Här presenterar vi ett protokoll för moduleringen av intrakardiellt autonoma nervsystemet och bedömningen av dess påverkan på grundläggande elektrofysiologi, arrhythmogenesis och läger dynamics med en ex vivo av installationsprogrammet.
Sedan dess uppfinning i sent 19: e talet fortsätter av ex vivo hjärtat perfusion systemet att vara ett relevant verktyg för att studera ett brett spektrum av fysiologisk, biokemisk, morfologisk och farmakologiska parametrar i centralt denervated hjärtan. Här beskriver vi en setup för moduleringen av intrakardiellt autonoma nervsystemet och bedömningen av dess påverkan på grundläggande elektrofysiologi, arrhythmogenesis och cykliskt adenosinmonofosfat (cAMP) dynamics. Intrakardiellt autonoma nervsystemet moduleras av mekaniska dissektion av förmaksflimmer fett kuddar-i vilken murina ganglier finns främst — eller genom användningen av globala samt riktade farmakologiska interventioner. En octapolar Elektrofysiologisk kateter införs i höger förmak och höger kammare och epikardiell placerade multi elektrod matriser (MEA) för högupplösta mappning används för att bestämma hjärtats elektrofysiologi och arrhythmogenesis. Förster resonans energiöverföringen (bandet) imaging utförs för realtid övervakning av cAMP-nivåerna i olika hjärt regioner. Neuromorphology studeras med hjälp av antikroppsbaserade färgning av hela hjärtan med neuronala märkpennor för att vägleda identifiering och modulering av specifika mål av intrakardiellt autonoma nervsystemet i de utförda studierna. Ex vivo av inställningen tillåter för ett stort antal reproducerbara experiment på kort tid. Dock delvis öppna karaktär av installationen (t.ex., under MEA mätningar) försvårar konstant temperaturkontroll och bör hållas till ett minimum. Här beskrivs metoden gör det möjligt att analysera och modulera intrakardiellt autonoma nervsystemet i decentraliserade hjärtan.
Av ex vivo hjärtat perfusion systemet fortsätter att vara ett relevant verktyg för att utföra ett brett spektrum av fysiologisk, biokemisk, morfologisk och farmakologiska studier i centralt denervated hjärtan1,2 ,3,4,5 sedan dess uppfinning i sena 19: e talet6. Hittills har detta system fortfarande används flitigt för olika ämnen (t.ex., ischemi reperfusion) eller studera hjärt farmakologiska effekter7,8, och är ett grundläggande verktyg i kardiovaskulär forskning. Livslängden på denna metod resulterar från flera fördelar (t.ex., mätningar utförs utan påverkan av centrala nervsystemet eller andra organ, systemiska cirkulationen eller cirkulerande hormoner). Om det behövs kan läkemedel läggas på ett kontrollerat sätt till perfusion bufferten eller tillämpas på specifika strukturer direkt. Experiment är reproducerbara och ett relativt högt antal experiment kan utföras i en kort tidsperiod. (Delvis) öppna karaktär av installationen kan göra temperaturreglering svår och måste beaktas. Även om det av systemet används också i större arter9, mindre djur används främst som den experimentella setup är mindre komplex och en större biologisk variabilitet (t.ex., transgen mus modeller) kan användas.
I experimentella inställningen av detta protokoll är påverkan av intrakardiellt autonoma nervsystemet på grundläggande elektrofysiologiska parametrar, ventrikulär arrhythmogenesis, epikardiell överledning och cykliskt adenosinmonofosfat (cAMP) dynamics utvärderas. Ett stort antal intrakardiellt ganglier, som främst finns i de förmaksflimmer fett kuddar och är nu väl känt att styra hjärtats elektrofysiologi oberoende från neurala centralstyrning, är antingen kvar intakt eller manuellt bort med noggrann mekanisk dissektion. En farmakologisk modulering av det autonoma nervsystemet utförs antingen globalt genom att lägga till läkemedel perfusion bufferten eller lokalt genom riktade modulering av förmaksflimmer ganglier. Efter experiment är hjärtan väl lämpade för en immunohistological bedömning som alla blodkroppar har tagits bort på grund av kontinuerlig perfusionen, vilket kan öka kvaliteten på färgning.
Teknikerna som beskrivs övergripande mål är att erbjuda nya perspektiv för detaljerade studier om effekterna av det autonoma nervsystemet på hjärtats elektrofysiologi och arrhythmogenesis i mus hjärtat. En anledning att använda denna teknik är att det är möjligt att studera och förändra det autonoma nervsystemet utan påverkan av centrala nervsystemet. En stor fördel är lätt anställning av farmakologiska experiment, i vilka potentiella pro- eller antiarytmiska egenskaper av gamla och nya agenter kan testas. Dessutom finns transgena och knockout musmodeller av olika hjärtsjukdomar att undersöka mekanismerna bakom arytmier, hjärtsvikt eller metabola sjukdomar. Detta tillvägagångssätt har ökat vår förståelse för hur det autonoma nervsystemet på nivån förmaksflimmer kan påverka ventrikulära hjärtats elektrofysiologi och induktion av arytmier.
I detta manuskript presenteras det välkända av ex vivo hjärtat perfusion systemet som ett verktyg för att studera effekterna av intrakardiellt nervceller på hjärtats elektrofysiologi och arrhythmogenesis med hjälp av olika kartläggning och stimulering tekniker inklusive endokardiella och epikardiell strategier.
Flera delar av protokollet är avgörande för installationen. Först, är det viktigt att använda en förberedelse teknik där de förmaksflimmer fett kuddar bo intak…
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka Hartwig Wieboldt för hans utmärkta tekniskt bistånd, och UKE mikroskopi Imaging Facility (Umif) av den University Medical Center Hamburg-Eppendorf för Mikroskop och stöd. Denna forskning var finansierade av Förderverein des Universitären Herzzentrums Hamburg e.V. och av DZHK (tyska centrum för kardiovaskulär forskning) [FKZ 81Z4710141].
Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S3014 | Modified Krebs-Henleit solution |
Sodium hydrogencarbonate | Sigma-Aldrich | 401676 | Modified Krebs-Henleit solution |
Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P5405 | Modified Krebs-Henleit solution |
Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P5655 | Modified Krebs-Henleit solution |
Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | M1880 | Modified Krebs-Henleit solution |
Calcium chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | C7902 | Modified Krebs-Henleit solution |
Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | Modified Krebs-Henleit solution |
Sodium pyruvate bioXtra | Sigma-Aldrich | P8574 | Modified Krebs-Henleit solution |
Carbogen (95% O2 / 5% CO2) | SOL-Group, TMG Technische und Medizinische Gas GmbH, Krefeld, Gersthofen, Germany | Modified Krebs-Henleit solution | |
Sterile filter steritop-GP 0.22 | EMD Millipore | SCGPT05RE | Modified Krebs-Henleit solution |
Atropine sulfate | Sigma-Aldrich | A0257 | Neuromodulation |
Hexamethonium chloride | Sigma-Aldrich | H2138 | Neuromodulation |
Nicotine free base 98-100% | Sigma-Aldrich | N3876 | Neuromodulation |
Formalin solution neutral buffered 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | Whole mount staining |
Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Sigma-Aldrich | 252859 | Whole mount staining |
Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | Whole mount staining |
Hydrogen peroxide solution 30% (w/w) in H2O | Merck, KGA, Darmstadt, Germany | H1009 | Whole mount staining |
Dimethyl sulfoxide | Merck, KGA, Darmstadt, Germany | D8418 | Whole mount staining |
Phosphate-buffered saline tablets | Gibco / Invitrogen | 18912-014 | Whole mount staining |
Triton-x-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Whole mount staining |
Albumin bovine fraction V | Biomol, Hamburg, Germany | 11924.03 | Whole mount staining |
Chicken anti neurofilament | EMD Millipore | AB5539 | Whole mount staining |
Rabbit anti tyrosine hydroxylase | EMD Millipore | AB152 | Whole mount staining |
Goat anti choline acetyltransferase | EMD Millipore | AP144P | Whole mount staining |
Donkey α rabbit IgG Alexa 488 | Thermo Fisher Scientific | A21206 | Whole mount staining |
Donkey α goat IgG Alexa 568 | Thermo Fisher Scientific | A11057 | Whole mount staining |
Donkey α chicken IgY Alexa 647 | Merck, KGA, Darmstadt, Germany | AP194SA6 | Whole mount staining |
Biotin-conjugated donkey α rabbit igG | R&D Systems | AP182B | Whole mount staining |
Biotin-conjugated donkey α goat igG | R&D Systems | AP192P | Whole mount staining |
Biotin-conjugated goat α chicken igY | R&D Systems | BAD010 | Whole mount staining |
Vectashield mounting medium | Vector laboratories, Burlingame, CA, USA | H-1000 | Immunohistochemistry |
Vectastain ABC kit | Vector laboratories, Burlingame, CA, USA | PK-4000 | Immunohistochemistry |
Steady DAB/Plus | Abcam plc, Cambridge, UK | ab103723 | Whole mount staining |
HistoClear | DiaTec, Bamberg, Germany | HS2002 | Immunohistochemistry |
BisBenzimide H33342 trihydrochloride (Hoechst) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | B2261 | Immunohistochemistry |
Vectashield HardSet mounting medium | Vector laboratories, Burlingame, CA, USA | VEC-H-1400 | Immunohistochemistry |
Perfusion system | HUGO SACHS ELEKTRONIK – HARVARD APPARATUS GmbH, March-Hugstetten, Germany | 73-4343 | Langendorff apparatus |
Data acquisition system and corresponding software for catheter and physiological parameter | Powerlab 8/30 & Labchart, ADInstruments, Dunedin, New Zealand | PL3508 PowerLab 8/35 | Langendorff setup |
Octapolar catheter | CIB’ER Mouse, NuMed Inc., Hopkinton, NY, USA | custom | Langendorff setup |
Stimulus generator | STG4002, Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany | STG4002-160µA | Stimulation setup |
Stimulation software | Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany | MC_Stimulus II | Stimulation setup |
Data acquisition system and corresponding software for epicardial electrograms | ME128-FAI-MPA-System, Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany | USB-ME128-System | MEA setup |
Multi-electrode array | MEA, EcoFlexMEA36, Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany | EcoFlexMEA36 | MEA setup |
Multi-electrode array recording software | Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany | MC_Rack | MEA setup |
Spring scissors | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 15003-08 | Heart Preparation |
Strabismus Scissors | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 14575-09 | Heart Preparation |
Mayo Scissors | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 14110-15 | Heart Preparation |
Dumont SS Forceps | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 11203-25 | Heart Preparation |
London Forceps | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 11080-02 | Heart Preparation |
Narrow Pattern Forceps | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 11003-13 | Heart Preparation |
Plastic Wrap | Parafilm M, Bemis NA, based in Neenah, WI, United States | Consumable Materials | |
Stereomicroscope | Leica M165FC; Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Germany | FRET | |
LED | CoolLED, Andover, UK | pE-100 | FRET |
DualView | Photometrics, Tucson, AZ, USA | DV2-SYS | FRET |
DualView filter set | Photometrics, Tucson, AZ, USA | 05-EM | FRET |
optiMOS scientific CMOS camera | Qimaging, Surrey, BC, Canada | 01-OPTIMOS-R-M-16-C | FRET |
Imaging software | Micro-Manager; Vale Lab, University of California San Francisco, CA, USA | FRET | |
Analysis Software | Image J software; Public Domain, NIH, USA | FRET |