植物と微生物の相互作用: ジャガイモ根分泌物に細菌 Mycoidesの転写応答
Summary
ここで提示されたプロトコルの目的は、ジャガイモ根分泌物への endosphere 分離細菌 mycoidesのトランスクリプトーム応答を勉強することです。このメソッドは、植物と微生物の相互作用に関与する重要な細菌の遺伝子の識別を容易にしは、原則として他のエンドファイトと植物で、細かな調整に適用されます。
Abstract
プラント関連の有益な細菌は、成長を促進し、植物の病気を防止する重要な役割を果たします。生物肥料や防除剤として植物生育促進根圏細菌 (PGPR) のアプリケーションは従来の肥料の使用に効果的な代替となって、低コストで作物の生産性を高めることができます。植物・微生物相互作用はホスト植物分泌シグナルとここに至ってその関連細菌反応に依存します。しかし、どのように有益な細菌の分子機構は信号が完全に理解されていない、関連付けられている植物由来に応答します。根分泌物に細菌のトランスクリプトームの応答を評価する、細菌の遺伝子発現と根の条件の下で規制を決定する強力なアプローチです。そのような知識は、植物と微生物の相互作用に関与する基になるメカニズムを理解する必要です。本稿では、 B. mycoides EC18、ジャガイモの endosphere から分離されたジャガイモ根分泌物系統のトランスクリプトーム応答の研究に詳しいプロトコルについて説明します。最近の高スループット シーケンス技術の助けを借りて、いくつかの数週間、生産大規模なデータセットでこのプロトコルを実行できます。まず、 B. mycoides文化にその後追加された無菌条件下での根の分泌物を収集します。これらの文化からの RNA は、市販のキットと組み合わせるし、自動電気泳動装置による品質管理を受けるフェノール/クロロホルム メソッドを使用して分離されます。シーケンス処理の後 web ベースの T-レックス パイプラインでデータ解析が行われる、特異的発現遺伝子のグループが識別されます。このメソッドは、植物と微生物の相互作用に関与する細菌の遺伝子に新たな発見を容易にする便利なツールです。
Introduction
植物は根圏1,すなわち, 根に近い土の狭いゾーンに根を通して光合成中固定炭素の 20% まで滲出液を可能性があります。高い栄養アベイラビリティのため根は植物成長促進菌を含む、多様な微生物の適した生息地です。根の分泌物には、イオン、無機酸、酸素、水などの無機化合物の範囲が含まれています。ただし、根分泌物の大半は、低分子化合物と高分子量化合物に分けることができる有機材料によって形成されます。低分子量化合物には、アミノ酸、有機酸、糖、フェノール、脂肪酸、二次代謝産物の配列が含まれます。高分子量化合物は粘液と蛋白質の2,の3から成っています。根圏微生物は、成長と開発のため、エネルギー源としてこれらの化合物のいくつかを使用できます。根分泌物分泌物の製造工場化合物根関連細菌の挙動に影響を与える特定の遺伝子の発現に影響を与えるので rhizobacterial コミュニティの形成に重要な役割を再生します。
根分泌物に細菌の応答を理解することは、植物と微生物の相互作用メカニズムを解読の重要なステップです。植物・微生物相互作用への細菌の応答は差動遺伝子発現の製品、トランスクリプトーム解析によって学ぶことができます。このメソッドを使用して、以前の研究は、植物微生物相互作用に関与するいくつかの重要な遺伝子を特定しました。緑膿菌、新陳代謝、走化性、およびタイプ II の分泌に関与する遺伝子はテンサイ根分泌物4に対応する示されていた。ファンら。5はトウモロコシ根分泌物に対して用いて B FZB42 のトランスクリプトームのプロファイル.その結果を示すこと、強く根分泌物によって誘導される遺伝子のいくつかのグループ栄養使用率、走化性、運動性、および非リボソーム合成抗菌ペプチドとポリケチドに関連する代謝経路に関与しています。
これらの研究の精度は、根分泌物のコレクションに依存します。ただし、いくつかの方法は、異なる目的のため根分泌物のコレクションを説明した、洗練された楽器を要求または制御された条件6,7,8で実行されていません。また、根を阻害する微生物に影響を与えるルート滲出液組成植物細胞膜の透過性に影響を与える微生物9のコンソーシアムの場合は特に、根組織の損傷と。根分泌物に微生物の応答を調査するとき他の微生物10によって化合物の変質を避けるために明確に定義された条件を使用することが重要です。さらに、高品質の RNA が RNA シーケンス ベースのトランスクリプトーム研究必要です。しかし、非モデル細菌株を扱う場合、標準プロトコルまたは商業キット通常ある未知の要因または特別な成長プロパティによる低効率
ここで説明されているプロトコルは、Firmicute 門のグラム陽性、胞子形成菌であるB. mycoidesを用いて検証しました。様々 な植物の根圏におけるユビキタスです。いくつか植物成長促進プロパティは、テンサイ11、枯病菌Pythiumキュウリ12として窒素の抑制の組織的な抵抗 (ISR) の誘導を含め、この種の報告されています。ヒマワリ根13で固定。しかし、宿主植物との相互作用の分子メカニズムはよく研究されていません。
ここで示した実験の目的は、ジャガイモ根分泌物への免震 endosphere B. mycoidesのトランスクリプトーム応答を研究することです。一言で言えば、プロトコルは次の手順で構成されています: 最初に、無菌条件下でジャガイモ根分泌物を収集します。その後、根分泌物細菌細胞から高品質の RNA を抽出します。最後の手順は、web ベースの T-レックス パイプライン14を使用してデータ分析です。このプロトコルは、根分泌物との接触時に発現レベルにシフトして表示し、したがって植物微生物相互作用に重要な役割を果たす可能性があります* mycoides遺伝子を識別するために使用されました。
Protocol
Representative Results
Discussion
植物・微生物相互作用は、細菌と植物と細かく調整された平衡によって決定されるという仮説があります。このような相互作用は非常に複雑な勉強は難しい自然システムで構成されたコンソーシアムとして潜在的機能、多様な微生物種。本稿では、制御された条件下での根の分泌物に細菌の応答を研究する簡略化されたプロトコルについて説明します。根分泌物への露出に、根圏細菌のトラ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ありがとうヤコブ ベールを脱いだ彼の有用なコメントや提案。また、アン de Jong はバイオインフォマティクス解析に彼の助けに感謝我々。Yanglei 李 Zhibo Li によって中国奨学金委員会 (CSC) をサポートしています。私たちは NWO TTW Perspectief プログラム Back2Roots に感謝 (TKI-AF-15510) OPK を金融支援。
Materials
| sodium hypochlorite | Sigma | CAS: 7681-52-9 | 10-15% active chlorine |
| Luria-Bertani (LB) broth | |||
| incubater | New Brunswick Scientific | Innova 4000 | |
| spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | Genesys 20 | |
| liquid nitrogen | |||
| glass beads | Sigma | G8893 | 0.5 µm |
| 2.0 ml tube with screw cap | RNase free | ||
| 1.5 ml and 2.0 ml eppendorf tube | RNase free | ||
| Bead mill homogenizer | BioSpec | 607 | Mini_beadbeater |
| centrifuge | Eppendorf | 5430 | |
| Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | sigma | CAS: 1609-47-8 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | sigma | CAS: 151-21-3 | 10% solution prepared with DEPC treated MQ water |
| TE buffer | 10 mM Tris-HCl; 1 mM EDTA, pH=8 | ||
| phenol | Sigma | RNA grade | |
| chloroform-isoamyl alcohol | prepare 24:1 of chloroform:isoamyl alcohol, store at room temperature | ||
| High pure RNA isolation kit | Roche | 11828665001 | |
| RNase Decontamination Solution | Invitrogen | AM9780 | RNase-Zap |
| Automated electrophoresis instrument | Agilent | 2100 | Bioanalyzer |
| Microvolume spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | Nanodrop ND-1000 | |
| RNA quality analysis kit | Agilent | RNA 6000 Nano kit | |
| RNase inhibitor | Thermo Fisher Scientific | RiboLock | |
| Directional RNA library Prep kit | NEB | Ultra | For Illumina |
References
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