Summary
نقدم هنا، على بروتوكول لتحوير intracardiac العصبي اللاإرادي وتقييم تأثيرها على الكهربية الأساسية، أررهيثموجينيسيس، وديناميات المخيم باستخدام إعداد لانجيندورف السابقين فيفو .
Abstract
منذ اختراع لها في القرنال 19 في وقت متأخر، لا يزال نظام التروية السابقين فيفو لانجيندورف القلب لتكون أداة مناسبة لدراسة طائفة واسعة من المعلمات الفسيولوجية والبيوكيميائية والمورفولوجية والدوائية في قلوب دينيرفاتيد مركزياً. هنا، يمكننا وصف إعداد لتحوير intracardiac العصبي اللاإرادي وتقييم تأثيرها على الكهربية الأساسية، أررهيثموجينيسيس، وديناميات دوري الادينوسين الأدينوزين (مخيم). هو عن طريق تشريح الميكانيكية من الدهون أذينية منصات في ganglia مورين التي تقع أساسا التضمين العصبي اللاإرادي intracardiac – أو بواسطة استخدام التدخلات الدوائية العالمية فضلا عن المستهدف. يتم إدخال قسطرة الكهربية أوكتابولار في الاذين الأيمن والبطين الأيمن، وتستخدم صفائف متعدد القطب epicardial وضعها (طيران الشرق الأوسط) لرسم خرائط عالية الدقة لتحديد القلب الكهربية وأررهيثموجينيسيس. يتم تنفيذ نقل الطاقة الرنين فورستر (الحنق) تصوير للرصد في الوقت الحقيقي لمستويات المخيمات في مناطق مختلفة من القلب. هو درس نيورومورفولوجي عن طريق القائم على جسم تلطيخ القلوب كلها باستخدام علامات العصبية ليسترشد بها في تحديد الهوية والتحوير لأهداف محددة من الجهاز العصبي اللاإرادي intracardiac في الدراسات المنجزة. الإعداد لانجيندورف السابقين فيفو يسمح لعدد كبير من التجارب استنساخه في فترة زمنية قصيرة. على الرغم من ذلك، الطبيعة المفتوحة جزئيا للإعداد (مثلاً.، خلال قياسات الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف) يجعل من الصعب التحكم في درجة حرارة ثابتة وينبغي أن يظل الحد أدنى. هذا الأسلوب هو موضح يجعل من الممكن لتحليل وتعدل intracardiac العصبي المستقل في قلوب اللامركزية.
Introduction
لا يزال نظام التروية السابقين فيفو لانجيندورف القلب لتكون أداة مناسبة لأداء مجموعة واسعة من الفسيولوجية والبيوكيميائية والمورفولوجية، والدراسات الدوائية في مركزي دينيرفاتيد القلوب1،2 3، ،،من45 منذ اختراع لها فيال 19 أواخر القرن6. وحتى الآن، ويستخدم هذا النظام على نطاق واسع لمختلف المواضيع (مثلاً.، الاسكيمية ضخه) أو لدراسة القلب الدوائي آثار7،8، وهو أداة أساسية في أبحاث القلب والأوعية الدموية. طول العمر لهذا الأسلوب ينتج من مزايا عديدة (مثلاً.، قياسات تتم دون التأثير الجهاز العصبي المركزي أو أجهزة، والدوران الجهازي، أو هرمونات المتداولة). إذا لزم الأمر، يمكن إضافتها بطريقة الخاضعة للرقابة إلى المخزن المؤقت نضح المستحضرات الصيدلانية أو تطبيقها على هياكل محددة مباشرة. تجارب استنساخه، ويمكن أن يؤديها عدد كبير نسبيا من التجارب في فترة قصيرة من الزمن. يمكن جعل الطبيعة المفتوحة (جزئيا) للإعداد تنظيم درجة الحرارة صعبة وتحتاج إلى أن تؤخذ في الاعتبار. على الرغم من أن النظام لانجيندورف يستخدم أيضا في أكبر الأنواع9، أصغر الحيوانات تستخدم أساسا كالأعداد التجريبية هو أقل تعقيداً، وتغير البيولوجي أكبر (مثلاً.، محوره وراثيا الفأر نماذج) يمكن استخدامها.
في إعداد هذا البروتوكول التجريبي، تأثير النظام العصبي اللاإرادي intracardiac على البارامترات الأساسية للكهربية والبطين أررهيثموجينيسيس والتوصيل ابيكارديال وديناميات دوري الادينوسين الأدينوزين (مخيم) تقييم. عدد كبير من العقد إينتراكاردياك، التي تقع أساسا في منصات الدهون الرجفان، والآن معروفة جيدا لمراقبة القلب الكهربية المستقل من السيطرة العصبية المركزية، أما ترك سليمة أو إزالتها يدوياً بعناية الميكانيكية تشريح. يتم تنفيذ تحوير الدوائي العصبي المستقل أما على الصعيد العالمي عن طريق إضافة المستحضرات الصيدلانية إلى المخزن المؤقت نضح أو محلياً بالتحوير مستهدفة من ganglia أذينية. بعد التجارب، والقلوب أيضا مناسبة لتقييم إيمونوهيستولوجيكال كما تم إزالة جميع خلايا الدم بسبب التروية المستمرة، التي يمكن أن تزيد من نوعية تلطيخ.
الهدف العام لتقنيات وصف عرض منظورات جديدة لدراسات تفصيلية فيما يتعلق بتأثير النظام العصبي اللاإرادي في القلب الكهربية وأررهيثموجينيسيس في قلب الماوس. سببا لاستخدام هذا الأسلوب أنه من الممكن دراسة وتغيير النظام العصبي اللاإرادي دون تأثير الجهاز العصبي المركزي. ميزة واحدة كبرى هي توظيف سهلة للتجارب الدوائية، في المحتملة برو-أو أنتيارهيثميك الخصائص التي القديمة ويمكن اختبار العوامل الجديدة. وبالإضافة إلى ذلك، تتوفر نماذج الماوس المعدلة وراثيا والضربة القاضية لمختلف أمراض القلب للتحقيق في الآليات الكامنة وراء عدم انتظام ضربات القلب أو فشل القلب أو الأمراض الأيضية. وعزز هذا النهج فهم كيف يمكن أن يؤثر العصبي المستقل على مستوى أذينية بطيني القلب الكهربية وتنظيم دورات تعريفية لعدم انتظام ضربات القلب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
جميع الإجراءات التي تنطوي على الحيوانات بموافقة السلطات المحلية "الدولة هامبورغ"، وجامعة هامبورغ رعاية الحيوان و "استخدام اللجان".
1-إعداد جهاز لانجيندورف
ملاحظة: يتم استخدام نظام التروية لانجيندورف متاحة تجارياً.
- تعد حلاً كريبس-هينسيليت معدلة (119 مم كلوريد الصوديوم، 25 مم بيكربونات الصوديوم، 4.6 ملم كلوريد البوتاسيوم، 1.2 مم فوسفات البوتاسيوم مونوباسيك، 1.1 مم سلفات المغنيزيوم، 2.5 ملم كلوريد الكالسيوم، 8.3 من السكر، و 2 ملم من الصوديوم بيروفات). إضافة خليط من ثاني أكسيد الكربون oxygen/5% 95% إلى الحل نضح لمنع ترسيب الكالسيوم. قم بتصفية المخزن المؤقت مع حجم مسام 0.22 ميكرومتر.
- إضافة عامل الدوائي إلى المخزن المؤقت للتحقيق في تأثيره على القلب الكهربية وأررهيثموجينيسيس حسب الحاجة.
- بدء حمام المياه ووضع الحل نضح بما في ذلك مزيج من 95% ثاني أكسيد الكربون oxygen/5% في ذلك. ضبط درجة حرارة الحمام المياه، حيث تكون درجة الحرارة الحل نضح مباشرة قبل القنية ˚C ~ 37.
- بدء تشغيل المضخة الدوارة وشغل الجهاز مع الحل نضح حالما يتم التوصل إلى درجة الحرارة الصحيحة.
- ضبط معدل ضخ قبل إرفاق القلب، بحيث يتم ترك لا فقاعات الهواء في القنية عند تركيب ذلك إلى الجهاز.
2-الثابت-وإعداد البرامج
- قم بتوصيل نظام الحصول على بيانات رقمية وما يقابلها من البرمجيات لجهاز لانجيندورف لتسجيل مستمر لضغط التروية ومعدل التدفق، ومعدل ضربات القلب.
- تعيين ضغط التروية المستهدفة في الإعدادات العامة إلى 80 مم زئبق.
- بدء التسجيل.
- استخدام قسطرة الكهربية (جدول المواد) مع أقطاب البلاتين وسطح قطب 0.5 × 0.5 ملم تباعد قطب من 0.5 مم لتسجيل البيانات والتحفيز بمولد حافز رقمي معين.
- مكان القسطرة قريبة من منطقة حيث ستتمركز في القلب بعد المرفق بالجهاز.
- يعد التحفيز عن طريق تحديد أقطاب 2 من القسطرة وتستخدم طول دورة 100 مللي ثانية.
3-إعداد القلب
- إضافة البرد (˚C ~ 2-4) نضح المخزن المؤقت (10-20 مل و 40-50 مل، حيث أنه يتم تغطية الطبق كله) أطباق بيتري 2 (قطرها 6 سم و 10 سم) والطبق مع القنية ومكان لهم في الجليد القادم مباشرة وتحت المجهر. إعداد عقده مزدوجة حول القنية.
- سرعة المكوس القلب بعد خلع عنق الرحم عن طريق فتح الصدر باستخدام مقص مايو كلينيك وملقط النقش الضيقة. ثم قبضة بالشريان الاورطي والوريد الأجوف فوق الحجاب الحاجز باستخدام الملقط لندن والمكوس كتلة القلب والرئة بقطع جميع السفن والنسيج الضام قريبة من العمود الفقري مع المقص الحول.
- نقل كتلة القلب والرئة في الطبق الأول (قطرها 6 سم) مليئة بالمخزن المؤقت المثلج وإزالة الرئتين بعناية دون الأضرار القلب باستخدام مقص الحول والملقط لندن. ثم ضع القلب تحت المجهر وإزالة الغدة الصعترية، والمريء والقصبة الهوائية بعناية باستخدام مقص الربيع والملقط SS دومون.
- استخدام مقص الربيع لقطع حفرة من 1.5-2 مم في الجزء العلوي من الاذين الأيمن لإدخال القسطرة. قطع حفرة في الشريان الرئوي. ثم قطع الشريان الاورطي مباشرة تحت الفروع سوبراورتيك وإزالة الأنسجة من الشريان الاورطي، بحيث يمكن إرفاق العقدة بسهولة.
- الحفاظ على منصات الدهون الرجفان، بما في ذلك الرئيسية تقع أتريالي بلكسي جانجليوناتيد، حول الاذين الأيسر سليمة أو إزالتها تماما بتشريح دقيق.
- نقل القلب إلى الطبق مع القنية ووضعها تحت المجهر. سحب الشريان الاورطي عبر القنية مع الملقط SS دومون وأن يعقدا قرانهما استعداد محكم حول الشريان الاورطي. تأكد من أنه لم يتم وضع القنية عميقة جداً في الشريان الاورطي حيث أن يترك الصمام الابهري والأوعية التاجية مجاناً.
- إرفاق القنية بسرعة إلى جهاز لانجيندورف. تأكد من أن هناك فقاعات لا يترك في القنية.
- مفتاح تبديل الضغط التروية إلى 80 مم زئبق، مما يسمح نضح ضغط مستمر.
- أدخل القسطرة بعناية في الاذين الأيمن والبطين الأيمن دون لمس أو تضر القلب وإرفاقه القسطرة القنية مع الشريط.
- ابدأ التحفيز مع طول دورة إعداد 100 مللي ثانية لفترة الموازنة أولية 20 دقيقة.
- إغلاق الدائرة للسماح بدرجة حرارة مستقرة.
4-الكهربية المعلمات وأررهيثموجينيسيس
- تطبيق حفز مبرمجة عن طريق أقطاب القاصي أو الدانية القسطرة مرتين على أعتاب أذينية أو البطين سرعة تقييم المعلمات الكهربية كما هو موضح في الخطوات التالية.
- تحديد وقت الاسترداد عقده الجيوب الأنفية كطول دورة العودة كحد أقصى بعد 10 s معدل ثابت سرعة الساعة على طول دورة S1S1 من 120 مرض التصلب العصبي المتعدد ومرض التصلب العصبي المتعدد 100 80 مرض التصلب العصبي المتعدد.
- تحديد نقطة Wenckebach كطول دورة S1S1 أطول (8 المحفزات؛ S1S1: 100 مللي ثانية؛ 2 مللي ثانية التخفيض التدريجي) مع فقدان 11 مركبات التوصيل العقدي. تحديد فترات صهر العقدي بي ك S1S2 أطول (12 المحفزات؛ S1S1: مايكروسوفت 120، 110 مرض التصلب العصبي المتعدد، و 100ms؛ واحد قصير مقترنا اكستراستيمولوس بانخفاض S1S2 التدرجي 2 مللي ثانية) مع فقدان التوصيل العقدي للمركبات.
- تحديد فترات صهر أذينية والبطين ك S1S2 أطول (12 المحفزات؛ S1S1: مايكروسوفت 120، 110 مرض التصلب العصبي المتعدد، و 100ms؛ واحد قصير مقترنا اكستراستيمولوس بانخفاض S1S2 التدرجي 2 مللي ثانية) مع استجابة الرجفان أو البطين تغيب10،11.
- أداء اكستراستيموليشن مبرمجة (S1S1: 120 مرض التصلب العصبي المتعدد ومرض التصلب العصبي المتعدد 100 80 مللي ثانية، تليها نبضة إضافية تصل إلى 3؛ 60-20 مللي ثانية مع تخفيض تدريجي 2 مللي ثانية) أو انفجار سرعة البروتوكولات (5 s في S1S1: 50-10 مللي ثانية مع تخفيض تدريجي 10 مللي ثانية) تتماشى مع "الاتفاقيات لامبث" إلى إيفا لواتي ال11،10،أررهيثموجينيسيس البطين12.
5-قياسات التوصيل ابيكارديال
ملاحظة: سجل اليكتروجرامس ابيكارديال القطب الواحد باستخدام نظام تسجيل 128-القناة، والحاسوب مع معدل أخذ عينات من 25 كيلوهرتز لرسم خرائط عالية الدقة. استخدام صفيف متعدد قطب 32 (اتفاق بيئي متعدد الأطراف؛ المسافة بين القطب: 300 ميكرون؛ 1.8 × 1.8 ملم). علما بأن البيانات تم تصفيتها ممر الموجه (50 هرتز) والرقمية مع 12 بت ومجموعة إشارات من 20 mV.
- مكان في الشرق الأوسط وأفريقيا في منطقة معينة للقلب وإضافة أسس إلى جزء آخر من القلب13،،من1415.
- مكان قسطرة تحفيز epicardial قريبة من شركة طيران الشرق الأوسط وتبدأ تحفيز مستمر.
- بدء التسجيل بعد التأكد الاتصال الجيد من أقطاب كهربائية بالتحقق من جودة الإشارة والسعة.
- استخدام تحليل متصل لتحديد سرعة انتشار الموجات، وتشتت في اتجاه التوصيل.
6. فورستر الرنين الطاقة نقل الحنق على أساس دوري الادينوسين الأدينوزين (معسكر) تصوير
ملاحظة: للقياسات الحنق، حصاد القلوب من الفئران المحورة وراثيا كاج-Epac1-المخيمات16.
- استخدام نظام تصوير الذاتي بنيت حول15،ستيريوميكروسكوبي17.
- ضع ستيريوميكروسكوبي أمام القلب وضبطه للبراعة.
- تثير مع مصدر ضوء استشعار المخيم [مثلاً، استخدم واحد-الطول الموجي الضوء التي تنبعث منها صمام ثنائي (440 nm)]. تقسيم انبعاث الضوء في قنوات المانحين ويقبلون باستخدام شعاع-الخائن (لزوج فلورسنت بروتين بروتين فلوري سماوي/أصفر واستخدام 565dcxr مرآة مزدوج اللون وعوامل الانبعاث D480/30 و D535/40).
- ضمان درجة حرارة مستقرة عن طريق وضع التفاف بلاستيك حول الدائرة.
- التقاط صور باستخدام كاميرا علمية معدن-أكسيد-أشباه الموصلات مكملة (سكموس). تنسيق مصدر الضوء والكاميرا التقاط الصور مع مصدر مفتوح برامج مثل مايكرو--مدير التصوير.
- للبدء في الحصول على الصور، دفع Acq مولتيد. الزر وقم بإعداد الوقت الفاصل، التي تستحوذ على صورة كل 10 ق، مع الوقت المناسب التعرض، والتي تعتمد على قوة الإشارة الفلورسنت (حوالي 100 مللي ثانية).
- استخدام وصف مسبقاً والمتوفرة الحنق على الإنترنت و تآكل 2 على الإنترنت الإضافات17 لتقسيم الصورة إلى قناتين، وتحديد المناطق ذات الأهمية، ورصد تتبع نسبة.
- خلال حيازة ونتخلل القلب مع تعديل الحل كريبس-هينسيليت التي تحتوي على مواد مختلفة، تبعاً لطبيعة التجربة.
- في نهاية التجربة، إيقاف اقتناء بالضغط على زر إيقاف وإنقاذ كومة الصور.
- تحليل البيانات الحنق دون اتصال باستخدام برنامج تحليل مخصصة التي يمكن تقسيم الصور إلى قسمين متطابقة لقنوات المانحين ويقبلون، ويمكن إجراء تحليل لبكي في مناطق متعددة من الفائدة.
ملاحظة: مكرسة في المكونات (تآكل دون اتصال) المسبق، التي يتم توفيرها في شبرنغر et al. 17.- بدء تشغيل البرنامج. فتح التحليل عن طريق الذهاب إلى قائمة الوظائف الإضافية ، ثم انقر فوق على MicroManager، ثم على فتح مايكرو--مدير ملف.
- تشغيل البرنامج المساعد تآكل دون اتصال من أجل تقسيم الصورتين متطابقة لقنوات الحراجية المعتمدة ويفب مرور الوقت.
- استخدم أداة تحديدات مرفوعة لوضع علامة على منطقة اهتمام بالصورة يفب. اضغط على الزر " إضافة " لإضافة التحديد إلى إطار قياس متعددة .
- اختر المنطقة اهتمام في إطار التدبير متعدد واضغط متعددة للحصول على جدول ذات قيم الرمادي يعني لكل منطقة والإطار. نسخ ولصق كافة البيانات في ورقة عمل Excel.
- انقر فوق مكدس الصورة الحراجية المعتمدة. تنفيذ الإجراءات نفسها كما في الخطوة 6.10.4 للمكدس الحراجية المعتمدة ولصق قيم رمادية يعني في نفس ورقة Excel.
- تصحيح البيانات الخام دون اتصال لمعامل التسييل من خلال الجهات المانحة إلى قناة يقبلون17.
- تستخدم الصيغة التالية, حيث B هو معامل التسييل من خلال:
نسبة = (يفب-x CFP ب)/الحراجية المعتمدة - تحديد التسييل من خلال عامل ب بتصوير قلب معربا عن الحراجية المعتمدة فقط وقياس النسبة المئوية للأسفار المانحين في قناة يفب (ب = يفب/الحراجية المعتمدة).
- تستخدم الصيغة التالية, حيث B هو معامل التسييل من خلال:
7-نيورومورفولوجي
ملاحظة: تحليل النظام العصبي اللاإرادي intracardiac باستخدام إيمونوستينينجس الجامعة-جبل القلوب مورين سليمة. علما بأن أغلبية intracardiac ganglia تكون مترجمة في الأنسجة الدهنية ابيكارديال قريبة من الأوردة الرئوية.
- استخدام ستينينجس مختلفة لتصوير نيوروفيلامينت (الهياكل العصبية العامة؛ الدجاج مكافحة-NF-ح، 1:3، 000)، hydroxylase التيروزين (TH، تتعاطف مع الهياكل العصبية؛ وارنب α TH، 1:1، 000)، ومادة الكولين أسيتيلترانسفيراسي (دردشة, الجهاز السمبتاوي الهياكل العصبية؛ α الماعز دردشة، 01:50).
- بعد التروية في الجهاز لانجيندورف، إصلاح قلوب الماوس في 10 مل فورمالين ح 24 وتخزينها في مخزنة الفوسفات المالحة (PBS) في 4 ˚C.
- بليتش القلوب في التبييض دنت (الميثانول 4:1:1: بيروكسيد الهيدروجين الحل 30% (w/w) في ح2o: ثنائي ميثيل سلفوكسيد ([دمس])) لمدة أسبوع واحد في 4 ˚C وترطيب لهم فيما بعد إلى برنامج تلفزيوني في سلسلة من تنازلي الميثانول في برنامج تلفزيوني (100%، 75%، 50%، 25%؛ ح 1 كل) 18.
- أداء إينكوبيشنز التالية في شكل 24-جيدا--لوحة مع الانفعالات لطيف في 4 ˚C:
- بيرميبيليزي القلوب في 1% تريتون-X-100/برنامج تلفزيوني (برنامج تلفزيوني-T) ح 3 × 1 في درجة حرارة الغرفة قبل حظر عليهم بين عشية وضحاها في المخزن مؤقت حظر [ألبومين المصل البقري 5% (BSA)/برنامج تلفزيوني-T + أزيد الصوديوم 0.2%].
- تمييع الأجسام المضادة على النحو التالي: α الماعز دردشة (01:50)، وارنب α TH (1:1، 000)، والدجاج α نيوروفيلامينت (1:3، 000)؛ الأجسام المضادة الثانوية لوضع العلامات الفلورية (1: 500؛ أو وفقا لإرشادات الشركة المصنعة)؛ بيوتينيلاتيد الأجسام المضادة الثانوية لوضع العلامات اللونية (1: 200؛ أو وفقا لإرشادات الشركة المصنعة).
- احتضان العينات في الأجسام المضادة الأساسي المخفف في المخزن مؤقت حظر لمدة أسبوع واحد في 4 ˚C.
- أغسل القلوب ل 3 × 15 دقيقة في برنامج تلفزيوني-T قبل الاحتضان جسم الثانوية في المخزن مؤقت حظر لمدة 4 أيام.
- أغسل القلوب ل 3 × 15 دقيقة في برنامج تلفزيوني-T وتخزينها في وسط تصاعد لتلطيخ الفلورسنت ح 3 في درجة حرارة الغرفة أو استخدام مجموعة معقدة من الكشف عن عبدين-بيوتين وفقا لإرشادات الشركة المصنعة.
- قبل احتضان القلوب ح 1 في مخزن مؤقت تجارية 3، 3 '--ديامينوبينزيديني (DAB)، قبل وضع لهم تحت عنصر تحكم visual في المخزن مؤقت الذي يحتوي على دأب وفقا لإرشادات الشركة المصنعة.
- تخزين العينات في الماء المقطر مزدوجة.
- مقاطع البارافين، يذوي وتضمين القلوب في البارافين.
- قطع المقاطع 4-ميكرومتر سميكة وديبارافينيزي لهم وفقا للإجراءات الروتينية في المختبر. مدى وكيفية استرجاعها مستضد يحتاج إلى إجراء يلزم إنشاء كل الإعداد الفردية لأنه يعتمد على الجمع بين الأضداد.
- بيرميبيليزي المقاطع ل 10 دقيقة في 0.2% تريتون العاشر-100/تريس-مخزنة المالحة (تبس)، تليها يغسل 3 x 5 دقيقة في tbs.
- كتلة لهم مع 3% جيش صرب البوسنة/تبس ح 1 في درجة حرارة الغرفة.
- تبني عليها بين عشية وضحاها في 4 ˚C [الأجسام الأولية: α الماعز دردشة (01:50)، وارنب α TH (1: 500)، الدجاج α نيوروفيلامينت (1:1، 000)] أو ح 2 في درجة حرارة الغرفة (المسمى fluorescence الأجسام المضادة الثانوية، 1: 500) في جيش صرب البوسنة/TBS مع 3 x 5 دقيقة يغسل TBS في ما بين 1 في المائة.
- إضافة 1 ميكروغرام/مل من بيسبينزيميدي H33342 تريهيدروتشلوريدي في حل جسم الثانوية أو استخدام أسلوب المصبوغة نووية مختلفة.
- تحميل الشرائح في وسط تصاعد لتلطيخ الفلورسنت.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويبين الشكل 1 صورة للإعداد لانجيندورف بما في ذلك 2 صفائف متعدد القطب (الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف). قبل هذه التجربة، يتم وضع القسطرة intracardiac قريبة من قنية لتسهيل إدراج سهلة وسريعة في البطين الاذين اليمين/اليمين ولضمان فترة زمنية قصيرة حتى يمكن البدء الموازنة. الجزء السفلي من الدائرة يمكن زيادة (انظر الأسهم في الشكل 1) حيث أن الدائرة مغلقة تماما وتضمن درجة حرارة مستقرة.
ويبين الشكل 2 ستينينجس القلب تمثيلية مختلفة. يرد في الشكل 2 أ الهيماتوكسيلين وويوزين تلطيخ (ح & ه) قسم البارافين. في توسيع المثالية (الشكل 2)، تلطيخ المناعي للعقدة أذينية واحد يوضح الخلايا غالباً الجهاز السمبتاوي (الأحمر، دردشة-إيجابي) مقارنة مع الخلايا متعاطفة مع أقل عديدة (الأخضر، TH إيجابية). في الشكل 2-ه تلطيخ المناعي العصبية (الشكل 2، الأخضر، نيوروفيلامينت) وألياف متعاطفة (الشكل 2D، أحمر، TH) فضلا عن تراكب الصورتين (الشكل 2E) يصور ألياف العصبية كيف اجتياز من الاذينين عبر الجيب التاجي نحو البطينين الخلفي.
ويبين الشكل 3 الفاري القلب متصلاً قنية جهاز لانجيندورف مع قسطرة أوكتابولار مدرجة في الاذين الأيمن والبطين الأيمن ووضع صفيف متعدد قطب epicardial (الشرق الأوسط) على البطين الأيسر الأمامي ( الشكل 3A). ويرد في الشكل 3Bعدم انتظام ضربات البطين قابلية الاختبار عن طريق أقطاب كهربائية في RV. وقعت تحريض خفقان البطين في قلوب أكثر تواترا بعد إزالة التعصيب أذينية جزئية. ويرد التخطيطي تخطيط الأقطاب في شركة طيران الشرق الأوسط الموسع (الشكل 3). من المهم ضمان اتصال epicardial مستقرة لجميع الأقطاب. ويرد في الشكل 3D التوصيل ابيكارديال دون اتصال حلل سجلتها اتفاق بيئي متعدد الأطراف.
ويبين الشكل 4 قياسات بكى في قلب كله يجري perfused ريتروجراديلي في الجهاز لانجيندورف. يمكن تحليل مجالات مختلفة للقلب كاللازمة (الشكل 4 أ). تطبيق موضعي العالمية فضلا عن المحلية للمستحضرات الصيدلانية من الممكن بسهولة في هذا الإعداد (الشكل 4 باء).
رقم 1: إعداد لانجيندورف بما في ذلك الصفيف متعدد القطب (الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف)- يتم وضع القسطرة التحفيز وتسجيل أوكتابولار القريبة من المنطقة التي سيتم إرفاق القلب. ستنقل إلى أعلى الجزء السفلي من الدائرة (الأبيض الأسهم) بعد القلب قد تم إرفاق الجهاز حيث أن درجة حرارة مستقرة مكفولة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: القلب ستينينجس جبل كله يصور أجزاء من الجهاز العصبي اللاإرادي. A) تصوير ح القلب & البارافين الملون ه قسم (مقياس بار 1 مم). ب) توسيع مثالية لأحد إيمونوهيستوتشيميكالي الملون العقدة أذينية يوضح الخلايا غالباً الجهاز السمبتاوي (الأحمر، دردشة-إيجابي) مقارنة مع أقل الخلايا متعاطفة مع العديد (الأخضر، TH-إيجابية؛ ومقياس بار 75 ميكرون). ه ج) ستينينجس المناعي الممثل من العصبية (الشكل 2، الأخضر، نيوروفيلامينت، NF) وألياف متعاطفة (الشكل 2D، الأحمر، TH، وعلى تراكب في الشكل 2E) اجتياز من الاذينين عن طريق الجيوب الأنفية التاجي (CS) نحو البطينين الخلفي. ألياف مثالية تتسم برؤوس الأسهم. تدل العلامات النجمية أذينية ganglia. تغيير حجم شريط 1 مم-لوس أنجليس، الاذين الأيسر؛ LV، البطين الأيسر؛ NF، نيوروفيلامينت؛ PV، الأوردة الرئوية؛ جمهورية أرمينيا، الاذين الأيمن؛ RAA، أطرافهم أذينية الحق؛ رف، البطين الأيمن. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: داخل والقياسات ابيكارديال باستخدام الإعداد لانجيندورف- أ-يبين هذا الفريق مثالاً للقلب مورين داخل النظام لانجيندورف. يصور القسطرة أوكتابولار إينتراكاردياك، التي يتم إدراجها في الاذين الأيمن والبطين صفيف متعدد القطب ابيكارديال واحد (طيران الشرق الأوسط). ب-عدم انتظام ضربات القلب اختبار قابلية استخدام انفجر التحفيز دون (تحكم) أو مع الحث الذاتي إنهاء يصور خفقان البطين [بعد إزالة الرجفان جزئية التعصيب (PAD)]. ج-الشرق الأوسط وأفريقيا ابيكارديال هو يصور مع توسيع للتخطيط الكهربائي التخطيطي. د-سرعة انتشار موجه تم تحليلها باستخدام برمجيات حسب الطلب. المسافة بين إيسوتشرونيس م 2/س. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: قياسات بكى في إعداد لانجيندورف- أ. يصور ديفيرينتكامب بيوسينسور fluorescence القناتين] بروتين فلوري الصفراء (يفب) وبروتين فلوري السماوي (CFP) [خلال قياسات بكى في قلب بيرفوسيد إلى الوراء. إذا لزم الأمر، يمكن تحليل الأجزاء المختلفة من القلب (مثلاً، اتريا والبطين) (شريط مقياس: 1 ملم). ب. يظهر هذا الفريق بتجربة الحنق ممثل، الذي يقيس مستويات المخيم خلال حفز الدوائي في الاذين والبطين الأيسر. أولاً، كان عناصره perfused القلب مع المنشط adenylyl cyclase NKH477، analogon فورسكولين، زيادة مستويات المخيم. ثم تطبق النيكوتين موضعياً وتستهدف ganglia الرجفان، مما خفض حدة مستويات المخيم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ويرد في هذه المخطوطة، المعروفة لانجيندورف السابقين فيفو القلب نضح النظام كأداة لدراسة أثر إينتراكاردياك من الخلايا العصبية في القلب الكهربية وأررهيثموجينيسيس باستخدام رسم الخرائط المختلفة وتقنيات التحفيز بما في ذلك النهج للوفلر وابيكارديال.
عدة أجزاء من البروتوكول حاسمة بالنسبة لبرنامج الإعداد. أولاً، من المهم استخدام تقنية التحضير فيها منصات الدهون أذينية البقاء سليمة أو يتم إزالتها بسرعة دون إصابة في عضلة القلب. ثانيا، قد فتح حجم ملائم أن تقطع في الاذين الأيمن لسهولة إدخال القسطرة أوكتابولار في الاذين الأيمن والبطين الأيمن. وينبغي أن تنزلق القسطرة بسهولة إلى البطين الأيمن دون إنشاء أي ضغط. أثناء إرفاق القسطرة القنية، وينبغي أن تراجع القسطرة أعمق في البطين، لتجنب إصابة القلب. ثالثا، يتم التحكم في درجة الحرارة جزءا أساسيا من جميع لانجيندورف الأجهزة،1،2،5. يتم إغلاق الدائرة الحرارية أثناء عدم انتظام ضربات القلب الاختبار، وضمان درجة حرارة مستقرة. ولكن لتسجيلات شركة طيران الشرق الأوسط أو الحنق، الدائرة يجب أن يكون على الأقل مفتوح جزئيا للسماح للقياسات. ينبغي أن تظل وقت التسجيل إلى الحد أدنى، أو تقنيات أخرى الحد من فقدان الحرارة، مثل وضع التفاف بلاستيك حول الدائرة خلال قياسات أطول، يجب أن يتم تنفيذ. رابعا، ينبغي أن توضع الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف في نفس المواقع التشريحية في جميع التجارب. ويمكن تحقيق الاتصال الجيد السطحية، وهو ما يؤكده الاتساع الكبير في التحليل في الوقت الحقيقي، باستخدام اثنين من الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف على عكس المواقع حيث يتم إنتاجه من موازنة. خامسا، قياسات الحنق تتأثر بالحركة. للحد من حركة عفوية، هو القلب الإيقاع بتردد ثابت بالقسطرة إينتراكاردياك. لتثبيت إضافية، يمكن تثبيت أنبوب مع فراغ طفيف ذروة.
ميزة واحدة للنظام لانجيندورف أن القلوب يمكن استخدامها في وقت لاحق لتقييم إيمونوهيستولوجيكال العصبي القلب. نضح المستمر يزيل معظم خلايا الدم الحمراء التي لها مستوى عال من أوتوفلوريسسينسي19، تحسين نوعية تلطيخ. بعد التثبيت الفورمالين، يمكن تخزينها في القلوب في بيئة خاضعة لمراقبة (˚C 4) درجة حرارة في المحلول الملحي مخزنة الفوسفات لتصل إلى سنة دون تغييرات ملحوظة في تلطيخ الجودة.
الميزة الأكثر أهمية لهذا الإعداد أن يتم تنفيذ جميع القياسات في قلب دينيرفاتيد مركزياً. Ganglia intracardiac أذينية الجهاز السمبتاوي معظمها هي آخر محطة التقوية داخل القلب20 ستلتثم العقدة متعاطفة يقع إينتراثوراسيكالي ولإزالة أثناء الإعداد. على الرغم من أن الخلايا العصبية إينتراكاردياك الحصول على أي إدخال المركزية، قد تبين أنها لا تزال نشطة في طريقة فسيولوجية كما فوتواكتيفيشن الأعصاب متعاطفة مع القلب يزيد من معدل ضربات القلب وقوة تقلص القلب21. وتمشيا مع هذه النتائج تدعم أهمية الوظيفية للخلايا العصبية إينتراكاردياك في قلب دينيرفاتيد مركزياً، أظهرنا مؤخرا أثرها على وظيفة البطين وأررهيثموجينيسيس15.
ميزة واحدة من هذه الإعداد دينيرفاتيد مركزياً أنه يسمح للباحث بدراسة الاتصالات بين مختلف الشبكات العصبية الإقليمية إينتراكاردياك (مثلاً، التفاعل بين الاذين والبطين)15. قد تكون هذه الاختلافات ذات الصلة للمرضى بعد زرع قلب في منهم يحسن المعاملة مع ايفابرادين المغير الانتقائي الجيوب الأنفية عقده البقاء على قيد الحياة، مقارنة بالعلاج مع succinate ميتوبرولول beta-blocker22. في خطوة مقبلة، ستساعد التحفيز الكهربائي المباشر السمبتاوي (العصب المبهم) أو يتعاطف مع هياكل (ستلتثم قرضاً.23) لتحسين معرفتنا بالتفاعل بين إضافية-و intracardiac العصبي اللاإرادي.
من المهم أن نضع في اعتبارنا أن السمبتاوي ومتعاطفة مع ألياف معظمها يشترك المترجمة حيث أن العلاجات الحالية مثل الاجتثاث قسطرة لعدم انتظام ضربات أذينية أو البطين حتما سيتم تعديل هياكل كلا. في الإعداد هو موضح هنا، يمكن دراسة التعديل الصيدلانية المحلية الهياكل المستهدفة (مثل، تحفيز معينة للجهاز السمبتاوي ganglia). إلى جانب التعديلات المستهدفة، نضح العالمي مع مختلف الأدوية (مثل حاصرات بيتا) ممكن بسهولة، حيث أنه يمكن دراسة خصائص بروارهيثميك أو أنتيارهيثميك المحتملة لعوامل مختلفة. باستخدام هذا الإعداد، التدخلات وتقنيات مختلفة يمكن اختبارها أثناء تنشيط أو تثبيط لأجزاء مختلفة من الجهاز العصبي اللاإرادي intracardiac، الكشف عن معلومات لتأثير أجزاء محددة من الجهاز العصبي اللاإرادي في وظيفة القلب وأررهيثموجينيسيس. علاوة على ذلك، يسمح برنامج الإعداد مورين دراسة العصبي اللاإرادي القلب في الولايات للمرض مثل احتشاء عضلة القلب أو فشل القلب أو مرض السكري.
وفي الختام، بسيطة ومعروفة لانجيندورف السابقين فيفو القلب نضح ويوفر النظام أساسا مرنة تعديل ودراسة أثر إينتراكاردياك من الخلايا العصبية في القلب الكهربية وأررهيثموجينيسيس.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
المؤلف يود أن يشكر ويبولدت هارتويغ لمساعدته التقنية الممتازة، ويوكه "المجهري التصوير مرفق" (أوميف) للجامعة الطبية مركز هامبورغ-ايبندورف لتوفير الدعم والمجاهر. وكان هذا البحث الممولة bythe Förderverein des اونيفرسترن هيرزينترومس هامبورغ أ. ف. ومن دزهك (المركز الألماني لبحوث القلب والأوعية الدموية) [فكز 81Z4710141].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S3014 | Modified Krebs-Henleit solution |
| Sodium hydrogencarbonate | Sigma-Aldrich | 401676 | Modified Krebs-Henleit solution |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P5405 | Modified Krebs-Henleit solution |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P5655 | Modified Krebs-Henleit solution |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | M1880 | Modified Krebs-Henleit solution |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | C7902 | Modified Krebs-Henleit solution |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | Modified Krebs-Henleit solution |
| Sodium pyruvate bioXtra | Sigma-Aldrich | P8574 | Modified Krebs-Henleit solution |
| Carbogen (95% O2 / 5% CO2) | SOL-Group, TMG Technische und Medizinische Gas GmbH, Krefeld, Gersthofen, Germany | Modified Krebs-Henleit solution | |
| Sterile filter steritop-GP 0.22 | EMD Millipore | SCGPT05RE | Modified Krebs-Henleit solution |
| Atropine sulfate | Sigma-Aldrich | A0257 | Neuromodulation |
| Hexamethonium chloride | Sigma-Aldrich | H2138 | Neuromodulation |
| Nicotine free base 98-100% | Sigma-Aldrich | N3876 | Neuromodulation |
| Formalin solution neutral buffered 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | Whole mount staining |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Sigma-Aldrich | 252859 | Whole mount staining |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | Whole mount staining |
| Hydrogen peroxide solution 30% (w/w) in H2O | Merck, KGA, Darmstadt, Germany | H1009 | Whole mount staining |
| Dimethyl sulfoxide | Merck, KGA, Darmstadt, Germany | D8418 | Whole mount staining |
| Phosphate-buffered saline tablets | Gibco / Invitrogen | 18912-014 | Whole mount staining |
| Triton-x-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Whole mount staining |
| Albumin bovine fraction V | Biomol, Hamburg, Germany | 11924.03 | Whole mount staining |
| Chicken anti neurofilament | EMD Millipore | AB5539 | Whole mount staining |
| Rabbit anti tyrosine hydroxylase | EMD Millipore | AB152 | Whole mount staining |
| Goat anti choline acetyltransferase | EMD Millipore | AP144P | Whole mount staining |
| Donkey α rabbit IgG Alexa 488 | Thermo Fisher Scientific | A21206 | Whole mount staining |
| Donkey α goat IgG Alexa 568 | Thermo Fisher Scientific | A11057 | Whole mount staining |
| Donkey α chicken IgY Alexa 647 | Merck, KGA, Darmstadt, Germany | AP194SA6 | Whole mount staining |
| Biotin-conjugated donkey α rabbit igG | R&D Systems | AP182B | Whole mount staining |
| Biotin-conjugated donkey α goat igG | R&D Systems | AP192P | Whole mount staining |
| Biotin-conjugated goat α chicken igY | R&D Systems | BAD010 | Whole mount staining |
| Vectashield mounting medium | Vector laboratories, Burlingame, CA, USA | H-1000 | Immunohistochemistry |
| Vectastain ABC kit | Vector laboratories, Burlingame, CA, USA | PK-4000 | Immunohistochemistry |
| Steady DAB/Plus | Abcam plc, Cambridge, UK | ab103723 | Whole mount staining |
| HistoClear | DiaTec, Bamberg, Germany | HS2002 | Immunohistochemistry |
| BisBenzimide H33342 trihydrochloride (Hoechst) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | B2261 | Immunohistochemistry |
| Vectashield HardSet mounting medium | Vector laboratories, Burlingame, CA, USA | VEC-H-1400 | Immunohistochemistry |
| Perfusion system | HUGO SACHS ELEKTRONIK - HARVARD APPARATUS GmbH, March-Hugstetten, Germany | 73-4343 | Langendorff apparatus |
| Data acquisition system and corresponding software for catheter and physiological parameter | Powerlab 8/30 & Labchart, ADInstruments, Dunedin, New Zealand | PL3508 PowerLab 8/35 | Langendorff setup |
| Octapolar catheter | CIB’ER Mouse, NuMed Inc., Hopkinton, NY, USA | custom | Langendorff setup |
| Stimulus generator | STG4002, Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany | STG4002-160µA | Stimulation setup |
| Stimulation software | Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany | MC_Stimulus II | Stimulation setup |
| Data acquisition system and corresponding software for epicardial electrograms | ME128-FAI-MPA-System, Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany | USB-ME128-System | MEA setup |
| Multi-electrode array | MEA, EcoFlexMEA36, Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany | EcoFlexMEA36 | MEA setup |
| Multi-electrode array recording software | Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany | MC_Rack | MEA setup |
| Spring scissors | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 15003-08 | Heart Preparation |
| Strabismus Scissors | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 14575-09 | Heart Preparation |
| Mayo Scissors | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 14110-15 | Heart Preparation |
| Dumont SS Forceps | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 11203-25 | Heart Preparation |
| London Forceps | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 11080-02 | Heart Preparation |
| Narrow Pattern Forceps | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 11003-13 | Heart Preparation |
| Plastic Wrap | Parafilm M, Bemis NA, based in Neenah, WI, United States | Consumable Materials | |
| Stereomicroscope | Leica M165FC; Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Germany | FRET | |
| LED | CoolLED, Andover, UK | pE-100 | FRET |
| DualView | Photometrics, Tucson, AZ, USA | DV2-SYS | FRET |
| DualView filter set | Photometrics, Tucson, AZ, USA | 05-EM | FRET |
| optiMOS scientific CMOS camera | Qimaging, Surrey, BC, Canada | 01-OPTIMOS-R-M-16-C | FRET |
| Imaging software | Micro-Manager; Vale Lab, University of California San Francisco, CA, USA | FRET | |
| Analysis Software | Image J software; Public Domain, NIH, USA | FRET |
References
- Bell, R. M., Mocanu, M. M., Yellon, D. M. Retrograde heart perfusion: the Langendorff technique of isolated heart perfusion. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 50 (6), 940-950 (2011).
- Sutherland, F. J., Hearse, D. J. The isolated blood and perfusion fluid perfused heart. Pharmacological Research. 41 (6), 613-627 (2000).
- Hearse, D. J., Sutherland, F. J. Experimental models for the study of cardiovascular function and disease. Pharmacological Research. 41 (6), 597-603 (2000).
- Valentin, J. P., Hoffmann, P., De Clerck, F., Hammond, T. G., Hondeghem, L. Review of the predictive value of the Langendorff heart model (Screenit system) in assessing the proarrhythmic potential of drugs. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 49 (3), 171-181 (2004).
- Skrzypiec-Spring, M., Grotthus, B., Szelag, A., Schulz, R. Isolated heart perfusion according to Langendorff-still viable in the new millennium. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 55 (2), 113-126 (2007).
- Langendorff, O. Investigation of the living mammalian heart. Pflügers Archiv. 61, 291-332 (1895).
- Matsumoto-Ida, M., Akao, M., Takeda, T., Kato, M., Kita, T. Real-time 2-photon imaging of mitochondrial function in perfused rat hearts subjected to ischemia/reperfusion. Circulation. 114 (14), 1497-1503 (2006).
- Rassaf, T., Totzeck, M., Hendgen-Cotta, U. B., Shiva, S., Heusch, G., Kelm, M. Circulating nitrite contributes to cardioprotection by remote ischemic preconditioning. Circulation Research. 114 (10), 1601-1610 (2014).
- Schechter, M. A., et al. An isolated working heart system for large animal models. Journal of Visualized Experiments. 88 (88), 51671 (2014).
- Stockigt, F., et al. Total beta-adrenoceptor knockout slows conduction and reduces inducible arrhythmias in the mouse heart. PLoS One. 7 (11), e49203 (2012).
- Berul, C. I. Electrophysiological phenotyping in genetically engineered mice. Physiological Genomics. 13 (3), 207-216 (2003).
- Curtis, M. J., et al. The Lambeth Conventions (II): guidelines for the study of animal and human ventricular and supraventricular arrhythmias. Pharmacology & Therapeutics. 139 (2), 213-248 (2013).
- Schrickel, J. W., et al. Enhanced heterogeneity of myocardial conduction and severe cardiac electrical instability in annexin A7-deficient mice. Cardiovascular Research. 76 (2), 257-268 (2007).
- Rudolph, V., et al. Myeloperoxidase acts as a profibrotic mediator of atrial fibrillation. Nature Medicine. 16 (4), 470-474 (2010).
- Jungen, C., et al. Disruption of cardiac cholinergic neurons enhances susceptibility to ventricular arrhythmias. Nature Communications. 8, 14155 (2017).
- Calebiro, D., et al. Persistent cAMP-signals triggered by internalized G-protein-coupled receptors. PLoS Biology. 7 (8), e1000172 (2009).
- Sprenger, J. U., Perera, R. K., Götz, K. R., Nikolaev, V. O. FRET microscopy for real-time monitoring of signaling events in live cells using unimolecular biosensors. Journal of Visualized Experiments. (66), e4081 (2012).
- Alanentalo, T., et al. Tomographic molecular imaging and 3D quantification within adult mouse organs. Nature Methods. 4 (1), 31-33 (2007).
- Whittington, N. C., Wray, S. Suppression of red blood cell autofluorescence for immunocytochemistry on fixed embryonic mouse tissue. Current Protocols in Neuroscience. 81, 2.28.1-2.28.12 (2017).
- Fukuda, K., Kanazawa, H., Aizawa, Y., Ardell, J. L., Shivkumar, K. Cardiac innervation and sudden cardiac death. Circulation Research. 116 (12), 2005-2019 (2015).
- Wengrowski, A. M., Wang, X., Tapa, S., Posnack, N. G., Mendelowitz, D., Kay, M. W. Optogenetic release of norepinephrine from cardiac sympathetic neurons alters mechanical and electrical function. Cardiovascular Research. 105 (2), 143-150 (2015).
- Rivinius, R., et al. Control of cardiac chronotropic function in patients after heart transplantation: effects of ivabradine and metoprolol succinate on resting heart rate in the denervated heart. Clinical Research in Cardiology. , (2017).
- Ajijola, O. A., et al. Augmentation of cardiac sympathetic tone by percutaneous low-level stellate ganglion stimulation in humans: a feasibility study. Physiological Reports. 3 (3), e12328 (2015).
