Interazioni piante-microrganismi: Risposta trascrizionale di Bacillus Mycoides di essudati di patate
Summary
L’obiettivo del protocollo presentato qui è quello di studiare la risposta di trascrittomica di endosphere-isolato Bacillus mycoides di essudati di patata. Questo metodo facilita l’identificazione di importanti geni batterici coinvolti nelle interazioni piante-microrganismi ed è in linea di principio applicabile ad altri endofiti e piante, con piccoli aggiustamenti.
Abstract
Batteri benefici associati pianta giocano un ruolo importante nel promuovere la crescita e prevenire la malattia in piante. L’applicazione della pianta dipromozione rhizobacteria (PGPR) come agenti di biocontrollo e concime biologico è diventato una valida alternativa all’uso di fertilizzanti convenzionali e può aumentare la produttività delle colture a basso costo. Interazioni piante-microrganismi dipendono da segnali di pianta-secreto di host e una reazione hereon dai loro batteri associati. Tuttavia, i meccanismi molecolari di batteri benefici come rispondono a loro associati pianta-derivati segnali completamente non sono capiti. Valutazione della risposta di trascrittomica di batteri di essudati radicali è un approccio potente per determinare l’espressione di gene batterico e regolamento alle condizioni rizosferici. Tale conoscenza è necessaria comprendere i meccanismi coinvolti nelle interazioni piante-microrganismi. Questo articolo descrive un protocollo dettagliato per studiare la risposta di trascrittomica di b. mycoides EC18, uno sforzo isolato dalla endosphere di patata, di essudati di patata. Con l’aiuto di recente tecnologia di sequenziamento ad alta velocità, questo protocollo può essere eseguito in diverse settimane e produrre grandi set di dati. In primo luogo, che raccogliamo gli essudati in condizioni sterili, dopo di che vengono aggiunti al b. mycoides culture. il RNA da queste culture è isolato usando un metodo di fenolo/cloroformio, combinato con un kit commerciale e sottoposti a controllo di qualità di uno strumento automatizzato di elettroforesi. Dopo l’ordinamento, l’analisi dei dati viene eseguita con la pipeline di T-REx basata sul web e viene identificato un gruppo di geni differenzialmente espressi. Questo metodo è uno strumento utile per facilitare nuove scoperte sui geni batterici coinvolti nelle interazioni piante-microrganismi.
Introduction
Piante possono essudato fino al 20% del carbonio fissato durante la fotosintesi attraverso le radici nella rizosfera1, vale a dire, la zona stretta del terreno vicino alle radici. A causa di una maggiore disponibilità dei nutrienti, la rizosfera è un habitat adatto per diversi microrganismi, inclusi batteri promuovere crescita di pianta. Gli essudati contengono una gamma di composti inorganici come ioni, acidi inorganici, ossigeno e acqua. Tuttavia, la maggior parte degli essudati radice è formata da materiali organici, che possono essere suddivisi in composti a basso peso molecolare e ad alto peso molecolare, composti. I composti a basso peso molecolare includono gli aminoacidi, acidi organici, zuccheri, composti fenolici, acidi grassi e una matrice di metaboliti secondari. I composti ad alto peso molecolare costituiti da mucillagini e proteine2,3. Microrganismi della rizosfera possono utilizzare alcuni di questi composti come fonte di energia per la crescita e lo sviluppo. Gli essudati giocano un ruolo importante nel plasmare la comunità di rizobatterica, poiché i composti pianta-prodotta in essudati possono influenzare il comportamento dei batteri associati rizosfera, influenzando l’espressione di specifici geni.
Comprensione della risposta batterica alla essudati è un passo fondamentale nel decifrare i meccanismi di interazione pianta-microbo. Come la risposta batterica alle interazioni piante-microrganismi è il prodotto dell’espressione genica, possono essere studiato mediante analisi del trascrittoma. Utilizzando questo metodo, gli studi precedenti identificati diversi importanti geni coinvolti nelle interazioni piante-microrganismi. In Pseudomonas aeruginosa, geni coinvolti nel metabolismo, chemiotassi e tipo di secrezione di II sono stati indicati per rispondere a barbabietola da zucchero radice essudati4. Ventilatore et al. 5 ha studiato la profilazione di trascrittomica di b. amyloliquefaciens FZB42 in risposta a mais essudati. I risultati ottenuti mostrano che, dei geni fortemente indotti dagli essudati, diversi gruppi sono coinvolti nelle vie metaboliche relative all’utilizzazione dei nutrienti, chemiotassi, motilità e non-ribosomal sintesi di peptidi antimicrobici e polichetidi.
La precisione di questi studi si basa sulla raccolta di essudati radicali. Anche se diversi metodi sono descritti la raccolta di essudati radicali per scopi diversi, richiedono strumenti sofisticati o non vengono eseguiti in condizioni ben controllate6,7,8. Inoltre, inibendo la rizosfera microrganismi possono influenzare composizione principale dell’essudato che interessano le permeabilità della membrana cellulare di pianta e danneggiare i tessuti della radice, particolarmente nel caso di consorzi di microrganismi9. Quando si esamina la risposta microbica di essudati radicali, è importante utilizzare condizioni ben definite al fine di evitare l’alterazione dei composti da altri microrganismi10. Inoltre, RNA di alta qualità è necessario per RNA-seq basati su studi di trascrittoma. Tuttavia, quando si tratta di ceppi non modello-batteriche, i protocolli standard o kit commerciali di solito hanno una bassa efficienza a causa di fattori sconosciuti o proprietà speciale di crescita.
Il protocollo descritto qui è stato verificato utilizzando b. mycoides, che è un batterio gram-positivo, sporigeni del phylum Firmicute. È onnipresente nella rizosfera di varie specie vegetali. Diverse proprietà di promuovere crescita pianta sono state segnalate per questa specie, tra cui l’induzione di resistenza sistematica (ISR) nella barbabietola da zucchero11, inibizione del attenuante-fuori patogeno Pythium per cetriolo12, così come azoto fissazione del girasole rizosfera13. Tuttavia, i meccanismi molecolari della sua interazione con una pianta ospite non sono ben studiati.
L’obiettivo degli esperimenti presentati qui è quello di studiare la risposta di trascrittomica di endosphere-isolato b. mycoides di essudati di patata. In breve, il protocollo prevede i passaggi seguenti: in primo luogo, raccogliere essudati di patata in condizioni sterili. Quindi, estrarre RNA di alta qualità da cellule batteriche trattate con essudati. Il passo finale è l’analisi dei dati utilizzando il web-based T-REx pipeline14. Questo protocollo è stato usato per identificare i geni di b. mycoides che mostrano un cambiamento nei livelli di espressione al contatto con essudati radicali- e quindi potrebbero giocare un ruolo importante nelle interazioni piante-microrganismi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Interazioni piante-microrganismi sono stati supposti per essere determinato da un equilibrio finemente sintonizzato tra batteri e piante. Tali interazioni sono molto complesse e difficili da studiare in un sistema naturale, che comprende diverse specie microbiche, potenzialmente funge da consorzi. Questo articolo descrive un protocollo semplificato per studiare la risposta batterica di essudati in condizioni ben controllate. Il profilo di trascrittoma di rizobatteri, sopra l’esposizione di essudati radicali, fornisce inf…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Jakob Viel per i suoi utili commenti e suggerimenti. Ringraziamo anche Anne de Jong per il suo aiuto nell’analisi bioinformatica. Yanglei Yi e Zhibo Li sono supportati dal Consiglio di borsa di studio Cina (CSC). Ringraziamo NWO-TTW Perspectief Programma Back2Roots (TKI-AF-15510) per il loro sostegno finanziario all’OPK.
Materials
| sodium hypochlorite | Sigma | CAS: 7681-52-9 | 10-15% active chlorine |
| Luria-Bertani (LB) broth | |||
| incubater | New Brunswick Scientific | Innova 4000 | |
| spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | Genesys 20 | |
| liquid nitrogen | |||
| glass beads | Sigma | G8893 | 0.5 µm |
| 2.0 ml tube with screw cap | RNase free | ||
| 1.5 ml and 2.0 ml eppendorf tube | RNase free | ||
| Bead mill homogenizer | BioSpec | 607 | Mini_beadbeater |
| centrifuge | Eppendorf | 5430 | |
| Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | sigma | CAS: 1609-47-8 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | sigma | CAS: 151-21-3 | 10% solution prepared with DEPC treated MQ water |
| TE buffer | 10 mM Tris-HCl; 1 mM EDTA, pH=8 | ||
| phenol | Sigma | RNA grade | |
| chloroform-isoamyl alcohol | prepare 24:1 of chloroform:isoamyl alcohol, store at room temperature | ||
| High pure RNA isolation kit | Roche | 11828665001 | |
| RNase Decontamination Solution | Invitrogen | AM9780 | RNase-Zap |
| Automated electrophoresis instrument | Agilent | 2100 | Bioanalyzer |
| Microvolume spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | Nanodrop ND-1000 | |
| RNA quality analysis kit | Agilent | RNA 6000 Nano kit | |
| RNase inhibitor | Thermo Fisher Scientific | RiboLock | |
| Directional RNA library Prep kit | NEB | Ultra | For Illumina |
References
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