Her vises en protokoll å etterligne av bakteriell-avledet forbindelser etter intestinal barriere brudd. En lav sublethal dose av lipopolysakkarid ble injisert systemisk i mus, som var overvåket for 24 timer etter injeksjon. Uttrykk for pro-inflammatoriske cytokiner var fast bestemt på flere tidspunkt i milten og leveren kolon.
Intestinal epithelial barrieren skiller verten fra microbiota som normalt tolerert eller ignorert. Brudd på denne barrieren gir av bakterier eller bakterier avledede produkter inn i vert, tilgang til verten sirkulasjon og indre organer som fører til ukontrollert betennelse som observert hos pasienter med inflammatorisk tarmsykdom (IBD), som kjennetegnes av en økt tarm epithelial permeabilitet.
For å etterligne av bakteriell-avledet forbindelser til verten, en endotoxemia modell har iverksatt som lipopolysakkarid (LPS), en komponent i ytre cellen vegg av Gram-negative bakterier, ble injisert i mus. I denne studien, en sublethal dose LPS ble intraperitoneally injisert og mus ble senere overvåket 8 h bruker en sykdom score. Videre legge uttrykket nivåer av inflammatoriske cytokiner Il6, Il1b, og Tnfa ble analysert i milten, lever og kolon av qPCR på ulike tidspunkt LPS injeksjon. Denne modellen kan være nyttig for studiene som involverer undersøkelse av immunreaksjoner etter invasjonen av mikroorganismer eller bakteriell avledede produkter skyldes barriere brudd på karosseriet.
Menneskelige tarmen er ferdig kolonisert med et stort konsortium av mikroorganismer som danner bakterieflora, som har utviklet en gjensidig fordelaktig forhold med verten under utviklingen. I dette forholdet gir verten en sikker nisje for bakterieflora, mens bakterieflora gir vitaminer, Nærings fordøyelsen og beskyttelse mot patogener til verten der bakterieflora ligger1. Når dette gunstig forholdet mellom verten og bakterieflora er forstyrret, kan sykdommer utvikle, som inflammatorisk tarmsykdom (IBD). IBD er en multifaktoriell kronisk inflammatorisk sykdom i tarmen forårsaket av genetiske og miljømessige faktorer som forekommer i to store former, Crohns sykdom (CD) og ulcerøs kolitt (UC). Til tross for likheter mellom de to IBD formene, er de preget av visse forskjeller i plasseringen og arten av inflammatoriske endringer. CD er en relapsing transmuralt inflammatorisk lidelse som potensielt kan utvide til alle deler av mage-tarmkanalen, mens UC er ikke-transmuralt og er begrenset til tykktarmen. I tillegg mutasjoner i Nucleotide bindende oligomerization domenet inneholder protein 2 (NOD2), en mønster anerkjennelse reseptor (PRR) som gjenkjenner muramyl dipeptide (MDP), en komponent i cellen vegg av mest Gram-positive og -negative bakterier, er knyttet til CD2. Videre ble Escherichia coli (E. coli), Listeria og Streptococci og deres produkter alle funnet i makrofager i CD pasienter har angitt verten når en barriere bryter3. Når bakterier eller deres produkter Angir verten under utviklingen av CD, utvikler immunsystemet et svar som fører til produksjon av sirkulerende antibakterielt antistoffer4. Kanskje stammer det mest overbevisende beviset for rollen bakterieflora i patogenesen av IBD fra musen modeller. Når dyrene er behandlet med antibiotika, eller mus holdes i bakterie-fri (GF) forhold, reduseres det alvorlighetsgraden av sykdommen i de fleste kolitt modeller, som i IL-10-/-mus som ikke utvikle kolitt i GF fasiliteter5,6. Videre forstyrrer kolitt også sammensetningen av bakterieflora, som er preget av en ubalanse komposisjon og redusert rikdom kalt dysbiosis7. Konsekvensen av IBD kan være en økt tarm permeabilitet som kan føre til inngangen mikrober og mikrobiell avledede produkter til verten.
I dyr induserer programmet av dekstran Sodium Sulfate (DSS) en intestinal epithelial brudd fører til en økt permeabilitet av epitelial barriere8. Portalen LPS konsentrasjoner er opphøyet i dyr med DSS kolitt9. Interessant, er dyr mangler C type Lektiner reseptor spesifikke intracellulær vedheft molekyl-3 fanget nonintegrin homolog-relaterte 1 (tegn-R1) beskyttet fra DSS kolitt og LPS-indusert endotoxemia10. Du videre spre til verten, må bakterier eller bakterier avledet produkter passere vaskulær barriere11, bukhulen, små og store tarmen er plassert i, hvem lymfeknuter og/eller de lever12. For å redusere kompleksiteten i systemet, ble en definert bakteriell-avledet sammensatt brukt. LP-plater, som forårsaker endotoxemia etter intraperitoneal (IP) eller intravenøs (IV) injeksjon13 ble injisert i mus, uttrykk for interleukins Il6 og Ilb og cytokin Tnfa svar på LPS.
LPS er en patogen-forbundet molekylær mønster (PAMP) uttrykt som en celle-vegg komponent av Gram-negative bakterier, som består av lipid A (den viktigste PAMP i strukturen i LPS), en kjerne oligosaccharide og en O side kjede14. Toll-like reseptor 4 (TLR4) uttrykt av dendrittiske celler og makrofager epitelceller gjenkjenner LPS15, som krever co reseptorer for aktuelle bindingen. Akutt fase protein LPS-bindende protein (LBP) binder LPS danner et kompleks som overfører LPS til cluster for differensiering 14 (CD14), en glycosylphosphatidylinositol-forankret membran protein. CD14 videre transport LPS lymfocytt antigen 96 eller også MD-2, som er forbundet med den ekstracellulære domenet av TLR4. Binding av LPS til MD-2 muliggjør dimerization av TLR4/MD-2 for å skape conformational å rekruttere intracellulær adapter molekyler for å aktivere den nedstrøms signalnettverk veien14, som inkluderer den myelogen differensiering primært Response gene 88 (MyD88) – avhengige pathway og den TIR domenet inneholder adapter-inducing interferon-β (TRIF) – avhengige veien16. Anerkjennelse av LPS av TLR4 deretter aktiverer NF-κB veien og induserer uttrykk for proinflammatory cytokiner, slik som TNFα, IL-6 og IL-1β17.
Spesielt når LPS injiseres i dyr, konsentrasjonen av LPS gitt til dyrene, har genetisk bakgrunn av dyret og kosthold vurderes. Høye konsentrasjoner av LPS fører til en septisk sjokk, preget av hypotensjon og flere organ svikt, og til slutt til død18. Mus er mindre følsomme til LPS forhold til mennesker, hvor LPS foretakssammenslutninger mellom 2-4 ng/kg kroppsvekt (BW) er i stand til å indusere en cytokin storm19. For mus, dødelig dose (LD50), som induserer død i halvparten av mus varierer fra 10-25 mg/kg BW20 avhengig av musen påkjenningen brukes. De brukte mus stammene, C57Bl/6 og BALB/c, er dødelig dose 50% (LD50) 10 mg/kg BW. Derimot er stammer C3H/HeJ og C57BL/10ScCr beskyttet mot LPS indusert endotoxemia, som skyldes mutasjoner i Tlr421. Følgelig er Tlr4 dårlig mus hyporesponsive til injeksjoner med LPS22. Andre genmodifiserte musen linjer, for eksempel PARP1/mus23 er motstandsdyktig mot LPS-indusert toksisk sjokk.
Mus-modell som er beskrevet bruker her en sublethal dose LPS administrert systemisk for å etterligne konsekvensene av LPS formidling etter en barriere brudd av kroppens overflater. Valgte LPS konsentrasjonen (2 mg/kg BW) ikke få dødelighet i C56Bl/6 mus, men indusert utgivelsen av pro-inflammatoriske cytokiner.
Denne protokollen etterligner immunologiske prosesser som oppstår etter invasjonen av mikrobielle avledede produkter. Avgjørende skritt i protokollen er valget av musen linjen, statusen hygiene for mus, dosen av LPS, overvåking av dyrene for forekomsten av endotoxemia og tidspunktet eksperiment avslutning. Viktigst, må genetisk bakgrunn av musen belastning vurderes. Annen mus stammer ha annerledes mottagelighet å LPS. For eksempel indusert C3H/HeJ og C57BL/10ScCr mus er resistente mot LPS endotoxemia<sup class="xref…
The authors have nothing to disclose.
JHN støttes av Swiss National Foundation (SNSF 310030_146290).
DreamTaq Green PCR Master Mix (2x) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | K1081 | |
High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit, | Applied Biosystems, Foster City, CA, USA | 4368813 | |
RNase-Free DNase Set, | Qiagen, Hilden, Germany | 79254 | |
LPS Escherichia coli O111:B4 | Invivogen, San Diego, CA, USA. | tlrl-eblps | |
Omnican 50 Single-use insulin syringe | B. Braun Melsungen, Melsungen, Germany | 9151125 | |
Bioanalyzer 2100 | Agilent Technologie, Santa Clara, USA | not applicable | |
Centrifuge 5430 | Eppendorf, Hamburg, Germany | not applicable | |
Centrifuge Mikro 220R | Hettich, Kirchlengern, Germany | not applicable | |
Dissection tools | Aesculap, Tuttlingen, Germany | not applicable | |
Fast-Prep-24 5G Sample Preparation System | M.P. Biomedicals, Santa Ana, CA, USA | not applicable | |
NanoDrop ND-1000 | NanoDrop Products, Wilmington, DE, USA | not applicable | |
TRI Reagent | Zymo Research, Irvine, CA, USA | R2050-1 |