Qui, presentiamo un protocollo per quantificare i follicoli nelle ovaie colte di giovani topi senza sezionamento seriale. Mediante immunofluorescenza di intero organo e tessuto di compensazione, sezionamento fisico viene sostituito con sezionamento ottico. Questo metodo di preparazione del campione e visualizzazione mantiene l’integrità dell’organo e facilita la quantificazione automatizzata di cellule specifiche.
Ricerca nel campo della biologia riproduttiva nei mammiferi spesso coinvolge valutare la salute generale delle ovaie e testicoli. In particolare, nelle femmine, fitness ovarico è spesso valutata da visualizzare e quantificare i follicoli e gli ovociti. Perché l’ovaio è un tessuto tridimensionale opaco, gli approcci tradizionali richiedono faticosamente affettare il tessuto in numerose sezioni di serie al fine di visualizzare le cellule in tutto l’intero organo. Inoltre, poiché la quantificazione di questo metodo implica, generalmente, segnando solo un sottoinsieme delle sezioni separate dal diametro approssimativo di un ovocita, è incline ad inesattezza. Qui, un protocollo è descritto che invece utilizza organo intero tessuto compensazione e colorazione di immunofluorescenza delle ovaie del mouse per visualizzare i follicoli e gli ovociti. Rispetto ad approcci più tradizionali, questo protocollo è vantaggioso per la visualizzazione di celle all’interno dell’ovaio per numerose ragioni: 1) l’ovaio rimane intatto in tutta la preparazione del campione e trattamento; 2) piccole ovaie, che sono difficili da sezione, possono essere esaminate con facilità; 3) cellulare quantificazione avviene più facilmente e con precisione; e 4) l’intero organo imaged.
Al fine di studiare la composizione cellulare e caratteristiche morfologiche delle ovaie dei mammiferi, gli scienziati spesso si affidano in vivo esperimenti seguiti dalla macchiatura immunohistological delle ovaie di paraffina. Più recentemente comunque, coltura di organo intero ovaio ha dimostrato di essere un’alternativa efficace per studiare la funzione ovarica1,2,3,4 perché la tecnica può essere accoppiata con migliore visualizzazione e strumenti di quantificazione. Tradizionalmente, analisi della morfologia ovarica dipende dalla ricostruzione tridimensionale ovarico architettura dalla paraffina sezioni di serie, ma, oltre ad essere laboriosa e richiede tempo, sezionamento in serie del tessuto paraffina non garanzia di ricostruzione adeguata dell’organo, e sezioni sono spesso persi o mis-ordinati nel processo.
Oltre le sfide tecniche associate di sezionamento seriale, ci sono inoltre variazioni nei metodi abitualmente utilizzati per quantificare numeri follicolo per ovaia5,6. La variabilità metodologica attualmente utilizzata altera la meta-analisi della riserva ovarica attraverso studi5,7. Ad esempio, numeri di follicolo da articoli di ricerca diversi possono variare da 10 volte o più tra simili età inerente allo sviluppo all’interno di un ceppo specifico6. Queste grandi differenze nella quantificazione riferito follicolo possono portare a confusione e hanno ostacolato i confronti Croce-Studio. Sperimentalmente, gli approcci tradizionali alla quantificazione del follicolo da sezioni di serie vengono eseguiti da follicoli di un numero predeterminato di sezioni di conteggio (ad esempio, ogni quinto, decimo, o altra sezione). Variabilità nei conteggi di follicolo utilizzando questo approccio deriva non solo dalla periodicità in quali sezioni sono contati, ma anche da variazioni di spessore della sezione e l’esperienza tecnica nella generazione di sezioni di serie5,6. Oltre alla sua variabilità, un altro svantaggio del taglio di tessuto tradizionale è che il sezionamento delle ovaie piccole dagli animali giovani è particolarmente difficile e dipende molto dal tessuto orientamento8.
Il protocollo sottostante descrive un ovaio ordinariamente usato cultura tecnica1 ma migliora notevolmente sulla quantificazione del follicolo tradizionale sostituendo sezionamento fisico con il tessuto di compensazione e sezionamento ottico mediante microscopia confocale8 ,9. Pulizia con immersione del tessuto (senza la necessità di transcranial aspersione o elettroforesi) in un – e sorbitolo-a base di urea soluzione (ad es., ScaleS(0)10) si è rivelato compatibile con immunostaining e ammessi per la riduzione del tempo di compensazione senza compromettere la profondità dell’imaging. Altri metodi segnalati (ad es., ScaleA28,10, SeeDB11, clean12e ClearT212) sono più tempo che consumano o non consentono approfondita risoluzione ottica del campione. Sezionamento ottico è vantaggioso perché è meno laborioso e mantiene l’architettura tridimensionale7,8 dell’organo. Un altro vantaggio di questo approccio è che la preparazione dei campioni non richiede costosi reagenti per cancellare il tessuto e può essere condotta con relativa facilità.
In particolare, il protocollo descritto è stato ottimizzato per le ovaie coltivati del topo al quinto giorno postnatale ma è stato condotto su ovaie che vanno dal giorno postnatale 0 – 10. Il metodo si avvale di un sistema di cultura dell’ovaia in cui il tessuto naturalmente si attacca alla membrana su cui è coltivato, facilitando l’utilizzo dell’organo e manipolazione. Il sistema di cultura descritto può essere utilizzato per mantenere explanted ovaie per fino a 10 giorni e di valutare come le diverse condizioni sperimentali possono interferire con ovocita sopravvivenza13. La procedura di quantificazione descritta viene eseguita utilizzando il pacchetto FIJI-ImageJ14 di elaborazione delle immagini non commerciali e può essere condotta sulla maggior parte dei personal computer. Inoltre, immagini utilizzate per la quantificazione possono essere reso ampiamente disponibile per la comunità scientifica, consentendo in tal modo futura meta-analisi.
Lo studio della riproduzione dei mammiferi richiede utilizzando e quantificare le cellule specializzate che non sono ordinariamente favorevoli alla coltura delle cellule. Tuttavia, sistemi di coltura ex vivo sono efficaci a mantenere dell’ovaia e del follicolo vitalità1,15. Durante la coltura di ovaio, il tessuto richiede una maggiore superficie per lo scambio di sostanze nutritive tramite diffusione. Di conseguenza, 5 – giorno vecchio mouse ovaie sono …
The authors have nothing to disclose.
Ringraziamo Rebecca Williams e Johanna Dela Cruz da BRC di Cornell, l’Imaging e Andrew Recknagel per utili suggerimenti e assistenza tecnica. Questo lavoro è stato supportato da istituti nazionali di sovvenzione di salute S10-OD018516 (per Imaging Facility cornelliano), T32HD057854 a j.c.b. e R01-GM45415 per J.C.S.
Micro dissecting scissor 4.5", straight, sharp points | Roboz | RS-5912 | Micro dissecting scissor |
Jewelers style forceps 4-3/8", style 5 | Integra Miltex | 17-305X | Fine tip forceps |
Micro Iris Scissors 4", straight, sharp points | Integra Miltex | 18-1618 | Micro dissecting iris scissor or micro dissecting spring scissor |
1X Minimal Essential Media (MEM) | ThermoFisher Scientific | 11090-081 | |
Fetal Bovine Serium | Corning | 35011CV | |
HEPES (1M) | Gibco | 15630080 | |
Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco | 15240062 | Used in Step 1.3.1 |
35mm Tissue Culture Treated Dish | Corning | 430165 | |
Nunc™ 24-Well Carrier Plate for Cell Culture Inserts | ThermoFisher Scientific | 141006 | Pore size: 8μm |
Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | 16% solution |
1X Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco | 10010023 | |
Nutator mixer GyroTwister™ | Labnet | S1000-A-B | three dimensional shaker |
Normal Goat Serum | VWR | 103219-578 | |
Bovine Serum Albumen (BSA) | VWR | 97061-416 | |
Sodium Azide (NaN3) | Sigma-Aldrich | S2002-25G | |
Sodium borohydride solution (NaBH4) | Sigma-Aldrich | 452904-25ML | Use the solution, rather than the tablet or powder form |
Polyvinyl Alcohol (PVA) | Sigma-Aldrich | P8136-250G | Cold water soluble |
Triton™ X-100 | Sigma-Aldrich | 93443-100ML | polyethylene glycol tert-octylphenyl ether |
Syringe filters | ThermoFisher Scientific | 725-2520 | 25mm |
10mL Syringes | BD | 309695 | |
Mouse anti-p63 antibody (4A4) | Biocare Medical | CM 163A | Dilution 1:500 |
Rabbit anti-MVH antibody | Abcam | ab13840 | Dilution 1:600 |
Alexa Fluor® goat anti-mouse 594 | ThermoFisher Scientific | A-11032 | Dilution 1:1000 |
Alexa Fluor® goat anti-rabbit 488 | ThermoFisher Scientific | A-11034 | Dilution 1:1000 |
4,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI) | ThermoFisher Scientific | 62248 | |
D-(-)sorbitol | Sigma-Aldrich | 240850-100G | |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012-100ML | |
Urea | Sigma-Aldrich | U5378-500G | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650-5X10ML | |
FIJI-ImageJ | Image processing software | ||
Disposable plastic transfer pipettes | VWR | 414044-034 |