המטרה של פרוטוקול המובאת כאן היא ללמוד תגובת transcriptomic בודדים endosphere Bacillus mycoides תפוחי אדמה השורש exudates. שיטה זו מקלה על הזיהוי של גנים חיידקיים חשוב מעורב אינטראקציות צמח-חיידק, באופן עקרוני החלים endophytes וצמחים אחרים, עם התאמות קלות.
הבקטריה צמח-הקשורים לשחק תפקיד חשוב בקידום הצמיחה ולמניעת מחלות בצמחים. היישום של הצמח הצמיחה וקידום rhizobacteria (PGPR) כסוכני biofertilizers או משולבת הפך חלופה יעילה לשימוש בדשנים קונבנציונלי ו יכולים להגביר את הפרודוקטיביות חיתוך במחיר נמוך. אינטראקציות צמח-חיידק תלויים אותות מופרש הצמח הפונדקאי ואת תגובת לכאן בזמן שנסעתי על ידי חיידקים הקשורים שלהם. עם זאת, המנגנון המולקולרי של חיידקים מועילים כיצד להגיב שלהם הקשורים הצמחי אותות אינם מובנים במלואם. הערכת התגובה transcriptomic של חיידקים השורש exudates היא גישה רב-עוצמה כדי לקבוע את ביטוי גנים חיידקיים ורגולציה בתנאים rhizospheric. ידע כזה יש צורך להבין את המנגנונים שבבסיס מעורב אינטראקציות צמח-חיידק. מאמר זה מתאר פרוטוקול מפורט ללמוד את התגובה transcriptomic של mycoides נולד ב- EC18, זן מבודד את endosphere תפוחי אדמה, כדי exudates שורש תפוח אדמה. בעזרת הטכנולוגיה תפוקה גבוהה רצף האחרונות, פרוטוקול זה יכול להתבצע תוך מספר שבועות, התוצרת datasets מסיבית. ראשית, אנו אוספים את exudates שורש בתנאים סטריליים, לאחר מכן הם מתווספים mycoides דרב תרבויות. הרנ א מהתרביות האלה היא מבודדת באמצעות שיטה פנול/כלורופורם בשילוב עם ערכת מסחרי ונחשפו בקרת איכות על ידי כלי נגינה אוטומטיות אלקטרופורזה. לאחר רצף, ניתוח נתונים מתבצע באמצעות הצינור T-REx מבוססת-אינטרנט, קבוצה של גנים ביטוי באופן שונה מזוהה. שיטה זו היא כלי שימושי כדי להקל על תגליות חדשות על גנים חיידקיים מעורב אינטראקציות צמח-חיידק.
צמחים מאי תפליט עד 20% של פחמן קבוע בעת ההטמעה דרך השורשים של rhizosphere1, כלומר, אזור צר של אדמה בקרבת השורשים. בשל הזמינות מזין גבוה, rhizosphere הוא גידול מתאימים עבור מיקרואורגניזמים מגוונים, כולל צמחים-צמיחה קידום חיידקים. Exudates שורש להכיל מגוון של חומרים אורגניים נדיפים כמו יונים, חומצות אנאורגניות, חמצן ומים. עם זאת, הרוב המכריע של exudates הבסיס נוצר על ידי חומרים אורגניים, אשר ניתן לחלק תרכובות משקל מולקולרי נמוך, משקל מולקולרי גבוה תרכובות. תרכובות משקל מולקולרי נמוך כולל חומצות אמינו, חומצות אורגניות, סוכרים, תרכובות בעל תאים פנוליים, חומצות שומן, ושורה של מטבוליטים משניים. תרכובות משקל מולקולרי גבוה מורכב2,mucilage, חלבונים3. Rhizosphere מיקרואורגניזמים יכולים להשתמש בחלק תרכובות אלו כמקור אנרגיה לצמיחה ופיתוח. Exudates שורש תפקיד חשוב בעיצוב הקהילה rhizobacterial מאז המיוצר במפעל תרכובות של exudates יכולים להשפיע על ההתנהגות של חיידקים rhizosphere-הקשורים על ידי המשפיעים על הביטוי של גנים ספציפיים.
הבנת התגובה חיידקי השורש exudates היא צעד המפתח בפענוח מנגנוני אינטראקציה צמח-חיידק. כמו התגובה חיידקי אינטראקציות צמח-חיידק הוא התוצר של ביטוי גנים דיפרנציאלית, זה ניתן יהיה ללמוד על ידי ניתוח transcriptome. באמצעות שיטה זו, מחקרים קודמים זיהו מספר חשוב גנים המעורבים באינטראקציה צמח-חיידק. ב- Pseudomonas aeruginosa, גנים המעורבים חילוף החומרים, כימוטקסיס וסוג II הפרשת הוצגו להגיב exudates שורש סלק סוכר4. מאוורר ואח. 5 חקר את פרופיל transcriptomic של amyloliquefaciens נולד ב- FZB42 בתגובה exudates שורש תירס. התוצאות שלהם מראים כי של גנים חריפה הנגרמת על ידי exudates השורש, מספר קבוצות מעורבים מסלולים מטבוליים הנוגעים ניצול מזין, כימוטקסיס, תנועתיות ו- 30s ריבוזומלי סינתזה של פפטידים מיקרוביאלית ו- polyketides.
הדיוק של מחקרים אלה מסתמך על האוסף של השורש exudates. למרות מספר שיטות תיארו את האוסף של שורש exudates למטרות שונות, הם דורשים מכשירים מתוחכמים או לא יבוצעו ב תנאים מבוקרים היטב-6,–7,–8. יתר על כן, עיכוב rhizosphere מיקרואורגניזמים יכולים להשפיע על שורש תפליט הרכב על ידי המשפיעים על חדירות קרום התא צמח ופגיעה ברקמות שורש, במיוחד במקרה של קונסורציומים של מיקרואורגניזמים9. כאשר חוקרים התגובה מיקרוביאלי שורש exudates, חשוב להשתמש בתנאים מוגדרים היטב על מנת למנוע שינוי של תרכובות על-ידי מיקרואורגניזמים10. יתר על כן, ה-RNA באיכות גבוהה נדרש עבור ה-RNA-seq המבוסס על מחקרים transcriptome. עם זאת, בעת התמודדות עם זנים שאינם-מודל-בקטריאלי, פרוטוקולים סטנדרטיים או קיטים מסחריים יש בדרך כלל של יעילות נמוכה עקב גורמים לא ידועים או מאפייני צמיחה מיוחד.
הפרוטוקול המתואר כאן אומתה באמצעות mycoides דרב, אשר הוא חיידק גראם חיובי, יוצרי ספורה של שלקרוא Firmicute. . זה נמצא בכל מקום, rhizosphere של מיני צמחים שונים. גידול צמח מספר מאפיינים קידום דווחו על מין זה, לרבות אינדוקציה ההתנגדות שיטתית (ISR) סלק סוכר11, עיכוב של המתלים-off המחלה Pythium מלפפון12, כמו גם חנקן קיבוע חמניות rhizosphere13. עם זאת, המנגנון המולקולרי של ביחסיו עם צמח המארח לא טוב נלמדים.
המטרה של הניסויים המובאת כאן היא ללמוד תגובת transcriptomic בודדים endosphere דרב mycoides תפוחי אדמה השורש exudates. בקיצור, הפרוטוקול מורכב מהשלבים הבאים: ראשית, לאסוף תפוחי אדמה exudates שורש בתנאים סטריליים. לאחר מכן, לחלץ RNA באיכות גבוהה מתאים חיידקיים שטופלו exudates השורש. השלב הסופי הוא ניתוח נתונים תוך שימוש באינטרנט T-REx צינור14. פרוטוקול זה שימש לזיהוי גנים mycoides דרב הצג את משמרת ברמות הביטוי בעת מגע עם שורש-exudates, ובכך עלול לשחק תפקיד חשוב ב אינטראקציות צמח-חיידק.
אינטראקציות צמח-חיידק יש כבר שיערו להיקבע על-ידי שיווי משקל משומנת בין חיידקים וצמחים. אינטראקציות כאלה הם מורכבים מאוד, קשה ללמוד במערכת טבעית, אשר כוללת מגוון מינים מיקרוביאלי, כגורם העלול קונסורציומים. מאמר זה מתאר פרוטוקול פשוטה ללמוד את חיידקי בתגובה שורש exudates בתנאים מבוקרים היטב. הפ…
The authors have nothing to disclose.
אנו מודים יעקב הרבה על הערות מועילות והצעות שלו. אנו מודים גם אן דה יונג לעזרתו בניתוח ביואינפורמטיקה. Yanglei יי ו- Zhibo Li נתמכים על ידי מועצת מלגות סין (CSC). אנו מודים Back2Roots תכנית בתחרות-TTW Perspectief (TKI-AF-15510) לתמיכה הפיננסית שלהם OPK.
sodium hypochlorite | Sigma | CAS: 7681-52-9 | 10-15% active chlorine |
Luria-Bertani (LB) broth | |||
incubater | New Brunswick Scientific | Innova 4000 | |
spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | Genesys 20 | |
liquid nitrogen | |||
glass beads | Sigma | G8893 | 0.5 µm |
2.0 ml tube with screw cap | RNase free | ||
1.5 ml and 2.0 ml eppendorf tube | RNase free | ||
Bead mill homogenizer | BioSpec | 607 | Mini_beadbeater |
centrifuge | Eppendorf | 5430 | |
Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | sigma | CAS: 1609-47-8 | |
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | sigma | CAS: 151-21-3 | 10% solution prepared with DEPC treated MQ water |
TE buffer | 10 mM Tris-HCl; 1 mM EDTA, pH=8 | ||
phenol | Sigma | RNA grade | |
chloroform-isoamyl alcohol | prepare 24:1 of chloroform:isoamyl alcohol, store at room temperature | ||
High pure RNA isolation kit | Roche | 11828665001 | |
RNase Decontamination Solution | Invitrogen | AM9780 | RNase-Zap |
Automated electrophoresis instrument | Agilent | 2100 | Bioanalyzer |
Microvolume spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | Nanodrop ND-1000 | |
RNA quality analysis kit | Agilent | RNA 6000 Nano kit | |
RNase inhibitor | Thermo Fisher Scientific | RiboLock | |
Directional RNA library Prep kit | NEB | Ultra | For Illumina |