Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para a modulação do sistema nervoso autonomic intracardíaca e a avaliação da sua influência na eletrofisiologia básica, arritmogênica e acampamento dinâmica usando uma configuração de Langendorff ex vivo .
Abstract
Desde a sua invenção noséculo 19 tarde , o sistema de perfusão do Langendorff ex vivo coração continua a ser uma ferramenta relevante para o estudo de um amplo espectro de parâmetros fisiológicos, bioquímicos, morfológicos e farmacológicos em corações centralmente desnervadas. Aqui, descrevemos uma configuração para a modulação do sistema nervoso autonomic intracardíaca e a avaliação da sua influência na eletrofisiologia básica, arritmogênica e dinâmica de monofosfato de adenosina cíclico (cAMP). O sistema nervoso autônomo intracardíaco é modulado pela dissecção mecânica da gordura atrial almofadas-no quais murino gânglios estão localizados principalmente — ou pelo uso de intervenções farmacológicas globais, bem como alvo. Um cateter eletrofisiológicos octapolar é introduzido no átrio direito e o ventrículo direito, e multi eletrodos epicárdico colocado matrizes (MEA) para mapeamento de alta resolução são usados para determinar arritmogênica e Eletrofisiologia cardíaca. Transferência de energia de ressonância Förster (FRET) imagem é realizada para o monitoramento em tempo real dos níveis de campo em diferentes regiões cardíacas. Neuromorphology é estudado por meio de anticorpos-baseado coloração de todo o coração usando marcadores neuronais para orientar a identificação e a modulação de metas específicas do sistema nervoso autonomic intracardíaco nos estudos realizados. A configuração de Langendorff ex vivo permite um elevado número de experimentos reprodutíveis em um curto espaço de tempo. No entanto, a natureza parcialmente aberta da instalação (ex., durante as medições de MEA) dificulta o controle de temperatura constante e deve ser mantida a um mínimo. Esse método descrito torna possível analisar e modulam o sistema nervoso autônomo intracardíaco em corações descentralizadas.
Introduction
O sistema de perfusão do Langendorff ex vivo coração continua a ser uma ferramenta relevante para a realização de um amplo espectro de fisiológicas, bioquímicas, morfológicas e estudos farmacológicos em centralmente desnervados corações1,2 ,3,4,5 , desde a sua invenção no final 19th do século6. Até à data, este sistema é ainda amplamente utilizado para vários tópicos (EG., reperfusão de isquemia) ou estudar cardíaco farmacológico efeitos7,8e é uma ferramenta básica em pesquisa cardiovascular. A longevidade deste método resulta de várias vantagens (ex., as medições são realizadas sem a influência do sistema nervoso central ou outros órgãos, circulação sistêmica ou hormônios circulantes). Se necessário, produtos farmacêuticos podem ser adicionados de forma controlada para o buffer de perfusão ou aplicados diretamente às estruturas específicas. Experimentos são reprodutíveis, e um número relativamente elevado de experiências pode ser executado em um curto período de tempo. A natureza aberta (em parte) da instalação do pode tornar difícil de regulação da temperatura e precisa ser levado em conta. Embora o sistema de Langendorff também é usado em maior espécie9, animais menores são usados principalmente como a instalação experimental é menos complexo e uma maior variabilidade biológica (EG., transgénicos mouse modelos) podem ser usados.
No menu configuração experimental do presente protocolo, a influência do sistema nervoso autonomic intracardíaca de parâmetros eletrofisiológicos básicos, arritmogênica ventricular, condução Epicárdica e dinâmica de monofosfato de adenosina cíclico (cAMP) é avaliada. Um grande número de gânglios intracardíacos, que localizam-se principalmente nas almofadas de gordura atrial e agora são conhecidos para controlar Eletrofisiologia Cardíaca independente de controle neural central, é que também deixou intacta ou removido manualmente com cuidado mecânica dissecação. Uma modulação farmacológica do sistema nervoso autonomic é realizada globalmente pela adição de produtos farmacêuticos para o buffer de perfusão ou localmente pela modulação alvo de gânglios atrial. Após os experimentos, os corações são adequados para uma avaliação reagidos como todas as células do sangue foram removidas devido a perfusão contínua, que pode aumentar a qualidade da coloração.
O objetivo geral das técnicas descritas é oferecer novas perspectivas para estudos detalhados sobre o impacto a nível do sistema nervoso autônomo na eletrofisiologia cardíaca e arritmogênica no coração do mouse. Uma razão para usar essa técnica é que é possível estudar e alterar o sistema nervoso autônomo sem o impacto do sistema nervoso central. Uma grande vantagem é o fácil emprego de experimentos farmacológicos, em quais pro - ou antiarrítmicas Propriedades potenciais de velhos e novos agentes podem ser testados. Além disso, modelos de rato transgénico e nocaute de várias doenças cardíacas estão disponíveis para investigar os mecanismos subjacentes a arritmias, insuficiência cardíaca ou doenças metabólicas. Esta abordagem tem reforçado a nossa compreensão de como o sistema nervoso autônomo no nível atrial podem afetar Eletrofisiologia Cardíaca ventricular e a indução de arritmias.
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Protocol
Todos os procedimentos que envolvam animais foram aprovados pelas autoridades locais das comissões de uso, cuidados com animais da Universidade de Hamburgo e o estado de Hamburgo.
1. preparação do aparato de Langendorff
Nota: Um sistema de perfusão de Langendorff comercialmente disponível é usado.
- Preparar uma solução de Krebs-Henseleit modificada (119 mM de cloreto de sódio, 25 mM de bicarbonato de sódio, 4,6 mM de cloreto de potássio, 1,2 mM de fosfato de potássio monobásico, 1,1 mM de sulfato de magnésio, 2.5 mM de cloreto de cálcio, 8,3 mM de glicose e 2 mM de sódio piruvato). Adicione uma mistura de 95% de dióxido de carbono de oxygen/5% para a solução de perfusão para evitar a precipitação do cálcio. Filtre o buffer com um tamanho de poros de 0,22 µm.
- Adicione um agente farmacológico para o buffer para investigar seu efeito na eletrofisiologia cardíaca e arritmogênica conforme necessário.
- Comece o banho de água e coloque a solução de perfusão, incluindo uma mistura de 95% de dióxido de carbono de oxygen/5% nele. Ajuste a temperatura do banho de água, para que a temperatura de solução de perfusão diretamente antes da cânula é ~ 37 ˚ c.
- Inicie a bomba de roletes e encher o aparelho com a solução de perfusão assim que atingir a temperatura correta.
- Ajuste a taxa de bomba antes de anexar o coração, para que nenhuma bolha de ar é deixada na cânula quando montá-lo para o aparelho.
2. hard - e Software de preparação
- Ligar um sistema de aquisição de dados digitais e seu software correspondente ao aparelho de Langendorff para uma gravação contínua da pressão de perfusão, taxa de fluxo e frequência cardíaca.
- Ajustar a pressão de perfusão alvo nas configurações gerais para 80 mmHg.
- Inicie a gravação.
- Use um cateter de eletrofisiologia (Tabela de materiais) com eléctrodos de platina, uma superfície de eletrodo de 0,5 x 0,5 mm e um espaçamento de eletrodo de 0,5 mm para a gravação de dados e estimulação com um gerador de estímulo digital designado.
- Coloque o cateter perto da área onde o coração será posicionado após o acessório para o aparelho.
- Preparar a estimulação selecionando 2 eléctrodos do cateter e usar um comprimento de ciclo de 100 ms.
3. preparação do coração
- Adicionar o frio (~ 2-4 ˚ c) buffer de perfusão (10-20 mL e 40-50 mL, para que todo o prato está coberto) para os 2 pratos de Petri (diâmetro de 6 cm e 10 cm) e o prato com a cânula e o local-los no gelo diretamente próxima e sob o microscópio. Prepare um nó duplo ao redor da cânula.
- Excisar rapidamente o coração após deslocamento cervical, abrindo o tórax usando uma tesoura de Mayo e fórceps estreito padrão. Então segure a aorta e a veia cava acima do diafragma usando a pinça de Londres e excisar o bloco de coração-pulmão cortando todos os vasos e tecido conjuntivo perto da espinha com a tesoura de estrabismo.
- Transferir o bloco de coração-pulmão para o primeiro prato (6 cm de diâmetro) preenchido com o buffer de gelada e remova cuidadosamente os pulmões sem danificar o coração usando estrabismo tesoura e pinça de Londres. Em seguida, coloque o coração sob o microscópio e remova cuidadosamente o timo, o esôfago e a traqueia por usando mola tesoura e pinça Dumont SS.
- Use a tesoura de mola para abrir um buraco de 1,5-2 mm na parte superior da aurícula direita para a inserção do cateter. Corte um buraco na artéria pulmonar. Então cortou a aorta diretamente sob os ramos de supraaortic e remover o tecido da aorta, para que o nó pode ser conectado facilmente.
- Mantenha as almofadas de gordura atrial, incluindo o major atrially localizado ganglionated plexi, ao redor do átrio esquerdo intacto ou removê-los completamente por dissecção cuidadosa.
- Transferir o coração para o prato com a cânula e colocá-la sob o microscópio. Encostar a aorta da cânula com a pinça de Dumont SS e preparado o nó firmemente em torno da aorta. Certifique-se de que a cânula não é colocada muito fundo na aorta, para que a válvula da aorta e os vasos coronarianos são deixados livre.
- Anexe a cânula rapidamente ao aparelho de Langendorff. Certifique-se de que não há nenhuma bolha na cânula.
- Alterne a pressão de perfusão para 80 mmHg, permitindo uma perfusão de pressão constante.
- Insira o cateter cuidadosamente o átrio direito e ventrículo direito sem tocar ou danificar o coração e fixe o cateter à cânula com fita.
- Começa a estimulação com a duração do ciclo preparado de 100 ms, por um período de equilíbrio inicial 20 min.
- Feche a câmara para permitir uma temperatura estável.
4. eletrofisiológicos parâmetros e arritmogênica
- Aplica uma estimulação programada através de eletrodos distais ou proximais do cateter em duas vezes o batimentos atrial ou ventricular limiar estimulação para avaliar os parâmetros eletrofisiológicos, conforme descrito nas etapas a seguir.
- Determinar o tempo de recuperação do nó sinusal como a duração do ciclo de retorno máximo após 10 s de estimulação em um comprimento de ciclo S1S1 de 120 ms 100 ms e 80 ms fixa.
- Determinar o ponto de Wenckebach como a duração do ciclo mais longa S1S1 (8 estímulos; S1S1: 100 ms; 2 redução gradual do ms) com uma perda de 11 da condução nodal AV. Determinar os períodos refratários nodais atrioventricular como a mais longa S1S2 (12 estímulos; S1S1: 120 ms, ms 110 e 100ms; um falta acoplado extrastimulus com 2 ms redução gradual S1S2) com uma perda de condução nodal AV.
- Determinar os períodos refratários atrial e ventriculares, como a mais longa S1S2 (12 estímulos; S1S1: 120 ms, ms 110 e 100ms; um falta acoplado extrastimulus com 2 ms redução gradual S1S2) com uma resposta de batimentos atrial ou ventricular ausente10,11.
- Executar um extrastimulation programado (S1S1: 120 ms 100 ms e 80 ms, seguidos por até 3 batidas extras; 60-20 ms com uma redução gradual de 2 ms) ou explosão protocolos de estimulação (5 s no S1S1: 50-10 ms com uma redução gradual de 10 ms) em conformidade com as convenções de Lambeth para eva luate arritmogênica ventricular10,11,12.
5. Epicárdica condução medições
Nota: Registro unipolar Epicárdica electrogramas usando um sistema de gravação de 128 canais, assistida por computador com uma taxa de amostragem de 25 kHz para mapeamento de alta resolução. Usar uma matriz de eletrodo multi 32 (MEA; distância eletroda inter: 300 µm; 1,8 x 1,8 mm). Note que os dados foram filtrados de bandpass (50 Hz) e digitalizados com 12 bits e uma gama de sinal de 20 mV.
- Coloque a MEA na área designada do coração e adicionar o aterramento para outra parte do coração13,14,15.
- Coloque um cateter de estimulação Epicárdica perto o MEA e iniciar uma estimulação constante.
- Inicie a gravação após a confirmação do bom contacto dos eléctrodos, verificando a qualidade do sinal e a amplitude.
- Use uma análise off-line para a determinação da velocidade de propagação da onda e dispersão na direção da condução.
6. Förster ressonância FRET transferência de energia cíclico adenosina monofosfato (cAMP) geração de imagens baseada
Nota: Para medições baseadas no traste, colheita de corações de ratos transgénicos de CAG-Epac1-campos16.
- Use um sistema de imageamento autoconstruído em torno de um estereomicroscópio15,17.
- Coloque as duas oculares na frente do coração e ajustá-lo para a acuidade.
- Excitar o sensor de campo com uma fonte de luz [por exemplo, use um único comprimento de onda luz emitida por diodo (440 nm)]. Dividi a emissão de luz em canais de doador e aceptor usando um divisor de feixe (para um par de proteína fluorescente de proteína/amarelo fluorescente ciano, uso um 565dcxr espelho dicroico e filtros de emissão D480/30 e D535/40).
- Assegurar uma temperatura estável colocando um envoltório de plástico em torno da câmara.
- Tirar fotos usando uma câmera científica metal-óxido-semicondutor complementar (sCMOS). Coordene a fonte de luz e a câmera captura de imagem com um software como Micro-Gerenciador de imagem de código aberto.
- Para iniciar a aquisição de imagem, empurre o Acq Multi-D. botão e configurar um lapso de tempo, que adquire uma imagem cada 10 s, com o tempo de exposição adequado, que depende da força do sinal fluorescente (cerca de 100 ms).
- Use o anteriormente descrito e disponível FRET on-line e FRET on-line 2 plugins17 para dividir a imagem em dois canais, selecione as regiões de interesse e monitorar o rastreamento de relação.
- Durante a aquisição, perfundir o coração com a solução de Krebs-Henseleit modificada contendo substâncias diferentes, dependendo da natureza do experimento.
- No final do experimento, desligue a aquisição pressionando o botão parar e salvar a pilha de imagens.
- Analise os dados FRET off-line usando um software de análise dedicado que pode dividir imagens em duas seções idênticas para os canais de doador e aceptor e pode executar análise FRET em várias regiões de interesse.
Nota: Um dedicado plug-in (FRET off-line) é necessária, que é fornecido no et al . Sprenger 17.- Inicie o software. Abra a análise, indo ao menu Plugins e, em seguida, clique em MicroManagere depois em Abrir arquivo de Microgerente.
- Execute o plugin FRET off-line para dividir o lapso de tempo em duas imagens idênticas para os canais de PCP e YFP.
- Use a ferramenta de Seleções à mão livre para marcar a região de interesse na imagem YFP. Pressione o botão Adicionar para adicionar a selecção à janela Multi medida .
- Escolha a região de interesse na Medida Multi janela e pressione Multi para obter uma tabela com valores médios de cinza para cada frame e região. Copie e cole todos os dados em uma folha de Excel.
- Clique na pilha de imagem do PCP. Executar as mesmas ações como na etapa 6.10.4 para a pilha de PCP e cole a mesma folha de Excel com os valores médios de cinza.
- Corrigi os dados off-line para o fator de infiltração do doador para o aceitador canal17.
- Use a seguinte fórmula, onde B é o fator de infiltração:
Ratio = (YFP - B x CFP) / PCP - Determinar o fator de infiltração B por um coração expressando o PCP só de imagem e medir a porcentagem da fluorescência no canal YFP doador (B = YFP / PCP).
- Use a seguinte fórmula, onde B é o fator de infiltração:
7. Neuromorphology
Nota: Analise o sistema nervoso autônomo intracardíaco usando immunostainings de toda a montagem de corações murino intactas. Note que a maioria dos gânglios intracardíacos é localizada no tecido adiposo epicárdico perto das veias pulmonares.
- Usar diferentes colorações para a representação de Neurofilamento (estruturas neuronais gerais; frango anti-NF-H, 1:3, 000), Tirosina Hidroxilase (TH, simpáticas estruturas neuronais; coelho α TH, 1:1, 000) e colina acetiltransferase (ChAT, parassimpático estruturas neuronais; cabra α ChAT, 01:50).
- Após a perfusão no aparato de Langendorff, consertar os corações de rato em 10 mL de formalina para 24h e armazená-los em tampão fosfato salino (PBS) no 4 ˚ c.
- Branquear os corações em lixívia de Dent (4:1:1 metanol: água oxigenada solução 30% (w/w) em H2O: dimetilsulfóxido (DMSO)) durante 1 semana a 4 ˚ c e re-hidratá-los posteriormente a PBS em uma série de decrescente metanol em PBS (100%, 75%, 50%, 25%; 1 h cada) 18.
- Realizar a incubação do seguinte formato com uma agitação suave no 4 ˚ c-24-placa:
- Permeabilize os corações em 1% Triton-X-100/PBS (PBS-T) por 3 x 1 h à temperatura ambiente antes de bloqueá-los durante a noite em um tampão de bloqueio [5% albumina de soro bovino (BSA) / PBS-T + 0,2% de azida de sódio].
- Diluir os anticorpos como segue: cabra α ChAT (01:50), coelho α TH (1:1, 000), Neurofilamento α de frango (1:3, 000); anticorpos secundarios para rotulagem fluorescente (1: 500; ou de acordo com as instruções do fabricante); biotinilado anticorpos secundários para rotulagem cromogênico (1: 200; ou de acordo com as instruções do fabricante).
- Incube as amostras em anticorpos primários diluídos em um tampão de bloqueio durante uma semana a 4 ˚ c.
- Lave os corações para 3 x 15 min em PBS-T antes da incubação do anticorpo secundário em um tampão de bloqueio por 4 dias.
- Lave os corações para 3 x 15 min em PBS-T e armazená-los em um meio de montagem para a coloração fluorescente para 3h em temperatura ambiente ou usar um kit de deteção complexo avidina-biotina de acordo com as instruções do fabricante.
- Pre-incube os corações por 1h em um buffer de comercial para 3, 3'-diaminobenzidine (DAB), antes de desenvolvê-los sob um controle visual em um buffer contendo DAB de acordo com as instruções do fabricante.
- Armazene as amostras em água bidestilada.
- Para cortes de parafina, desidratar e incorporar os corações em parafina.
- 4-µm espessura seções de corte e deparaffinize-los de acordo com os procedimentos de rotina do laboratório. Se e como a recuperação do antígeno precisa ser executada precisa ser estabelecido para cada instalação individual uma vez que depende da combinação de anticorpos.
- Permeabilize as seções por 10 min em 0,2% Triton X-100/Tris-salino (TBS), seguido de lavagens de 3 x 5 min na TBS.
- Bloqueá-los com 3% BSA/TBS por 1h à temperatura ambiente.
- Incube-os durante a noite a 4 ˚ c [anticorpos primários: cabra α ChAT (01:50), coelho α TH (1: 500), frango Neurofilamento α (1:1, 000)] ou 2 h à temperatura ambiente (marcado com fluorescência anticorpos secundários, 1: 500) em 1% BSA/TBS com 3 x 5 min lava TBS in-between.
- Adicionar 1 µ g/mL de trihydrochloride de H33342 de bisbenzimide para a solução de anticorpo secundário ou usar um método diferente de coloração nuclear.
- Monte as lâminas em um meio de montagem para a coloração fluorescente.
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Representative Results
A Figura 1 mostra uma imagem da instalação do Langendorff incluindo 2 eletrodos multi matrizes (MEAs). Antes do experimento, o cateter intracardíaco é posicionado perto da cânula para facilitar uma rápida e fácil inserção no ventrículo direito átrio/direita e certifique-se de um curto período de tempo até que o equilíbrio pode começar. A parte inferior da câmara pode ser aumentada (veja as setas na Figura 1) para que a câmara está totalmente fechada e garante uma temperatura estável.
A Figura 2 mostra diferentes colorações cardíacas representativas. Na Figura 2A uma hematoxilina e eosina (H & E) a coloração de uma seção de parafina é apresentada. O alargamento exemplar (Figura 2B), uma coloração imuno-histoquímica de um gânglio atrial demonstra as células predominantemente parassimpáticas (vermelho, bate-papo-positivo) em comparação com menos numerosas células simpáticas (verde, TH positivo). Na Figura 2-E uma coloração imuno-histoquímica das fibras simpáticas (Figura 2D, vermelho, TH) e neural (Figura 2, verde, Neurofilamento), bem como a sobreposição das duas imagens (Figura 2E) retrata fibras neurais como Atravesse de átrios através do seio coronário para os ventrículos posteriores.
A Figura 3 mostra o murino coração conectado para a cânula do aparato de Langendorff com cateter inserido octapolar no átrio direito e ventrículo direito e uma matriz de multi eletroda Epicárdica (MEA) colocado no ventrículo esquerdo anterior ( Figura 3A). Susceptibilidade de arritmia ventricular testes através dos eléctrodos no trailer é apresentada na Figura 3B. A indução de uma taquicardia ventricular em corações ocorreu mais frequentemente após a denervação atrial parcial. O MEA alargada (Figura 3) é apresentado o layout esquemático dos eletrodos. É importante assegurar um contato epicárdico estável de todos os eletrodos. Na Figura 3D é retratada a condução Epicárdica off-line-analisados, gravada por um MEA.
A Figura 4 mostra o FRET medições em um retrogradely sendo perfundido no aparato de Langendorff todo o coração. Diferentes áreas do coração podem ser analisadas como necessário (Figura 4A). Global, bem como local a aplicação tópica de fármacos é facilmente possível nesta configuração (Figura 4B).
Figura 1: configuração de Langendorff incluindo matrizes multi eletrodos (MEAs). O cateter de estimulação e gravação de octapolar é colocado perto da área em que o coração será anexado. A parte inferior da câmara será movida para cima (branco setas) depois o coração foi anexado ao aparelho de modo que seja assegurada uma temperatura estável. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Cardiac toda montagem citológicas retratando partes do sistema nervoso autonomic. A) representação de um cardíaco H & parafina manchada E seção (escala bar 1 mm). B) um alargamento exemplar de um immunohistochemically manchado gânglio atrial demonstra as células predominantemente parassimpáticas (vermelho, bate-papo-positivo) em comparação com menos numerosas células simpáticas (verde, TH-positivo; escala bar 75 µm). C-E) Colorações imuno-histoquímica representante de neural (Figura 2, verde, Neurofilamento, NF) e fibras simpáticas (Figura 2D, vermelho, TH e sua sobreposição na Figura 2E) desviar do átrios através do seio coronário (CS) em direção a ventrículos posteriores. Exemplares fibras são marcadas por pontas de flechas. Asteriscos denotam gânglios atrial. Escala da barra 1 mm. LA, átrio esquerdo; LV, ventrículo esquerdo; NF, Neurofilamento; PV, veias pulmonares; RA, átrio direito; RAA, apêndice atrial direito; RV, o ventrículo direito. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Intrae Epicárdica medições usando a configuração de Langendorff. A. este painel mostra um exemplo de um coração murino dentro do sistema de Langendorff. O cateter intracardíaco octapolar, que é inserido no átrio direito e ventrículo esquerdo e uma matriz de multi eletroda Epicárdica (MEA) são retratados. B. testes de susceptibilidade arritmia usando estourar estimulação sem (controle) ou com a indução de um self encerra taquicardia ventricular [após denervação atrial parcial (PAD)] são retratados. C. O MEA Epicárdica é retratado com um alargamento do layout esquemático do eletrodo. D. velocidade de propagação da onda foi analisada utilizando um software feito sob medida. A distância entre o isócronas é 2 m/s. , por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: FRET medições em uma configuração de Langendorff. A. os dois differentcAMP biosensor fluorescência canais [proteína fluorescente amarela (YFP) e proteína fluorescente ciana (PCP)] durante as medições de traste em um coração perfundido retrógrada são retratados. Se necessário, diferentes partes do coração (por exemplo, átrios e ventrículo) podem ser analisadas (barra de escala: 1 mm). B. este painel mostra um experimento FRET representativo, que mede os níveis de campo durante uma estimulação farmacológica no átrio e ventrículo esquerdo. Primeiro, o coração era sistemicamente perfundido com o ativador adenilato ciclase NKH477, um analogon forskolin, para aumentar os níveis de acampamento. Então nicotina foi topicamente aplicada e direcionada para os gânglios atrial, que agudamente reduziram os níveis de acampamento. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Neste manuscrito, o conhecido Langendorff ex vivo coração perfusão sistema é apresentado como uma ferramenta para estudar o impacto dos neurônios intracardíacos eletrofisiologia cardíaca e arritmogênica usando mapeamento diferente e técnicas de estimulação incluindo as abordagens endocárdico e Epicárdica.
Várias partes do protocolo são cruciais para a instalação. Em primeiro lugar, é importante o uso de uma técnica de preparação em que as almofadas de gordura atrial permanecer intacto ou são removidas rapidamente sem ferir o miocárdio. Em segundo lugar, uma abertura de tamanho adequado deve ser cortado no átrio direito para uma fácil inserção do cateter octapolar no átrio direito e ventrículo direito. O cateter deve deslizar facilmente em ventrículo direito sem gerar qualquer tipo de pressão. Durante a fixação do cateter para a cânula, o cateter não deve mergulhar mais fundo para o ventrículo, para evitar lesão cardíaca. Em terceiro lugar, o controle de temperatura é uma parte crucial de todos Langendorff configurações1,2,5. A câmara térmica é fechada durante a arritmia, ensaios, garantindo uma temperatura estável. Mas para as gravações de MEA ou FRET, a câmara precisa ser, pelo menos, parcialmente aberto para permitir que as medições. Tempo de gravação deve ser mantido a um mínimo, ou outras técnicas para reduzir a perda de temperatura, como colocar um envoltório de plástico em torno da câmara durante as medições de tempo, devem ser realizadas. Em quarto lugar, MEAs devem ser colocados nos mesmos locais anatômicos em todos os experimentos. Bom contato de superfície, o que é confirmado por grandes amplitudes na análise em tempo real, pode ser alcançado usando dois MEAs em sites opostos para que um contrapeso é produzido. Em quinto lugar, FRET medições são influenciadas pelo movimento. Para reduzir o movimento espontâneo, o coração é acelerado em uma frequência estável por cateter intracardíaco. Para estabilização adicional, um tubo com um ligeiro vácuo pode estabilizar o ápice.
Uma vantagem do sistema de Langendorff é que os corações podem ser usados posteriormente para reagidos avaliações do sistema nervoso cardíaco. A perfusão contínua remove a maioria das células vermelhas do sangue que têm um elevado nível de autofluorescência19, melhorando a qualidade da coloração. Após a fixação de formalina, os corações podem ser armazenados em um ambiente de temperatura controlada (4 ˚ c) em tampão fosfato salino para até um ano sem mudanças perceptíveis na coloração de qualidade.
A característica mais importante desta configuração é que todas as medições são realizadas em um coração desnervado centralmente. Os gânglios intracardíacos atrial predominantemente parassimpáticos são a última estação de retransmissão dentro o coração20 como o gânglio simpático stellatum situa-se intrathoracically e, portanto, é removido durante a preparação. Embora os neurônios intracardíacos não obter nenhuma entrada central, mostrou que eles são como o photoactivation de nervos simpáticos cardíacos aumenta a frequência cardíaca e a força contrátil cardíaca21ainda ativos de forma fisiológica. Em consonância com estas conclusões, apoiando a importância funcional dos neurônios intracardíacos no coração desnervado centralmente, demonstrámos recentemente seu impacto sobre a função ventricular e arritmogênica15.
Uma vantagem desta configuração centralmente desnervada é que ele permite que o pesquisador a estudar a comunicação entre diferentes intracardíaco regional redes neurais (por exemplo, a interação entre o átrio e o ventrículo)15. Essas diferenças podem ser relevantes para pacientes após transplante cardíaco em quem o tratamento com o ivabradine de modulador seletivo nó sinusal melhora a sobrevivência, comparada ao tratamento com beta-bloqueador metoprolol succinato22. Em uma etapa futura, estimulação elétrica direta do parassimpático (nervo vago) ou estruturas simpáticas (Ggl. stellatum23) vai ajudar a melhorar o nosso conhecimento da interação entre o sistema nervoso intracardíaco e extra.
É importante ter em mente que parassimpático e simpáticas fibras são na sua maioria co localizadas para que atuais terapias como a ablação por cateter de arritmias atrial ou ventriculares inevitavelmente modificará as duas estruturas. No menu configuração descrita aqui, local farmacêutica modificação de estruturas específicas (por exemplo, estimulação específica de Gânglios parassimpáticos) pode ser estudada. Além de modificações específicas, perfusão global com diferentes fármacos (por exemplo, beta-bloqueadores) é facilmente possível, para que potenciais Propriedades pró-arrítmica ou antidisrítmico de vários agentes podem ser estudadas. Usando esta configuração, as intervenções e técnicas diferentes podem ser testadas durante a estimulação ou a inibição de diferentes partes do intracardíaco sistema nervoso autônomo, revelando informações do impacto das partes específicas do sistema nervoso autônomo na função cardíaca e arritmogênica. Além disso, a instalação de murino permite estudar o sistema nervoso autônomo cardíaco nos Estados de doença como diabetes, insuficiência cardíaca ou infarto do miocárdio.
Em conclusão, o sistema simples e bem conhecido Langendorff ex vivo coração perfusão fornece uma base flexível para modificar e estudar o impacto dos neurônios intracardíacos eletrofisiologia cardíaca e arritmogênica.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Os autores gostaria agradecer Hartwig Wieboldt por sua excelente assistência técnica e o UKE microscopia Imaging Facility (Umif) da universidade médica centro de Hamburgo-Eppendorf para fornecer suporte e microscópios. Esta pesquisa foi financiada bythe Förderverein des Universitären Herzzentrums Hamburg e.V. e pelo DZHK (centro alemão de pesquisa Cardiovascular) [FKZ 81Z4710141].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S3014 | Modified Krebs-Henleit solution |
| Sodium hydrogencarbonate | Sigma-Aldrich | 401676 | Modified Krebs-Henleit solution |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P5405 | Modified Krebs-Henleit solution |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P5655 | Modified Krebs-Henleit solution |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | M1880 | Modified Krebs-Henleit solution |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | C7902 | Modified Krebs-Henleit solution |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | Modified Krebs-Henleit solution |
| Sodium pyruvate bioXtra | Sigma-Aldrich | P8574 | Modified Krebs-Henleit solution |
| Carbogen (95% O2 / 5% CO2) | SOL-Group, TMG Technische und Medizinische Gas GmbH, Krefeld, Gersthofen, Germany | Modified Krebs-Henleit solution | |
| Sterile filter steritop-GP 0.22 | EMD Millipore | SCGPT05RE | Modified Krebs-Henleit solution |
| Atropine sulfate | Sigma-Aldrich | A0257 | Neuromodulation |
| Hexamethonium chloride | Sigma-Aldrich | H2138 | Neuromodulation |
| Nicotine free base 98-100% | Sigma-Aldrich | N3876 | Neuromodulation |
| Formalin solution neutral buffered 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | Whole mount staining |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Sigma-Aldrich | 252859 | Whole mount staining |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | Whole mount staining |
| Hydrogen peroxide solution 30% (w/w) in H2O | Merck, KGA, Darmstadt, Germany | H1009 | Whole mount staining |
| Dimethyl sulfoxide | Merck, KGA, Darmstadt, Germany | D8418 | Whole mount staining |
| Phosphate-buffered saline tablets | Gibco / Invitrogen | 18912-014 | Whole mount staining |
| Triton-x-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Whole mount staining |
| Albumin bovine fraction V | Biomol, Hamburg, Germany | 11924.03 | Whole mount staining |
| Chicken anti neurofilament | EMD Millipore | AB5539 | Whole mount staining |
| Rabbit anti tyrosine hydroxylase | EMD Millipore | AB152 | Whole mount staining |
| Goat anti choline acetyltransferase | EMD Millipore | AP144P | Whole mount staining |
| Donkey α rabbit IgG Alexa 488 | Thermo Fisher Scientific | A21206 | Whole mount staining |
| Donkey α goat IgG Alexa 568 | Thermo Fisher Scientific | A11057 | Whole mount staining |
| Donkey α chicken IgY Alexa 647 | Merck, KGA, Darmstadt, Germany | AP194SA6 | Whole mount staining |
| Biotin-conjugated donkey α rabbit igG | R&D Systems | AP182B | Whole mount staining |
| Biotin-conjugated donkey α goat igG | R&D Systems | AP192P | Whole mount staining |
| Biotin-conjugated goat α chicken igY | R&D Systems | BAD010 | Whole mount staining |
| Vectashield mounting medium | Vector laboratories, Burlingame, CA, USA | H-1000 | Immunohistochemistry |
| Vectastain ABC kit | Vector laboratories, Burlingame, CA, USA | PK-4000 | Immunohistochemistry |
| Steady DAB/Plus | Abcam plc, Cambridge, UK | ab103723 | Whole mount staining |
| HistoClear | DiaTec, Bamberg, Germany | HS2002 | Immunohistochemistry |
| BisBenzimide H33342 trihydrochloride (Hoechst) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | B2261 | Immunohistochemistry |
| Vectashield HardSet mounting medium | Vector laboratories, Burlingame, CA, USA | VEC-H-1400 | Immunohistochemistry |
| Perfusion system | HUGO SACHS ELEKTRONIK - HARVARD APPARATUS GmbH, March-Hugstetten, Germany | 73-4343 | Langendorff apparatus |
| Data acquisition system and corresponding software for catheter and physiological parameter | Powerlab 8/30 & Labchart, ADInstruments, Dunedin, New Zealand | PL3508 PowerLab 8/35 | Langendorff setup |
| Octapolar catheter | CIB’ER Mouse, NuMed Inc., Hopkinton, NY, USA | custom | Langendorff setup |
| Stimulus generator | STG4002, Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany | STG4002-160µA | Stimulation setup |
| Stimulation software | Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany | MC_Stimulus II | Stimulation setup |
| Data acquisition system and corresponding software for epicardial electrograms | ME128-FAI-MPA-System, Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany | USB-ME128-System | MEA setup |
| Multi-electrode array | MEA, EcoFlexMEA36, Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany | EcoFlexMEA36 | MEA setup |
| Multi-electrode array recording software | Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany | MC_Rack | MEA setup |
| Spring scissors | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 15003-08 | Heart Preparation |
| Strabismus Scissors | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 14575-09 | Heart Preparation |
| Mayo Scissors | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 14110-15 | Heart Preparation |
| Dumont SS Forceps | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 11203-25 | Heart Preparation |
| London Forceps | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 11080-02 | Heart Preparation |
| Narrow Pattern Forceps | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 11003-13 | Heart Preparation |
| Plastic Wrap | Parafilm M, Bemis NA, based in Neenah, WI, United States | Consumable Materials | |
| Stereomicroscope | Leica M165FC; Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Germany | FRET | |
| LED | CoolLED, Andover, UK | pE-100 | FRET |
| DualView | Photometrics, Tucson, AZ, USA | DV2-SYS | FRET |
| DualView filter set | Photometrics, Tucson, AZ, USA | 05-EM | FRET |
| optiMOS scientific CMOS camera | Qimaging, Surrey, BC, Canada | 01-OPTIMOS-R-M-16-C | FRET |
| Imaging software | Micro-Manager; Vale Lab, University of California San Francisco, CA, USA | FRET | |
| Analysis Software | Image J software; Public Domain, NIH, USA | FRET |
References
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