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Neuroscience

एकल सेल मल्टीप्लेक्स रिवर्स प्रतिलेखन पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन के बाद पैच-दबाना

Published: June 20, 2018 doi: 10.3791/57627
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1
1UPMC Univ Paris 06, INSERM, CNRS, Neuroscience Paris Seine - Institut de Biologie Paris Seine (NPS - IBPS), Sorbonne Université
* These authors contributed equally

Summary

यह प्रोटोकॉल महत्वपूर्ण चरणों का वर्णन करता है और पैच-दबाना के बाद एकल सेल मल्टीप्लेक्स रिवर्स प्रतिलेखन पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया करने के लिए आवश्यक सावधानियों । यह तकनीक एक सरल और प्रभावी तरीका है एक एकल सेल से जीन के एक पूर्वनिर्धारित सेट की अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल का विश्लेषण करने के लिए पैच-दबाना रिकॉर्डिंग की विशेषता है ।

Abstract

सेरेब्रल प्रांतस्था कई कोशिका विभिन्न रूपात्मक, शारीरिक, और आणविक सुविधाओं का प्रदर्शन प्रकार से बना है. इस विविधता आसान पहचान और इन कोशिकाओं के प्रकार के लक्षण वर्णन करता है, उनके विशिष्ट कार्यों का अध्ययन करने के लिए आवश्यकताएँ प्रभावित करता है । यह लेख मल्टीप्लेक्स एकल सेल रिवर्स प्रतिलेखन पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (आरटी-पीसीआर) प्रोटोकॉल, जो की अनुमति देता है, के बाद पैच दबाना स्लाइस में रिकॉर्डिंग, एक ही सेल में जीन के दसियों की अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए वर्णन करता है । इस सरल विधि रूपात्मक लक्षण वर्णन के साथ लागू किया जा सकता है और इस तरह के रक्त वाहिकाओं के आसपास के क्षेत्र में के रूप में विभिन्न कोशिका प्रकार और उनके विशेष सेलुलर वातावरण, के phenotypic लक्षण निर्धारित करने के लिए व्यापक रूप से लागू है । इस प्रोटोकॉल के सिद्धांत को पैच-दबाना तकनीक के साथ एक सेल रिकॉर्ड है, फसल के लिए और रिवर्स अपनी cytoplasmic सामग्री टाइप करना, और गुणात्मक मल्टीप्लेक्स पीसीआर द्वारा जीन के एक पूर्वनिर्धारित सेट की अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए । यह आर सी पीसीआर के साथ संगत पीसीआर प्राइमरों और intracellular पैच दबाना समाधान के एक सावधान डिजाइन की आवश्यकता है । एक चयनात्मक और विश्वसनीय प्रतिलिपि का पता लगाने सुनिश्चित करने के लिए, इस तकनीक को भी कोशिका द्रव्य संचयन से उचित नियंत्रण प्रवर्धन कदम की आवश्यकता है । हालांकि सावधानियों की चर्चा यहां कड़ाई से पालन किया जाना चाहिए, वस्तुतः किसी भी electrophysiological प्रयोगशाला मल्टीप्लेक्स एकल सेल आरटी-पीसीआर तकनीक का उपयोग कर सकते हैं ।

Introduction

मस्तिष्क प्रांतस्था कई कोशिका विभिंन शारीरिक प्रक्रियाओं में शामिल प्रकार शामिल हैं । उनकी पहचान और लक्षण वर्णन, उनके विशिष्ट कार्यों की समझ के लिए एक शर्त, बहुत बड़ी रूपात्मक दिया चुनौतीपूर्ण हो सकता है, शारीरिक, और आणविक विविधता है कि cortical सेल प्रकार1 की विशेषता है ,2,3,4.

सिंगल सेल मल्टीप्लेक्स आरटी-पीसीआर पैच-क्लैंप और आरटी-पीसीआर तकनीकों के संयोजन पर आधारित है । यह एक साथ जांच कर सकते है electrophysiologically में 30 से अधिक पूर्वनिर्धारित जीन की अभिव्यक्ति की पहचान की कोशिकाओं को5। रिकॉर्डिंग पिपेट में एक न्यूरॉन अनुरेखक के शामिल किए जाने के आगे histochemical रहस्योद्घाटन6,7,8,9के बाद दर्ज की कोशिकाओं के रूपात्मक लक्षण वर्णन की अनुमति देता है, 10. यह उनके phenotypic लक्षण5,9,10,11,12 के बहुभिंनरूपी विश्लेषण के आधार पर ंयूरॉन प्रकार के वर्गीकरण के लिए एक बहुत ही उपयोगी तकनीक है ,13,14. सिंगल सेल मल्टीप्लेक्स आरटी पीसीआर भी गैर के लक्षण वर्णन के लिए अनुकूल है-न्यूरॉनी कोशिकाओं astrocytes जैसे15,16,17, और वस्तुतः हर मस्तिष्क संरचना करने के लिए लागू किया जा सकता18, 19,20,21,22,23 और कक्ष प्रकार, मान लें कि वे पूरे सेल विन्यास में दर्ज किया जा सकता है.

इस तकनीक की पहचान के लिए बहुत सुविधाजनक है सेलुलर स्रोतों और पारेषण प्रणालियों के/या लक्ष्य7,8,15,16,20,21, 24,25,26,27,28, विशेष रूप से जब विशिष्ट एंटीबॉडी की कमी है । यह नेत्रहीन पहचाना कोशिकाओं29से पैच दबाना रिकॉर्डिंग पर निर्भर करता है, और इस प्रकार भी एक विशिष्ट सेलुलर वातावरण में कोशिकाओं के लक्ष्यीकरण की अनुमति देता है8,15,16. इसके अलावा मस्तिष्क ऊतक के cytoarchitecture के बाद से मस्तिष्क के स्लाइस में संरक्षित है, इस दृष्टिकोण भी विशेषता कोशिकाओं के संरचनात्मक संबंधों के अध्ययन में सक्षम बनाता है के साथ ंयूरॉन और गैर-ंयूरॉन तत्वों7,8 , 18.

इस तकनीक के बाद से काटा कोशिका द्रव्य की मात्रा द्वारा सीमित है और आरटी की दक्षता से, कम प्रति संख्या पर व्यक्त mRNA का पता लगाने मुश्किल हो सकता है । हालांकि अंय RNaseq प्रौद्योगिकी पर आधारित दृष्टिकोण एकल कोशिकाओं3,4,30,31के पूरे transcriptome का विश्लेषण करने की अनुमति, वे उच्च प्रवाह की जरूरत है महंगी sequencers जरूरी नहीं हर प्रयोगशाला के लिए उपलब्ध है । चूंकि सिंगल सेल मल्टीप्लेक्स आरटी-पीसीआर तकनीक अंत बिंदु पीसीआर का उपयोग करता है, यह केवल व्यापक रूप से उपलब्ध thermocyclers की आवश्यकता है । यह आसानी से electrophysiological सेट अप से सुसज्जित प्रयोगशालाओं में विकसित किया जा सकता है और महंगे उपकरणों की आवश्यकता नहीं है । यह एक दिन, जीन के एक पूर्वनिर्धारित सेट की अभिव्यक्ति का एक गुणात्मक विश्लेषण के भीतर प्रदान कर सकते हैं । इस प्रकार, यह दृष्टिकोण एक तेजी से तरीके से एकल कोशिकाओं के आणविक लक्षण वर्णन करने के लिए एक आसान पहुँच प्रदान करता है.

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Protocol

सभी प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं जानवरों का उपयोग कर फ्रेंच विनियमों के साथ सख्त अनुसार प्रदर्शन किया गया (ग्रामीण R214/87 के लिए R214/130) और दोनों यूरोपीय आर्थिक समुदाय के नैतिक दिशानिर्देशों के अनुरूप (86/609/EEC) और फ्रांसीसी राष्ट्रीय चार्टर पशु प्रयोग की नैतिकता पर । सभी प्रोटोकॉल चार्ल्स डार्विन नैतिकता समिति द्वारा अनुमोदित और शिक्षा और अनुसंधान के फ्रांसीसी मंत्रालय को प्रस्तुत किया गया (अनुमोदन २०१५ ०६१०११३६७५४०) । आईबीपीएस पशु सुविधा फ्रेंच अधिकारियों द्वारा मान्यता प्राप्त है (A75-05-24).

1. प्रारंभिक विचार

नोट: संदूषणों से बचने के लिए, पैच-दबाना के बाद एकल सेल RT-पीसीआर का उपक्रम करने से पहले निंनलिखित सिफारिशों का पालन करें ।

  1. प्रयोगशाला में ब्याज की जीन युक्त plasmids का उपयोग न करें क्योंकि वे संदूषण के एक संभावित स्रोत हैं ।
  2. पीसीआर तैयार करने के लिए जेल ट्रो रूम से दूर एक लैब बैंच को रिजर्व करें ।
  3. पिपेट और एयरोसोल प्रतिरोधी फ़िल्टर युक्तियों का एक सेट समर्पित करने के लिए 1 एनजी/µ एल से कम सांद्रता पर डीएनए और आरएनए में हेरफेर कभी इन का उपयोग करने के लिए पीसीआर उत्पादों का विश्लेषण ।
  4. हमेशा RNase-और DNase मुक्त उत्पादों का उपयोग करें और दस्ताने पहनते हैं ।
  5. आंतरिक पैच-दबाना समाधान तैयार करने के लिए समर्पित रसायनों का प्रयोग करें । कभी नहीं एक रंग का उपयोग करें बल्कि वजन पाउडर वजन के लिए कागज ।
  6. एक समर्पित पीएच इलेक्ट्रोड और पीएच मानक समाधान का उपयोग करें, के रूप में वे दूषण का एक स्रोत हो सकता है (जैसे, RNase).
  7. borosilicate ग्लास केशिकाओं की दुकान; 20 µ l लंबे, महीन और लचीले नुस्खे; a 20 µ l micropipette; एक घर में बने निष्कासित (पैच-क्लैंप पिपेट धारक एक 10 मिलीलीटर सिरिंज से जुड़ी); ५०० µ l पीसीआर ट्यूबों; 10 µ एल एयरोसोल प्रतिरोधी फ़िल्टर युक्तियां; और एक समर्पित बॉक्स में पतली स्थाई मार्करों (चित्रा 1) ।

2. प्राइमर डिजाइन

नोट: मल्टीप्लेक्स आरटी-पीसीआर दो प्रवर्धन कदम पर निर्भर करता है । पहली पीसीआर के दौरान सभी रूचि के जीन को एक साथ मिलाकर सभी पीसीआर प्राइमरियों को सह-प्रवर्धित किया जाता है । एकल कोशिकाओं से मज़बूती से टेप का पता लगाने के लिए, यह कुशल और चयनात्मक पीसीआर प्राइमरों डिजाइन करने के लिए आवश्यक है । पीसीआर के दूसरे दौर के लिए नेस्टेड (आंतरिक) प्राइमरों का उपयोग विशिष्टता और प्रवर्धन की दक्षता दोनों में सुधार ।

  1. NCBI संदर्भ अनुक्रम डाटाबेस३२ में ब्याज के जीन के उपचारात्मक mRNA दृश्यों को पुनः प्राप्त करने के साथ ही उनके संबंधित परिवार (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/) के उन लोगों के रूप में ।
    1. जीन (ओं) का नाम और एक क्वेरी के रूप में ब्याज की प्रजातियों और प्राप्त प्रासंगिक अनुक्रम पर क्लिक करें दर्ज ।
    2. जीन (ओं) के कोडिंग अनुक्रम करने के लिए विश्लेषण को प्रतिबंधित करने के लिए, भेजें पर क्लिक करें (ऊपरी दाएँ कोने), और प्रारूप के रूप में कोडिंग दृश्यों और फसता न्यूक्लियोटाइड का चयन करें. फिर फ़ाइल बनाएं और एक ". nt" फ़ाइल एक्सटेंशन का उपयोग कर फसता अनुक्रम को बचाने पर क्लिक करें ।
  2. समरूपता के क्षेत्रों का निर्धारण करने के लिए हिरामन सॉफ्टवेयर३३ (एकाधिक संरेखण निर्माण और विश्लेषण कार्यक्षेत्र) या किसी भी अन्य कई संरेखण सॉफ्टवेयर का उपयोग करें.
    1. फ़ाइल पर क्लिक करें | नया प्रोजेक्ट... और अनुक्रम प्रकार के रूप में डीएनए का चयन करें । जीन अनुक्रम आयात करने के लिए, अनुक्रम का चयन करें | अनुक्रम आयात करें.. । और एक ". nt" फ़ाइल लोड करें । सभी संबंधित अनुक्रम के लिए प्रक्रिया को दोहराएँ ।
    2. क्लिक करें और पूरे अनुक्रम का चयन करने के लिए योजनाबद्ध विंडो में सभी दृश्यों खींचें ।
    3. संरेखण का चयन करके समरूपता के क्षेत्रों खोजें । ब्लॉक के लिए खोज .. । (CTRL + S) । खोज विधिमें सेगमेंट जोड़ी ओवरलैप का चयन करें. Pairwise स्कोर cutoff एक अपेक्षाकृत उच्च मूल्य (जैसे, १,०००) और क्रम की कुल संख्या के लिए प्रति ब्लॉक न्यूनतम seqs. to समायोजित करने के लिए संरेखित करें और शुरूपर क्लिक करने के लिए ।
    4. प्रदर्शित होने वाले खोज परिणाम विंडो में, उच्चतम MP-स्कोर के साथ परिणाम (ओं) का चयन करें और लिंकपर क्लिक करें । यदि कोई परिणाम नहीं मिला है, Pairwise स्कोर cutoff और/या न्यूनतम seqs. प्रति ब्लॉकघटाएं.
    5. मुताबिक़ क्षेत्रों के दृश्य की सुविधा के लिए, संरेखण का चयन करें | छायांकन । मतलब स्कोर।
    6. अनुक्रम के अनलिंक भागों का चयन करें और कदम 2.2.3 दोहराने-2.2.4 संभावित एक कम सांसद-स्कोर के साथ समरूपता के अन्य क्षेत्रों का निर्धारण करने के लिए ।
    7. सबसे विशिष्ट प्राइमरों को प्राप्त करने के लिए, कम अनुक्रम समरूपता के साथ क्षेत्रों का चयन करें ।
  3. सभी ब्याह वेरिएंट का जुगाड़ लाने और दोहराने कदम 2.2.1-2.2.6 । एक समग्र खोज के लिए उनके सामांय क्षेत्रों का चयन करें । समर्पित ब्याह वेरिएंट विश्लेषण के लिए वैकल्पिक कैसेट्स पर विचार20,३४,३५,३६।
  4. जीन (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) के intron-एक्सॉन संरचना का निर्धारण करने के लिए ब्लास्ट३७ जीनोम (बुनियादी स्थानीय संरेखण खोज उपकरण) का उपयोग कर पशु मॉडल जीनोम पर mRNA दृश्यों संरेखित करें ।
    1. माउस पर क्लिक करके विस्फोट माउस जीनोम का चयन करें और प्राप्त फसता अनुक्रम में अपलोड क्वेरी अनुक्रम दर्ज करें अनुभाग । प्रोग्राम चयनमें, अत्यधिक समान अनुक्रम (megablast) के लिए ऑप्टिमाइज़ करें चुनें, फिर विस्फोट बटन पर क्लिक करें.
    2. वर्णन अनुभाग में, उच्चतम पहचान के साथ संरेखण का चयन करें (अप करने के लिए १००%) । सुनिश्चित करें कि यह संरेखण अनुभाग की सुविधाओं में इंगित के रूप में ब्याज की जीन से मेल खाती है ।
    3. कोडिंग अनुक्रम के exons उत्तराधिकार प्राप्त करने के लिए एक ही खंड में क्वेरी प्रारंभ स्थिति द्वारा संरेखण सॉर्ट करें । सभी हिट की प्रारंभ और समाप्ति स्थिति नोट करें जो लगभग क्वेरी अनुक्रम (चित्र 2a) पर introns की स्थिति से संबंधित हैं ।
  5. अर्थ और antisense प्राइमरों के लिए दो अलग exons का चयन एक आकार की कसौटी पर आधारित जीनोमिक डीएनए (gDNA) प्रवर्धन से आसानी से सीडीएनए अंतर करने के लिए (चित्रा 2).
    नोट: gDNA का प्रवर्धन एक कम आवृत्ति पर हो सकता है जब नाभिक कोशिका द्रव्य के साथ काटा जाता है । इस प्रकार, यह आवश्यक है intron अपयश प्राइमरी जोड़े (चित्रा 2a) डिजाइन करने के लिए । intron-कम जीन के मामले में, नाभिक का संग्रह समस्याग्रस्त है क्योंकि यह संभावित परिणाम प्राप्त करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । इस मुद्दे को हल करने के लिए, gDNA25की उपस्थिति के लिए जांच करने के लिए एक intronic अनुक्रम बढ़ाना के उद्देश्य से प्राइमरों का एक सेट शामिल हैं । यदि जीनोमिक नियंत्रण सकारात्मक है, सभी intron कम जीन के लिए परिणाम छोड़ दिया जाना चाहिए ।
  6. एक कुशल प्रवर्धन प्राप्त करने के लिए, एक आदर्श २०० और ४०० आधार जोड़े के बीच (चित्रा 2) शामिल लंबाई के साथ amplicons पैदा करने का चयन करें ।
  7. मल्टीप्लेक्स पीसीआर कदम के दौरान एक साथ विभिंन cDNAs को बढ़ाना, 18 और 24 न्यूक्लियोटाइड के बीच एक लंबाई के साथ डिजाइन प्राइमरों और ५५ और ६० डिग्री सेल्सियस के बीच एक पिघलने तापमान (Tm) ।
  8. द्वितीयक संरचनाओं के गठन को कम करने के लिए, जो प्रवर्धन उपज को कम, भावना और विरोधी भावना प्राइमरों न्यूनतम hairpin और द्वैध लंबाई (चित्रा बी) के साथ का चयन करें ।
  9. डिजाइन आंतरिक एक ही मानदंड (कदम 2.5-2.8) का उपयोग कर प्राइमर ।
  10. एक न्यूक्लियोटाइड विस्फोट का उपयोग कर ब्याज की जीव के संदर्भ आरएनए अनुक्रम डेटाबेस पर प्राइमरों में संरेखित करके पीसीआर प्राइमरों की विशिष्टता की पुष्टि करें ।
    1. ब्लास्ट (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) में न्यूक्लियोटाइड ब्लास्टपर क्लिक करें । क्वेरी अनुक्रम दर्ज करेंमें किसी प्राइमरी का अनुक्रम चिपकाएं ।
    2. खोज सेट चुनें अनुभाग में, दूसरों पर क्लिक करें (nr आदि), डेटाबेस विकल्प में संदर्भ शाही सेना अनुक्रम (refseq_rna) का चयन करें और जीव निर्दिष्ट (उदा, मस musculus (टैक्सी्ड: 10090) ) के लिए वांछित प्रजातियों के विश्लेषण को प्रतिबंधित ।
    3. प्रोग्राम चयन में कुछ हद तक समान अनुक्रम (blastn) के लिए ऑप्टिमाइज़ करेंका चयन करें । एल्गोरिथ्म पैरामीटर अनुभाग में हिट प्राप्त करने का मौका बढ़ाने के लिए 7 के लिए नीचे शब्द का आकार कम करें ।
  11. चयनात्मक प्राइमरों डिजाइन करने के लिए, केवल उन जिसका अनुक्रम अवांछित cDNAs जब संभव के साथ कम से कम 3 बेमेल है रखने के लिए ।
  12. आदेश एक अपेक्षाकृत उच्च एकाग्रता (उदाहरणके लिए, २०० µ मीटर) पर नमकीन प्राइमरों सुनिश्चित करने के लिए कि सभी बाह्य प्राइमरों एक साथ 1 µ एम के अंतिम एकाग्रता में मिलाया जा सकता है ।

3. आरटी रिएजेंट की तैयारी

  1. 5x आरटी-mix: RNase में तैयार-मुफ्त पानी ४०० µ एल वर्किंग आरटी मिश्रण समाधान (5x) यादृच्छिक प्राइमरों युक्त 25 µ एम और dNTPs में २.५ मिमी प्रत्येक । इस वर्किंग मिक्स को ५०० µ एल ट्यूब्स में 20 µ l aliquots के रूप में स्टोर करे ।
  2. 20x Dithiothreitol (डीटीटी): RNase-फ्री वॉटर में ०.२ मीटर डीटीटी की 1 एमएल तैयार करें और इसे ५० µ l aliquots के रूप में स्टोर कर लें ।
  3. Store २,५०० u of RNase अवरोध करनेवाला (४० u/µ l) और १०,००० u of रिवर्स transcriptase (RTase, २०० u/µ l) के रूप में 5 µ l aliquots.
  4. RT रिएजेंट की एक इष्टतम गुणवत्ता सुनिश्चित करने के लिए, aliquots पर-८० ° c संग्रहीत करें । 10 कोशिकाओं के लिए और केवल एक दिन के लिए उन्हें का उपयोग करें ।

4. पीसीआर मान् यता

  1. कुल आरएनए की एक अपेक्षाकृत बड़ी राशि पर एक रिवर्स प्रतिलेखन कर cDNAs तैयार (आमतौर पर 1 µ जी) ब्याज की संरचना से३८ निकाले ।
    1. इन प्रारंभिक चरणों के लिए सिंगल सेल आरटी-पीसीआर के लिए समर्पित पिपेट का उपयोग न करें, लेकिन RNase मुक्त पिपेट का उपयोग करें । पतला कुल आरएनए नीचे 1 µ g/µ l
    2. एक ५०० µ एल पीसीआर ट्यूब में, RNase-मुक्त पानी की पतला कुल आरएनए और 8 µ एल के 1 µ एल जोड़ें । 1 मिनट के लिए ९५ डिग्री सेल्सियस पर स्वभाव और बर्फ पर ट्यूब नीचे शांत ।
    3. इस निर्माता द्वारा आपूर्ति की आरटी 5x बफर के 4 µ एल जोड़ें, आरटी मिश्रण समाधान के 4 µ एल, RTase के 1 µ एल, RNase अवरोध करनेवाला, और 1 µ एल के २०० मिमी डीटीटी (अनुभाग 3 देखें) ।
    4. ट्यूब झटका, यह स्पिन, और ३७ डिग्री सेल्सियस पर रात भर गर्मी ।
    5. cDNAs पर-८० ° c कई वर्षों तक के लिए स्टोर । कुल RNAs समकक्ष के 1 एनजी/µ एल के लिए पतला cDNAs के एक aliquot तैयार करें ।
  2. मिश्रण और एक सेल आरटी-पीसीआर को समर्पित पिपेट के साथ 1 µ मीटर पर प्रत्येक प्राइमरी जोड़ी पतला । १०० µ l पीसीआर के लिए प्रत्येक प्राइमरी मिक्स के 20 µ l का प्रयोग करें ।
  3. बर्फ पर, प्रत्येक किताब एक premix युक्त जोड़ी के लिए तैयार: पानी (q.s., ८० µ एल), 10x बफर के 10 µ एल, 1 µ एल के 100x dNTPs (५० µ मीटर प्रत्येक), 500 – 1000 सीडीएनए के स्नातकोत्तर 1 एनजी पर पतला/µ एल, और ०.५ µ एल (२.५ यू, 5 यू/µ एल) के Taq पोलीमरेज़.
  4. एक इष्टतम तापमान नियंत्रण के लिए पीसीआर मशीन के कुओं को कसकर फिट है कि पीसीआर ट्यूबों का उपयोग करें । दीवार या पीसीआर ट्यूब की टोपी को छूने के बिना premix को खनिज तेल की 2 बूंदें (~ १०० µ एल) जोड़ें ।
  5. प्राइमर-dimers के गठन को कम करने के लिए, ९५ डिग्री सेल्सियस पर thermocycler प्री-गरम में पीसीआर ट्यूबों रखकर एक गर्म शुरुआत करते हैं । 30 एस के बाद, जल्दी से तेल के शीर्ष पर प्राइमरी मिश्रण के 20 µ एल निष्कासित ।
  6. ९५ ° c पर 3 मिनट के बाद, रन ४० चक्र (९५ ° c, 30 s; ६० ° c, 30 s; ७२ ° c, ३५ s) 5 मिनट के लिए ७२ ° c पर एक अंतिम बढ़ाव कदम के बाद ।
  7. विश्लेषण agarose जेल ट्रो द्वारा प्रत्येक पीसीआर उत्पादों के 10 µ एल (2%, वजन/ यदि कुछ पीसीआर उत्पादों की उंमीद आकार नहीं है, फिर से डिजाइन अंय प्राइमरों (खंड 2 देखें) ।
    चेतावनी: Ethidium ब्रोमाइड एक intercalating रासायनिक है कि डीएनए उत्परिवर्तनों पैदा कर सकता है । इसका उपयोग करने से पहले स्थानीय सुरक्षा कार्यालय से परामर्श लें । हमेशा दस्ताने पहनते है जब यह हेरफेर । ethidium ब्रोमाइड के व्यावसायिक रूप से उपलब्ध समाधान का उपयोग करें (10 मिलीग्राम/एमएल) समाधान के बजाय पाउडर सांस लेना के जोखिम को कम करने के लिए । इसी तरह, यूवी प्रकाश हानिकारक हो सकता है, तो यूवी संरक्षण सुरक्षा चश्मा या एक मुखौटा पहनने के लिए सुनिश्चित करें । ethidium अपशिष्ट को समर्पित कंटेनरों में नेपकिन जैल, टिप्स, दस्ताने, और बफर को वापस लें ।
  8. एक बार सभी प्राइमरी जोड़े को व्यक्तिगत रूप से मान्य किया गया है, मल्टीप्लेक्स प्रोटोकॉल (चित्रा 3) का परीक्षण करें ।
    1. मिश्रण और सभी बाहरी प्राइमरों में एक साथ पतला 1 µ m. कई हफ्तों तक के लिए मल्टीप्लेक्स प्राइमरों को-20 डिग्री सेल्सियस पर मिक्स स्टोर करें ।
    2. बर्फ पर, एक premix युक्त तैयार: पानी (q.s., ८० µ एल), 10x बफर के 10 µ एल, 1 µ एल के 100x dNTPs (५० µ मीटर प्रत्येक के), 500 – 1000 cDNAs के स्नातकोत्तर 1 एनजी पर पतला/µ एल, और ०.५ µ एल (२.५ यू, 5 यू/µ एल) के Taq पोलीमरेज़.
    3. पीसीआर ट्यूब झटका, यह स्पिन, और खनिज तेल की दो बूंदें (~ १०० µ एल) जोड़ें ।
    4. मल्टीप्लेक्स प्राइमरी मिक्स के 20 µ एल के साथ चरण ४.५ में वर्णित के रूप में एक गर्म शुरू करते हैं । ९५ ° c पर 3 मिनट के बाद, 20 पीसीआर चरण ४.६ के उन लोगों के लिए समान चक्र चलाते हैं ।
    5. विश्लेषण करने के लिए जीन की संख्या के समान पीसीआर ट्यूबों के एक नंबर तैयार करें । चरण 4.8.2 के रूप में एक premix तैयार है, लेकिन प्रति जीन टेंपलेट के रूप में पहली पीसीआर उत्पाद के 1 µ एल का उपयोग कर । विश्लेषण और pipetting त्रुटियों के लिए क्षतिपूर्ति करने के लिए अतिरिक्त मात्रा का 10% का उपयोग करने पर विचार करने के लिए जीन की संख्या के अनुसार सभी संस्करणों को समायोजित करें ।
    6. धीरे शेक, ट्यूब स्पिन, प्रत्येक पीसीआर ट्यूब में premix के ८० µ एल प्रेषण, और दीवार या ट्यूबों की टोपी को छूने के बिना ट्यूब प्रति खनिज तेल की दो बूंदें (~ १०० µ एल) जोड़ें ।
    7. एक गर्म शुरू प्रदर्शन (चरण ४.५ देखें) को निष्कासित करके 20 µ एल आंतरिक प्राइमरी मिक्स के चरण ४.२ में तैयार किया । ४.६ कदम के समान ३५ पीसीआर साइकिल चलाने के लिए ।
    8. agarose जेल ट्रो द्वारा दूसरी पीसीआर उत्पादों का विश्लेषण । सुनिश्चित करें कि हर दूसरी पीसीआर अपेक्षित आकार के एक amplicon उत्पंन करता है । अक्षम या गैर विशिष्ट प्रवर्धन के मामले में, फिर से डिजाइन नई प्राइमरों (कदम 2.5-2.12) और उंहें मांय (4.2 कदम-4.8) ।

5. तैयारी और Intracellular पैच के सत्यापन-क्लैंप समाधान

नोट: निंनलिखित प्रोटोकॉल की तैयारी और एक कश्मीर+/gluconate आधारित आंतरिक समाधान के सत्यापन का वर्णन है, लेकिन वस्तुतः पैच-क्लैंप समाधान के किसी भी प्रकार के रूप में यह आर टी-पीसीआर की क्षमता में बाधा नहीं है लंबे समय के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है । दस्ताने पहने एक RNase मुक्त आंतरिक समाधान प्राप्त करने के लिए अनिवार्य है ।

  1. आंतरिक पैच-दबाना रिकॉर्डिंग समाधान के ६० मिलीलीटर के लिए, ०.१ मीटर KOH के extemporaneously 10 मिलीलीटर तैयार करें ।
  2. भंग ११.४ EGTA के एमजी (०.५ मिमी अंतिम) ०.९ मिलीलीटर में ०.१ M KOH.
  3. जोड़ें ४० एमएल RNase-नि: शुल्क पानी और भंग २.०२ जी के K-gluconate (१४४ mm अंतिम), १४३ HEPES के एमजी (10 मिमी अंतिम), और १८० µ एल के 1 मीटर MgCl2 (3 मिमी अंतिम).
  4. ०.१ एम KOH के ~ 6 मिलीलीटर जोड़कर ७.२ करने के लिए पीएच समायोजित करें ।
  5. osmolarity के साथ २९५ mOsm को समायोजित करें ~ RNase-मुक्त पानी की 13 मिलीलीटर ।
  6. आंतरिक समाधान भी रिवर्स प्रतिलेखन के लिए एक बफर के रूप में प्रयोग किया जाता है के बाद से, ध्यान से नियंत्रण मिलीग्राम2 + एकाग्रता । एक कम मिलीग्राम 2 के लिए क्षतिपूर्ति+ MgCl जोड़कर आंतरिक समाधान में एकाग्रता 2 बाद में 2 मिमी की प्रतिक्रिया में एक अंतिम एकाग्रता तक पहुँचने के लिए.
  7. पैच-दबाना रिकॉर्डिंग के बाद काटा हुआ सेल लेबल करने के लिए, ऊपर वर्णित आंतरिक समाधान के लिए 2 – 5 मिलीग्राम/एमएल RNase-free biocytin के जोड़ें (कदम 5.1 – 5.5) ।
  8. फ़िल्टर (०.२२ µm ताकना आकार) आंतरिक समाधान और यह दुकान पर-८० ° c के रूप में 100 – 250 µ l aliquots.
  9. एकल सेल आरटी पीसीआर के लिए आंतरिक समाधान के उपयोग को मांय करने के लिए, कुल RNAs के ०.५ µ एल जोड़ें 1 एनजी पर पतला/µ एल पैच-क्लैंप समाधान के 6 µ एल के लिए और यह के बारे में 30 मिनट के लिए बेंच पर छोड़ दें ।
  10. एक 2 µ एल micropipette के साथ, 5x आरटी के 2 µ एल-मिश्रण, 20x डीडीटी, ०.५ µ एल RNase अवरोध करनेवाला, और ०.५ µ एल RTase के ०.५ µ एल जोड़ें, और ३७ डिग्री सेल्सियस पर रात भर मशीन ।
  11. ट्यूब स्पिन । बर्फ जोड़ें पानी पर (q.s., ८० µ एल), 10x बफर के 10 µ एल, और ०.५ µ एल (२.५ यू, 5 यू/µ एल) के Taq पोलीमरेज़ ।
  12. प्रदर्शन पीसीआर के ४० चक्र सत्यापित प्राइमरों का एक सेट का उपयोग (कदम 4.4-4.6) ।
  13. agarose जेल ट्रो द्वारा पीसीआर उत्पादों का विश्लेषण (चरण ४.७ देखें) और सत्यापित करें कि वे अपेक्षित आकार है ।
    नोट: कुल आरएनए के ०.५ µ l का लोप करें और ०.५ µ l RNase के साथ प्रतिस्थापित करें-मुक्त पानी यह सुनिश्चित करेगा कि आंतरिक समाधान आरएनए और/या डीएनए संदूषणों से मुक्त है ।

6. तीव्र टुकड़ा तैयारी

नोट: इस प्रोटोकॉल किशोर के लिए टुकड़ा करने की क्रिया प्रक्रिया का वर्णन (यानी, 28 जन्मोत्तर दिन से कम) पुरुष और मादा चूहे । अन्य काटना समाधान, जैसे सुक्रोज आधारित कृत्रिम मस्तिष्कमेरु द्रव (aCSF) भी प्रयोग करने योग्य४०हैं ।

  1. तैयार aCSF के 2 एल युक्त (मिमी में) १२५ NaCl, २.५ KCl, 2 CaCl2, 1 MgCl2, १.२५ णः2पीओ4, 26 NaHCO3, 10 ग्लूकोज, और 15 सुक्रोज । टुकड़ा तैयारी के दौरान glutamatergic गतिविधि को कम करने के लिए, kynurenic एसिड की 1 मिमी जोड़कर एक काटने समाधान तैयार करते हैं ।
  2. टुकड़ा करने की क्रिया से पहले, शल्य कैंची, ठीक आईरिस कैंची, दो spatulas, संदंश, कागज फिल्टर की एक डिस्क, और cyanoacrylate गोंद युक्त एक विच्छेदन किट तैयार करते हैं ।
  3. का प्रयोग करें बर्फ ठंडा काटने के समाधान ओ2/CO2 (95%/5%) के साथ संतृप्त और नीचे-20 डिग्री सेल्सियस पर काटने चैंबर शांत ।
  4. Anesthetize एक छोटा सा कागज तौलिया के साथ isoflurane से लथपथ माउस । ~ 2 मिनट के बाद, सुनिश्चित करें कि माउस पंजा चुटकी के लिए प्रतिक्रिया के अभाव की पुष्टि करने के द्वारा गहरी संज्ञाहरण के तहत है ।
  5. जल्दी से माउस decapitate । खोपड़ी को निकालें और खोपड़ी खोलें । मस्तिष्क को ध्यान से निकालें और यह बर्फ ठंड (~ 4 ° c) के साथ समाधान oxygenated काटने ओ2/CO2के साथ भरा एक छोटा सा चोंच में जगह है ।
  6. -20 ° c शर्तों से काटने चैंबर निकालें और एक कागज तौलिया के साथ नमी को दूर ।
  7. ध्यान काटना हित के क्षेत्र को अलग करने के लिए मस्तिष्क को काटने के चैंबर पर गोंद, और ओ2/CO2के साथ बर्फ ठंड काटने समाधान oxygenated जोड़ें ।
  8. कट ३०० µm एक vibratome का उपयोग कर मोटी स्लाइसें । oxygenated काटने समाधान के साथ भरा एक आराम कक्ष में कमरे के तापमान पर उन्हें हस्तांतरण और कम से ०.५ एच के लिए उन्हें ठीक करने के लिए अनुमति देते हैं ।

7. एकल सेल RT-पीसीआर पैच-दबाना रिकॉर्डिंग के बाद

  1. छिड़काव प्रणाली के साथ नियमित रूप से साफ ~ १०० 30% एच2ओ2 समाधान और बड़े पैमाने पर के साथ कुल्ला ~ ५०० आसुत पानी की मिलीलीटर जीवाणु विकास से बचने के लिए, के रूप में यह RNase संदूषण का एक अनदेखी स्रोत है ।
  2. Chlorinate हर कटाई दिन केंद्रित ब्लीच से भरा एक पैच पिपेट के साथ रेशा । पैच पिपेट लेकिन बल्कि एक 20 µ एल लंबी, ठीक है, लचीला टिप एक 1 मिलीलीटर सिरिंज से जुड़ी भरने के लिए एक micropipette का उपयोग न करें । फिर, इसे बड़े पैमाने पर RNase मुक्त पानी के साथ कुल्ला और एक गैस डस्टर के साथ सूखी ।
  3. 5x आरटी-मिश्रण और 20x डीटीटी aliquots युक्त बर्फ के एक छोटे से बॉक्स तैयार करें । एक benchtop कूलर में-20 डिग्री सेल्सियस पर RTase और RNase अवरोधक aliquots स्टोर ।
  4. oxygenated aCSF के साथ 1-2 मिलीलीटर/मिनट में रिकॉर्डिंग चैंबर perfused में एक टुकड़ा स्थानांतरण ।
  5. खींच पैच पिपेट (1-2 µm खुला टिप व्यास, 3-5 MΩ) borosilicate ग्लास से जबकि दस्ताने पहने हुए है और उनमें से एक को भरने के साथ 8 आंतरिक समाधान के μL । पिपेट खींचने के knobs RNase संदूषण का एक स्रोत हैं कि ध्यान में रखें.
  6. पिपेट को पिपेट धारक में रखें जबकि नए दस्ताने पहने और उंगलियों के साथ रेशा न छुए ।
  7. एक सकारात्मक दबाव के साथ पैच पिपेट दृष्टिकोण और लक्षित सेल (चित्रा 4) की विशेषता के लिए पूरे सेल रिकॉर्डिंग प्रदर्शन.
  8. आदेश में mRNAs को बचाने के लिए, पूरे सेल विंयास में समय सीमा 20 मिनट४१।
  9. रिकॉर्डिंग के अंत में, 20x डीटीटी के 5x आरटी मिश्रण और ०.५ µ एल के 2 µ एल से भरा एक ५०० µ एल पीसीआर ट्यूब तैयार, यह स्पिन, और यह बर्फ पर दुकान.
  10. एक सौंय नकारात्मक दबाव (चित्रा 4) को लागू करने से सेल कोशिका द्रव्य फसल । नेत्रहीन नियंत्रण है कि कोशिका की सामग्री पिपेट अंदर आता है, जबकि एक तंग सील बनाए रखने ।
    1. नाभिक का संग्रह जितना संभव हो सके उससे बचें यदि कुछ intron-कम जीन माने जाते हैं. ऐसे मामले में हमेशा जीनोमिक संदूषण के लिए जांच करने के लिए gDNA बढ़ाना के उद्देश्य से प्राइमरों का एक सेट शामिल हैं ।
    2. यदि नाभिक पिपेट की नोक के करीब आ रहा है, नकारात्मक दबाव जारी है और पिपेट नाभिक से दूर ले जाएं । सुनिश्चित करें कि तंग सील संरक्षित है और नए पिपेट स्थान पर कोशिका द्रव्य इकट्ठा करने के लिए पुनः आरंभ करें ।
  11. कटाई बंद करो जब कोई और अधिक सामग्री आ रहा है और/
  12. पिपेट धीरे से वापस लेने के लिए एक बाहर बाहर पैच फार्म के लिए extracellular मलबे (चित्रा 4) द्वारा संक्रमण सीमा और बाद में histochemical विश्लेषण के लिए सेल झिल्ली के बंद एहसान ।
  13. ध्यान रखें कि knobs, micromanipulators, कंप्यूटर कीबोर्ड, या कंप्यूटर माउस RNase संदूषण के संभावित स्रोत हैं । यदि वे रिकॉर्डिंग के दौरान छुआ गया है, दस्ताने बदल जाते हैं ।
  14. पिपेट को निष्कासित करने के लिए अटैच करें और एक सकारात्मक दबाव (चित्रा 1) को लागू करके अपनी सामग्री को पीसीआर ट्यूब में निष्कासित कर दें ।
  15. अपनी सामग्री के संग्रह में मदद करने के लिए पीसीआर ट्यूब में पिपेट की नोक तोड़ ।
  16. संक्षेप ट्यूब, RNase अवरोध करनेवाला और RTase के ०.५ µ एल के ०.५ µ एल जोड़ने के लिए, धीरे से मिश्रण, फिर से, और ३७ डिग्री सेल्सियस पर रात भर गर्मी ।
  17. ट्यूब स्पिन और यह दुकान पर-८० ° c अप करने के लिए कई महीनों तक पीसीआर विश्लेषण ।
  18. (q.s., ८० µ एल) पानी जोड़कर आरटी उत्पादों के ~ 10 µ एल युक्त ट्यूब में सीधे प्रवर्धन कदम प्रदर्शन, 10x बफर के 10 µ एल, और ०.५ µ एल (२.५ यू) Taq पोलीमरेज़ की । उसके बाद, चरणों में वर्णित निर्देशों का पालन करें 4.8.2 – 4.8.8 ।

8. दर्ज की गई सेल के धुंधला Histochemical (वैकल्पिक)

  1. electrophysiological रिकॉर्डिंग के बाद, oxygenated aCSF में 20 मिनट के लिए टुकड़ा बनाए रखने के लिए axonal और वृक्ष पेड़ में biocytin के प्रसार की अनुमति ।
  2. एक अच्छी तरह से एक 24 की थाली में स्लाइस प्लेस और यह 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर तय ०.१ मीटर फास्फेट बफर में 4% paraformaldehyde की 1 मिलीलीटर के साथ ।
  3. स्लाइस को 4 बार धोएं, 5 मिनट प्रत्येक, 1 मिलीलीटर फॉस्फेट के साथ खारा (पंजाब) ।
  4. एक ही अच्छी तरह से, permeabilize और में 1 घंटे के दौरान टुकड़ा संतृप्त, ०.२५% ट्राइटन X-१०० और ठंडे पानी मछली त्वचा (पंजाबियों-GT) से ०.२% जिलेटिन के साथ पूरक पंजाब के 1 एमएल के साथ कमरे के तापमान पर ।
  5. एक फ्लोरोसेंट लेबल avidin के साथ रात भर की मशीन 250 में 1/400 पर पतला-500 µ पंजाब के एल-GT ।
  6. 5 बार धो, 5 मिनट प्रत्येक, पंजाब के 1 मिलीलीटर के साथ और स्लाइस माउंट ।

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Representative Results

मल्टीप्लेक्स आरटी-पीसीआर का एक प्रतिनिधि सत्यापन चित्रा 3में दिखाया गया है । प्रोटोकॉल को एक साथ जांच के लिए डिजाइन किया गया था 12 विभिंन जीन की अभिव्यक्ति । vesicular ग्लूटामेट ट्रांसपोर्टर vGluT1 glutamatergic न्यूरॉन्स४२के लिए एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में लिया गया था । गाबा synthesizing एंजाइमों (GAD65 और गैड ६७), Neuropeptide Y (NPY), और सोमेटोस्टैटिन (सोम) GABAergic न्यूरॉन्स के मार्कर के रूप में इस्तेमाल किया गया3,5,11. साइक्लोऑक्सीजिनेज-2 एंजाइम (कॉक्स-2) पिरामिड सेल उप जनसंख्या3,16के एक मार्कर के रूप में इस्तेमाल किया गया था ।

ना+/K+ ATPase की atp1α 1-3 उपइकाईयों और एटीपी-संवेदी K+ चैनलों की कीर 6.2 और SUR1 उपइकाईयों को न्यूरॉन गतिविधि और चयापचय राज्यों४३के बीच संबंध का मूल्यांकन करने के लिए चुना गया. चूंकि कीर 6.2 एक intron-कम जीन है, सोम intron को जीनोमिक नियंत्रण के रूप में शामिल किया गया था । प्रोटोकॉल रिवर्स के 1 एनजी पर परीक्षण किया गया है कुल आरएनए माउस पूरे मस्तिष्क से निकाले, जो लगभग 20 कोशिकाओं४४के टेप करने के लिए संगत । मल्टीप्लेक्स पीसीआर ने अपेक्षित आकार के 12 amplicons का उत्पादन किया (चित्रा 3 और तालिका 1) प्रोटोकॉल की संवेदनशीलता और दक्षता का प्रदर्शन किया । आरएनए बिना प्रदर्शन नकारात्मक नियंत्रण कोई amplicon (डेटा नहीं दिखाया) का उत्पादन किया.

एक परत वी पिरामिडीय ंयूरॉन नेत्रहीन अपनी बड़ी सोमा और एक प्रमुख शिखर dendrite (चित्रा 5, इनसेट) से पहचाना गया था । पूरे सेल रिकॉर्डिंग से पता चला ठेठ electrophysiological के गुण वी नियमित spiking न्यूरॉन्स5,४५,४६ के साथ, विशेष रूप से, एक कम इनपुट प्रतिरोध, लंबे समय तक चलने कार्रवाई की क्षमता, और स्पष्ट स्पाइक आवृत्ति अनुकूलन (आंकड़ा 5 ए) । इस ंयूरॉन के आणविक विश्लेषण vGluT1 (चित्रा 5B) की अभिव्यक्ति का पता चला, इसकी पुष्टि glutamatergic phenotype४२,४६। इस ंयूरॉन भी सोम, ATP1α1, और न के 3 उपयूनिटों व्यक्त+/K+ ATPase । दर्ज न्यूरॉन्स की Biocytin लेबलिंग एक पिरामिड आकृति विज्ञान (चित्रा 5d) की पुष्टि की ।

glutamatergic न्यूरॉन्स से उम्मीद के रूप में, 26 परत V पिरामिडीय कोशिकाओं के आणविक विश्लेषण VGluT1 की अभिव्यक्ति का पता चला, लेकिन दो GADs के न तो (चित्रा 5C). न्यूरॉन्स के मार्करों शायद ही कभी5,४२,४६मनाया गया. कॉक्स-2, मुख्य रूप से परत द्वितीय द्वारा व्यक्त-III हवामहल कोशिकाओं3,16, परत V पिरामिड कोशिकाओं में नहीं पाया गया । ATP1α1 और 3 उपयूनिटों अधिक बार ATP1α2 उपइकाई3से मनाया गया । कीर 6.2 और SUR1 उपइकाईयों को शायद ही कभी परत V पिरामिडीय न्यूरॉन्स में पाया गया, जो ऊपरी परतों3,४३में उनके तरजीही अभिव्यक्ति के अनुरूप है । देखभाल नाभिक फसल के लिए नहीं लिया गया था, सोम introns का एक दुर्लभ पता लगाने में जिसके परिणामस्वरूप (3 से बाहर 26 कोशिकाओं, यानी, 12%) ।

Figure 1
चित्रा 1: एकल सेल आरटी के लिए समर्पित बॉक्स-पीसीआर । पैच-क्लैंप के बाद आर टी-पीसीआर के लिए आरक्षित सामग्री की सूची । (१) Borosilicate काँच की केशिकाएँ, (2) 20 µ l लॉन्ग, फाइन, फ्लेक्सिबल टिप्स, (3) 20 µ l micropipette, (4) घर में बने हुए खदेड़ने वाले, (5) ५०० µ l पीसीआर ट्यूब, (6) 10 µ l एयरोसोल प्रतिरोधी फ़िल्टर युक्तियां, और (7) स्थाई मार्करों । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: पीसीआर प्राइमर डिजाइन रणनीति । (एक) कॉक्स 2 सीडीएनए के कोडन अनुक्रम के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व 2 कॉक्स 2 जीन युक्त क्रम माउस गुणसूत्र के लिए गठबंधन । Exons काले बक्से और सफेद बक्से द्वारा gDNA पर introns द्वारा प्रतिनिधित्व कर रहे हैं । gDNA पर intronic अनुक्रम के संगत सीडीएनए में अंतराल को नोट करें । बुरा और अच्छा oligonucleotides के प्रतिनिधि उदाहरण क्रमशः लाल और हरे रंग के तीर के रूप में प्रतिनिधित्व किया । दाएँ और बाएँ तीर आगे और रिवर्स प्राइमरों निरूपित. (ख) (क) में दर्शाए गए oligonucleotides के अनुक्रम और द्वितीयक संरचनाओं/ बाएँ और दाएँ पैनलों क्रमशः hairpin स्व-complementarity और आत्म-डिमर गठन, संकेत मिलता है. B1 oligonucleotide प्रदर्शित करता है दोनों एक मजबूत hairpin स्व-complementarity और डिमर गठन जबकि B2 oligonucleotide केवल डिमर गठन से पता चलता है । B3 और B4 oligonucleotides के पास कोई hairpin स्व-complementarity और कोई डिमर गठन नहीं है; वे intron अपयश (अ) हैं और उन्हें संभावित पीसीआर प्राइमरों के रूप में चुना गया है ( तालिका १देखें). कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: मल्टीप्लेक्स पीसीआर का सत्यापन । माउस पूरे मस्तिष्क से 1 कुल आरएनए के एनजी पीसीआर प्रवर्धन के दो दौर के बाद एक रिवर्स प्रतिलिपि करने के लिए अधीन था । 12 पीसीआर उत्पादों HaeIII द्वारा पचा Φx174 के साथ समानांतर में agarose जेल ट्रो द्वारा अलग गलियों में हल किया गया । दूसरी पीसीआर उत्पादों (बीपी) में आकार था अनुक्रम द्वारा भविष्यवाणी की: १५३ (vGluT1), २४८ (GAD65), २५५ (GAD67), १८१ (कॉक्स 2), २२० (NPY), १४६ (सोम), १८३ (ATP1a1), २१३ (ATP1a2), १२८ (ATP1a3), ३४२ (कीर 6.2), २११ (SUR1), और १८२ (सोमint) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: मस्तिष्क स्लाइस में पैच-क्लैंप संचयन । एक बार एक सेल नेत्रहीन की पहचान की है, रिकॉर्डिंग पिपेट एक सकारात्मक दबाव के साथ संपर्क किया है ताकि पिपेट की नोक पर सेलुलर मलबे संदूषण से बचने के लिए । इस न्यूरॉन की झिल्ली पर डिंपल को ध्यान दें. सकारात्मक दबाव तो एक Gigaohm तंग मुहर के साथ एक सेल संलग्न विंयास फार्म के क्रम में बाधित है । संपूर्ण-कक्ष कॉन्फ़िगरेशन पर स्विच करने के लिए संक्षिप्त सक्शन लागू होते हैं. रिकॉर्डिंग के अंत में, कोशिका द्रव्य तंग सील बनाए रखते हुए पिपेट में एक सौंय नकारात्मक दबाव लागू करने के द्वारा काटा जाता है । कटाई प्रक्रिया के दौरान कोशिका शरीर के सिकुड़न को नोट करें । रिकॉर्डिंग पिपेट फिर धीरे से एक बाहर बाहर पैच, जो बाद में biocytin रहस्योद्घाटन के लिए सेल झिल्ली बंद एहसान, और पैच पिपेट में काटा सामग्री के संरक्षण के रूप में वापस ले लिया है । रसायन विज्ञान के रॉयल सोसायटी से अनुमति के साथ Cauli और Lambolez४७ से reproduced । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: परत वी neocortical पिरामिड कोशिकाओं का लक्षण वर्णन । (क)-१००,-४०,-10, + ६०, + १२०, और + ५०० फिलीस्तीनी अथॉरिटी (नीचे निशान) की वर्तमान दालों से प्रेरित एक परत वी पिरामिडीय कोशिका की झिल्ली संभावित प्रतिक्रिया । न्यूरॉन प्रारंभिक hyperpolarizing प्रतिक्रिया (ऊपरी निशान) के बाद एक कमजोर संभावित विक्षेपन प्रदर्शित करता है. एक supraliminal ध्रुवीकरण के जवाब में, न्यूरॉन निर्वहन लंबे समय से स्थाई कार्रवाई क्षमता धीरे-hyperpolarization (ऊपरी ट्रेस) के बाद विकसित करने के साथ । संतृप्ति के पास, एक कम आवृत्ति पर निर्वहन ंयूरॉन और एक स्पष्ट अनुकूलन (ऊपरी ग्रे ट्रेस) का प्रदर्शन किया । इनसेट: दर्ज की गई लेयर वी हवामहल न्यूरॉन की इन्फ्रारेड तस्वीरें । pial सतह ऊपर की ओर है । स्केल बार: 20 µm (ख) मल्टीप्लेक्स आरटी-पीसीआर विश्लेषण vGluT1, सोम, ATP1α1, और ATP1α3 की अभिव्यक्ति का खुलासा । (ग) 26 परत V पिरामिडीय कोशिकाओं के नमूने में जीन एक्सप्रेशन प्रोफाइल । vGluT1 सभी न्यूरॉन्स में व्यक्त किया गया था, जबकि GAD65, GAD67, और COX2 कभी नहीं पाया गया. NPY, सोम, कीर 6.2, SUR1, और सोमint शायद ही कभी देखा गया था । पिरामिड कोशिकाओं ATP1α3 व्यक्त की, 1 की उपइकाई न+/K+ ATPase, और एक हद तक कम ATP1α2 । (घ) फोकल (ए) में दर्ज ंयूरॉन के biocytin लेबल दिखा छवियों की अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

जीन/GenBank संख्या बाहरी प्राइमर आकार (बीपी) आंतरिक प्राइमर आकार (बीपी)
vGlut1
NM_182993		 भावना,-११३ २५९ भावना,-५४ १५३
GGCTCCTTTTTCTGGGGCTAC ATTCGCAGCCAACAGGGTCT
विरोधी भावना, १२६ विरोधी भावना, ७९
CCAGCCGACTCCGTTCTAAG TGGCAAGCAGGGTATGTGAC
GAD65
NM_008078		 अर्थ, ९९ ३७५ अर्थ, २१९ २४८
CCAAAAGTTCACGGGCGG CACCTGCGACCAAAAACCCT
विरोधी भावना, ४५४ विरोधी भावना, ४४७
TCCTCCAGATTTTGCGGTTG GATTTTGCGGTTGGTCTGCC
GAD67
NM_008077		 अर्थ, ५२९ ५९८ अर्थ, ८०१ २५५
TACGGGGTTCGCACAGGTC CCCAGAAGTGAAGACAAAAGGC
विरोधी भावना, ११०९ विरोधी भावना, १०३४
CCCAGGCAGCATCCACAT AATGCTCCGTAAACAGTCGTGC
कॉक्स 2
NM_011198		 अर्थ, १९९ २६८ अर्थ, २६५ १८१
CTGAAGCCCACCCCAAACAC AACAACATCCCCTTCCTGCG
विरोधी भावना, ४४५ विरोधी भावना, ४२६
CCTTATTTCCCTTCACACCCAT TGGGAGTTGGGCAGTCATCT
NPY
NM_023456		 भावना, 16 २९४ अर्थ, ३८ २२०
CGAATGGGGCTGTGTGGA CCCTCGCTCTATCTCTGCTCGT
विरोधी भावना, २८६ विरोधी भावना, २३६
AAGTTTCATTTCCCATCACCACAT GCGTTTTCTGTGCTTTCCTTCA
सोम
NM_009215		 अर्थ, ४३ २०८ अर्थ, ७५ १४६
ATCGTCCTGGCTTTGGGC GCCCTCGGACCCCAGACT
विरोधी भावना, २३१ विरोधी भावना, २०३
GCCTCATCTCGTCCTGCTCA GCAAATCCTCGGGCTCCA
ATP1α1
NM_144900 		अर्थ, १२८७ २८८ अर्थ, १३२९ १८३
CAGGGCAGTGTTTCAGGCTAA TAAGCGGGCAGTAGCGGG
विरोधी भावना, १५५६ विरोधी भावना, १४९२
CCGTGGAGAAGGATGGAGC AGGTGTTTGGGCTCAGATGC
ATP1α2
NM_178405		 अर्थ, १३९२ २६८ अर्थ, १४३० २१३
AGTGAGGAAGATGAGGGACAGG AAATCCCCTTCAACTCCACCA
विरोधी भावना, १६४० विरोधी भावना, १६२३
ACAGAAGCCCAGCACTCGTT GTTCCCCAAGTCCTCCCAGC
ATP1α3
NM_144921		 अर्थ, १२७ २१६ अर्थ, १५८ १२८
CGGAAATACAATACTGACTGCGTG TGACACACAGTAAAGCCCAGGA
विरोधी भावना, ३२४ विरोधी भावना, २६४
GTCATCCTCCGTCCCTGCC CCACAGCAGGATAGAGAAGCCA
कीर 6.2
NM_010602		 अर्थ, ३०६ ४३१ अर्थ, ३३९ ३४२
CGGAGAGGGCACCAATGT CATCCACTCCTTTTCATCTGCC
विरोधी भावना, ७१९ विरोधी भावना, ६६३
CACCCACGCCATTCTCCA TCGGGGCTGGTGGTCTTG
SUR1
NM_011510		 अर्थ, १८६७ ३८५ अर्थ, २०४१ २११
CAGTGTGCCCCCCGAGAG ATCATCGGAGGCTTCTTCACC
विरोधी भावना, २२३१ विरोधी भावना, २२३१
GGTCTTCTCCCTCGCTGTCTG GGTCTTCTCCCTCGCTGTCTG
ौमींत
X51468		 भावना, 8 २४० भावना, 16 १८२
CTGTCCCCCTTACGAATCCC CTTACGAATCCCCCAGCCTT
विरोधी भावना, २२८ विरोधी भावना, १७८
CCAGCACCAGGGATAGAGCC TTGAAAGCCAGGGAGGAACT

तालिका 1. पहली और दूसरी पीसीआर प्राइमरों का जुगाड़ । प्रत्येक पीसीआर प्राइमरी की पोजीशन और उनके सीक्वेंस 5 ' to 3 ' से दिए गए हैं । सोमेटोस्टैटिन intron के अलावा, 1 स्थिति प्रत्येक जीन के शुरू codon के पहले आधार से मेल खाती है ।

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Discussion

एकल सेल मल्टीप्लेक्स RT-पीसीआर पैच-दबाना के बाद एक साथ और मज़बूती से electrophysiologically की पहचान की कोशिकाओं5में 30 से अधिक जीनों की अभिव्यक्ति की जांच कर सकते हैं । एकल कोशिका स्तर पर जीन की अभिव्यक्ति का विश्लेषण अत्यधिक कुशल पीसीआर प्राइमरों की आवश्यकता है । सबसे सीमित चरणों में से एक सेल की सामग्री का संग्रह है । इसकी दक्षता पैच पिपेट टिप के व्यास पर निर्भर करता है, जो सेल के आकार के मिलान के दौरान जितना संभव हो उतना बड़ा होना चाहिए । एक 1-2 µm खुला टिप व्यास के साथ पिपेट सबसे ंयूरॉंस प्रकार के लिए उपयुक्त साबित हो रहे थे । यह भी सुनिश्चित करें कि केवल सेलुलर सामग्री एकत्र की है, और नहीं आसपास के ऊतकों आवश्यक है । यह फसल के दौरान एक तंग मुहर के संरक्षण electrophysiologically को नियंत्रित करने से हासिल की है । पिपेट वापसी के दौरान बाहर एक पैच विंयास के गठन आगे सेलुलर मलबे से काटा कोशिका द्रव्य की रक्षा । सिंगल सेल मल्टीप्लेक्स आरटी-पीसीआर की सफलता दर भी खोजी कोशिका प्रकार की mRNAs बहुतायत पर निर्भर करती है । उदाहरण के लिए, astrocytes के साथ प्राप्त उपज है, जो अपेक्षाकृत कम मात्रा में mRNAs व्यक्त3, आम तौर पर ंयूरॉंस के साथ प्राप्त की तुलना में कम है और इस प्रकार नमूना आकार15,16बढ़ाने की आवश्यकता है । उल्टा प्रतिलेखन, जो ट्यूबों४८में एक कम दक्षता है, एकल सेल मल्टीप्लेक्स आरटी-पीसीआर की सीमित प्रतिक्रिया है । इसलिए शीर्ष गुणवत्ता रिएजेंट का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है, aliquots के रूप में उन्हें स्टोर करने के लिए-८० ° c, और उन्हें केवल एक दिन के लिए उपयोग करने के लिए. अंत में, RTase के डीएनए पोलीमरेज़ गतिविधि अक्सर प्राइमर के एक अनदेखी स्रोत-डिमर गठन है । इस मुद्दे को संबोधित करने के लिए, प्राइमर के साथ एक गर्म शुरू प्रदर्शन प्रवर्धन क्षमता बढ़ाने के लिए महत्वपूर्ण है । इसके अलावा इस Taq डीएनए पोलीमरेज़ गतिविधि४९पर RTase के निरोधात्मक प्रभाव को कम करेगा ।

सिंगल सेल मल्टीप्लेक्स आरटी-पीसीआर तकनीक अत्यधिक बहुमुखी है । यह बड़े पैमाने पर कुतर10,11,13,19,20,३४,५०,५१,५२ में इस्तेमाल किया गया है ,५३,५४ लेकिन लगभग सभी पशु मॉडल और जीन मानते है कि ऊतक और जीन अनुक्रम उपलब्ध है के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । विभिन्न पैच दबाना समाधान के रूप में वे सेल मुक्त परख पर आर टी-पीसीआर के साथ हस्तक्षेप नहीं करते लंबे समय के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है । उदाहरण के लिए आंतरिक समाधान के आधार पर K+ या Cs+ cations, Cl- या gluconate सफलतापूर्वक6,३६,४१,५५का उपयोग किया गया है ।

शास्त्रीय गलत नकारात्मक परिणाम पैच पिपेट रेशा और/या आंतरिक पैच-क्लैंप समाधान के RNase संदूषण से स्टेम । ध्यान से रेशा chlorinating और आंतरिक समाधान मान्य करना सामान्यतः इस समस्या का समाधान करता है. झूठी नकारात्मक परिणाम भी हो सकता है जब एक जीन एक कम एकल कोशिका स्तर पर व्यक्त की है, क्योंकि केवल कोशिका द्रव्य के अनुपात काटा जाता है । कटाई की गुणवत्ता बड़ा पिपेट और/या पूरे सेल रिकॉर्डिंग के समय को कम करने का उपयोग करके बढ़ाया जा सकता है । संचयन गुणवत्ता एक जीन ज्ञात सहित द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है एकल कोशिकाओं में एक कम स्तर पर व्यक्त किया जाएगा20। गलत सकारात्मक परिणाम खराब ऊतक गुणवत्ता, जिसमें सेलुलर मलबे प्रदूषित की मात्रा अधिक है के साथ हो सकता है । मलबे की उपस्थिति का परीक्षण किसी भी सील प्रदर्शन और पिपेट हटाने से पहले सकारात्मक दबाव जारी करने के बिना टुकड़ा में एक पैच पिपेट डालने के द्वारा किया जाता है । इसके बाद मल्टीप्लेक्स आरटी-पीसीआर४२द्वारा प्रवर्धक सामग्रियों की मौजूदगी में जांच की जाती है । Silanizing पैच पिपेट का उपयोग भी किया गया है extracellular दूषित पदार्थों का संग्रह कम५६. सिंगल सेल पीसीआर एक बहुत ही संवेदनशील तकनीक है कि डबल असहाय डीएनए५७की एक प्रति के रूप में कम के रूप में पता लगा सकता है । intron-कम जीन के मामले में, नाभिक में निहित gDNA भी झूठी सकारात्मक उत्पादन कर सकते हैं । कटाई के दौरान पिपेट को नाभिक से दूर रखकर gDNA के संग्रह से बचना इस समस्या को हल करने में मदद करता है । gDNA की उपस्थिति मज़बूती से एक intronic अनुक्रम25बढ़ाना द्वारा जांच की जा सकती है ।

आर टी-पीसीआर द्वारा mRNA अणुओं का पता लगाने के 10 प्रतियां४४पर अविश्वसनीय हो जाता है, क्योंकि RTase४८की कम क्षमता का शायद, और एक कम-बहुतायत टेप का पता लगाने के तहत नेतृत्व कर सकते है26,४२। यह intron-कम जीन के मामले में समस्याग्रस्त किया जा सकता है । दरअसल, नाभिक की फसल से परहेज कोशिका द्रव्य कि एकत्र किया जा सकता है और इसलिए जांच संवेदनशीलता की मात्रा कम कर देता है । biocytin लेबलिंग के साथ पैच-दबाना के बाद सिंगल-सेल आरटी-पीसीआर के संयोजन की आवश्यकता है कि कोशिका की आकृति को यथासंभव बनाए रखा जाए (चित्रा 3) । अपरिहार्य, यह सामग्री है कि एकत्र किया जा सकता है की मात्रा कम कर देता है, जिससे सफलता की दर को कम करने । कोशिका द्रव्य संग्रह और कक्ष आकृति विज्ञान के संरक्षण के बीच एक समझौता अनिवार्य है ।

मल्टीप्लेक्स एकल सेल आरटी-पीसीआर डेटा मात्रात्मक नहीं कर रहे है के रूप में वे केवल कि cDNAs मौजूद है या एकत्र सामग्री में अनुपस्थित पर जानकारी दे । हालांकि, पता लगाने की सीमा के ऊपर वर्णित की वजह से, जनसंख्या स्तर पर पता लगाने की घटना एकल कोशिका स्तर पर जीन की बहुतायत को प्रतिबिंबित कर सकते हैं । वैकल्पिक दृष्टिकोण और अधिक मात्रात्मक डेटा की पीढ़ी की अनुमति है, लेकिन तकनीकी उनके विशिष्ट प्रवर्धन रणनीतियों (यानी, मुताबिक़ जीन या आर टी-qPCR के सापेक्ष ठहराव) द्वारा लगाया बाधाओं मोटे तौर पर की संख्या को सीमित जीन है कि एक साथ विश्लेषण किया जा सकता है४१,५३,५५,५८,५९,६०,६१,६२,६३ ,६४,६५,६६. पैच के हाल के संयोजन-क्लैंप रिकॉर्डिंग और एकल सेल RNaseq, पैच के रूप में संदर्भित-seq30,31, electrophysiologically-विशेषता कोशिकाओं के मात्रात्मक transcriptomic विश्लेषण की अनुमति देता है. यह एक नया और आशाजनक दृष्टिकोण है, फिर भी यह उच्च प्रवाह sequencers के लिए उपयोग की आवश्यकता है और डेटा समय लेने वाले विश्लेषण की आवश्यकता उत्पंन ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

पांडुलिपि पर उनकी टिप्पणी के लिए हम डॉ एलेक्जेंडर Mourot का शुक्रिया अदा करते हैं । यह काम Agence नेशनल डे ला सभ्य (ANR २०११ MALZ ००३ ०१ से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था; ANR-15-CE16-0010 और ANR-17-CE37-0010-03), BLG स्नेहा डालो ला सभ्य सुर अल्जाइमर से फैलोशिप द्वारा समर्थित है । हम IBPS (पेरिस, फ्रांस) की पशु सुविधा का शुक्रिया अदा करते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MACAW v.2.0.5 NCBI Multiple alignement for primer design
Dithiothreitol VWR 443852A RT
Random primers Sigma-Aldrich (Merck) 11034731001 RT
dNTPs GE Healthcare Life Sciences 28-4065-52 RT and PCR
RNasin Ribonuclease Inhibitors Promega N2511 RT
SuperScript II Reverse Transcriptase Invitrogen 18064014 RT
Taq DNA Polymerase Qiagen 201205 PCR
Mineral Oil Sigma-Aldrich (Merck) M5904-5ML PCR
PCR primers Sigma-Aldrich (Merck) PCR / desalted and diluted at 200 µM
Tubes, 0.5 mL, flat cap ThermoFisher Scientific AB0350 RT and PCR
BT10 Series - 10 µL Filter Tip Neptune Scientific BT10 RT and PCR
BT20 Series - 20 µL Filter Tip Neptune Scientific BT20 RT and PCR
BT200 Series - 200 µL Filter Tip Neptune Scientific BT200 RT and PCR
BT1000 Series - 1000 µL Filter Tip Neptune Scientific BT1000.96 RT and PCR
DNA Thermal Cylcer Perkin Elmer Cetus PCR
Ethidium Bromide Sigma-Aldrich (Merck) E1510-10ML Agarose gel electrophoresis
Tris-Borate-EDTA buffer Sigma-Aldrich (Merck) T4415-1L Agarose gel electrophoresis
UltraPure Agarose Life Technologies 16500-500 Agarose gel electrophoresis
ΦX174 DNA-Hae III Digest NEB (New England BioLabs) N3026S Agarose gel electrophoresis
EDA 290 Kodak Agarose gel electrophoresis
Electrophoresis Power supply EPS 3500 Pharmacia Biotech Agarose gel electrophoresis
Midi Horizontal Elecrophoresis Unit Model SHU13 Sigma-Aldrich (Merck) Agarose gel electrophoresis
Smooth paper with satin appearance Fisherbrand 1748B Patch clamp internal solution
Potassium Hydroxyde Sigma-Aldrich (Merck) 60377 Patch clamp internal solution
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid Sigma-Aldrich (Merck) E3889 Patch clamp internal solution
HEPES Sigma-Aldrich (Merck) H4034 Patch clamp internal solution
Potassium D-gluconate Sigma-Aldrich (Merck) G4500 Patch clamp internal solution
Magnesium chloride solution Sigma-Aldrich (Merck) M1028 Patch clamp internal solution
5500 Vapor Pressure Osmometer Wescor Patch clamp internal solution
Biocytin Sigma-Aldrich (Merck) B4261 Patch clamp internal solution
Sucrose Sigma-Aldrich (Merck) S5016 Slice preparation
D-(+)-Glucose monohydrate Sigma-Aldrich (Merck) 49159 Slice preparation
Sodium chloride Sigma-Aldrich (Merck) S6191 Slice preparation
Potassium chloride Sigma-Aldrich (Merck) 60128 Slice preparation
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich (Merck) 31437-M Slice preparation
Sodium phosphate monobasic Sigma-Aldrich (Merck) S5011 Slice preparation
Magnesium chloride solution Sigma-Aldrich (Merck) 63069 Slice preparation
Calcium chloride solution Sigma-Aldrich (Merck) 21115 Slice preparation
Kynurenic acid Sigma-Aldrich (Merck) K3375 Slice preparation
Isoflurane Piramal Healthcare UK Slice preparation
VT 1000S Leica Biosystems 14047235613 Slice preparation
Hydrogen peroxide solution Sigma-Aldrich (Merck) H1009 Patch Clamp set-up cleaning
Thin Wall Glass Capillaries with filament World Precision Instruments TW150F-4 Patch Clamp
PP-83 Narishige Patch Clamp
Eppendorf Microloader Eppendorf 5242956003 Patch Clamp
BX51WI Upright microscope Olympus Patch Clamp
XC-ST70/CE CCD B/W VIDEO CAMERA Sony Patch Clamp
Axopatch 200B Amplifier Molecular Devices Patch Clamp
Digidata 1440 Molecular Devices Patch Clamp
pCLAMP 10 software suite Molecular Devices Patch Clamp
10 mL syringe Terumo SS-10ES Expelling
E Series with Straight Body (Holder) Phymep 64-0997 Expelling
Sodium phosphate dibasic Sigma-Aldrich (Merck) S7907 Histochemical revelation
Sodium phosphate monobasic Sigma-Aldrich (Merck) S8282 Histochemical revelation
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich (Merck) P6148 Histochemical revelation
Triton X-100 Sigma-Aldrich (Merck) X100 Histochemical revelation
Gelatin from cold water fish skin Sigma-Aldrich (Merck) G7041 Histochemical revelation
Streptavidin, Alexa Fluor 488 conjugate ThermoFisher Scientific S11223 Histochemical revelation
24-well plate Greiner Bio-One 662160 Histochemical revelation

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References

  1. Ascoli, G. A., et al. Petilla terminology: nomenclature of features of GABAergic interneurons of the cerebral cortex. Nat.Rev.Neurosci. 9 (7), 557-568 (2008).
  2. DeFelipe, J., et al. New insights into the classification and nomenclature of cortical GABAergic interneurons. Nat.Rev.Neurosci. , (2013).
  3. Tasic, B., et al. Adult mouse cortical cell taxonomy revealed by single cell transcriptomics. Nat.Neurosci. , (2016).
  4. Zeisel, A., et al. Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq. Science. , (2015).
  5. Cauli, B., et al. Classification of fusiform neocortical interneurons based on unsupervised clustering. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 97 (11), 6144-6149 (2000).
  6. Cauli, B., et al. Molecular and physiological diversity of cortical nonpyramidal cells. J.Neurosci. 17 (10), 3894-3906 (1997).
  7. Férézou, I., et al. 5-HT3 receptors mediate serotonergic fast synaptic excitation of neocortical vasoactive intestinal peptide/cholecystokinin interneurons. J. Neurosci. 22 (17), 7389-7397 (2002).
  8. Cauli, B., et al. Cortical GABA interneurons in neurovascular coupling: relays for subcortical vasoactive pathways. J.Neurosci. 24 (41), 8940-8949 (2004).
  9. Wang, Y., Gupta, A., Toledo-Rodriguez, M., Wu, C. Z., Markram, H. Anatomical, physiological, molecular and circuit properties of nest basket cells in the developing somatosensory cortex. Cereb.Cortex. 12 (4), 395-410 (2002).
  10. Wang, Y., et al. Anatomical, physiological and molecular properties of Martinotti cells in the somatosensory cortex of the juvenile rat. J.Physiol. 561 (Pt 1), 65-90 (2004).
  11. Karagiannis, A., et al. Classification of NPY-expressing neocortical interneurons. J.Neurosci. 29 (11), 3642-3659 (2009).
  12. Battaglia, D., Karagiannis, A., Gallopin, T., Gutch, H. W., Cauli, B. Beyond the frontiers of neuronal types. Front Neural Circuits. 7, 13 (2013).
  13. Toledo-Rodriguez, M., et al. Correlation maps allow neuronal electrical properties to be predicted from single-cell gene expression profiles in rat neocortex. Cereb.Cortex. 14 (12), 1310-1327 (2004).
  14. Toledo-Rodriguez, M., Goodman, P., Illic, M., Wu, C., Markram, H. Neuropeptide and calcium binding protein gene expression profiles predict neuronal anatomical type in the juvenile rat. J.Physiol. , (2005).
  15. Lecrux, C., et al. Pyramidal neurons are "neurogenic hubs" in the neurovascular coupling response to whisker stimulation. J.Neurosci. 31 (27), 9836-9847 (2011).
  16. Lacroix, A., et al. COX-2-derived prostaglandin E2 produced by pyramidal neurons contributes to neurovascular coupling in the rodent cerebral cortex. J.Neurosci. 35 (34), 11791-11810 (2015).
  17. Matthias, K., et al. Segregated expression of AMPA-type glutamate receptors and glutamate transporters defines distinct astrocyte populations in the mouse hippocampus. J.Neurosci. 23 (5), 1750-1758 (2003).
  18. Rancillac, A., et al. Glutamatergic control of microvascular tone by distinct gaba neurons in the cerebellum. J.Neurosci. 26 (26), 6997-7006 (2006).
  19. Miki, T., et al. ATP-sensitive K+ channels in the hypothalamus are essential for the maintenance of glucose homeostasis. Nat.Neurosci. 4 (5), 507-512 (2001).
  20. Liss, B., Bruns, R., Roeper, J. Alternative sulfonylurea receptor expression defines metabolic sensitivity of K-ATP channels in dopaminergic midbrain neurons. EMBO J. 18 (4), 833-846 (1999).
  21. Gallopin, T., et al. Identification of sleep-promoting neurons in vitro. Nature. 404 (6781), 992-995 (2000).
  22. Gallopin, T., et al. The endogenous somnogen adenosine excites a subset of sleep-promoting neurons via A2A receptors in the ventrolateral preoptic nucleus. Neuroscience. 134 (4), 1377-1390 (2005).
  23. Fernandez, S. P., et al. Multiscale single-cell analysis reveals unique phenotypes of raphe 5-HT neurons projecting to the forebrain. Brain Struct.Funct. , (2015).
  24. Porter, J. T., et al. Selective excitation of subtypes of neocortical interneurons by nicotinic receptors. J.Neurosci. 19 (13), 5228-5235 (1999).
  25. Hill, E. L., et al. Functional CB1 receptors are broadly expressed in neocortical GABAergic and glutamatergic neurons. J.Neurophysiol. 97 (4), 2580-2589 (2007).
  26. Férézou, I., et al. Extensive overlap of mu-opioid and nicotinic sensitivity in cortical interneurons. Cereb.Cortex. 17 (8), 1948-1957 (2007).
  27. Hu, E., et al. PACAP act at distinct receptors to elicit different cAMP/PKA dynamics in the neocortex. Cereb.Cortex. 21 (3), 708-718 (2011).
  28. Louessard, M., et al. Tissue plasminogen activator expression is restricted to subsets of excitatory pyramidal glutamatergic neurons. Mol.Neurobiol. , (2015).
  29. Stuart, G. J., Dodt, H. U., Sakmann, B. Patch-clamp recordings from the soma and dendrites of neurons in brain slices using infrared video microscopy. Pflugers Arch. 423 (5-6), 511-518 (1993).
  30. Cadwell, C. R., et al. Electrophysiological, transcriptomic and morphologic profiling of single neurons using Patch-seq. Nat.Biotechnol. 34 (2), 199-203 (2016).
  31. Fuzik, J., et al. Integration of electrophysiological recordings with single-cell RNA-seq data identifies neuronal subtypes. Nat.Biotechnol. 34 (2), 175-183 (2016).
  32. O'Leary, N. A., et al. Reference sequence (RefSeq) database at NCBI: current status, taxonomic expansion, and functional annotation. Nucleic Acids Res. 44, D733-D745 (2016).
  33. Schuler, G. D., Altschul, S. F., Lipman, D. J. A workbench for multiple alignment construction and analysis. Proteins. 9 (3), 180-190 (1991).
  34. Ruano, D., Lambolez, B., Rossier, J., Paternain, A. V., Lerma, J. Kainate receptor subunits expressed in single cultured hippocampal neurons: molecular and functional variants by RNA editing. Neuron. 14 (5), 1009-1017 (1995).
  35. Porter, J. T., et al. Properties of bipolar VIPergic interneurons and their excitation by pyramidal neurons in the rat neocortex. Eur.J.Neurosci. 10 (12), 3617-3628 (1998).
  36. Ruano, D., Perrais, D., Rossier, J., Ropert, N. Expression of GABA(A) receptor subunit mRNAs by layer V pyramidal cells of the rat primary visual cortex. Eur.J.Neurosci. 9 (4), 857-862 (1997).
  37. Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J. Basic local alignment search tool. J.Mol.Biol. 215 (3), 403-410 (1990).
  38. Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate- phenol-chloroform extraction. Anal Biochem. 162 (1), 156-159 (1987).
  39. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J.Vis.Exp. (62), (2012).
  40. Liss, B., et al. K-ATP channels promote the differential degeneration of dopaminergic midbrain neurons. Nat.Neurosci. 8 (12), 1742-1751 (2005).
  41. Lambolez, B., Audinat, E., Bochet, P., Crepel, F., Rossier, J. AMPA receptor subunits expressed by single Purkinje cells. Neuron. 9 (2), 247-258 (1992).
  42. Gallopin, T., Geoffroy, H., Rossier, J., Lambolez, B. Cortical sources of CRF, NKB, and CCK and their effects on pyramidal cells in the neocortex. Cereb.Cortex. 16 (10), 1440-1452 (2006).
  43. Cunningham, M. O., et al. Neuronal metabolism governs cortical network response state. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 103 (14), 5597-5601 (2006).
  44. Tsuzuki, K., Lambolez, B., Rossier, J., Ozawa, S. Absolute quantification of AMPA receptor subunit mRNAs in single hippocampal neurons. J.Neurochem. 77 (6), 1650-1659 (2001).
  45. McCormick, D. A., Connors, B. W., Lighthall, J. W., Prince, D. A. Comparative electrophysiology of pyramidal and sparsely spiny stellate neurons of the neocortex. Journal of Neurophysiology. 54 (4), 782-806 (1985).
  46. Andjelic, S., et al. Glutamatergic nonpyramidal neurons from neocortical layer VI and their comparison with pyramidal and spiny stellate neurons. J.Neurophysiol. 101 (2), 641-654 (2009).
  47. Cauli, B., Lambolez, B. Chapter 9: Gene Analysis of Single Cells. Unravelling Single Cell Genomics: Micro and Nanotools. Bontoux, N., Potier, M. C. , RSC publishing. Cambridge. 81-92 (2010).
  48. Bontoux, N., et al. Integrating whole transcriptome assays on a lab-on-a-chip for single cell gene profiling. Lab Chip. 8 (3), 443-450 (2008).
  49. Sellner, L. N., Coelen, R. J., Mackenzie, J. S. Reverse transcriptase inhibits Taq polymerase activity. Nucleic Acids Res. 20 (7), 1487-1490 (1992).
  50. Perrenoud, Q., Rossier, J., Geoffroy, H., Vitalis, T., Gallopin, T. Diversity of GABAergic interneurons in layer VIa and VIb of mouse barrel cortex. Cereb.Cortex. , (2012).
  51. Tricoire, L., et al. Common origins of hippocampal ivy and nitric oxide synthase expressing neurogliaform cells. J.Neurosci. 30 (6), 2165-2176 (2010).
  52. Cea-del Rio, C. A., et al. M3 muscarinic acetylcholine receptor expression confers differential cholinergic modulation to neurochemically distinct hippocampal basket cell subtypes. J.Neurosci. 30 (17), 6011-6024 (2010).
  53. Tricoire, L., et al. A blueprint for the spatiotemporal origins of mouse hippocampal interneuron diversity. J.Neurosci. 31 (30), 10948-10970 (2011).
  54. Franz, O., Liss, B., Neu, A., Roeper, J. Single-cell mRNA expression of HCN1 correlates with a fast gating phenotype of hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated ion channels (Ih) in central neurons. Eur.J.Neurosci. 12 (8), 2685-2693 (2000).
  55. Szabo, A., et al. Calcium-permeable AMPA receptors provide a common mechanism for LTP in glutamatergic synapses of distinct hippocampal interneuron types. J.Neurosci. 32 (19), 6511-6516 (2012).
  56. Hodne, K., Weltzien, F. A. Single-Cell Isolation and Gene Analysis: Pitfalls and Possibilities. Int.J.Mol.Sci. 16 (11), 26832-26849 (2015).
  57. Li, H. H., et al. Amplification and analysis of DNA sequences in single human sperm and diploid cells. Nature. 335 (6189), 414-417 (1988).
  58. Bochet, P., et al. Subunit composition at the single-cell level explains functional properties of a glutamate-gated channel. Neuron. 12 (2), 383-388 (1994).
  59. Audinat, E., Lambolez, B., Rossier, J., Crepel, F. Activity-dependent regulation of N-methyl-D-aspartate receptor subunit expression in rat cerebellar granule cells. Eur.J.Neurosci. 6 (12), 1792-1800 (1994).
  60. Jonas, P., Racca, C., Sakmann, B., Seeburg, P. H., Monyer, H. Differences in Ca2+ permeability of AMPA-type glutamate receptor channels in neocortical neurons caused by differential GluR-B subunit expression. Neuron. 12 (6), 1281-1289 (1994).
  61. Geiger, J. R., et al. Relative abundance of subunit mRNAs determines gating and Ca2+ permeability of AMPA receptors in principal neurons and interneurons in rat CNS. Neuron. 15 (1), 193-204 (1995).
  62. Flint, A. C., Maisch, U. S., Weishaupt, J. H., Kriegstein, A. R., Monyer, H. NR2A subunit expression shortens NMDA receptor synaptic currents in developing neocortex. J.Neurosci. 17 (7), 2469-2476 (1997).
  63. Angulo, M. C., Lambolez, B., Audinat, E., Hestrin, S., Rossier, J. Subunit composition, kinetic, and permeation properties of AMPA receptors in single neocortical nonpyramidal cells. J.Neurosci. 17 (17), 6685-6696 (1997).
  64. Lambolez, B., Ropert, N., Perrais, D., Rossier, J., Hestrin, S. Correlation between kinetics and RNA splicing of alpha-amino-3-hydroxy-5-methylisoxazole-4-propionic acid receptors in neocortical neurons. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 93 (5), 1797-1802 (1996).
  65. Liss, B., et al. Tuning pacemaker frequency of individual dopaminergic neurons by Kv4.3L and KChip3.1 transcription. EMBO J. 20 (20), 5715-5724 (2001).
  66. Aponte, Y., Lien, C. C., Reisinger, E., Jonas, P. Hyperpolarization-activated cation channels in fast-spiking interneurons of rat hippocampus. J.Physiol. 574, 229-243 (2006).

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Devienne, G., Le Gac, B., Piquet, J., Cauli, B. Single Cell Multiplex Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction After Patch-clamp. J. Vis. Exp. (136), e57627, doi:10.3791/57627 (2018).

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