감자 루트 Exudates 균 Mycoides 의 Transcriptional 응답을 식물 세균 상호 작용:
Summary
여기에 제시 된 프로토콜의 목표 endosphere 절연 균 mycoides 의 감자 루트 exudates에 transcriptomic 반응을 것입니다. 이 메서드는 식물-미생물 상호작용에 관련 된 중요 한 세균 유전자의 식별을 용이 하 게 하 고 원칙적으로 다른 endophytes 및 식물, 사소한 조정에 적용.
Abstract
유익한 식물 관련 박테리아 성장을 촉진 하 고 식물에 질병을 방지에 중요 한 역할. Biofertilizers 또는 biocontrol 대리인으로 식물 성장을 승진 시키는 rhizobacteria (PGPR)의 응용 프로그램 기존의 비료의 사용에 효과적인 대안이 되 고 저렴 한 비용에 작물 생산성을 높일 수 있습니다. 식물-미생물 상호작용 호스트 공장 분 비 신호 및 그들의 관련 된 박테리아에 의해 hereon 반응에 의존. 그러나 어떻게 유익한 박테리아의 분자 메커니즘 응답 그들의 관련 된 식물 유래 신호는 완전히 이해 되지 않습니다. 루트 exudates 박테리아의 transcriptomic 반응 평가 세균성 유전자 발현 rhizospheric 조건 하에서 규제를 결정 하는 강력한 접근 이다. 이러한 정보는 식물-미생물 상호작용에 관련 된 근본적인 메커니즘을 이해 하는 데 필요한 있습니다. 이 종이 transcriptomic 반응을 B. mycoides EC18, 감자 루트 exudates 감자 endosphere에서 격리 하는 긴장의 상세한 프로토콜을 설명 합니다. 최근 높은 처리량 시퀀싱 기술의 도움으로,이 프로토콜은 몇 주 및 생산 대규모 데이터 집합에서 수행할 수 있습니다. 먼저, 루트 exudates B. mycoides 문화에 추가 되는 무 균 조건 하에서 수집 합니다. 이러한 문화에서 RNA는 상용 키트와 결합 하 고 자동화 된 전기 악기에 의해 품질 관리 대상이 페 놀/클로 프롬 방법을 사용 하 여 격리 됩니다. 시퀀싱, 데이터 분석 수행 됩니다 웹 기반 T-렉스 파이프라인 차동 표현한 유전자의 그룹을 식별 하는 후에. 이 방법은 세균 유전자 식물-미생물 상호작용에 관련 된 새로운 발견을 촉진 하는 유용한 도구입니다.
Introduction
식물 exudate rhizosphere1, 즉, 뿌리 근처 토양의 좁은 영역에 뿌리를 통해 광합성 동안 고정 탄소의 최대 20% 수 있습니다. 더 높은 영양소 여부는 rhizosphere은 식물 성장을 승진 시키는 박테리아를 포함 하 여 다양 한 미생물에 대 한 적당 한 서식 지. 루트 exudates 이온, 무기 산, 산소, 물 같은 무기 화합물의 범위를 포함합니다. 그러나, 대부분의 루트 exudates 화합물 저 분자 무게 화합물 및 고분자 중량으로 분할 될 수 있다 유기 물질에 의해 형성 된다. 저 분자 무게 화합물 아미노산, 유기 산, 설탕, 페 놀 화합물, 지방산 및 2 차 대사 산물의 배열을 포함합니다. 점액과 단백질2,3높은 분자 무게 화합물에 의하여 이루어져 있다. Rhizosphere 미생물 에너지 원으로 성장 및 개발에 대 한 이러한 화합물 중 일부를 사용할 수 있습니다. 루트 exudates 이후는 exudates에서 공장 생산 화합물 영향을 미칠 수 rhizosphere 관련 된 박테리아의 동작에 영향을 주는 특정 유전자의 표현에 의해 rhizobacterial 커뮤니티 형성에 중요 한 역할을.
루트 exudates에 세균성 응답을 이해 해독 식물-미생물 상호작용 메커니즘에서 중요 한 단계입니다. 식물-미생물 상호작용에 세균성 응답 차동 유전자 발현의 제품으로, transcriptome 분석에 의해 공부 될 수 있다. 이 메서드를 사용 하 여 이전 연구 식물-미생물 상호작용에 관련 된 몇 가지 중요 한 유전자를 확인. 녹 농 균, 신진 대사, chemotaxis, 유형 II 분 비에 관여 하는 유전자 사탕 루트 exudates4에 응답을 표시 했다. 팬 외. 5 옥수수 루트 exudates 응답에 B. amyloliquefaciens FZB42의 프로 파일링 transcriptomic 공부. 그들의 결과, 강하게 루트 exudates에 의해 유도 된 유전자의 몇몇 그룹에에서 관련 영양소 사용률, chemotaxis, 운동 성, 및 항균 성 펩 티 드와 polyketides의 비 ribosomal 합성 대사 경로 보여 줍니다.
이러한 연구의 정확도 루트 exudates 컬렉션에 의존합니다. 여러 가지 방법을 서로 다른 목적을 위해 루트 exudates의 컬렉션을 설명 했으며, 비록 그들은 정교한 악기를 요구 하거나 잘 제어 조건6,,78수행 되지 않습니다. 또한, rhizosphere 억제 미생물 수 영향 루트 exudate 구성 식물 세포 막 침투성에 영향을 미치는 미생물9의 컨소시엄의 경우 특히 루트 조직 손상. 루트 exudates에 미생물 반응 조사, 다른 미생물10화합물의 피하기 위하여 잘 정의 된 조건을 사용 하 여 중요 하다. 또한, 높은-품질 RNA가 RNA-seq transcriptome 연구 기반을 위한 필요 합니다. 그러나, 비 모델 세균성 긴장 처리, 표준 프로토콜 또는 상업 키트 보통 있다 알 수 없는 요인 또는 특별 한 성장 특성으로 인해 낮은 효율성.
여기에 설명 된 프로토콜 사용 하 여 B. mycoidesFirmicute 문의 그람 양성, 포자 형성 박테리아를 확인 했습니다. 그것은 다양 한 식물 종의 rhizosphere에 유비 쿼터 스입니다. 여러 식물 성장 촉진 특성 사탕11, 감쇠 떨어져 병원 체의 Pythium 질소로 서 오이12, 억제에에서 체계적인 저항 (ISR)의 유도 포함 한이 종에 대 한 보고 해바라기 rhizosphere13에 고정입니다. 그러나, 호스트 플랜트와의 상호 작용의 분자 메커니즘은 잘 공부 하지.
여기에 제시 된 실험의 목적은 감자 루트 exudates에 endosphere 절연 B. mycoides 의 transcriptomic 반응을 것입니다. 즉, 프로토콜은 다음 단계로 구성 됩니다: 첫째, 메 마른 조건 하에서 감자 루트 exudates 수집. 그런 다음, 루트 exudates 치료 세균 세포에서 높은-품질 RNA를 추출 합니다. 마지막 단계는 T-렉스 웹 기반 파이프라인14를 사용 하 여 데이터 분석. 이 프로토콜 루트 exudates와 접촉 시 식 수준에 변화를 표시 하 고 따라서 식물-미생물 상호작용에 중요 한 역할을 재생 있습니다 B. mycoides 유전자를 식별 하기 위해 사용 되었다.
Protocol
Representative Results
Discussion
식물-미생물 상호작용 박테리아와 식물 사이 가늘게 조정된 평형에 의해 결정 될 가설 되어 있다. 이러한 상호 작용은 매우 복잡 하 고 공부 하기 어려운 자연 시스템에는 구성 다양 한 미생물 종, 잠재적으로 컨소시엄의 역할. 이 문서는 잘 제어 된 조건 하에서 루트 exudates에 세균성 응답을 공부 하는 간단한 프로토콜을 설명 합니다. Rhizobacteria, 루트 exudates에 노출 시의 transcriptome 프로필 rhizosphere …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 그의 도움이 의견 및 제안에 대 한 제이콥 재를 감사합니다. 우리는 또한 생물 정보학 분석에 그의 도움에 대 한 앤 데 종 감사합니다. Yanglei 이순신 Zhibo Li 중국 장학금 위원회 (CSC)에 의해 지원 됩니다. 우리 감사 NWO TTW Perspectief 전문 직원 Back2Roots (TKI-AF-15510) OPK에 그들의 재정 지원에 대 한.
Materials
| sodium hypochlorite | Sigma | CAS: 7681-52-9 | 10-15% active chlorine |
| Luria-Bertani (LB) broth | |||
| incubater | New Brunswick Scientific | Innova 4000 | |
| spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | Genesys 20 | |
| liquid nitrogen | |||
| glass beads | Sigma | G8893 | 0.5 µm |
| 2.0 ml tube with screw cap | RNase free | ||
| 1.5 ml and 2.0 ml eppendorf tube | RNase free | ||
| Bead mill homogenizer | BioSpec | 607 | Mini_beadbeater |
| centrifuge | Eppendorf | 5430 | |
| Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | sigma | CAS: 1609-47-8 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | sigma | CAS: 151-21-3 | 10% solution prepared with DEPC treated MQ water |
| TE buffer | 10 mM Tris-HCl; 1 mM EDTA, pH=8 | ||
| phenol | Sigma | RNA grade | |
| chloroform-isoamyl alcohol | prepare 24:1 of chloroform:isoamyl alcohol, store at room temperature | ||
| High pure RNA isolation kit | Roche | 11828665001 | |
| RNase Decontamination Solution | Invitrogen | AM9780 | RNase-Zap |
| Automated electrophoresis instrument | Agilent | 2100 | Bioanalyzer |
| Microvolume spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | Nanodrop ND-1000 | |
| RNA quality analysis kit | Agilent | RNA 6000 Nano kit | |
| RNase inhibitor | Thermo Fisher Scientific | RiboLock | |
| Directional RNA library Prep kit | NEB | Ultra | For Illumina |
References
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