: Em nosso estudo, imagens foram analisadas por dois observadores independentes (um cego) utilizando um visualizador DICOM para identificar se um aneurisma estava presente. O diâmetro do eixo menor foi medido no ponto mais largo do arco aórtico, descendente de aorta torácica e aorta abdominal como descrito anteriormente19 (Figura 1). Quer dizer não-aneurismática segmentos arteriais de ratos BAPN-tratada estabeleceram diâmetros navio normal, servindo como os valores de controle de idade correspondente. - Os aneurismas são definidos como uma dilatação localizada ou difusa dos segmentos da aorta para diâmetros superiores a 50% do diâmetro da referência. Localize estas com base nas medidas acima.
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Representative Results
Para avaliar este protocolo, 20 ratos adultos masculinos, de fundo misto como descrito anteriormente,19 e 20-30 semanas de idade, com ou sem tratamento de BAPN, foram pintados com uma borracha de silicone radiopaco à base de chumbo (veja a tabela de materiais ) usando o protocolo detalhado acima. Eles foram submetidos a micro-CT varredura no dia seguinte (Figura 1 e Figura 2). Não havia diferenças significativas na média dos ratos entre qualquer um dos grupos em comparação.
Diâmetros de eixo menor então foram quantificados nestes ratos. O diâmetro médio da aorta ascendente nos ratos tratados com BAPN foi significativamente maior do que os controles não tratados idade de correspondência (1,43 ± 0,56 mm vs 0,93 ± 0,11 mm; p = 0,023, unpaired estudantes t-teste). A inibição da lisil oxidase com BAPN não teve um efeito significativo sobre a média decrescente diâmetros da aorta abdominais ou torácicos, em comparação com os controles idade (p > desirmanada 0.082, estudantes t-teste, Figura 3).
Um aneurisma foi definido como sendo de 1,5 x o diâmetro médio do grupo não tratado. Houve um aumento significativo no número de ratos com aneurismas na BAPN-tratadas em comparação com os controles BAPN-tratada (50% dos ratos tratados com BAPN vs. 0% dos ratos não tratados; P = 0.042) pelo teste exato de Fisher. Aneurismas nos ratos tratados com BAPN foram identificados exclusivamente na aorta, com a maioria identificada na aorta torácica (8 em 10 aneurismas identificados). 4 ratos desenvolveram mais de 1 aneurisma com o BAPN-tratamento (tabela 1).
Figura 1: imagens representativas de micro-CT transversais. A. esta é uma imagem transversal dos ratos BAPN-tratada. B. esta é uma imagem transversal dos ratos tratados com BAPN. As medições de diâmetro do eixo menor são feitas no nível do arco aórtico.
Figura 2: reconstrução tridimensional de aneurisma da aorta de rato e dissecação identificado por micro-CT. A. esta é uma reconstrução 3-d representativa de um rato BAPN-tratada com uma aneurisma da aorta abdominal sacular e um aneurisma do arco aórtico. B. este painel mostra um representante decrescente na aorta torácica em um rato BAPN-tratados. O lúmen verdadeiro e falso são separados pelo flap da íntima. O lúmen verdadeiro (TL) é a passagem normal do sangue e o lúmen falso (FL) é a passagem do recém-criado.
Figura 3: efeito do tratamento com BAPN em diâmetros da aorta. Estes painéis mostram o eixo menor médio diâmetros do navio medidos pelo micro-CT em camundongos machos BAPN-não tratada e tratada com BAPN. Aqueles ratos determinados a ter um aneurisma são destacados em vermelho. A média do grupo não tratado é representada como uma linha pontilhada em cada painel. a. esta é a aorta ascendente/arch (AAo/Arch); 0,93 ± 0,11 vs 1,43 ± 0,56 mm; p = 0,023. b. esta é a aorta torácica descendente (DTA); 0,82 ± 0,04 vs 1,11 ± 0,43 mm; p = 0.0817. c. esta é a aorta abdominal; 0,66 ± 0,11 vs 0,89 ± 0,58 mm; p = 0,296. Todos os dados são apresentados como média ± desvio-padrão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Não BAPN (n = 8) |
BAPN (n = 12) |
|
| Animais totais com aneurisma | 0 | 6 * |
| Número total de aneurismas | 0 | 10 |
| AAO/ARCH | 0 | 5 |
| DTA | 0 | 3 |
| AORTA ABD | 0 | 2 |
Tabela 1. Distribuição anatômica dos aneurismas identificadas em camundongos machos com e sem tratamento de BAPN. Esta tabela mostra a incidência de aneurismas, conforme identificado pelo micro-CT (n = 20). AAO = aorta ascendente; DTA = decrescente aorta torácica; AORTA ABD = aorta abdominal. p < 0.05.
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Discussion
Imagem de micro-CT pode ser usada para fornecer reconstruções altamente detalhadas e tridimensionais de patologia vascular em modelos animais. Através da utilização de meios de contraste aprimorado intravasculares, tecidos moles não-avançado, tais como o lúmen de um vaso sanguíneo, podem ser diferenciados daqueles que estão aumentando. Enquanto o laser Doppler, microangiography, ressonância magnética, angiografia, histologia com microscopia confocal, ou dois fotões pode ser utilizada para avaliar leitos vasculares, eles geralmente se concentrar em uma área limitada de estudo e/ou limitam-se às avaliações bidimensionais. Micro-CT fornece um meio eficaz de obtenção de imagens detalhadas das estruturas vasculares, que podem auxiliar na obtenção de um entendimento da angiogênese subjacente e biologia vascular. Métodos adicionais de pequenos animais de imagem incluem na vivo micro-CT e angiografia de subtração digital. Semelhante à técnica descrita aqui, na vivo micro-CT depende de um agente de contraste exógeno para aumentar a resolução. Fenestra VC e Isovue-370 são 2 desses agentes de contraste de poça de sangue que são disponíveis para micro-CT. Fenestra VC tem sido usado e é relatado para ter um realce médio máximo de ~ 620 unidades de Hounsfield na aorta 20 min após injeção de20. Outros agentes de contraste baseados em nanopartículas também mostraram potenciais no MRI e CT. Cateterismo ventricular esquerdo sem abrir o peito é um outro método de perfusão todo rato de microfilmagem que tem sido descrito21. Ecografia para as medições longitudinais de um diâmetro do vaso é um método final que pode ser usado em estudos de sobrevivência.
Durante este procedimento, perfusão adequada requer um alto grau de atenção aos detalhes. É importante para o sistema vascular ser completamente drenado antes a perfusão com um agente de contraste. Se o fígado não blanch e mantém sua cor vermelha escura, adicional de lavagem com uma solução salina heparinizada pode ser necessária antes da perfusão com um contraste. Exsanguinação incompleta da vasculatura pode afetar a qualidade da imagem final, aparecendo como defeitos na vasculatura de enchimento ou oclusões vasculares distais diferente. Além disso, a inserção da agulha para o ventrículo esquerdo é um procedimento delicado que pode rasgar a parede ventricular ou cortar através do ventrículo direito. Se a agulha é inserida no ventrículo direito, os pulmões vão ser perfundidos rapidamente e vão virar amarelos cedo durante a perfusão, levando a uma perfusão vascular incompleta. Uma ruptura do vaso é uma complicação final que leva a uma perfusão incompleta. A possibilidade de uma ruptura do vaso pode ser minimizada, garantindo uma drenagem adequada da circulação venosa antes de iniciar a perfusão através da árvore arterial. Injeção retrógrada é um método alternativo para perfusing uma cama vascular, o que anteriormente foi descrita a imagem a vasculatura coronária11. Optamos por um método de hemorragias anterógradas de perfusão como mais precisamente representa sangue fisiológica fluxo na aorta torácica e abdominal. A qualidade da imagem obtida com micro-CT limitar a capacidade de avaliar a aorta para trombo intramural ou hematoma. No entanto, o tecido mole pode ser visualizado dependendo muito bem como o protocolo de CT é formulado. Para nossos estudos, notamos segmentos da aorta com defeitos, presumivelmente devido a estenoses do trombo intraluminal de enchimento. A técnica como descrito é melhor para avaliar o espaço intravascular.
Em resumo, este protocolo fornece uma técnica segura para o exame de alta resolução da vasculatura de um modelo murino de aneurisma da aorta e dissecação. Análises quantitativas pode ser facilmente conseguidas usando imagens de micro-CT, que são capazes de fornecer um elenco preciso da vasculatura. Para efeitos das experiências ilustrados nesta publicação, escolhemos medir o diâmetro da aorta maior para imitar a medição dos aneurismas da aorta na prática clínica. Uma combinação de pontos de referência anatômicos e fatia localização distâncias pode ser utilizada para medir segmentos específicos da aorta, se for o caso. Também é mostrado que vasculatura perfundida animal pode ser fotografada e digitalmente separada do fundo esquelético para a quantidade desejada para criar uma representação tridimensional dos principais vasos sanguíneos e seus ramos menores distais. Este protocolo preserva os tecidos vasculares de interesse, que pode ser incorporado em parafina e usado para corte histológico para uma análise mais aprofundada.
Micro-CT é uma promissora modalidade de imagem para o estudo da biologia vascular. Com sua alta resolução espacial, oferece uma oportunidade para avaliar a estrutura, organização e patologia dos vasos sanguíneos. O procedimento descrito neste manuscrito exige múltiplas habilidades e técnicas, incluindo a preparação e manipulação de animais, aquisição de imagens e quantificação dos resultados. Este artigo demonstrou com sucesso um aplicativo de perfusão vascular para identificar aortopathies em camundongos. Mais estudos são necessários para avaliar a sua aplicabilidade em outros modelos animais e processos da doença.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Gostaríamos de agradecer a Mark Smith pela ajuda com imagem radiográfica. Este trabalho é apoiado pela NIH T32 subvenção para pesquisa interdisciplinar na doença Cardiovascular (BOA), a associação americana do coração (SMC) e o NIH R35 Grant (DKS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microfil | Flow Tech, Inc | MV-122 | We use yellow, a different color can be ordered as desired. Kit includes MV-Compound, MV-Diluent, and MV-Curing Agent. |
| Heparin (1000 U/mL) | Sagent Pharmaceuticals | 25021-400-10 | |
| Phosphate buffered saline | Corning | 21-031-CV | |
| Isoflurane | Vet One, MWI | 502017 | |
| 3-Aminopropionitrile fumarate salt | Sigma-Aldrich | A3134 | |
| Single syringe pump | Fisher Scientific | 14-831-200 | |
| 27-gauge scalp vein set needle | Exel Int | 26709 | 27G x 3/4", 12" tube |
| Inveon Micro-CT scanner | Siemens Medical Solutions | ||
| Osirix MD | Pimxmeo SARL | Version 8.0.2 | |
| Inveon Research Workplace | Siemens Medical Solutions | Version 4.2 | |
| Rodent Chow | Harlan Teklad | 2018sx |
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