Summary
Burada, bir iletişim kuralı modülasyonu intrakardiyak otonom sinir sistemi ve temel Elektrofizyoloji, arrhythmogenesis ve ex vivo Langendorff kurulumu kullanarak kamp dinamikleri üzerindeki etkisi değerlendirilmesi için mevcut.
Abstract
Geç 19 yy onun icat beri Langendorff ex vivo kalp perfüzyon sistemi fizyolojik, biyokimyasal, morfolojik ve farmakolojik parametrelerinde geniş bir yelpazede eğitim için uygun bir araç olmaya devam ediyor Merkezi olarak denervated kalpler. Burada, modülasyon intrakardiyak otonom sinir sistemi ve temel Elektrofizyoloji, arrhythmogenesis ve siklik adenozin monofosfattır (kampı) dinamikleri üzerindeki etkisi değerlendirmesi için bir Kur açıklayın. İntrakardiyak otonom sinir sistemi tarafından hangi fare gangliyon bulunduğu esas olarak atriyal yağ yastıkları diseksiyon mekanik modülasyonlu — veya küresel yanı sıra hedeflenen farmakolojik müdahalelerin kullanımına göre. Bir octapolar elektrofizyolojik kateter sağ atriyumu ve sağ ventrikül tanıtıldı ve epicardial yerleştirilen çoklu elektrot dizilerin (MEA) yüksek çözünürlüklü eşleme kardiyak Elektrofizyoloji ve arrhythmogenesis belirlemek için kullanılır. Imaging Förster rezonans enerji transferi (FRET) kamp düzeyleri farklı kalp bölgelerdeki gerçek zamanlı izlenmesi için gerçekleştirilir. Neuromorphology aracılığıyla boyama kılavuzu tanımlama ve modülasyon gerçekleştirilen çalışmalarda intrakardiyak otonom sinir sisteminin belirli hedefleri için nöronal işaretçileri kullanarak tüm kalplerin antikor tabanlı incelenmiştir. Ex vivo Langendorff Kur tekrarlanabilir deneyler kısa bir süre içinde çok sayıda olanak sağlar. Yine de, kısmen açık yapısı yapısı (Örn., MEA ölçümler sırasında) sabit sıcaklık kontrolü zor hale getirir ve minimumda tutulmalıdır. Açıklanan bu yöntemi analiz ve adem-i merkeziyetçi kalpler intrakardiyak otonom sinir sisteminde modüle olanak sağlar.
Introduction
Langendorff ex vivo kalp perfüzyon sistemi fizyolojik, biyokimyasal, morfolojik geniş bir yelpazede gerçekleştirmek için ilgili bir araç olmaya devam etmektedir ve hearts1,2 denervated merkezi olarak Farmakolojik çalışmalar beri onun buluşu geç 19inci yüzyıl6' ,3,4,5 . Bugüne kadar bu sistem hala yaygın olarak çeşitli konular için kullanılır (Örn., iskemi reperfüzyon) veya çalışmaya kalp farmakolojik etkileri7,8ve kardiyovasküler araştırma temel bir araçtır. Uzun ömürlü bu yöntemin sonuçları çeşitli yararları (Örn., ölçümleri merkezi sinir sistemi veya diğer organları, sistemik dolaşımı veya dolaşan hormon etkisi gerçekleştirilir). Gerekirse, eczacılık denetimli bir biçimde perfüzyon arabelleğe eklenemez veya belirli yapılara doğrudan uygulanan. Deneyler tekrarlanabilir ve deneyler nispeten yüksek bir dizi kısa bir sürede gerçekleştirilebilir. Belgili tanımlık tertibat (kısmen) açık yapısı sıcaklık regülasyonu zor ve dikkate alınması gereken yapabilirsiniz. Langendorff sistem daha büyük tür9' da kullanılsa da daha az karmaşık ve büyük bir biyolojik çeşitliliğine deneysel Kur olduğu gibi daha küçük hayvanlar öncelikle kullanılır (Örn., transgenik fare modelleri) kullanılabilir.
Bu iletişim kuralı deneysel kurulumunda, intrakardiyak otonom sinir sisteminin temel elektrofizyolojik parametreleri, ventriküler arrhythmogenesis, epicardial ve tel ve siklik adenozin monofosfattır (kampı) dynamics biri olarak değerlendirildi. Ya bozulmamış veya el ile kaldırıldı dikkatli makine ile sol atriyal yağ yastıkları esas olarak bulunan ve şimdi kardiyak Elektrofizyoloji merkezi sinir denetiminden bağımsız kontrol etmek için bilinen, intrakardiyak gangliyon, çok sayıda vardır diseksiyon. Farmakolojik bir modülasyon otonom sinir sisteminin genel olarak perfüzyon arabelleğe Eczacılık ekleyerek veya atriyal gangliyon hedeflenen modülasyon tarafından yerel olarak gerçekleştirilir. Tüm kan hücreleri boyama kalitesini artırabilir sürekli perfüzyon nedeniyle kaldırıldı olarak deneyler sonra kalpleri bir immunohistological değerlendirme için de uygundur.
Açıklanan teknikleri genel amacı kardiyak Elektrofizyoloji ve fare kalbinde arrhythmogenesis otonom sinir sisteminin etkisi konusunda ayrıntılı çalışmalar için yeni perspektifler sunmaktır. Bu tekniği kullanmak için bir neden çalışma ve otonom sinir sistemi merkezi sinir sistemine etkisi olmadan değiştirmek mümkün olmasıdır. Bir büyük avantajı kolay istihdam farmakolojik deneylerinde potansiyel pro - ya da antiarrhythmic özellikleri eski ve yeni acentalar test. Buna ek olarak, transgenik ve nakavt fare modelleri çeşitli kardiyak hastalıkların aritmiler, kalp yetmezliği veya metabolik hastalıkların altında yatan mekanizmaları incelemek kullanılabilir. Bu yaklaşımı otonom sinir sistemi atriyal düzeyde ventrikül kardiyak Elektrofizyoloji ve aritmiler indüksiyon nasıl etkileyebilir bizim anlayış geliştirmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hayvanları içeren tüm yordamları devlet Hamburg, Hamburg Üniversitesi hayvan bakımı ve kullanımı komiteler yerel yetkilileri tarafından kabul edildi.
1. Langendorff aparatı hazırlanması
Not: Piyasada bulunan bir Langendorff perfüzyon sistemi kullanılır.
- Değiştirilmiş bir Krebs-Henseleit çözüm (119 mM sodyum klorür, sodyum bikarbonat, potasyum klorür, potasyum fosfat Yem mono, magnezyum sülfat, kalsiyum klorür, glikoz 8.3 mM ve sodyum 2 mM, 2.5 mM 1,1 mM 1.2 mM 4.6 mM, 25 mM hazırlamak pyruvate). % 95'i oxygen/5% karbondioksit karışımı kalsiyum yağış önlemek için perfüzyon ekleyin. Gözenek boyutu 0,22 µm olarak arabellek filtre.
- Farmakolojik Ajan kalp Elektrofizyoloji ve gerektiği gibi arrhythmogenesis üzerindeki etkisini araştırmak için tampon ekleyin.
- Su banyosu başlatmak ve % 95 oxygen/5% karbondioksit karışımı dahil perfüzyon çözüm yerleştirin. ~ 37 ˚C kanül önce doğrudan perfüzyon çözüm sıcaklığıdır su banyosu, sıcaklığı ayarlayın.
- Silindir pompa başlatmak ve en kısa zamanda doğru sıcaklık ulaşıldığında aparatı ile perfüzyon çözüm doldurun.
- Böylece hiçbir hava kabarcıkları kanül içinde ne zaman için aparatı montaj bırakılır pompa hızı kalp eklemeden önce ayarlayın.
2. zor - ve yazılım hazırlık
- Dijital veri toplama sistemi ve ilgili yazılımı perfüzyon basıncı, akış hızı ve kalp hızı sürekli bir kayıt için Langendorff aleti bağlayın.
- Hedeflenen perfüzyon basıncı 80 mmHg için genel ayarları ayarlayın.
- Kayıt işlemini başlatmak.
- Elektrofizyoloji kateter (Tablo reçetesi) platin elektrotlar, 0.5 x 0.5 mm bir elektrot yüzeyi ve bir elektrot aralığı 0.5 mm ile veri kayıt ve stimülasyon için belirlenen dijital uyarıcı jeneratör ile kullanın.
- Nerede kalp cihazları eki sonra yerleştirilmiş olacaktır bölgesi kateter yerleştirin.
- Sonda 2 elektrotlar seçerek stimülasyon hazırlamak ve bir döngü uzunluğu 100 ms kullanın.
3. kalp hazırlanması
- Soğuk (~ 2-4 ˚C) eklemek perfüzyon arabellek (10-20 mL ve 40-50 mL, böylece bütün çanak kaplıdır) buz üzerinde 2 Petri yemekler (çapı 6 cm ve 10 cm) ve yeri ve kanül ile çanak doğrudan sonraki ve mikroskop altında. Çift düğüm kanül çevresinde hazırlayın.
- Hızla kalp sonra servikal çıkığı Mayo makas ve dar desen forseps kullanarak toraks açarak tüketim. Sonra Londra forseps kullanarak diyafram yukarıda vena kava ve aort kavrama ve kalp-akciğer blok tüm damarları ve omurga yakın bağ dokusu şaşılık makasla keserek tüketim.
- Buz gibi soğuk arabellek ile dolu kalp-akciğer bloğu ilk çanak (6 cm çapında) içine aktarmak ve akciğerleri şaşılık makas ve Londra forseps kullanarak kalp zarar vermeden dikkatli bir şekilde çıkarın. Mikroskop altında kalp yerleştirin ve timus, yemek borusu ve trakea bahar makas ve Dumont SS forseps kullanarak dikkatli bir şekilde çıkarın.
- 1.5-2 mm sağ atrium Kateter yerleştirilmesi için üst kısmında bir delik için bahar makas kullanın. Pulmoner arter delik. Daha sonra aort supraaortic dalları altında doğrudan kesmek ve düğüm kolayca eklenebilir böylece aorta dokuyu.
- Atriyal yağ yastıkları devam edin, Binbaşı da dahil olmak üzere atrially ganglionated Pleksi, sol atriyum sağlam çevresinde bulunan veya tamamen tarafından dikkatli diseksiyon kaldırmalısınız.
- Kanül ile çanak kalp aktarmak ve mikroskop altında yerleştirin. Aort kanülü üzerinde Dumont SS forseps ile çekin ve aort etrafında sıkıca hazır düğüm kravat. Böylece aort kapak ve Koroner damarları serbest bırakılır kanül aort çok derine yerleştirilen değil emin olun.
- Kanül Langendorff cihazlar için hızlı bir şekilde takın. Kanül yaptı hava kabarcığı yok olduğundan emin olun.
- Perfüzyon basıncı sabit basınç perfüzyon izin 80 mmHg için geçiş.
- Kateter dikkatli bir şekilde sağ atriyumu ve sağ ventrikül dokunmadan veya kalp zarar takın ve bant ile kanül kateter takın.
- Stimülasyon 100 ms hazır döngüsü uzunluğu için bir ilk 20 dk denge dönem başlangıcı.
- İstikrarlı bir sıcaklık izin vermek için odası kapatın.
4. elektrofizyolojik parametreleri ve Arrhythmogenesis
- Elektrofizyolojik parametreleri aşağıdaki adımlarda açıklandığı gibi değerlendirmek için iki kez atriyal veya ventriküler pacing eşik, kateterin distal veya proksimal elektrotlar ile programlanmış bir stimülasyon uygulanır.
- 10 sonrası maksimum dönüş döngüsü uzunluğu olarak sinüs düğümü toparlanma süresini belirlemek s sabit oran bir S1S1 döngü uzunluğu 120 ms, 100 ms ve 80 ms pacing.
- Uzun S1S1 döngüsü uzunluğu (8 uyaranlara; Wenckebach çizilmeye başlanacağı noktayı belirlemek S1S1: 100 ms; 2 ms kademeli azaltma) 11 AV nodal iletim kaybı ile. En uzun S1S2 olarak Atriyoventriküler nodal ateşe dayanıklı nokta belirlemek (12 uyaranlara; S1S1: 120 ms, 110 msn ve 100ms; kısa bir extrastimulus 2 ms kademeli S1S2 azalması ile birleştiğinde) AV nodal iletim kaybı ile.
- En uzun S1S2 olarak atriyal ve ventriküler ateşe dayanıklı nokta belirlemek (12 uyaranlara; S1S1: 120 ms, 110 msn ve 100ms; kısa bir extrastimulus 2 ms kademeli S1S2 azalması ile birleştiğinde) yok atriyal veya ventriküler Yanıt ile10,11.
- Programlanmış bir extrastimulation gerçekleştirmek (S1S1: 120 ms, 100 ms ve 80 ms tarafından 3 ekstra vuruş; takip, 60-20 ms 2 ms kademeli azaltma ile) veya protokoller pacing patlama (5 S1S1 s: 50-10 ms ile 10 ms kademeli azaltma) eva için Lambeth kuralları doğrultusunda luate ventriküler arrhythmogenesis10,11,12.
5. epicardial ve tel ölçümleri
Not: tek kutuplu epicardial electrograms yüksek çözünürlüklü eşlemesi için 25 kHz örnekleme oranı ile 128-kanal, bilgisayar destekli kayıt sistemi kullanarak kaydedin. 32 bir çoklu elektrot kullanın (MEA; arası elektrot mesafe: 300 µm; 1,8 x 1,8 mm). Not veri edildi bant (50 Hz) filtre ve 12 bit ve 20 sinyal aralığı ile sayısallaştırılmış mV.
- Bana kalp belirlenmiş alanda yer ve topraklama kalp13,14,15başka bir bölümüne ekleyin.
- Bana yakın bir epicardial stimülasyon kateter yerleştirin ve sabit bir stimülasyon başlar.
- Genlik ve sinyal kalitesini kontrol ederek iyi temas elektrotlar, onay alındıktan sonra kaydetmeye başlamak.
- Çevrimdışı bir analiz dalga yayılma hızı ve dağılım ve tel yönde belirlenmesi için kullanın.
6. Förster rezonans Enerji Transfer FRET tabanlı siklik adenozin monofosfattır (kampı) görüntüleme
Not: CAG-Epac1-kampları transgenik fareler16kalpler FRET tabanlı ölçümleri için hasat.
- Bir stereomicroscope15,17etrafında kendi kendini inşa bir görüntüleme sistemi kullanın.
- Stereomicroscope kalp önünde yerleştirin ve keskinliği için ayarlayın.
- Bir ışık kaynağı ile kamp sensör heyecanlandırmak [Örneğin, bir tek-dalgaboyu ışık yayan diyot kullanımı (440 nm)]. Bir ışın ayırıcı (Camgöbeği floresan protein/sarı floresan protein çifti, kullan bir 565dcxr Dikroik ayna ve D480/30 ve D535/40 emisyon filtreleri) kullanarak donör ve alıcısı kanal içine ışık emisyon bölün.
- İstikrarlı bir sıcaklık odası plastik bir şal koyarak olun.
- Bilimsel tamamlayıcı metal oksit-yarıiletken (sCMOS) kamera kullanarak görüntü alabilir. Işık kaynağı ve kamera görüntüleme yazılımı mikro-Yöneticisi gibi bir açık kaynak ile görüntü yakalama koordine etmek.
- Resim alma başlatmak için Multi-D almaitin. düğme ve hızlandırılmış kadar hangi bir görüntü edinme her 10 ayarla s, floresan sinyal (yaklaşık 100 ms) gücüne bağlıdır uygun çekim hızı ile.
- Daha önce açıklanan ve mevcut online FRET ve online 2 FRET eklentileri17 görüntü iki kanal içine bölünmüş, faiz bölgeleri seçin ve oranı izleme izlemek için kullanın.
- Satın alma sırasında deneme yapısına bağlı olarak farklı maddeler içeren değiştirilmiş Krebs-Henseleit çözüm ile kalp sıvı.
- Deney sonunda, satın alma Durdur düğmesine basarak geçin ve görüntü yığınını kaydetmek.
- İki özdeş bölümler için donör ve alıcısı kanalları görüntüleri bölebilirsiniz ve birden çok bölge-in-ilgi FRET analiz gerçekleştirebilirsiniz bir özel analiz yazılımı kullanarak çevrimdışı FRET veri analiz.
Not: Bir özel eklenti (çevrimdışı FRET), hangi Sprenger vd içinde sağlanan gereklidir 17.- Yazılımını başlatın. Analiz eklentileri menüsüne giderek açın, sonra kartve daha sonra Mikro-Yöneticisi dosya aç'ıtıklatın.
- İki özdeş resim CFP ve YFP kanallar için hızlandırılmış ayrılmıştır için çevrimdışı FRET eklentisi çalıştırmak.
- YFP görüntü ilgi bölgenin işaretlemek için Serbest seçim aracını kullanın. Seçimi Çok ölçü penceresine eklemek için Ekle düğmesine basın.
- Faiz Multi ölçü birimi penceresinde bölge seçin ve bir tablo her çerçeve ve bölge için Ortalama gri değerleri elde etmek için çok tuşuna basın. Kopyalayın ve tüm verileri bir Excel sheet yapıştırın.
- CFP görüntü yığınıüzerinde'yi tıklatın. CFP yığını için adım 6.10.4 olduğu gibi aynı işlemleri ve ortalama gri değerleri aynı Excel sayfası yapıştırın.
- Taşma payı ile faktör bağış için ham verileri çevrimdışı alıcısı kanal17düzeltmek.
- B. kanama yoluyla faktör nerede aşağıdaki formülü kullanın:
Oranı = (YFP - B x CFP) / CFP - Taşma payı üzerinden faktörü B CFP sadece ifade bir kalp Imaging tarafından belirlemek ve donör floresan YFP kanaldaki yüzdesi ölçmek (B = YFP / CFP).
- B. kanama yoluyla faktör nerede aşağıdaki formülü kullanın:
7. Neuromorphology
Not: bütün-mount immunostainings olduğu gibi fare kalplerin intrakardiyak otonom sinir sistemi çözümleme. Not çoğu intrakardiyak gangliyon epicardial yağ dokusu pulmoner damarlar yakın lokalizedir.
- Farklı stainings kullanımı neurofilament (genel nöronal yapıları; tavuk anti-NF-H, 1:3, 000), gösterimi için tirozin hidroksilaz (TH, sempatik nöronal yapıları; tavşan α TH, 1:1, 000) ve kolin asetiltransferaz (sohbet, parasempatik nöronal yapıları; keçi α sohbet, 1:50).
- Perfüzyon Langendorff aparatı içinde sonra fare kalpler 24 h için formalin 10 mL fix ve fosfat tamponlu tuz (PBS) 4 ˚C, içinde depolayabilirsiniz.
- Dent'in çamaşır suyu kalbimizde bleach (4:1:1 metanol: hidrojen peroksit çözüm %30 (w/w) H2O: dimetil sülfoksit (DMSO)) 4 ˚C 1 haftadır ve onları daha sonra rehydrate PBS'ye metanol PBS içinde azalan bir dizi (% 100, % 75, % 50, % 25; 1 h) 18.
- Aşağıdaki incubations 24-iyi-plaka kartvizitlere 4 ˚C, nazik bir ajitasyon ile gerçekleştirin:
- % 1 kalbimizde permeabilize Triton-X-100/PBS (PBS-T) için 3 x 1 h gecede engelleme arabellekte kütük parçası onları önce oda sıcaklığında [%5 Sığır serum albumin (BSA) / PBS-T + % 0,2 Sodyum azid].
- Antikorlar aşağıdaki gibi seyreltik: keçi α sohbet (1:50), tavşan α TH (1:1, 000), tavuk α neurofilament (1:3, 000); Floresan etiketleme için ikincil antikorlar (1:500; veya üreticinin yönergelerine göre); biotinylated ikincil antikorlar chromogenic etiketleme için (1: 200; veya üreticinin yönergelerine göre).
- Birincil antikorlar 4 ˚C 1 haftadır engelleme arabellekte seyreltilmiş numune kuluçkaya.
- Kalpler 3 x 15 dk için PBS-T engelleme arabellekte ikincil antikor kuluçka için 4 gün önce yıkayın.
- Kalpler 3 x 15 dk için PBS-T içinde yıkayın ve oda sıcaklığında 3 h için floresan boyama için montaj orta depolamak veya bir avidin-biotin karmaşık algılama kiti üreticinin talimatlarına göre kullanın.
- Kalpler 1s içinde bir ticari tampon 3, 3'-diaminobenzidine (DAB), için için üreticinin yönergelerine göre DAB içeren arabellekte görsel bir denetim altında geliştirme önce önceden kuluçkaya.
- Numuneler Çift Kişilik distile su içinde saklayın.
- Parafin kesitler için kurutmak ve kalpleri parafin içinde embed.
- 4-µm kalınlığında kesitler kesin ve onları Laboratuvarı rutin prosedürleri göre deparaffinize. Ve nasıl yapılması antijen alma ihtiyacı antikor kasanın bağlı olduğundan tek tek her kurulum için kurulacak ihtiyacı var.
- 10 min % 0,2 Triton-X-100/Tris-tamponlu tuz (TBS), 3 x 5 dk yıkar TBS. içinde takip için bölümleri permeabilize
- %3 ile engellemek BSA/TBS oda sıcaklığında 1 h için.
- Onları gecede 4 ˚C kuluçkaya [birincil antikorlar: keçi α sohbet (1:50), tavşan α TH (1:500), tavuk α neurofilament (1:1, 000)] veya oda sıcaklığında (ikincil antikorlar floresans etiketli, 1:500) 1 BSA/TBS ile 3 x 5 dk yıkar TBS arasında % 2 h.
- Bisbenzimide H33342 trihydrochloride 1 µg/mL ikincil antikor ekleyin veya farklı bir nükleer boyama yöntemi kullanın.
- Floresan boyama için montaj orta slaytları bağlayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 1 2 çoklu elektrot dizilerin (ölçü) dahil olmak üzere Langendorff kurulum görüntüsünü gösterir. Deneme önce intrakardiyak kateter kanülü sağ atrium/sağ ventrikül içinde hızlı ve kolay ekleme kolaylaştırmak için ve denge başlayabilirsiniz kadar kısa bir süre sağlamak için yakın konumlandırılmış. Odası tam olarak kapatılır ve istikrarlı bir sıcaklık garanti böylece alt kısmındaki odasının (bkz. Şekil 1' deki oklar) artan.
Şekil 2 farklı temsilcisi kardiyak stainings gösteriyor. Şekil 2A bir Hematoksilen ve eozin (H & E) bir parafin bölümünü boyama sunulur. Örnek büyütme (Şekil 2B), bir immunohistokimyasal bir atriyal ganglion boyama daha az çok sayıda sempatik hücrelere (yeşil, TH pozitif) göre ağırlıklı olarak parasempatik hücreleri (kırmızı, sohbet-pozitif) gösterir. Şekil 2C-E bir immunohistokimyasal sinirsel (Şekil 2C, yeşil, neurofilament) ve sempatik lifler (Şekil 2B, kırmızı, TH) (Şekil 2E) iki görüntü bindirme yanı sıra boyama nasıl sinir lifleri gösteriyor koroner sinüs arka ventrikül doğru yolu ile kulakçık gezer.
Şekil 3 kalp Langendorff aparatı ile eklenen octapolar kateter sağ atriyumu ve sağ ventrikül kanül bağlanması ve ön sol ventrikül ( epicardial çoklu elektrot dizi (MEA) yerleştirilen antikorundan gösterir Şekil 3A). Ventriküler aritmi duyarlılık RV içinde elektrotlar ile test Şekil 3B' sunulur. Ventriküler taşikardi kalplerine indüksiyon daha sık kısmi atriyal denervation sonra oluştu. Genişlemiş MEA (Şekil 3 c) elektrotlar Şematik düzeni sunulmaktadır. Bütün elektrot istikrarlı bir epicardial temas sağlamak önemlidir. Şekil 3D bir MEA tarafından kaydedilen çevrimdışı analiz epicardial iletim tasvir edilir.
Şekil 4 retrogradely Langendorff aparatı periosteum bir bütün kalp FRET ölçüleri gösterir. Farklı alanlarda kalp gerekli (4A rakamolarak) analiz edilebilir. İlaç bir küresel hem de yerel topikal uygulama kolayca bu kurulum (Şekil 4B) mümkündür.
Şekil 1: çoklu elektrot dizilerin (ölçü) dahil olmak üzere Langendorff Kur. Octapolar uyarım ve kayıt kateter kalp takılacak bölgesine yakın yerleştirilir. Odası alt kısmı yukarı taşınır (beyaz okları) sonra istikrarlı bir sıcaklık sağlanır böylece kalp cihazı için eklenmiş olması. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: kalp bütün Dağı otonom sinir sisteminin parçaları tasvir stainings. A) bir kalp H & E lekeli parafin tasviri bölümü (ölçek 1 mm). B) örnek büyütülmüş atriyal ganglion lekeli bir immunohistochemically daha az çok sayıda sempatik hücreleri (yeşil, TH-pozitif; ölçek 75 µm bar) göre ağırlıklı olarak parasempatik hücreleri (kırmızı, sohbet-pozitif) gösterir. C-E) Sinirsel (şekil 2C, yeşil, neurofilament, NF) temsilcisi immunohistokimyasal stainings ve sempatik lifler (2D rakam, kırmızı, inci ve Şekil 2Eonların bindirme) çapraz kulakçık koroner sinüs (CS) yolu ile doğru posterior ventrikül. Örnek teşkil eden lifler ok uçları tarafından işaretlenir. Yıldız atriyal gangliyon göstermek. 1 mm. bar LA, sol atriyum ölçek; LV, sol ventrikül; NF, neurofilament; PV, pulmoner damarlar; RA, sağ atrium; RAA, sağ atriyal apendiks; RV, sağ ventrikül. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: içi ve Langendorff Kur kullanarak epicardial ölçüleri. A. Bu panel bir fare kalp Langendorff sistemi içinde bir örneği gösterilir. Sağ atrium ve ventrikül ve bir epicardial çoklu elektrot dizi (MEA) eklenir intrakardiyak octapolar kateter tasvir. B. ritim bozukluğu duyarlılık test kullanarak stimülasyon (kontrol) olmadan patlama veya bir ventriküler taşikardi [sonra kısmi atriyal denervation (PAD)] tasvir kendini sonlandırma indüksiyon ile. C. epicardial MEA şematik elektrot düzen bir genişleme ile tasvir edilir. D. dalga yayılma hızı özel yapım bir yazılım kullanarak analiz. 2 m/s. isochrones arasındaki mesafedir Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: Langendorff kurulum ölçümlerde FRET. A. iki differentcAMP biyoalgılayıcı floresan Kanal [Sarı floresan protein (YFP) ve Camgöbeği floresan protein (CFP)] bir retrograd perfused kalp ölçümlerde FRET sırasında tasvir edilmektedir. Gerekirse, kalp (Örneğin, kulakçık ve ventrikül) farklı bölümlerini analiz edilebilir (ölçek çubuğu: 1 mm). B. atrium ve sol ventrikül farmakolojik bir stimülasyon sırasında kamp düzeylerini ölçen bir temsilcisi FRET deney, bu panel gösterir. İlk olarak, kalp sistemik gozlemler cyclase harekete geçirmek ile NKH477, kamp düzeylerini artırmak için bir forskolin analogon periosteum. Sonra nikotin topikal uygulanan ve akut kamp düzeyleri azaltılmış atriyal gangliyon hedef. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu makale, iyi bilinen Langendorff ex vivo kalp perfüzyon sistemi etkisi kardiyak Elektrofizyoloji ve arrhythmogenesis intrakardiyak nöronların farklı eşleme ve stimülasyon teknikleri kullanarak çalışma için bir araç olarak sunulan endocardial ve epicardial yaklaşımlar da dahil olmak üzere.
İletişim kuralı'nın çeşitli yerlerinde kurulum için büyük önem taşımaktadır. İlk olarak, atriyal yağ yastıkları bozulmamış kalmak veya hızlı bir şekilde Miyokardiyum yaralanmasına olmadan kaldırılır bir Hazırlama tekniği kullanmak önemlidir. İkinci olarak, uygun büyüklükte bir açılış sağ atriyumu ve sağ ventrikül içine octapolar kateter kolay bir ekleme için sağ atrium içinde kesmek zorundadır. Kateter kolayca herhangi bir baskı oluşturmadan sağ ventrikül kayma. Kanül için kateter eki sırasında kateter daha derin kalp yaralanmayı önlemek için ventrikül daldırma değil. Üçüncü olarak, sıcaklık kontrolü tüm Langendorff kurulumları1,2,5çok önemli bir parçasıdır. Termal odası test, istikrarlı bir sıcaklık sağlanması ritim bozukluğu sırasında kapalı. Ama bana veya perde kayıtları için odası en az kısmen ölçümleri izin vermek için açık olması gerekir. Kayıt süresi minimumda tutulmalıdır veya plastik bir şal odası uzun ölçümler sırasında koyarak gibi ısı kaybını azaltmak için başka teknikler yapılmalıdır. Dördüncü olarak, bana, tüm deneylerin aynı anatomik yerlerdeki yer almalıdır. Gerçek zamanlı analiz büyük genlikleri tarafından doğrulanır, iyi yüzey temas bir eş ağırlık üretilen iki ölçü ters sitelerinde kullanılarak elde edilebilir. Beşinci olarak, FRET ölçümleri hareketi tarafından etkilenmiştir. Spontan hareketi azaltmak için kalp tarafından intrakardiyak kateter istikrarlı bir frekansta Pace edilen. Ek istikrar için hafif bir vakum tüp tepe sakinleştirebilecek.
Bir Langendorff sisteminin kalbini daha sonra kalp sinir sisteminin immunohistological değerlendirmeler için kullanılabilir bir avantajdır. Sürekli perfüzyon çoğu kırmızı kan hücreleri autofluorescence19boyama kalitesini artırma, yüksek bir düzeyde olması kaldırır. Formalin fiksasyon sonra kalplerini fosfat tamponlu tuz için kalite boyama içinde göze çarpan değişiklikler olmadan bir yıl kadar bir sıcaklık kontrollü (4 ˚C) ortamında saklanabilir.
Bu kurulum en önemli özelliği tüm ölçüleri içinde merkezi olarak denervated HeartYorumlayan var. Ağırlıklı olarak parasempatik atriyal intrakardiyak gangliyon sempatik ganglion stellatum intrathoracically yer alır ve bu nedenle hazırlık sırasında kaldırılır kalp20 içinde son röle istasyonu şunlardır. İntrakardiyak nöronlar hiçbir Merkezi girdisini alır rağmen kardiyak sempatik sinirler photoactivation kalp hızı ve kardiyak contractile kuvvet21arttıkça onlar fizyolojik bir şekilde hala etkin olup olmadığını gösterilmiştir. İntrakardiyak nöronlar fonksiyonel önemini merkezi olarak denervated kalbinde destekleyen bu bulgular doğrultusunda, son zamanlarda ventrikül fonksiyonları ve arrhythmogenesis15üzerindeki etkisini gösterdi.
Bu merkezi olarak denervated kurulum bir avantajı farklı intrakardiyak bölgesel sinir ağları (Örneğin, atrium ve ventrikül arasındaki etkileşimi)15arasındaki iletişimi çalışmaya araştırmacı sağlanmıştır. Bu farklılıklar kime hayatta kalma tedavi görünüyorsam metoprolol süksinat22ile karşılaştırıldığında, selektif sinüs düğümü modülatör ivabradine ile tedavi geliştirir kalp nakli sonra hastalar için ilgili olabilir. Bir sonraki adımda, parasempatik (vagus siniri) veya sempatik yapıları (Ggl. stellatum23) doğrudan elektrik stimülasyonu ekstra - ve intrakardiyak otonom sinir sistemi arasındaki etkileşimi ile ilgili bilgilerimizi artırmak için yardımcı olur.
O parasempatik göz önünde tutmak önemlidir ve kateter ablasyon atriyal veya ventriküler aritmiler, gibi mevcut tedaviler kaçınılmaz olarak her iki yapıları değiştirmek böylece sempatik lifleri çoğunlukla Co yerelleştirilmiş. Burada anlatılan kurulum, hedeflenen yapıları (Örneğin, belirli parasempatik gangliyon uyarılması) yerel ilaç değişikliği okudu olabilir. Böylece potansiyel proarrhythmic veya antiarrhythmic özelliklerini çeşitli ajanların okudu hedeflenen değişiklikler yanı sıra farklı ilaç (Örneğin, beta-bloker) ile küresel perfüzyon kolayca mümkündür. Bu ayarı kullanarak, müdahaleler ve farklı teknikler stimülasyon veya inhibisyon intrakardiyak otonom sinir sistemi, üzerinde bilgi otonom sinir sistemi belirli bölümlerine etkisi vermeden farklı bölümlerinin sırasında test edilebilir kardiyak fonksiyon ve arrhythmogenesis. Ayrıca, fare kurulum kardiyak otonom sinir sistemi hastalığı miyokard infarktüsü, kalp yetmezliği veya diyabet gibi Devletleri'nde eğitim verir.
Sonuç olarak, basit ve iyi bilinen Langendorff ex vivo kalp perfüzyon sistemi değiştirmek ve etkisi kardiyak Elektrofizyoloji ve arrhythmogenesis intrakardiyak nöronların çalışma için esnek bir temel sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Yazarlar için onun mükemmel teknik yardım ve UKE mikroskobu görüntüleme Merkezi (Umif), Üniversitesi Tıp Merkezi Hamburg-mikroskoplar ve destek sağlamak için Eppendorf Hartwig Wieboldt teşekkür etmek istiyorum. Bu araştırma tarafından finanse edilen yanında Dernegimizin des Universitären Herzzentrums Hamburg e.V. yapıldı ve DZHK (Almanca Kardiyovasküler Araştırma Merkezi) tarafından [FKZ 81Z4710141].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S3014 | Modified Krebs-Henleit solution |
| Sodium hydrogencarbonate | Sigma-Aldrich | 401676 | Modified Krebs-Henleit solution |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P5405 | Modified Krebs-Henleit solution |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P5655 | Modified Krebs-Henleit solution |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | M1880 | Modified Krebs-Henleit solution |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | C7902 | Modified Krebs-Henleit solution |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | Modified Krebs-Henleit solution |
| Sodium pyruvate bioXtra | Sigma-Aldrich | P8574 | Modified Krebs-Henleit solution |
| Carbogen (95% O2 / 5% CO2) | SOL-Group, TMG Technische und Medizinische Gas GmbH, Krefeld, Gersthofen, Germany | Modified Krebs-Henleit solution | |
| Sterile filter steritop-GP 0.22 | EMD Millipore | SCGPT05RE | Modified Krebs-Henleit solution |
| Atropine sulfate | Sigma-Aldrich | A0257 | Neuromodulation |
| Hexamethonium chloride | Sigma-Aldrich | H2138 | Neuromodulation |
| Nicotine free base 98-100% | Sigma-Aldrich | N3876 | Neuromodulation |
| Formalin solution neutral buffered 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | Whole mount staining |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Sigma-Aldrich | 252859 | Whole mount staining |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | Whole mount staining |
| Hydrogen peroxide solution 30% (w/w) in H2O | Merck, KGA, Darmstadt, Germany | H1009 | Whole mount staining |
| Dimethyl sulfoxide | Merck, KGA, Darmstadt, Germany | D8418 | Whole mount staining |
| Phosphate-buffered saline tablets | Gibco / Invitrogen | 18912-014 | Whole mount staining |
| Triton-x-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Whole mount staining |
| Albumin bovine fraction V | Biomol, Hamburg, Germany | 11924.03 | Whole mount staining |
| Chicken anti neurofilament | EMD Millipore | AB5539 | Whole mount staining |
| Rabbit anti tyrosine hydroxylase | EMD Millipore | AB152 | Whole mount staining |
| Goat anti choline acetyltransferase | EMD Millipore | AP144P | Whole mount staining |
| Donkey α rabbit IgG Alexa 488 | Thermo Fisher Scientific | A21206 | Whole mount staining |
| Donkey α goat IgG Alexa 568 | Thermo Fisher Scientific | A11057 | Whole mount staining |
| Donkey α chicken IgY Alexa 647 | Merck, KGA, Darmstadt, Germany | AP194SA6 | Whole mount staining |
| Biotin-conjugated donkey α rabbit igG | R&D Systems | AP182B | Whole mount staining |
| Biotin-conjugated donkey α goat igG | R&D Systems | AP192P | Whole mount staining |
| Biotin-conjugated goat α chicken igY | R&D Systems | BAD010 | Whole mount staining |
| Vectashield mounting medium | Vector laboratories, Burlingame, CA, USA | H-1000 | Immunohistochemistry |
| Vectastain ABC kit | Vector laboratories, Burlingame, CA, USA | PK-4000 | Immunohistochemistry |
| Steady DAB/Plus | Abcam plc, Cambridge, UK | ab103723 | Whole mount staining |
| HistoClear | DiaTec, Bamberg, Germany | HS2002 | Immunohistochemistry |
| BisBenzimide H33342 trihydrochloride (Hoechst) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | B2261 | Immunohistochemistry |
| Vectashield HardSet mounting medium | Vector laboratories, Burlingame, CA, USA | VEC-H-1400 | Immunohistochemistry |
| Perfusion system | HUGO SACHS ELEKTRONIK - HARVARD APPARATUS GmbH, March-Hugstetten, Germany | 73-4343 | Langendorff apparatus |
| Data acquisition system and corresponding software for catheter and physiological parameter | Powerlab 8/30 & Labchart, ADInstruments, Dunedin, New Zealand | PL3508 PowerLab 8/35 | Langendorff setup |
| Octapolar catheter | CIB’ER Mouse, NuMed Inc., Hopkinton, NY, USA | custom | Langendorff setup |
| Stimulus generator | STG4002, Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany | STG4002-160µA | Stimulation setup |
| Stimulation software | Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany | MC_Stimulus II | Stimulation setup |
| Data acquisition system and corresponding software for epicardial electrograms | ME128-FAI-MPA-System, Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany | USB-ME128-System | MEA setup |
| Multi-electrode array | MEA, EcoFlexMEA36, Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany | EcoFlexMEA36 | MEA setup |
| Multi-electrode array recording software | Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany | MC_Rack | MEA setup |
| Spring scissors | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 15003-08 | Heart Preparation |
| Strabismus Scissors | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 14575-09 | Heart Preparation |
| Mayo Scissors | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 14110-15 | Heart Preparation |
| Dumont SS Forceps | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 11203-25 | Heart Preparation |
| London Forceps | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 11080-02 | Heart Preparation |
| Narrow Pattern Forceps | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 11003-13 | Heart Preparation |
| Plastic Wrap | Parafilm M, Bemis NA, based in Neenah, WI, United States | Consumable Materials | |
| Stereomicroscope | Leica M165FC; Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Germany | FRET | |
| LED | CoolLED, Andover, UK | pE-100 | FRET |
| DualView | Photometrics, Tucson, AZ, USA | DV2-SYS | FRET |
| DualView filter set | Photometrics, Tucson, AZ, USA | 05-EM | FRET |
| optiMOS scientific CMOS camera | Qimaging, Surrey, BC, Canada | 01-OPTIMOS-R-M-16-C | FRET |
| Imaging software | Micro-Manager; Vale Lab, University of California San Francisco, CA, USA | FRET | |
| Analysis Software | Image J software; Public Domain, NIH, USA | FRET |
References
- Bell, R. M., Mocanu, M. M., Yellon, D. M. Retrograde heart perfusion: the Langendorff technique of isolated heart perfusion. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 50 (6), 940-950 (2011).
- Sutherland, F. J., Hearse, D. J. The isolated blood and perfusion fluid perfused heart. Pharmacological Research. 41 (6), 613-627 (2000).
- Hearse, D. J., Sutherland, F. J. Experimental models for the study of cardiovascular function and disease. Pharmacological Research. 41 (6), 597-603 (2000).
- Valentin, J. P., Hoffmann, P., De Clerck, F., Hammond, T. G., Hondeghem, L. Review of the predictive value of the Langendorff heart model (Screenit system) in assessing the proarrhythmic potential of drugs. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 49 (3), 171-181 (2004).
- Skrzypiec-Spring, M., Grotthus, B., Szelag, A., Schulz, R. Isolated heart perfusion according to Langendorff-still viable in the new millennium. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 55 (2), 113-126 (2007).
- Langendorff, O. Investigation of the living mammalian heart. Pflügers Archiv. 61, 291-332 (1895).
- Matsumoto-Ida, M., Akao, M., Takeda, T., Kato, M., Kita, T. Real-time 2-photon imaging of mitochondrial function in perfused rat hearts subjected to ischemia/reperfusion. Circulation. 114 (14), 1497-1503 (2006).
- Rassaf, T., Totzeck, M., Hendgen-Cotta, U. B., Shiva, S., Heusch, G., Kelm, M. Circulating nitrite contributes to cardioprotection by remote ischemic preconditioning. Circulation Research. 114 (10), 1601-1610 (2014).
- Schechter, M. A., et al. An isolated working heart system for large animal models. Journal of Visualized Experiments. 88 (88), 51671 (2014).
- Stockigt, F., et al. Total beta-adrenoceptor knockout slows conduction and reduces inducible arrhythmias in the mouse heart. PLoS One. 7 (11), e49203 (2012).
- Berul, C. I. Electrophysiological phenotyping in genetically engineered mice. Physiological Genomics. 13 (3), 207-216 (2003).
- Curtis, M. J., et al. The Lambeth Conventions (II): guidelines for the study of animal and human ventricular and supraventricular arrhythmias. Pharmacology & Therapeutics. 139 (2), 213-248 (2013).
- Schrickel, J. W., et al. Enhanced heterogeneity of myocardial conduction and severe cardiac electrical instability in annexin A7-deficient mice. Cardiovascular Research. 76 (2), 257-268 (2007).
- Rudolph, V., et al. Myeloperoxidase acts as a profibrotic mediator of atrial fibrillation. Nature Medicine. 16 (4), 470-474 (2010).
- Jungen, C., et al. Disruption of cardiac cholinergic neurons enhances susceptibility to ventricular arrhythmias. Nature Communications. 8, 14155 (2017).
- Calebiro, D., et al. Persistent cAMP-signals triggered by internalized G-protein-coupled receptors. PLoS Biology. 7 (8), e1000172 (2009).
- Sprenger, J. U., Perera, R. K., Götz, K. R., Nikolaev, V. O. FRET microscopy for real-time monitoring of signaling events in live cells using unimolecular biosensors. Journal of Visualized Experiments. (66), e4081 (2012).
- Alanentalo, T., et al. Tomographic molecular imaging and 3D quantification within adult mouse organs. Nature Methods. 4 (1), 31-33 (2007).
- Whittington, N. C., Wray, S. Suppression of red blood cell autofluorescence for immunocytochemistry on fixed embryonic mouse tissue. Current Protocols in Neuroscience. 81, 2.28.1-2.28.12 (2017).
- Fukuda, K., Kanazawa, H., Aizawa, Y., Ardell, J. L., Shivkumar, K. Cardiac innervation and sudden cardiac death. Circulation Research. 116 (12), 2005-2019 (2015).
- Wengrowski, A. M., Wang, X., Tapa, S., Posnack, N. G., Mendelowitz, D., Kay, M. W. Optogenetic release of norepinephrine from cardiac sympathetic neurons alters mechanical and electrical function. Cardiovascular Research. 105 (2), 143-150 (2015).
- Rivinius, R., et al. Control of cardiac chronotropic function in patients after heart transplantation: effects of ivabradine and metoprolol succinate on resting heart rate in the denervated heart. Clinical Research in Cardiology. , (2017).
- Ajijola, O. A., et al. Augmentation of cardiac sympathetic tone by percutaneous low-level stellate ganglion stimulation in humans: a feasibility study. Physiological Reports. 3 (3), e12328 (2015).
