Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Tek hücre Multiplex Ters transkripsiyon polimeraz zincir tepkimesi sonra yama-kelepçe

Published: June 20, 2018 doi: 10.3791/57627
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1
1UPMC Univ Paris 06, INSERM, CNRS, Neuroscience Paris Seine - Institut de Biologie Paris Seine (NPS - IBPS), Sorbonne Université
* These authors contributed equally

Summary

Bu iletişim kuralı kritik adımlar ve yama-kelepçe sonra tek hücre multiplex Ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu gerçekleştirmek için gereken önlemleri açıklar. Bu teknik ifade profil genler tarafından yama-kelepçe kayıtları ile karakterize bir tek hücreden önceden belirlenmiş bir dizi analiz etmek için basit ve etkili bir yöntemdir.

Abstract

Serebral korteks çeşitli morfolojik, fizyolojik ve moleküler özellikler sergileyen çok sayıda hücre türleri oluşur. Bu hücre türleri, özel işlevleriyle çalışmak için Önkoşullar malzemelerin kolay tanımlanması ve bu çeşitliliği engellemektedir. Bu makalede, sonra yama-kelepçe dilimler halinde kayıt aynı anda onlarca genlerin ifade tek bir hücreye algılamak için sağlar multiplex tek hücre Ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) protokolünü açıklar. Bu basit yöntem ile morfolojik karakterizasyonu uygulanabilir ve kan damarlarının çevresinde gibi çeşitli hücre tiplerinin ve belirli hücresel çevreleri, fenotipik özellikleri belirlemek için yaygın olarak uygulanabilir. Bu iletişim kuralı bir hücre hasat ve ters yama-klemp tekniği ile uyarlamak sitoplazmik içeriğini kaydetmek için ve niteliksel algılamaya genler tarafından önceden tanımlanmış bir dizi ifade multiplex PCR ilkedir. PCR astar ve hücre içi yama-kelepçe çözüm RT-PCR ile uyumlu dikkatli bir tasarım gerektirir. Seçici ve güvenilir transkript sağlamak için algılama, bu teknik aynı zamanda sitoplazma amplifikasyon merdiven-e doğru hasat uygun denetimlerinin gerektirir. Burada tartışılan önlemler kesinlikle takip edilmesi gereken rağmen hemen hemen her elektrofizyolojik laboratuvar multiplex tek hücre RT-PCR tekniği kullanabilirsiniz.

Introduction

Serebral korteks çok sayıda hücre tipleri çeşitli fizyolojik süreçlerinde yer oluşmaktadır. Kendi kimlik ve karakterizasyonu, özel işlevleriyle, anlayış için bir ön koşul kortikal hücre tip1 karakterize büyük morfolojik, fizyolojik ve moleküler çeşitliliği göz önüne alındığında çok zor olabilir ,2,3,4.

Tek hücreli multiplex RT-PCR yama-kelepçe ve RT-PCR teknikleri kombinasyonuna dayanmaktadır. Aynı anda electrophysiologically tanımlanan hücreleri530'dan fazla önceden tanımlanmış genlerin ifade sonda. Histochemical vahiy6,7,8,9, sonra kaydedilen hücrelerin karakterizasyonu morfolojik dahil edilmesi daha fazla kayıt pipet nöronal bir izleyici sağlar 10. onların fenotipik özellikleri5,9,10,11,12 çok değişkenli analize dayalı nöronal türleri sınıflandırılması için çok kullanışlı bir yöntemdir ,13,14. Tek hücre multiplex RT-PCR da astrocytes15,16,17gibi sigara nöronal hücrelerin karakterizasyonu için uygundur ve hemen hemen her beyin yapısı-18uygulanabilir, onlar bütün hücreli yapılandırmada kaydedilebilir varsayarak 19,20,21,22,23 ve hücre tipi.

Bu teknik çok hücresel kaynakları tanımlaması ve/veya iletim sistemleri7,8,15,16,20,21hedefleri için uygundur, özellikle belirli antikor eksik zaman 24,25,26,27,28,. Bu yama-kelepçe kayıtları görsel olarak tanımlanan hücreleri29kullanır ve böylece aynı zamanda hücreleri belirli hücresel ortamı8,15,16hedefleme sağlar. Beyin dokusu cytoarchitecture beyin dilimler halinde korunmuş olduğundan, Ayrıca bu yaklaşım da anatomik ilişkileri nöronal ve nöronal elements7,8 ile karakterize hücrelerinin çalışma sağlar , 18.

Bu tekniği hasat sitoplazma miktarı ve RT verimliliğini tarafından sınırlı olduğu için düşük kopya sayısı ifade mRNA tespiti zor olabilir. Yüksek üretilen iş pahalı sıralayıcılar ihtiyaçları ille RNaseq teknolojisine dayalı diğer yaklaşımlar tek hücreleri3,4,30,31, Bütün transcriptome analiz etmek için izin rağmen Her laboratuvar için kullanılabilir. Tek hücre multiplex RT-PCR tekniği son nokta PCR kullandığından, yalnızca yaygın olarak kullanılan thermocyclers gerektirir. Bu kolayca elektrofizyolojik set-up ile donatılmış laboratuarlarında geliştirilen ve pahalı ekipman gerektirmez. O, bir gün içinde bir kalitatif analiz genler önceden tanımlanmış bir dizi ifade sağlayabilir. Bu nedenle, bu yaklaşım hızlı bir şekilde tek hücreleri moleküler karakterizasyonu kolay bir erişim sunmaktadır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Hayvanlar kullanarak tüm deneysel prosedürler Fransız düzenlemeler (kod kırsal R214/87 için R214/130) ile sıkı uygun olarak gerçekleştirilen ve Avrupa Ekonomik Topluluğu (86/609/EEC) ve Fransız Ulusal Charter etik kuralları için standartlarla uyumlu hayvan deney etik üzerinde. Tüm iletişim kuralları Charles Darwin Etik Komitesi tarafından onaylanmış ve eğitim ve araştırma (onay 2015 061011367540) Fransız Bakanlığa gönderilmiş. IBPS hayvan tesisi Fransız yetkililer (A75-05-24) tarafından akredite edilmiştir.

1. ön dikkat edilmesi gereken noktalar

Not: contaminations önlemek için aşağıdaki önerileri girişim tek hücre RT-PCR önce yama-kelepçe sonra uygun.

  1. Onlar kirlenme potansiyel bir kaynak olarak laboratuvar ilgi genleri içeren plazmid kullanmayın.
  2. PCR hazırlamak için jel elektroforez Oda uzak bir laboratuvar tezgah saklıdır.
  3. Birtakım Pipetler ve aerosol dayanıklı filtre ipuçları 1 ng/µL düşük konsantrasyonlarda DNA ve RNA işlemek için adamak. Hiç bunlar PCR ürünleri çözümlemek için kullanın.
  4. Her zaman RNase ve DNaz ücretsiz ürünleri kullanmak ve eldiven giymek.
  5. Özel kimyasallar iç yama-kelepçe çözümleri hazırlamak için kullanın. Asla bir spatula kullanın ama oldukça kağıt tozu kilo ağırlığında.
  6. Bir kaynak (Örneğin, RNase) kirlenme olabildiğince özel pH elektrodu ve pH standart çözümler, kullanın.
  7. Borosilikat cam kılcal depolar; 20 µL uzun, ince ve esnek ipuçları; 20 µL micropipette; Ev yapımı Expeller üstün (yama-kelepçe pipet sahibi) bir 10 mL şırınga bağlı; 500 µL PCR tüpleri; 10 µL aerosol dayanıklı filtre ipuçları; ve kalıcı işaretleri adanmış kutusunda (Şekil 1).

2. astar tasarım

Not: İki amplifikasyon merdivenlerinde Multiplex RT-PCR dayanır. İlk PCR sırasında ilgi tüm genler birlikte tüm PCR astar boyaları karıştırarak birlikte güçlendirilmiş. Güvenilir bir şekilde transkript tek hücrelerden algılamak için verimli ve seçici PCR astar tasarım esastır. PCR ikinci tur için iç içe geçmiş (iç) astar kullanılması özgüllüğü ve amplifikasyon verimliliğini artırır.

  1. NCBI başvuru sıra veritabanı32 ilgi genlerin hem hem o ilgili aile (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/) küratörlüğünde mRNA dizisi almak.
    1. Bir sorgu olarak gene(s) ve ilgi tür adını girin ve alınan ilgili sırayı üzerinde'yi tıklatın.
    2. Gene(s) kodlama dizisi için analiz kısıtlamak için göndermek üstünde (sağ üst) tıklatın ve ve FASTA nükleotit dizileri kodlama biçimi olarak seçin. O zaman tıkırtı üstünde Dosyası oluştur ve bir ".nt" dosya uzantısı kullanılarak FASTA sırası kaydedin.
  2. Amerika papağanı yazılım33 (birden çok hizalama İnşaat & analiz Workbench) veya herhangi bir diğer birden fazla hizalama yazılım Homoloji bölgeleri belirlemek için kullanın.
    1. Dosyasında Doula tıklayınız | Yeni proje ve DNA sırasını türünü seçin. Gen dizileri almak için sırası seçin | Alma sırası... ve bir ".nt" dosyasını yükleyin. Tüm ilgili dizileri için yordamı yineleyin.
    2. ' I tıklatın ve tüm dizileri şematik penceresinde tüm serileri seçmek için sürükleyin.
    3. Homoloji bölgelerinde Hizalama seçerek arama | Arama blokları için (CTRL + S). Segment çifti üst üste Arama yöntemiseçin. Pairwise puan edinildi kesme (Örneğin, 1000) nispeten yüksek bir değere ayarlayın ve dk. seqs. blok başına toplam Numara sıralarının hizalamak ve başlamakiçin.
    4. Görünen Arama sonuç penceresinde en yüksek MP-puanı result(s) seçin ve bağlantıyıtıklayın. Hiçbir sonuç bulunursa, Pairwise puan edinildi kesme ve/veya dk. seqs. blok başınaazaltın.
    5. Homolog bölgeleri görselleştirme kolaylaştırmak için hizalama seçin | Gölgelendirme | Puanı demek.
    6. Bağlantısız parçalar sıralarının seçin ve potansiyel olarak daha düşük bir MP puan ile Homoloji diğer bölgelerinde belirlemek için adımları 2.2.3–2.2.4 tekrarlayın.
    7. En belirgin astar elde etmek için en azından sıra Homoloji bölgeleriyle seçin.
  3. Tüm ek yeri değişik dizisi getir ve adımları 2.2.1–2.2.6 tekrarlayın. Genel bir algılama için onların ortak bölgeleri seçin. Alternatif kaset adanmış splice türevleri analizleri20,34,35,36için göz önünde bulundurun.
  4. Genler (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) intron exon yapısını belirlemek için patlama37 genleri (temel yerel hizalama arama aracı) kullanarak hayvan modeli genom mRNA dizileri hizalayın.
    1. PATLAMA fare genom fare üzerinde tıklatarak seçin ve Girin sorgu sırası bölüm tarihinde erişilmiştir FASTA sırayla yükleyin. Program seçimi için en uygun duruma son derece benzer dizileri (megablast)seçin ardından patlama butonunu tıklayın.
    2. Açıklamalar bölümünde, en yüksek kimlik ile hizalamayı seçin (% 100). Faiz gen için özellikleri hizalamaları bölümünün belirtildiği şekilde ait olduğundan emin olun.
    3. Kodlama dizisi ekzonlar arkaya elde etmek için sorgu başlatmak konum aynı bölümdeki tarafından hizalama sıralayın. Başlangıç ve bitiş pozisyonlarının kabaca intron üzerinde sorgu sırası (Şekil 2A) konumuna karşılık gelen tüm isabetlerin unutmayın.
  5. Kolayca bir boyutu ölçüt (Şekil 2) dayalı genomik DNA (gDNA) amplifikasyon cDNA ayırt etmek anlam ve antisens astar için iki farklı ekzonlar seçin.
    Not: çekirdek sitoplazma ile hasat gDNA amplifikasyon düşük frekansta oluşabilir. Böylece, astar çiftleri (Şekil 2A) overspanning intron tasarlamak için esastır. Bu potansiyel sonuçları semptomlarıdır için açabilir gibi intron daha az genler durumunda çekirdeği sorunlu koleksiyonudur. Bu sorunu gidermek için gDNA25varlığı için soruşturma için intronic dizisi yükseltecek amaçlı astar bir kümesini içerir. Genomik denetim pozitif ise, sonuçlar için tüm intron daha az genler atılmalıdır.
  6. Verimli bir amplifikasyon elde etmek için ideal bir konuma sahip 200 ve 400 baz çifti arasında (Şekil 2) oluşan uzunluğu amplicons üreten astar seçin.
  7. Astar uzunluğu 18 ve 24 nukleotid ve erime sıcaklığı (Tm) arasında tasarım 55 ve 60 ° c arasında multiplex PCR adımı sırasında aynı anda çeşitli cDNAs yükseltmek için
  8. Amplifikasyon verim azaltmak, ikincil yapılar oluşumunu en aza indirmek için mantıklı ve anti-anlamda astar ile en az saç tokası ve çift yönlü uzunlukları (Şekil 2B) seçin.
  9. İç astar aynı ölçütleri (adım 2,5-2,8) kullanarak tasarlayın.
  10. PCR astar özgüllük başvuru RNA dizisi veritabanı bir nükleotit patlama kullanarak ilgi organizmanın astar hizalayarak doğrulayın.
    1. (Https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) patlamada nükleotit patlamaüzerinde'yi tıklatın. Bir astar dizisi Sorgu sırası girinyapıştırın.
    2. Arama ayarla seçin bölümünde, diğerleri (nr vb)tıklatın, başvuru RNA serileri (refseq_rna) veritabanı seçeneğini seçin ve organizma (Örneğin, Mus musculus (taxid:10090) belirtin ) analizi için istenen türün sınırlamak için.
    3. Program seçimi için en uygun duruma biraz benzer dizileri (blastn)seçin. Algoritma parametreleri bölümünde 7 sayısı elde etmek için şansını artırmak için aşağı kelime boyutu azaltmak.
  11. Seçici astar tasarlamak için sadece bu kimin sırası ile istenmeyen cDNAs mümkün olduğunda en az 3 uyuşmazlığı vardır tutmak.
  12. Desalted astar sipariş tüm dış astar birlikte 1 µM son bir konsantrasyon karışık olabilir emin olmak için bir nispeten yüksek konsantrasyon (Örneğin, 200 µM) at.

3. RT reaktifler hazırlanması

  1. 5 x RT-mix: RT mix çözüm (5 x) 25 µM, rasgele astar ve 2.5 mm dNTPs içeren çalışma 400 µL RNase free suda hazırlamak. Bu çalışma karışımı 20 µL aliquots 500 µL tüpler olarak depolar.
  2. 20 x Dithiothreitol (DTT): 0,2 m DTT RNase free içinde 1 mL su hazırlamak ve 50 µL aliquots saklayın.
  3. 2.500 U RNase inhibitörü (40 U/µL) ve 10.000 transkriptaz (RTase, 200 U/µL) U 5 µL aliquots saklayın.
  4. RT reaktifler bir optimal kalitesini garanti etmek için aliquots-80 ° C'de depolayın Onları en çok 10 hücreler için ve sadece bir gün için kullanın.

4. PCR doğrulama

  1. CDNAs faiz yapısından toplam RNA çıkarılan (genellikle 1 µg)38 nispeten büyük miktarda tarihinde geriye doğru bir transkripsiyon yaparak hazırlamak.
    1. Pipetler özel hücre RT-PCR ön adımları için tek ama RNase free pipetler kullanmak için kullanmayın. Toplam RNA 1 µg/µL aşağı sulandırmak.
    2. Bir 500 µL PCR tüp içinde seyreltilmiş toplam RNA'ın 1 µL ve 8 µL RNase free su ekleyin. 1 dk. için 95 ° C'de tabiatını ve buz üzerinde tüp sakin.
    3. 4 µL RT 5 x arabelleği üretici tarafından verilmiş, RT mix çözüm 4 µL RTase 1 µL RNase inhibitörü 1 µL ve 200 mm DTT 1 µL ekleyin (Bölüm 3 bakınız).
    4. Tüp fiske, sıralayacağız ve gecede 37 ° C'de kuluçkaya
    5. CDNAs-80 ° C'de için birkaç yıl kadar saklayın. 1 ng/µL için toplam RNA'ların eşdeğerleri, seyreltilmiş cDNAs bir aliquot hazırlayın.
  2. Mix ve her astar çifti 1 µM, tek hücre RT-PCR adanmış Pipetler ile oranında seyreltin. Her astar Mix 20 µL 100 µL PCR için kullanın.
  3. Premiks içeren bir buzun üstünde her astar çifti için hazırlamak: su (QS, 80 µL), 10 X arabellek, 100 x dNTPs (50 µM her), 500-1000 pg cDNA seyreltilmiş 1 ng/µL 1 µL ve 0.5 µL (2.5 U, 5 U/µL) Taq polimeraz 10 µL.
  4. Sıkı bir optimum sıcaklık kontrolü için PCR makinesi kuyu uygun PCR tüpleri kullanın. 2 damla (~ 100 µL) PCR tüp kap veya duvar dokunmadan Premiks için mineral yağı ekleyin.
  5. Astar-dimer oluşumunu en aza indirmek için sıcak bir başlangıç 95 ° C'de önceden ısıtılmış thermocycler PCR tüpleri yerleştirerek gerçekleştirmek Sonra 30 s, hızlı bir şekilde yağ üzerine astar karışımı 20 µL sınırdışı.
  6. 95 ° C'de 3 dakika sonra 40 döngüleri çalıştırın (95 ° C, 30 s; 60 ° C, 30 s; 72 ° C, 35 s) son uzama adım 5 min için 72 ° C'de izledi.
  7. 10 µL her PCR ürünlerinin özel jel elektroforez (%2, ağırlık/hacim)39tarafından analiz. Bazı PCR ürünleri beklenen boyutu varsa, diğer astar (Bölüm 2 bkz) yeniden tasarımı.
    Dikkat: Etidyum bromür DNA mutasyonları neden olabilir intercalating bir kimyasaldır. Yerel emanet ofisi kullanmadan önce danışın. Her zaman bu işlenirken eldiven. Etidyum bromür (10 mg/mL) çözüm satın alabileceğiniz bir çözüm yerine toz inhalasyon riskini en aza indirmek için kullanın. Benzer şekilde, UV ışığı zararlı, UV koruma koruyucu gözlük ya da maske giymek emin olun. Kirli jelleri, ipuçları, eldiven ve kapsayıcılar etidyum atık için adanmış bir arabellek geri alıyorum.
  8. Tüm astar çiftleri tek tek doğrulandıktan sonra test multiplex protokolünü (Şekil 3).
    1. Mix ve tüm dış astar birlikte multiplex astar-20 ° C'de için birkaç hafta kadar karıştırın 1 µM. Store sulandırmak..
    2. Premiks içeren bir buz üzerinde hazırlamak: su (QS, 80 µL), 10 X arabellek, 100 x dNTPs (her 50 µM) 1 µL, 500-1000 pg 1 ng/µL ve 0.5 µL (2.5 U, 5 U/µL) Taq polimeraz seyreltilmiş cDNAs, 10 µL.
    3. PCR tüp fiske, sıralayacağız ve iki damla (~ 100 µL) madeni yağ ekleyin.
    4. Sıcak bir başlangıç adımda multiplex astar mix 4.5 20 µL ile anlatıldığı gibi gerçekleştirin. 95 ° C'de 3 dk sonra 20 PCR döngüleri olanlar adım 4,6 çalıştırın.
    5. PCR tüpleri analiz genlerin sayıya özdeş bir dizi hazır olun. Premiks adım 4.8.2, ancak ilk PCR ürününün gen başına 1 µL şablon olarak kullanarak hazırlayın. Tüm birimleri çözümlemek ve pipetting hataları telafi etmek için ilave hacminin % 10 kullanmayı düşünün için genlerin sayısına göre ayarlayın.
    6. Yavaşça salla, tüp spin, Premiks her PCR tüp 80 µL merkez ve tüpler kap veya duvar dokunmadan iki damla (~ 100 µL) tüp başına mineral yağ ekleyin.
    7. Bir sıcak gerçekleştirmek (bkz. Adım 4.5) başlamak iç astar mix kovma 20 µL tarafından hazırlanan adım 4.2. 35 PCR döngüleri adım 4,6 aynı çalıştırın.
    8. İkinci PCR ürünleri özel jel elektroforez tarafından analiz. Her ikinci PCR bir amplicon beklenen boyutu oluşturur emin olun. Yetersiz ya da nonspesifik arttırımlar durumunda yeni astar (adım 2.5-2.12) yeniden tasarımı ve onları (adım 4.2-4.8) doğrulamak.

5. hazırlık ve hücre içi yama-kelepçe çözüm doğrulama

Not: Aşağıdaki protokol hazırlık açıklar ve bir K+/gluconate doğrulanmasını iç çözüm bağlı RT-PCR verimliliğini engel değil sürece neredeyse her tür yama-kelepçe çözüm kullanılabilir Eldiven giymiş RNase free dahili çözümü elde etmek için zorunludur.

  1. 60 mL için iç yama-kelepçe kayıt çözeltisi, altercations 10 mL 0.1 m KOH hazırlayın.
  2. EGTA (0,5 mM son) 11,4 mg 0.9 ml 0.1 M KOH geçiyoruz.
  3. 40 mL RNase free su ekleyin ve K-glukonat (144 mM son), HEPES (son 10 mM) 143 mg ve 1 M MgCl2 (3 mM son) 180 µL 2.02 g geçiyoruz.
  4. PH 7.2 için ~ 6 mL 0.1 m KOH ekleyerek ayarlayın.
  5. OSMOLARİTE ~ 13 mL su RNase free ile 295 mOsm için ayarlayın.
  6. İç çözüm de ters transkripsiyon için bir tampon olarak kullanılır beri dikkatle Mg2 + konsantrasyonu kontrol. Daha sonra 2 mM RT tepki olarak son bir konsantrasyon ulaşmak için MgCl2 ekleyerek iç çözüm daha düşük bir Mg2 + konsantrasyon telafi.
  7. Hasat hücre sonra yama-kelepçe kayıt etiket (yukarıdaki adımları 5.1-5,5) açıklanan iç çözüm için 2-5 mg/mL RNase free biocytin ekleyin.
  8. (0,22 µm gözenek boyutu) iç çözüm filtre ve-80 ° C'de olarak 100-250 µL aliquots saklayın.
  9. Tek hücreli RT-PCR için iç çözüm kullanımını doğrulamak için 1 ng/µL 6 µL yama-kelepçe çözüm için seyreltilmiş toplam RNA'ların 0.5 µL ekleyin ve yaklaşık 30 dk için bankta bırakın.
  10. 2 µL micropipette ile 5 x RT-mix, 20 x DDT 0.5 µL, 0.5 µL RNase inhibitörü ve 0.5 µL 2 µL eklemek RTase ve bir gecede 37 ° C'de kuluçkaya
  11. Tüpü çevir. Buz üstünde su (QS, 80 µL), 10 X arabellek 10 µL ve 0.5 µL (2.5 U, 5 U/µL) Taq polimeraz ekleyin.
  12. PCR doğrulanmış astar (adım 4.4-4,6) bir dizi kullanarak 40 döngüleri gerçekleştirin.
  13. PCR ürünlerinin özel jel elektroforez tarafından analiz (bkz. Adım 4,7) ve beklenen boyutu olduğundan emin olun.
    Not: Toplam RNA'ın 0.5 µL atlama ve eski yerine koymak o ile 0.5 µL RNase free su iç çözüm RNA ve/veya DNA contaminations ücretsiz olmasını sağlayacaktır.

6. Akut dilim hazırlık

Not: Bu protokol çocuk (yani, daha az 28 Doğum sonrası gün) için dilimleme yordamı açıklar erkek ve dişi fareler. Sükroz tabanlı yapay beyin omurilik sıvısı (aCSF) gibi diğer kesim çözümler de kullanılabilir40vardır.

  1. 2 L 125 NaCl, 2.5 (mM) içeren aCSF hazırlamak KCl, 2 CaCl2, 1 MgCl2, 1,25 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 10 glikoz ve 15 sükroz. Dilim hazırlık sırasında glutamatergic etkinliğini azaltmak için kynurenic asit 1 mM ekleyerek bir kesme çözüm hazır olun.
  2. Dilimleme önce cerrahi makas, iyi Iris makas, iki spatula, forseps, kağıt filtre ve cyanoacrylate tutkal bir disk içeren bir diseksiyon çantası hazırla.
  3. O2Co2 (% %95/5) ve cool down-20 ° C'de kesim odası ile doymuş buz gibi kesme çözüm kullanın
  4. Fare ile isoflurane batırılmış küçük kağıt havlu ile anestezi. ~ 2 dk sonra fare yanıt-e doğru fiske pençe yokluğu doğrulayarak derin anestezi altında olduğundan emin olun.
  5. Hızlı fare başını kesmek. Kafa derisi kaldırmak ve kafatası açın. Beyin dikkatle ayıklamak ve O2Co2ile oksijenli buz gibi (~ 4 ° C) kesme çözüm ile dolu küçük bir kabı içine yerleştirin.
  6. -20 ° C şartlarından kesim odası kaldırın ve kağıt havlu ile nem kaldırın.
  7. Dikkatle bölgenin ilgi izole, bu kesim odası üzerinde tutkallayın ve O2Co2ile oksijenli buz gibi kesme çözüm eklemek için beynini incelememize.
  8. Bir vibratome kullanarak 300 µm kalınlığında dilimler kesin. Onları oksijenli kesme çözüm ile dolu bir dinlenme odasında oda sıcaklığında aktarmak ve en az 0.5 h kurtarmak izin.

7. tek hücre RT-PCR yama-kelepçe kaydettikten sonra

  1. %30 H2O2 çözüm perfüzyon sistemi ~ 100 mL ile düzenli olarak temizlemek ve RNase kirlenme gözden kaçan bir kaynak olduğu gibi ~ 500 mL yoğun bakteri büyüme, önlemek için distile su ile durulayın.
  2. Filaman hasat her gün konsantre çamaşır suyu ile dolu bir yama pipet ile klorlamak. Bir micropipette yama pipet ama 1 mL şırınga bağlı oldukça 20 µL uzun, ince, esnek bahşiş doldurmak için kullanmayın. Sonra yoğun RNase free suyla durulayın ve gaz silgi ile kuru.
  3. Buz 5 x RT-mix ve 20 x DTT aliquots içeren küçük bir kutu hazır olun. -20 ° C'de RTase ve RNase inhibitörü aliquots bir benchtop soğutucu depolar.
  4. Bir dilim oksijenli aCSF ile 1-2 mL/dk periosteum kayıt odasına aktar.
  5. Eldiven giyen süre (1-2 µm açık uç çapı, 3-5 MΩ) yama pipetler borosilikat camdan çek ve onlardan biri iç çözüm 8 μL ile doldurun. Pipet çektirme kolları RNase kirlenme kaynağı vardır unutmayın.
  6. Pipet pipet sahibi ise yeni eldiven giymiş ve filament parmak ile değil müessir yerleştirin.
  7. Pozitif basınç ile yama pipet yaklaşım ve hedeflenen hücre (Şekil 4) karakterize etmek için bütün hücreli kayıt gerçekleştirin.
  8. MRNA'ların korumak için tüm hücreli yapılandırma 20 dk41. zaman sınırı
  9. Kaydın sonunda, bir 500 µL PCR tüp ile 2 dolu hazırlamak µL RT Mix x 5 ve 20 0.5 µL x DTT, spin ve buza saklayın.
  10. Hücre sitoplazma (Şekil 4) hafif bir negatif basınç uygulayarak hasat. Hücrenin içeriği içinde pipet sıkı bir mühür koruyarak görsel denetimi.
    1. Bazı intron daha az genler görülürse çekirdek toplama mümkün olduğunca kaçının. Böyle bir durumda her zaman astar gDNA için genomik kontaminasyon sondası yükseltecek amaçlı bir dizi içerir.
    2. Eğer çekirdek pipet ucu yakın geliyor, negatif basınç ve pipet çekirdek uzak hareket. Sıkı mühür korunur emin olun ve yeni pipet yeri sitoplazma toplamak için yeniden başlatın.
  11. Yok daha fazla malzeme gelirken ve/veya sıkı mühür kaybetmek önce toplamaktan vazgeçin.
  12. Yavaşça bir dış-out yama kirlenme ekstraselüler enkaz (Şekil 4) tarafından sınırlamak için ve daha sonraki histochemical analiz için hücre zarı kapatılması lehine oluşturmak için pipet geri alıyorum.
  13. Unutmayın bu topuzlar, micromanipulators, bilgisayar klavye veya bilgisayar fare RNase kirlenme potansiyel kaynaklarıdır. Kayıt sırasında dokundu edilmiştir, eldiven değiştirin.
  14. Pipet Expeller üstün için iliştirin ve pozitif basınç (Şekil 1) uygulayarak PCR tüp içine içeriğini sınırdışı.
  15. Pipet Ucu içerik koleksiyonu yardım için PCR tüp kır.
  16. Kısaca tüp santrifüj kapasitesi, 0.5 µL RNase inhibitörü ve RTase 0.5 µL ekleyin, karışımı yavaşça, tekrar santrifüj kapasitesi ve gecede 37 ° C'de kuluçkaya
  17. Tüp spin ve-80 ° C'de için birkaç ay öncesine kadar PCR analiz kadar saklayın.
  18. İlk amplifikasyon adım doğrudan su (QS, 80 µL), 10 x arabelleği 10 µL ve 0.5 µL (2.5 U) Taq polimeraz ekleyerek ~ 10 µL RT ürünleri içeren tüp gerçekleştirin. Adımları 4.8.2–4.8.8 içinde açıklanan yönergeleri izleyin.

8. histochemical kaydedilen hücre (isteğe bağlı) boyama

  1. Elektrofizyolojik kayıtlar 20 dk için dilim biocytin difüzyon aksonlar ve dendritik ağacında izin vermek için oksijenli aCSF korumak.
  2. Dilimi bir 24-şey plaka ve düzeltme bu gecede 4 ° c ile % 4 paraformaldehyde 1 mL 0.1 M fosfat tampon bir kuyuda yerleştirin.
  3. 4 kez, 5 min her, dilimleri yıkayın 1 mL fosfat Buffered Saline (PBS) ile.
  4. Aynı şey, permeabilize ve 1 mL soğuk su balık cilt (PBS-GT) üzerinden % 0.25 Triton X-100 ve % 0,2 jelatin ile takıma PBS ile sırasında oda sıcaklığında 1 saat dilimi emdirmek.
  5. Gece 1'de seyreltilmiş bir fluorescently etiketli avidin ile kuluçkaya/400 PBS-gt 250-500 µL içinde
  6. 5 kere 5 dk yıkama her biri, PBS 1 mL ve dilimleri monte edin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Multiplex RT-PCR temsilcisi doğrulamasına Şekil 3' te gösterilmiştir. Protokol aynı anda 12 farklı genler ifade soruşturma için tasarlanmıştır. Veziküler glutamat ışınlama vGluT1 glutamatergic nöronlar42için pozitif kontrol olarak alınmıştır. Enzimler (GAD65 ve GAD 67), peptit Y (NPY) ve Somatostatin (SOM) sentezleme GABA GABAergic interneurons3,5,11işaretleri kullanılmıştır. Siklooksijenaz-2 enzim (COX-2) piramit hücre alt nüfus3,16bir işareti olarak kullanıldı.

ATP1α1-3 alt birimleri Na+nöronal aktivite ve metabolik Birleşik43arasındaki ilişki değerlendirmek için /K+ ATPaz ve ATP duyarlı K+ kanalları Kir6.2 ve SUR1 alt birimleri seçilmiştir. Kir6.2 bir intron daha az gen olduğundan, SOM intron genomik denetimi olarak dahil edildi. Protokol 1 üzerinde test edilmiştir44hücreleri ng ters kopya etmek toplam RNA yaklaşık 20 transkript için karşılık gelen fare tüm beyin ayıklanır. Çoklu PCR 12 amplicons beklenen boyutu (Şekil 3 ve Tablo 1) üretilen duyarlılık ve protokolünün etkinliği gösteren. RNA gerçekleştirilen negatif kontrol yok amplicon (veri gösterilmez) üretti.

Bir katman V piramit nöron görsel olarak onun büyük soma ve tanınmış bir apikal dendrite tarafından tespit edilmiştir (Şekil 5A, iç metin). Tüm cep telefonu kayıt katmanı V nöronlar5,45,46 ile özellikle spiking normal, düşük giriş dirençli, uzun ömürlü Aksiyon potansiyelleri ve belirgin başak tipik elektrofizyolojik özellikleri ortaya frekans adaptasyon (Şekil 5A). Bu nöron moleküler Analizi vGluT1 ifade saptandı (Şekil 5B), onun glutamatergic fenotip42,46teyit. Bu nöron de SOM, ATP1α1 ve+na 3 alt birimleri ifade /K+ ATPaz. Biocytin kaydedilen nöronlar etiketleme piramit morfoloji (Şekil 5 d) doğruladı.

Glutamatergic neurons beklendiği gibi 26 katman V piramit hücreleri moleküler Analizi VGluT1 ifadesi, ama iki GADs (Şekil 5C). hiçbiri ortaya İnterneurons işaretleri nadiren5,42,46tespit edildi. COX-2 esas Katman II-III piramit hücreleri3,16, ifade, katman V piramidal hücrelerde algılanmadı. ATP1α1 ve 3 alt birimleri ATP1α2 alt birim3daha sık gözlenen. Kir6.2 ve SUR1 alt birimleri nadiren katman V piramidal nöronların, üst katman3,43Tercihli onların ifade ile tutarlı olduğu tespit edildi. Bakım SOM intron (3 dışarı-in 26 hücreleri, yani, % 12'si) nadir bir algılama içinde kaynaklanan çekirdek hasat değil götürüldü.

Figure 1
Şekil 1: tek hücre RT-PCR için adanmış kutusu. RT-PCR için yama-kelepçe sonra ayrılmış malzeme listesi. (1) borosilikat cam kılcal damarlar, (2) 20 µL uzun, ince, esnek ipuçları, (3) 20 µL micropipette, (4) ev yapımı Expeller üstün, (5) 500 µL PCR tüpleri, (6) 10 µL aerosol dayanıklı filtre ipuçları ve (7) kalıcı işaretleri. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2: PCR astar tasarım stratejisi. (A)COX 2 gen içeren fare kromozom 2 sıra hizalanmış COX 2 cDNA kodlama dizisi şematik gösterimi. Ekzonlar siyah kasa ve intron gDNA beyaz kutuları üzerinde gösterilir. GDNA intronic dizileri karşılık gelen cDNA boşluklar unutmayın. Kırmızı ve yeşil ok olarak sırasıyla temsil kötü ve iyi oligonucleotides temsilcisi örnekleri. Sağ ve sol okları ileriye ve geriye doğru astar göstermek. (B) dizileri ve ikincil yapılar (A) gösterilen oligonucleotides. Sol ve sağ kapı aynası saç tokası öz-tamamlayıcılık ve öz-dimer oluşumu, sırasıyla gösterir. Oysa B2 oligonükleotid sadece dimer oluşumu gösterir B1 oligonükleotid bir her iki güçlü saç tokası öz-tamamlayıcılık ve dimer oluşumu görüntüler. B3 ve B4 oligonucleotides yok saç tokası öz-tamamlayıcılık ve hiçbir dimer oluşumu var; Onlar intron overspanning (A) ve (bkz. Tablo 1) potansiyel PCR astar seçilmiştir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: çoklu PCR doğrulanmasını. 1 ng--dan fare tüm beyin toplam RNA'ın PCR güçlendirme iki tur tarafından takip bir ters transkripsiyon için tabi. 12 PCR ürünleri ayrı Şerit özel jel elektroforez Haetarafından III sindirilmiş Φx174 paralel olarak tarafından çözüldü. İkinci PCR ürünleri dizileri tarafından öngörülen boyutlarda (bp) vardı: 153 (vGluT1), 248 (GAD65), 255 (GAD67), 181 (COX 2), 220 (NPY), 146 (SOM), 183 (ATP1a1), 213 (ATP1a2), 128 (ATP1a3), 342 (Kir6.2), 211 (SUR1) ve 182 (SOMint). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4: yama-kelepçe beyin dilimler halinde hasat. Bir kez bir hücreye görsel olarak tanımlanır, kayıt pipet pipet ucu, hücresel enkaz kirlenmesini önlemek için olumlu bir basınçla yaklaştı. Gamze bu nöron membran üzerinde unutmayın. Pozitif basınç sonra hücre bağlı yapılandırma Gigaohm sıkı mühür ile oluşturmak üzere kesilir. Kısa suctions bütün hücreli yapılandırmaya geçiş yapmak için uygulanır. Kaydın sonunda, sitoplazma pipet sıkı mühür koruyarak hafif bir negatif basınç uygulayarak hasat edilir. Hücre vücut büzülme toplama işlemi sırasında dikkat edin. Kayıt pipet sonra yavaşça hücre zarı kapatma sonraki biocytin vahiy ve yama pipet hasat malzeme korunması için iyilik bir dış-out yama oluşturmak için çekilmiş. Cauli ve Lambolez47 Kimya Royal Society izniyle çoğaltılamaz. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 5
Şekil 5: katman V neocortical piramit hücrelerin karakterizasyonu. (A)membran bir katman V piramit hücrenin olası yanıt -100, -40 -10 + 60 + 120 ve +500 pA (alt izleri) geçerli darbeleri tarafından indüklenen. Nöron ilk hyperpolarizing yanıt (üst izleri) sonra zayıf bir potansiyel saptırma görüntüler. Supraliminal bir depolarizasyon yanıt olarak, yavaş yavaş hyperpolarization sonra (üst izle) geliştirme ile uzun süreli Aksiyon potansiyelleri nöron taburcu. Doygunluk, nöron düşük frekansta taburcu ve belirgin adaptasyon (üst gri izle) sergilenmektedir. İç metin: kaydedilen katmanı V piramit nöron kızılötesi resimleri. Yukarı doğru pial yüzeydir. Ölçek çubuğu: Multiplex RT-PCR ifade vGluT1, SOM, ATP1α1 ve ATP1α3 açığa 20 µm. (B) analizi. (C) gen ifade profil 26 bir örnek katman V piramit hücreleri. GAD65, GAD67 ve COX2 asla algılanan iken vGluT1 tüm nöronlarda ifade edildi. NPY, SOM, Kir6.2, SUR1 ve SOMint nadiren gözlendi. Piramit hücreleri ifade ATP1α3, na+1 alt birim /K+ ATPaz ve daha az bir ölçüde ATP1α2. (D) en fazla yoğunluk projeksiyon confocal görüntülerin biocytin nöron etiketleme (A) kaydedilen gösterilen. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Gen / GenBank numarası Dış astar Boyutu (bp) İç astar Boyutu (bp)
vGlut1
NM_182993		 Anlamda,-113 259 Anlamda,-54 153
GGCTCCTTTTTCTGGGGCTAC ATTCGCAGCCAACAGGGTCT
Anti-anlamda, 126 Anti-anlamda, 79
CCAGCCGACTCCGTTCTAAG TGGCAAGCAGGGTATGTGAC
GAD65
NM_008078		 Anlamda, 99 375 Anlamda, 219 248
CCAAAAGTTCACGGGCGG CACCTGCGACCAAAAACCCT
Anti-anlamda, 454 Anti-anlamda, 447
TCCTCCAGATTTTGCGGTTG GATTTTGCGGTTGGTCTGCC
GAD67
NM_008077		 Anlamda, 529 598 Anlamda, 801 255
TACGGGGTTCGCACAGGTC CCCAGAAGTGAAGACAAAAGGC
Anti-anlamda, 1109 Anti-anlamda, 1034
CCCAGGCAGCATCCACAT AATGCTCCGTAAACAGTCGTGC
COX 2
NM_011198		 Anlamda, 199 268 Anlamda, 265 181
CTGAAGCCCACCCCAAACAC AACAACATCCCCTTCCTGCG
Anti-anlamda, 445 Anti-anlamda, 426
CCTTATTTCCCTTCACACCCAT TGGGAGTTGGGCAGTCATCT
NPY
NM_023456		 Anlamda, 16 69° Anlamda, 38 220
CGAATGGGGCTGTGTGGA CCCTCGCTCTATCTCTGCTCGT
Anti-anlamda, 286 Anti-anlamda, 236
AAGTTTCATTTCCCATCACCACAT GCGTTTTCTGTGCTTTCCTTCA
SOM
NM_009215		 Anlamda, 43 208 Anlamda, 75 146
ATCGTCCTGGCTTTGGGC GCCCTCGGACCCCAGACT
Anti-anlamda, 231 Anti-anlamda, 203
GCCTCATCTCGTCCTGCTCA GCAAATCCTCGGGCTCCA
ATP1α1
NM_144900 		Anlamda, 1287 288 Anlamda, 1329 183
CAGGGCAGTGTTTCAGGCTAA TAAGCGGGCAGTAGCGGG
Anti-anlamda, 1556 Anti-anlamda, 1492
CCGTGGAGAAGGATGGAGC AGGTGTTTGGGCTCAGATGC
ATP1α2
NM_178405		 Anlamda, 1392 268 Anlamda, 1430 213
AGTGAGGAAGATGAGGGACAGG AAATCCCCTTCAACTCCACCA
Anti-anlamda, 1640 Anti-anlamda, 1623
ACAGAAGCCCAGCACTCGTT GTTCCCCAAGTCCTCCCAGC
ATP1α3
NM_144921		 Anlamda, 127 216 Anlamda, 158 128
CGGAAATACAATACTGACTGCGTG TGACACACAGTAAAGCCCAGGA
Anti-anlamda, 324 Anti-anlamda, 264
GTCATCCTCCGTCCCTGCC CCACAGCAGGATAGAGAAGCCA
Kir6.2
NM_010602		 Anlamda, 306 431 Anlamda, 339 342
CGGAGAGGGCACCAATGT CATCCACTCCTTTTCATCTGCC
Anti-anlamda, 719 Anti-anlamda, 663
CACCCACGCCATTCTCCA TCGGGGCTGGTGGTCTTG
SUR1
NM_011510		 Anlamda, 1867 385 Anlamda, 2041 211
CAGTGTGCCCCCCGAGAG ATCATCGGAGGCTTCTTCACC
Anti-anlamda, 2231 Anti-anlamda, 2231
GGTCTTCTCCCTCGCTGTCTG GGTCTTCTCCCTCGCTGTCTG
SOMint
X51468		 Anlamda, 8 240 Anlamda, 16 182
CTGTCCCCCTTACGAATCCC CTTACGAATCCCCCAGCCTT
Anti-anlamda, 228 Anti-anlamda, 178
CCAGCACCAGGGATAGAGCC TTGAAAGCCAGGGAGGAACT

Tablo 1. Birinci ve ikinci PCR astar dizisi. Her PCR astar ve onların dizileri konumunu verilen 5' 3' için. Somatostatin intron dışında pozisyonu 1 başlama kodonu her gen ilk aşamaya karşılık gelir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Tek hücre multiplex RT-PCR electrophysiologically tanımlanan hücreleri530'dan fazla genlerin ifade aynı anda ve güvenilir bir şekilde yama-kelepçe yoklama sonra. Gen ifadesinin tek hücre düzeyinde analiz yüksek verimli PCR astar gerektirir. En sınırlayıcı adımlardan biri hücrenin içerik topluluğudur. Verimlilik hücre boyutu eşleştirme sırasında mümkün olduğu kadar büyük olmalıdır yama pipet ucu çapı göre değişir. Pipetler 1-2 µm açık uç çapı en nöronal türleri için uygun olduğu kanıtlanmıştır. Yalnızca hücre içeriği tahsil edilen, emin olmak için önemlidir ve çevresindeki doku olmadığı. Bu electrophysiologically sıkı bir mühür korunması hasat sırasında kontrol ederek elde edilir. Bir dış-out yama konfigürasyonu sırasında pipet çekilmesi daha fazla oluşumu hasat sitoplazma hücresel enkazı korur. Multiplex RT-PCR da incelenen hücre tipi mRNA'ların bolluk bağlıdır tek hücre başarı oranı. Örneğin, mRNA'ların nispeten düşük miktarda3hızlı, astrocytes ile elde edilen verim genellikle nöronlar ile elde edilen bir daha düşüktür ve bu nedenle örnek boyutu15,16artan gerektirir. Tüpler48yılında düşük verimlilik olan Ters transkripsiyon, tek sınırlayıcı tepki multiplex RT-PCR hücre var. Bu nedenle en kaliteli reaktifler, onları aliquots-80 ° c olarak depolamak ve bunları sadece bir gün için kullanmak için kullanmak için önemlidir. Son olarak, RTase DNA polimeraz faaliyet kez astar-dimer oluşumu gözden kaçan bir kaynağıdır. Bu sorunu gidermek için astar ile sıcak bir başlangıç yapmak amplifikasyon verimliliğini artırmak için önemlidir. Ayrıca bu RTase Taq DNA polimeraz etkinlik49üzerinde inhibitör etkisi azaltır.

Tek hücre multiplex RT-PCR tekniği çok yönlü olduğunu. Bu kapsamlı kemirgenler10,11,13,19,20,34,50,51,52 kullanılmıştır ,53,54 ama hemen hemen tüm hayvan modelleri ve doku ve gen dizileri hazır olduğunu varsayarsak genler için adapte edilebilir. Hücre ücretsiz deneyleri üzerinde RT-PCR ile müdahale değil sürece Çeşitli yama-kelepçe çözümleri kullanılabilir. Örneğin K+ veya Cs+ katyonlar, Cl- veya glukonat temel iç çözümleri başarıyla kullanılan6,36,41,55olmuştur.

Klasik yanlış negatif sonuçlar yama pipet filaman ve/veya iç yama-kelepçe çözüm RNase kirlenme kaynaklanıyor. Dikkatle filaman klorlanması ve iç çözüm genellikle doğrulama çözmek bu problem. Sitoplazma yalnızca bir kısmı hasat edilir beri düşük tek hücre düzeyinde bir gen ifade yanlış negatif sonuçlar da ortaya çıkabilir. Hasat kalitesi daha büyük pipetler kullanarak ve/veya bütün hücreli kayıt süresini azaltma tarafından artırılabilir. Hasat kalitesi bir gen tek hücreleri20düşük bir düzeyde ifade edilecek bilinen dahil olmak üzere tarafından tespit edilebilir. Yanlış pozitif sonuçlar hücresel enkaz kirletici miktarı yüksek olduğu kötü doku kalitesi ile oluşabilir. Şüpheleniliyorsa enkaz olmadan herhangi bir mühür gerçekleştirme ve pipet kaldırma önce pozitif basınç serbest bırakmak içine dilim yama pipet ekleyerek yapılır. Amplifiable malzemeleri varlığı sonra multiplex RT-PCR42tarafından probed. Silanizing yama pipet da ekstrasellüler kirletici madde56topluluğu azaltmak için kullanılmıştır. Tek hücre PCR küçük çift iplikçikli DNA57tek bir kopyası olarak algılayabilir çok hassas bir tekniktir. İntron daha az genler durumunda çekirdeğinde bulunan gDNA de yanlış pozitif üretebilir. GDNA topluluğu bu sorunu çözmek için hasat belgili tanımlık yardım etmek sırasında uzak çekirdek pipet yerleştirerek kaçınarak. GDNA varlığı güvenilir bir intronic sıra25yükseltecek tarafından probed.

MRNA molekülleri RT-PCR tarafından algılanmasını muhtemelen RTase48düşük verimlilik nedeniyle 10 kopya,44, güvenilmez olur ve neden olabilir bir algılama düşük-bereket transkript26,42altında. Bu durumda intron daha az genler sorunlu olabilir. Gerçekten de, hasat çekirdeği kaçınarak toplanabilir sitoplazma miktarı ve bu nedenle algılama hassasiyeti azaltır. Tek hücreli RT-PCR biocytin etiketleme ile yama-kelepçe hücrenin şeklini mümkün olduğunca korunmasını gerektirir sonra kombinasyonu (Şekil 3). Kaçınılmaz olarak, bu böylece başarı oranı azaltma toplanabilir malzeme miktarını azaltır. Sitoplazma toplanması ve korunması hücre morfolojisi arasında bir uzlaşma zorunludur.

Onlar sadece cDNAs olup bilgi vermek gibi Multiplex tek hücreli RT-PCR veri nicel değildir mevcut veya toplanan malzeme yok. Ancak, yukarıda açıklanan algılama sınırları nedeniyle, genler tek hücre düzeyinde bereket algılama nüfus düzeyinde oluşumunu yansıtabilirsiniz. Alternatif yaklaşımlar daha fazla nicel veri nesil izin, ancak onların belirli güçlendirme stratejileri ile (yani, göreli miktar homolog genleri veya RT-qPCR) büyük ölçüde empoze teknik kısıtlamalar sayısını kısıtlayın aynı anda olabilir genler41,53,55,58,59,60,61,62,63 analiz ,64,65,66. Yama-kelepçe kayıtları ve tek hücre RNaseq, yama-seq30,31anılacaktır son birleşimi nicel transcriptomic analiz hücre electrophysiologically ile karakterize sağlar. Bu yeni ve umut verici bir yaklaşım, henüz erişmesi gereken yüksek üretilen iş sıralayıcılar ve oluşturulan verilerin zaman alıcı analiz gerektirir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

Dr Alexandre Mourot el yazması üzerine onun yorum için teşekkür. Bu eser Agence Nationale de la Recherche (ANR 2011 MALZ 003 01; gelen hibe tarafından desteklenmiştir ANR-15-CE16-0010 ve ANR-17-CE37-0010-03), BLG Fondation pour la Recherche sur Alzheimer bursu tarafından desteklenmektedir. IBPS (Paris, Fransa) hayvan tesisi teşekkür ediyoruz.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MACAW v.2.0.5 NCBI Multiple alignement for primer design
Dithiothreitol VWR 443852A RT
Random primers Sigma-Aldrich (Merck) 11034731001 RT
dNTPs GE Healthcare Life Sciences 28-4065-52 RT and PCR
RNasin Ribonuclease Inhibitors Promega N2511 RT
SuperScript II Reverse Transcriptase Invitrogen 18064014 RT
Taq DNA Polymerase Qiagen 201205 PCR
Mineral Oil Sigma-Aldrich (Merck) M5904-5ML PCR
PCR primers Sigma-Aldrich (Merck) PCR / desalted and diluted at 200 µM
Tubes, 0.5 mL, flat cap ThermoFisher Scientific AB0350 RT and PCR
BT10 Series - 10 µL Filter Tip Neptune Scientific BT10 RT and PCR
BT20 Series - 20 µL Filter Tip Neptune Scientific BT20 RT and PCR
BT200 Series - 200 µL Filter Tip Neptune Scientific BT200 RT and PCR
BT1000 Series - 1000 µL Filter Tip Neptune Scientific BT1000.96 RT and PCR
DNA Thermal Cylcer Perkin Elmer Cetus PCR
Ethidium Bromide Sigma-Aldrich (Merck) E1510-10ML Agarose gel electrophoresis
Tris-Borate-EDTA buffer Sigma-Aldrich (Merck) T4415-1L Agarose gel electrophoresis
UltraPure Agarose Life Technologies 16500-500 Agarose gel electrophoresis
ΦX174 DNA-Hae III Digest NEB (New England BioLabs) N3026S Agarose gel electrophoresis
EDA 290 Kodak Agarose gel electrophoresis
Electrophoresis Power supply EPS 3500 Pharmacia Biotech Agarose gel electrophoresis
Midi Horizontal Elecrophoresis Unit Model SHU13 Sigma-Aldrich (Merck) Agarose gel electrophoresis
Smooth paper with satin appearance Fisherbrand 1748B Patch clamp internal solution
Potassium Hydroxyde Sigma-Aldrich (Merck) 60377 Patch clamp internal solution
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid Sigma-Aldrich (Merck) E3889 Patch clamp internal solution
HEPES Sigma-Aldrich (Merck) H4034 Patch clamp internal solution
Potassium D-gluconate Sigma-Aldrich (Merck) G4500 Patch clamp internal solution
Magnesium chloride solution Sigma-Aldrich (Merck) M1028 Patch clamp internal solution
5500 Vapor Pressure Osmometer Wescor Patch clamp internal solution
Biocytin Sigma-Aldrich (Merck) B4261 Patch clamp internal solution
Sucrose Sigma-Aldrich (Merck) S5016 Slice preparation
D-(+)-Glucose monohydrate Sigma-Aldrich (Merck) 49159 Slice preparation
Sodium chloride Sigma-Aldrich (Merck) S6191 Slice preparation
Potassium chloride Sigma-Aldrich (Merck) 60128 Slice preparation
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich (Merck) 31437-M Slice preparation
Sodium phosphate monobasic Sigma-Aldrich (Merck) S5011 Slice preparation
Magnesium chloride solution Sigma-Aldrich (Merck) 63069 Slice preparation
Calcium chloride solution Sigma-Aldrich (Merck) 21115 Slice preparation
Kynurenic acid Sigma-Aldrich (Merck) K3375 Slice preparation
Isoflurane Piramal Healthcare UK Slice preparation
VT 1000S Leica Biosystems 14047235613 Slice preparation
Hydrogen peroxide solution Sigma-Aldrich (Merck) H1009 Patch Clamp set-up cleaning
Thin Wall Glass Capillaries with filament World Precision Instruments TW150F-4 Patch Clamp
PP-83 Narishige Patch Clamp
Eppendorf Microloader Eppendorf 5242956003 Patch Clamp
BX51WI Upright microscope Olympus Patch Clamp
XC-ST70/CE CCD B/W VIDEO CAMERA Sony Patch Clamp
Axopatch 200B Amplifier Molecular Devices Patch Clamp
Digidata 1440 Molecular Devices Patch Clamp
pCLAMP 10 software suite Molecular Devices Patch Clamp
10 mL syringe Terumo SS-10ES Expelling
E Series with Straight Body (Holder) Phymep 64-0997 Expelling
Sodium phosphate dibasic Sigma-Aldrich (Merck) S7907 Histochemical revelation
Sodium phosphate monobasic Sigma-Aldrich (Merck) S8282 Histochemical revelation
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich (Merck) P6148 Histochemical revelation
Triton X-100 Sigma-Aldrich (Merck) X100 Histochemical revelation
Gelatin from cold water fish skin Sigma-Aldrich (Merck) G7041 Histochemical revelation
Streptavidin, Alexa Fluor 488 conjugate ThermoFisher Scientific S11223 Histochemical revelation
24-well plate Greiner Bio-One 662160 Histochemical revelation

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ascoli, G. A., et al. Petilla terminology: nomenclature of features of GABAergic interneurons of the cerebral cortex. Nat.Rev.Neurosci. 9 (7), 557-568 (2008).
  2. DeFelipe, J., et al. New insights into the classification and nomenclature of cortical GABAergic interneurons. Nat.Rev.Neurosci. , (2013).
  3. Tasic, B., et al. Adult mouse cortical cell taxonomy revealed by single cell transcriptomics. Nat.Neurosci. , (2016).
  4. Zeisel, A., et al. Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq. Science. , (2015).
  5. Cauli, B., et al. Classification of fusiform neocortical interneurons based on unsupervised clustering. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 97 (11), 6144-6149 (2000).
  6. Cauli, B., et al. Molecular and physiological diversity of cortical nonpyramidal cells. J.Neurosci. 17 (10), 3894-3906 (1997).
  7. Férézou, I., et al. 5-HT3 receptors mediate serotonergic fast synaptic excitation of neocortical vasoactive intestinal peptide/cholecystokinin interneurons. J. Neurosci. 22 (17), 7389-7397 (2002).
  8. Cauli, B., et al. Cortical GABA interneurons in neurovascular coupling: relays for subcortical vasoactive pathways. J.Neurosci. 24 (41), 8940-8949 (2004).
  9. Wang, Y., Gupta, A., Toledo-Rodriguez, M., Wu, C. Z., Markram, H. Anatomical, physiological, molecular and circuit properties of nest basket cells in the developing somatosensory cortex. Cereb.Cortex. 12 (4), 395-410 (2002).
  10. Wang, Y., et al. Anatomical, physiological and molecular properties of Martinotti cells in the somatosensory cortex of the juvenile rat. J.Physiol. 561 (Pt 1), 65-90 (2004).
  11. Karagiannis, A., et al. Classification of NPY-expressing neocortical interneurons. J.Neurosci. 29 (11), 3642-3659 (2009).
  12. Battaglia, D., Karagiannis, A., Gallopin, T., Gutch, H. W., Cauli, B. Beyond the frontiers of neuronal types. Front Neural Circuits. 7, 13 (2013).
  13. Toledo-Rodriguez, M., et al. Correlation maps allow neuronal electrical properties to be predicted from single-cell gene expression profiles in rat neocortex. Cereb.Cortex. 14 (12), 1310-1327 (2004).
  14. Toledo-Rodriguez, M., Goodman, P., Illic, M., Wu, C., Markram, H. Neuropeptide and calcium binding protein gene expression profiles predict neuronal anatomical type in the juvenile rat. J.Physiol. , (2005).
  15. Lecrux, C., et al. Pyramidal neurons are "neurogenic hubs" in the neurovascular coupling response to whisker stimulation. J.Neurosci. 31 (27), 9836-9847 (2011).
  16. Lacroix, A., et al. COX-2-derived prostaglandin E2 produced by pyramidal neurons contributes to neurovascular coupling in the rodent cerebral cortex. J.Neurosci. 35 (34), 11791-11810 (2015).
  17. Matthias, K., et al. Segregated expression of AMPA-type glutamate receptors and glutamate transporters defines distinct astrocyte populations in the mouse hippocampus. J.Neurosci. 23 (5), 1750-1758 (2003).
  18. Rancillac, A., et al. Glutamatergic control of microvascular tone by distinct gaba neurons in the cerebellum. J.Neurosci. 26 (26), 6997-7006 (2006).
  19. Miki, T., et al. ATP-sensitive K+ channels in the hypothalamus are essential for the maintenance of glucose homeostasis. Nat.Neurosci. 4 (5), 507-512 (2001).
  20. Liss, B., Bruns, R., Roeper, J. Alternative sulfonylurea receptor expression defines metabolic sensitivity of K-ATP channels in dopaminergic midbrain neurons. EMBO J. 18 (4), 833-846 (1999).
  21. Gallopin, T., et al. Identification of sleep-promoting neurons in vitro. Nature. 404 (6781), 992-995 (2000).
  22. Gallopin, T., et al. The endogenous somnogen adenosine excites a subset of sleep-promoting neurons via A2A receptors in the ventrolateral preoptic nucleus. Neuroscience. 134 (4), 1377-1390 (2005).
  23. Fernandez, S. P., et al. Multiscale single-cell analysis reveals unique phenotypes of raphe 5-HT neurons projecting to the forebrain. Brain Struct.Funct. , (2015).
  24. Porter, J. T., et al. Selective excitation of subtypes of neocortical interneurons by nicotinic receptors. J.Neurosci. 19 (13), 5228-5235 (1999).
  25. Hill, E. L., et al. Functional CB1 receptors are broadly expressed in neocortical GABAergic and glutamatergic neurons. J.Neurophysiol. 97 (4), 2580-2589 (2007).
  26. Férézou, I., et al. Extensive overlap of mu-opioid and nicotinic sensitivity in cortical interneurons. Cereb.Cortex. 17 (8), 1948-1957 (2007).
  27. Hu, E., et al. PACAP act at distinct receptors to elicit different cAMP/PKA dynamics in the neocortex. Cereb.Cortex. 21 (3), 708-718 (2011).
  28. Louessard, M., et al. Tissue plasminogen activator expression is restricted to subsets of excitatory pyramidal glutamatergic neurons. Mol.Neurobiol. , (2015).
  29. Stuart, G. J., Dodt, H. U., Sakmann, B. Patch-clamp recordings from the soma and dendrites of neurons in brain slices using infrared video microscopy. Pflugers Arch. 423 (5-6), 511-518 (1993).
  30. Cadwell, C. R., et al. Electrophysiological, transcriptomic and morphologic profiling of single neurons using Patch-seq. Nat.Biotechnol. 34 (2), 199-203 (2016).
  31. Fuzik, J., et al. Integration of electrophysiological recordings with single-cell RNA-seq data identifies neuronal subtypes. Nat.Biotechnol. 34 (2), 175-183 (2016).
  32. O'Leary, N. A., et al. Reference sequence (RefSeq) database at NCBI: current status, taxonomic expansion, and functional annotation. Nucleic Acids Res. 44, D733-D745 (2016).
  33. Schuler, G. D., Altschul, S. F., Lipman, D. J. A workbench for multiple alignment construction and analysis. Proteins. 9 (3), 180-190 (1991).
  34. Ruano, D., Lambolez, B., Rossier, J., Paternain, A. V., Lerma, J. Kainate receptor subunits expressed in single cultured hippocampal neurons: molecular and functional variants by RNA editing. Neuron. 14 (5), 1009-1017 (1995).
  35. Porter, J. T., et al. Properties of bipolar VIPergic interneurons and their excitation by pyramidal neurons in the rat neocortex. Eur.J.Neurosci. 10 (12), 3617-3628 (1998).
  36. Ruano, D., Perrais, D., Rossier, J., Ropert, N. Expression of GABA(A) receptor subunit mRNAs by layer V pyramidal cells of the rat primary visual cortex. Eur.J.Neurosci. 9 (4), 857-862 (1997).
  37. Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J. Basic local alignment search tool. J.Mol.Biol. 215 (3), 403-410 (1990).
  38. Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate- phenol-chloroform extraction. Anal Biochem. 162 (1), 156-159 (1987).
  39. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J.Vis.Exp. (62), (2012).
  40. Liss, B., et al. K-ATP channels promote the differential degeneration of dopaminergic midbrain neurons. Nat.Neurosci. 8 (12), 1742-1751 (2005).
  41. Lambolez, B., Audinat, E., Bochet, P., Crepel, F., Rossier, J. AMPA receptor subunits expressed by single Purkinje cells. Neuron. 9 (2), 247-258 (1992).
  42. Gallopin, T., Geoffroy, H., Rossier, J., Lambolez, B. Cortical sources of CRF, NKB, and CCK and their effects on pyramidal cells in the neocortex. Cereb.Cortex. 16 (10), 1440-1452 (2006).
  43. Cunningham, M. O., et al. Neuronal metabolism governs cortical network response state. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 103 (14), 5597-5601 (2006).
  44. Tsuzuki, K., Lambolez, B., Rossier, J., Ozawa, S. Absolute quantification of AMPA receptor subunit mRNAs in single hippocampal neurons. J.Neurochem. 77 (6), 1650-1659 (2001).
  45. McCormick, D. A., Connors, B. W., Lighthall, J. W., Prince, D. A. Comparative electrophysiology of pyramidal and sparsely spiny stellate neurons of the neocortex. Journal of Neurophysiology. 54 (4), 782-806 (1985).
  46. Andjelic, S., et al. Glutamatergic nonpyramidal neurons from neocortical layer VI and their comparison with pyramidal and spiny stellate neurons. J.Neurophysiol. 101 (2), 641-654 (2009).
  47. Cauli, B., Lambolez, B. Chapter 9: Gene Analysis of Single Cells. Unravelling Single Cell Genomics: Micro and Nanotools. Bontoux, N., Potier, M. C. , RSC publishing. Cambridge. 81-92 (2010).
  48. Bontoux, N., et al. Integrating whole transcriptome assays on a lab-on-a-chip for single cell gene profiling. Lab Chip. 8 (3), 443-450 (2008).
  49. Sellner, L. N., Coelen, R. J., Mackenzie, J. S. Reverse transcriptase inhibits Taq polymerase activity. Nucleic Acids Res. 20 (7), 1487-1490 (1992).
  50. Perrenoud, Q., Rossier, J., Geoffroy, H., Vitalis, T., Gallopin, T. Diversity of GABAergic interneurons in layer VIa and VIb of mouse barrel cortex. Cereb.Cortex. , (2012).
  51. Tricoire, L., et al. Common origins of hippocampal ivy and nitric oxide synthase expressing neurogliaform cells. J.Neurosci. 30 (6), 2165-2176 (2010).
  52. Cea-del Rio, C. A., et al. M3 muscarinic acetylcholine receptor expression confers differential cholinergic modulation to neurochemically distinct hippocampal basket cell subtypes. J.Neurosci. 30 (17), 6011-6024 (2010).
  53. Tricoire, L., et al. A blueprint for the spatiotemporal origins of mouse hippocampal interneuron diversity. J.Neurosci. 31 (30), 10948-10970 (2011).
  54. Franz, O., Liss, B., Neu, A., Roeper, J. Single-cell mRNA expression of HCN1 correlates with a fast gating phenotype of hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated ion channels (Ih) in central neurons. Eur.J.Neurosci. 12 (8), 2685-2693 (2000).
  55. Szabo, A., et al. Calcium-permeable AMPA receptors provide a common mechanism for LTP in glutamatergic synapses of distinct hippocampal interneuron types. J.Neurosci. 32 (19), 6511-6516 (2012).
  56. Hodne, K., Weltzien, F. A. Single-Cell Isolation and Gene Analysis: Pitfalls and Possibilities. Int.J.Mol.Sci. 16 (11), 26832-26849 (2015).
  57. Li, H. H., et al. Amplification and analysis of DNA sequences in single human sperm and diploid cells. Nature. 335 (6189), 414-417 (1988).
  58. Bochet, P., et al. Subunit composition at the single-cell level explains functional properties of a glutamate-gated channel. Neuron. 12 (2), 383-388 (1994).
  59. Audinat, E., Lambolez, B., Rossier, J., Crepel, F. Activity-dependent regulation of N-methyl-D-aspartate receptor subunit expression in rat cerebellar granule cells. Eur.J.Neurosci. 6 (12), 1792-1800 (1994).
  60. Jonas, P., Racca, C., Sakmann, B., Seeburg, P. H., Monyer, H. Differences in Ca2+ permeability of AMPA-type glutamate receptor channels in neocortical neurons caused by differential GluR-B subunit expression. Neuron. 12 (6), 1281-1289 (1994).
  61. Geiger, J. R., et al. Relative abundance of subunit mRNAs determines gating and Ca2+ permeability of AMPA receptors in principal neurons and interneurons in rat CNS. Neuron. 15 (1), 193-204 (1995).
  62. Flint, A. C., Maisch, U. S., Weishaupt, J. H., Kriegstein, A. R., Monyer, H. NR2A subunit expression shortens NMDA receptor synaptic currents in developing neocortex. J.Neurosci. 17 (7), 2469-2476 (1997).
  63. Angulo, M. C., Lambolez, B., Audinat, E., Hestrin, S., Rossier, J. Subunit composition, kinetic, and permeation properties of AMPA receptors in single neocortical nonpyramidal cells. J.Neurosci. 17 (17), 6685-6696 (1997).
  64. Lambolez, B., Ropert, N., Perrais, D., Rossier, J., Hestrin, S. Correlation between kinetics and RNA splicing of alpha-amino-3-hydroxy-5-methylisoxazole-4-propionic acid receptors in neocortical neurons. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 93 (5), 1797-1802 (1996).
  65. Liss, B., et al. Tuning pacemaker frequency of individual dopaminergic neurons by Kv4.3L and KChip3.1 transcription. EMBO J. 20 (20), 5715-5724 (2001).
  66. Aponte, Y., Lien, C. C., Reisinger, E., Jonas, P. Hyperpolarization-activated cation channels in fast-spiking interneurons of rat hippocampus. J.Physiol. 574, 229-243 (2006).

Tags

Neuroscience sayı 136 gen ifade profil nöronlar astrocytes beyin dilimleri tüm hücreli yapılandırma iç içe geçmiş polimeraz zincir tepkimesi (PCR)
Tek hücre Multiplex Ters transkripsiyon polimeraz zincir tepkimesi sonra yama-kelepçe
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Devienne, G., Le Gac, B., Piquet,… More

Devienne, G., Le Gac, B., Piquet, J., Cauli, B. Single Cell Multiplex Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction After Patch-clamp. J. Vis. Exp. (136), e57627, doi:10.3791/57627 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter