Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

תגובת שרשרת של פולימראז מולטיפלקס שעתוק במהופך תא בודד לאחר תיקון-קלאמפ

Published: June 20, 2018 doi: 10.3791/57627
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1
1UPMC Univ Paris 06, INSERM, CNRS, Neuroscience Paris Seine - Institut de Biologie Paris Seine (NPS - IBPS), Sorbonne Université
* These authors contributed equally

Summary

פרוטוקול זה מתאר את השלבים הקריטיים של אמצעי הזהירות הנדרשים לביצוע תגובת שרשרת של פולימראז שעתוק במהופך מולטיפלקס תא בודד לאחר תיקון-קלאמפ. טכניקה זו היא שיטה פשוטה ויעילה כדי לנתח את פרופיל ביטוי של קבוצת גנים מתא יחיד מאופיין על ידי תיקון-קלאמפ הקלטות מראש.

Abstract

קליפת המוח מורכב סוגי תאים רבים מפגין תכונות מורפולוגיות, הפיזיולוגית מולקולרית שונות. המגוון הסלים קל זיהוי ואפיון אחד מסוגי התאים, תנאים מוקדמים ללמוד הפונקציות הספציפיות שלהם. מאמר זה מתאר תא בודד מולטיפלקס שעתוק במהופך פולימראז תגובת שרשרת (RT-PCR) הפרוטוקול, המאפשר, לאחר תיקון-קלאמפ הקלטה לפרוסות, כדי לזהות בו זמנית את הביטוי של עשרות גנים בתא יחיד. שיטה זו פשוטה ניתן ליישם עם אפיון מורפולוגי, והוא החלים נרחב כדי לקבוע את התכונות פנוטיפי של סוגי תאים שונים ועם סביבתם הסלולר מסוים, כמו למשל בקרבת כלי דם. העיקרון של פרוטוקול זה היא כדי להקליט תא עם הטכניקה תיקון-קלאמפ, כדי לקצור ולהפוך לתמלל את התוכן cytoplasmic שלה, כדי לזהות איכותית הביטוי של ערכה מוגדרת מראש של גנים על ידי מגה-פלקס PCR. זה דורש עיצוב זהיר של PCR תחל והפתרון תיקון תאיים-קלאמפ תואמת ל- RT-PCR. כדי להבטיח תעתיק סלקטיבי ואמין זיהוי, טכניקה זו מחייבת גם הפקדים המתאימים הציטופלסמה הקטיף לצעדים הגברה. למרות אמצעי הזהירות שנדונו כאן חייב להיות במעקב בלבד, כמעט כל מעבדה אלקטרופיזיולוגיות באפשרותך להשתמש התא הבודד מולטיפלקס בטכניקת RT-PCR.

Introduction

קליפת כוללת סוגי תאים רבים המעורבים בתהליכים פיזיולוגיים שונים. זיהוי ואפיון שלהם, תנאי הכרחי להבנה של הפונקציות הספציפיות שלהם, יכולה להיות מאוד מאתגרת בהתחשב גדול מורפולוגי, הפיזיולוגית המולקולריים הרב גוניות המאפיינת את סלולרי קורטיקלית סוגים1 ,2,3,4.

תא בודד מולטיפלקס RT-PCR מבוססת על השילוב של תיקון-קלאמפ וטכניקות RT-PCR. זה יכול לחקור בו זמנית את הביטוי של גנים מוגדרים מראש יותר מ-30 תאים מזוהה electrophysiologically5 ההכללה של מכשיר מעקב עצביים ב ההקלטה פיפטה נוספת מאפשרת אפיון מורפולוגי של התאים מוקלט אחרי התגלות פתולוגיה6,7,8,9, 10. זאת שיטה מאוד שימושי עבור הסיווג של סוגי עצביים מבוסס על ניתוח רב משתני שלהם תכונות פנוטיפי5,9,10,11,12 13, ,14. תא בודד מולטיפלקס RT-PCR מתאים גם אפיון תאים שאינם עצביים כגון האסטרוציטים15,16,17, ולא ניתן להחיל כמעט על כל המוח מבנה18, 19,20,21,22,23 תא וסוג, בהנחה שהם ניתן להקליט בתצורה של כל תא.

טכניקה זו היא מאוד נוח עבור זיהוי מקורות הסלולר ו/או מטרות של שידור מערכות7,8,15,16,20,21, 24,25,26,27,28, במיוחד כאשר נוגדנים ספציפיים חסרים. זה מסתמך על תיקון-קלאמפ הקלטות של תאים שזוהה באופן חזותי29, ובכך מאפשר גם את המיקוד של תאים ב-15,8,16בסביבה התאית הספציפית. יתר על כן מאז cytoarchitecture של רקמת המוח נשמר פרוסות המוח, גישה זו גם מאפשרת חקר הקשרים האנטומי של התאים מאופיין עם אלמנטים שאינם עצבית עצביים7,8 , 18.

מאז בטכניקה זו הוא מוגבל לפי כמות הציטופלסמה שנקטפו ועל ידי יעילות RT, הגילוי של mRNA באה לידי ביטוי במספר עותק נמוך יכול להיות קשה. למרות גישות אחרות מבוסס על טכנולוגיית RNaseq לאפשר לנתח את כל transcriptome של תאים בודדים3,4,30,31, הם צריכים תפוקה גבוהה סקוונסרים יקר. לא בהכרח זמין בכל מעבדה. מאז הטכניקה RT-PCR תא בודד מולטיפלקס משתמשת מובילים PCR, זה רק דורש thermocyclers הנפוצה. זה יכול להתפתח בקלות במעבדות מצויד אלקטרופיזיולוגיות set-ups, לא דורשת ציוד יקר. זה יכול לספק, בתוך יום אחד, ניתוח איכותי של הביטוי של ערכה מוגדרת מראש של גנים. לפיכך, גישה זו מציעה גישה נוחה אפיון מולקולרי תאים בודדים בצורה מהירה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל ההליכים ניסיוני באמצעות בעלי חיים היו שבוצעה על פי תקנות צרפתי (קוד כפריים R214/87 כדי R214/130), תאמו את ההנחיות האתית של האמנה הלאומית הצרפתית והן בקהילה הכלכלית האירופית (86/609/EEC) על האתיקה של ניסויים בבעלי חיים. כל הפרוטוקולים היו אושרו על ידי ועדת האתיקה צ'ארלס דרווין, נאספו צרפתית משרד חינוך ומחקר (אישור 2015 061011367540). המתקן בעלי חיים IBPS הוא מוכר על ידי הרשויות הצרפתיות (A75-05-24).

1. שיקולים ראשוניים

הערה: כדי להימנע מציג, תואם ההמלצות הבאות לפני שיחתמו תא בודד RT-PCR לאחר תיקון-קלאמפ.

  1. אל תשתמש פלסמידים המכיל גנים עניין במעבדה כפי שהם מקור פוטנציאלי של זיהום.
  2. שומרים ספסל מעבדה מן החדר ג'ל אלקטרופורזה להכין מותני.
  3. להקדיש סט של פיפטות וטיפים אירוסול עמיד המסנן לתמרן DNA ו- RNA בריכוזים נמוכים יותר 1 ng/µL. אף פעם לא השתמש ברשימות אלה כדי לנתח את מוצרי ה-PCR.
  4. תמיד להשתמש במוצרים RNase-DNase נטול, תלבש כפפות.
  5. השתמש כימיקלים ייעודי עבור הכנת פתרונות תיקון פנימי-קלאמפ. לעולם אל תשתמש במרית אבל מעדיף במשקל נייר לשקול אבקות.
  6. השתמש אלקטרודת pH ייעודי ו- pH פתרונות סטנדרטיים, כמו שהם יכולים להיות מקור זיהום (למשל, RNase).
  7. לאחסן זכוכית בורוסיליקט נימים... 20 µL ארוכה, בסדר וגמיש טיפים; micropipette 20 µL; expeller תוצרת בית (מצורף מזרק 10 מ"ל מחזיק פיפטה תיקון-קלאמפ); µL המבחנות 500; 10 µL אירוסול עמיד המסנן טיפים; דק פרמננטיים בקופסא ייעודית (איור 1).

2. פריימר עיצוב

הערה: RT-PCR מולטיפלקס מסתמך על שני צעדים הגברה. במהלך PCR הראשון, כל הגנים של עניין הם מוגבר במשותף על ידי ערבוב יחד כל תחל ה-PCR. כדי לזהות באופן אמין תעתיקים של תאים בודדים, זה חיוני לעיצוב תחל PCR סלקטיבי ויעילה. השימוש מקוננים תחל (פנימי) הסיבוב השני של ה-PCR משפר את יחודיות וגם את היעילות של ההגברה.

  1. אחזר את רצפי mRNA אצר את הגנים של עניין NCBI הפניה רצף מסד32 , כמו גם אלה של משפחתם קשורים (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/).
    1. הזן את השם של gene (s), המינים של עניין כשאילתה ולחץ על הרצף הרלוונטיים שאוחזרו.
    2. כדי להגביל את הניתוח רצף קידוד gene (s), לחץ על שלח אל (בפינה הימנית העליונה), ובחר קידוד רצפים של נוקלאוטיד FASTA כתבנית. לאחר מכן לחץ על צור קובץ , שמירת הרצף FASTA באמצעות סיומת קובץ ".nt".
  2. השתמש ארת ענק התוכנה33 (בנייה יישור מרובים & ניתוח עבודה, שעליו מונחים) או כל תוכנה יישור מרובים אחרים כדי לקבוע את מחוזות הומולוגיה.
    1. לחץ על הקובץ | פרוייקט חדש... ובחר DNA כסוג רצף. כדי לייבא את רצפי הגן, בחר רצף | ייבוא רצף... לטעון קובץ ".nt". חזור על הפעולות על כל רצפי קשורים.
    2. לחץ וגרור כל רצפי בחלון סכמטית כדי לבחור את הרצף כולו.
    3. חפש את מחוזות הומולוגיה על-ידי בחירה יישור | חיפוש של רחובות... (CTRL + S). בחר קטע זוג חופפים שיטת החיפוש. התאם את Pairwise ניקוד הפסקת לערך גבוה יחסית (למשל, 1,000), את seqs. מינימלית לכל בלוק למספר הכולל של רצפי יישור, לחץ על התחל.
    4. המופיעים בחלון תוצאות חיפוש , בחר את result(s) עם MP-הניקוד הגבוה ביותר ולחץ על הקישור. אם התוצאה לא נמצא, להקטין את Pairwise ניקוד הפסקת ו/או את seqs. מינימלית לכל בלוק.
    5. כדי להקל על הפריט החזותי של אזורים הומולוגיים, בחר יישור | הצללה | כלומר הציון.
    6. בחר חלקים לא מקושרים של הרצף וחזור 2.2.3–2.2.4 את השלבים לקביעת פוטנציאל באזורים אחרים של הומולוגיה עם MP-ציון נמוך יותר.
    7. כדי להשיג את תחל הספציפי ביותר, בחר את האזורים עם הומולוגיה לפחות הרצף.
  3. תביא את רצף כל הווריאציות splice וחזור על שלבים 2.2.1–2.2.6. בחר שלהם אזורים משותפים לגילוי הכללית. שקול קלטות חלופי עבור splice ייעודי גרסאות ניתוחים20,34,35,36.
  4. יישר את רצפי mRNA על הגנום במודל חיה באמצעות הפיצוץ37 הגנום (בסיסי מקומי יישור כלי חיפוש) כדי לקבוע את המבנה אינטרון-אקסון של הגנים (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).
    1. בחר את הגנום העכבר הפיצוץ על ידי לחיצה על העכבר ולהעלות את רצף FASTA שאוחזרו במקטע להזין שאילתת רצף . תוכנית הבחירה, בחר מטב עבור רצפים דומים מאוד (megablast)ולאחר מכן לחץ על לחצן הפיצוץ .
    2. במקטע ' תיאור ', בחר את היישור באמצעות זהות הגבוהה ביותר (עד 100%). ודא כי הוא מתאים הגן עניין כמצוין תכונות של המקטע במערכים .
    3. למיין את היישור על-ידי השאילתה מיקום התחלה באותו מקטע כדי לקבל את הירושה exons של רצף קידוד. הערה את מיקומי ההתחלה והסוף של כל הלהיטים, המקבילים בערך למיקום של אינטרונים על הרצף שאילתה (איור 2 א).
  5. בחר שני exons שונים עבור תחל הישר ואת antisense להבדיל בקלות cDNA גנומית הגברה דנ א (gDNA) בהתבסס על קריטריון גודל (איור 2).
    הערה: ההגברה של gDNA יכול להתרחש בתדירות נמוכה כאשר הגרעין הוא נקצרו עם הציטופלסמה. לכן, זה חיוני כדי לעצב אינטרון overspanning זוגות פריימר (איור 2 א). במקרה של גנים אינטרון-פחות, האוסף של הגרעין בעייתי כמו זה יכול להוביל פוטנציאל משתנה מתערב תוצאות. כדי לטפל בבעיה זו, כולל ערכה של צבעי יסוד מכוון הגברה רצף intronic כדי לחקור הנוכחות של gDNA25. אם הפקד גנומית הוא חיובי, התוצאות עבור כל הגנים אינטרון-פחות חייב להיות מושלך.
  6. כדי להשיג הגברה יעיל, בחר תחל לייצר amplicons באורך מורכבת באופן אידיאלי בין 200 ו-400 בסיסי זוגות (איור 2).
  7. כדי להגביר בו זמנית שונים cDNAs במהלך השלב ה-PCR מולטיפלקס, עיצוב תחל עם אורך בין 18 ו-24 נוקלאוטידים טמפרטורת ההיתוך (Tm) בין 55 ל- 60 מעלות צלזיוס.
  8. כדי לצמצם את היווצרות מבנים משניים, המקטינים את התשואה הגברה, בחר חוש חוש אנטי תחל עם סיכת ראש מינימלי, דופלקס אורכי (איור 2B).
  9. עיצוב פנימי תחל אותם קריטריונים (שלבים 2.5-2.8).
  10. ודא יחודיות של תחל ה-PCR על ידי יישור תחל את הפניה RNA רצף במסד הנתונים של האורגניזם עניין באמצעות נוקלאוטיד הפיצוץ.
    1. בפיצוץ (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi), לחץ על נוקלאוטיד הפיצוץ. הדבק את הרצף של פריימר הזן רצף שאילתה.
    2. במקטע בחר להגדיר חיפוש , לחץ על אחרים (nr וכדומה), בחר רצפי RNA הפניה (refseq_rna) באפשרות מסד הנתונים וציין האורגניזם (למשל, ס. מאסכאלאס (taxid:10090) ) כדי להגביל את הניתוח מהמין הרצוי.
    3. בחירת תוכנית בחר מטב עבור רצפי דומה במקצת (blastn). במקטע פרמטרי האלגוריתם להקטין את גודל מילה עד 7 כדי להגדיל את הסיכוי להשגת תוצאות.
  11. כדי לעצב תחל סלקטיבית, לשמור רק את רצף של מי יש אי-התאמות לפחות 3 עם cDNAs רצויה כאשר הדבר אפשרי.
  12. סדר desalted תחל בריכוז גבוה יחסית (למשל, 200 מיקרומטר) על מנת להבטיח כי כל תחל החיצוני ניתן לערבב יחד-ריכוז סופי של 1 מיקרומטר.

3. הכנת ריאגנטים RT

  1. 5 x RT-מיקס: להכין במים נטולי RNase µL 400 של עובד RT תמהיל פתרון (5 x) המכילה אקראי תחל ב 25 מיקרומטר, dNTPs ב- 2.5 מ מ. חנות בשילוב עבודה זה כמו aliquots 20 µL 500 µL צינורות.
  2. 20 x Dithiothreitol (DTT): להכין 1 מ"ל של 0.2 מ' DTT ב RNase ללא מים, לאחסן אותו כמו 50 µL aliquots.
  3. חנות 2,500 U של RNase מעכב (40 U µL) ל- 10,000 U של רוורס טרנסקריפטאז (RTase, 200 U/µL) כמו 5 µL aliquots.
  4. כדי להבטיח איכות אופטימלית של ריאגנטים RT, לאחסן את aliquots ב-80 מעלות צלזיוס. להשתמש בהם עבור עד 10 תאים, רק ליום אחד.

4. PCR אימות

  1. להכין cDNAs על-ידי ביצוע של שעתוק במהופך על כמות גדולה יחסית של RNA (בדרך כלל 1 µg) שחולצו סה כ38 מן המבנה של ריבית.
    1. אין להשתמש על פיפטות ייעודי יחיד תא RT-PCR עבור שלבים מוקדמים אלה אבל השימוש מדי את RNase ללא סוכר. לדלל RNA הכולל עד µg 1/µL.
    2. בשפופרת 500 µL PCR, להוסיף 1 µL של RNA הכולל מדולל ו µL 8 RNase ללא מים. Denature ב 95 ° C עבור 1 דקות, לצנן את הצינורית על קרח.
    3. להוסיף µL 4 RT 5 x המאגר שסופק על-ידי היצרן, µL 4 RT תמהיל פתרון, 1 µL של RTase, 1 µL של מעכב RNase ו 1 µL של 200 מ מ DTT (ראה סעיף 3).
    4. קפיצי הצינור, לסובב אותו, דגירה בין לילה ב 37 º C.
    5. אחסן את cDNAs ב-80 מעלות צלזיוס במשך עד מספר שנים. הכן של aliquot של cDNAs מדולל כדי 1 ng/µL של מקבילות RNAs הכולל.
  2. לערבב, לדלל כל זוג תחל ב- 1 מיקרומטר עם פיפטות המוקדש תא בודד RT-PCR. השתמש µL 20 של כל תערובת פריימר עבור 100 µL מותני.
  3. על קרח, להכין עבור כל זוג פריימר של premix המכיל: מים (q.s., 80 µL), µL 10 של 10 X מאגר µL 1 של 100 x dNTPs (50 מיקרומטר כל אחד), 500 – 1,000 pg של cDNA מדולל ב 1 ng/µL, 0.5 µL (2.5 U, U 5/µL) של אנזימים.
  4. השתמש המבחנות שמתאימים בחוזקה הבארות של המכונה PCR עבור פקד טמפרטורה אופטימלית. להוסיף 2 טיפות (~ 100 µL) של שמן מינרלי premix בלי לגעת בקיר או את הכובע של הצינור ה-PCR.
  5. כדי לצמצם את היווצרות פריימר-הדימרים, לבצע התחלה חם על-ידי הצבת את המבחנות thermocycler שחומם מראש ב- 95 מעלות צלזיוס. לאחר 30 s, במהירות לגרש 20 µL של המיקס פריימר על גבי השמן.
  6. אחרי 3 דקות ב 95 מעלות צלזיוס, הפעל את מחזורי 40 (95 ° C, 30 s; 60 ° C, 30 s; 72 ° C, 35 s) ואחריו שלב התארכות הסופי ב-72 מעלות במשך 5 דקות.
  7. ניתוח µL 10 של כל מוצרי ה-PCR על-ידי agarose ג'ל אלקטרופורזה (2%, משקל/נפח)39. אם כמה מוצרים PCR אין את הגודל הצפוי, עיצוב מחדש אחרים תחל (ראה סעיף 2).
    התראה: אתידיום ברומיד הוא חומר כימי intercalating זה יכול לגרום DNA מוטציות. התייעץ עם המשרד המקומי בטיחות לפני השימוש בו. השתמש בכפפות בשעת טיפול זה. השתמש פתרון זמין מסחרית של אתידיום ברומיד (10 mg/mL) פתרון במקום אבקת כדי למזער את הסיכון של אינהלציה. באופן דומה, אור UV יכולה להזיק, כך שעליך לוודא ללבוש משקפי הגנה UV או מסכה. תיסוג ג'לים המלוכלכים, טיפים, כפפות, מאגר במיכלים המוקדש אתידיום פסולת.
  8. לאחר כל זוגות פריימר הוכר כתקף באופן אינדיבידואלי, הבדיקה פרוטוקול מולטיפלקס (איור 3).
    1. לערבב, לדלל כל תחל החיצוני יחד 1 מיקרומטר. בחנות תחל מולטיפלקס לערבב ב-20 ° C עבור עד מספר שבועות.
    2. על קרח, להכין premix המכיל: מים (q.s., 80 µL), µL 10 של 10 X מאגר, µL 1 של 100 x dNTPs (50 מיקרומטר של כל אחד), 500-1000 pg של cDNAs מדולל ב 1 ng/µL, 0.5 µL (2.5 U, U 5/µL) של אנזימים.
    3. קפיצי הצינור PCR, לסובב אותו, וכן להוסיף 2 טיפות (~ 100 µL) של שמן מינרלי.
    4. לבצע התחלה חם כפי שמתואר בשלב 4.5 עם 20 µL של פריימר מולטיפלקס מיקס. לאחר 3 דקות ב 95 מעלות צלזיוס, להפעיל 20 מחזורים PCR זהים לאלה של שלב 4.6.
    5. הכן מספר זהה למספר של גנים לנתח המבחנות. הכן של premix כמו שלב 4.8.2, אבל בעזרת µL 1 של המוצר הראשון PCR לכל הגן כתבנית. התאם את כל אמצעי האחסון לפי מספר גנים כדי לנתח, שקול להשתמש 10% יותר נפח כדי לפצות על שגיאות pipetting.
    6. לנער בעדינות, לסובב את הצינור, מוקד µL 80 של premix כל צינור PCR, וכן להוסיף שתי טיפות (~ 100 µL) של שמן מינרלי למחזור מבלי לגעת בקיר או את הכובע של הצינורות.
    7. מבצע חם להתחיל (ראה שלב 4.5) על ידי שחרור 20 µL של פריימר פנימי תערובת מוכנה בשלב 4.2. הפעל את מחזורי PCR 35 זהה לשלב 4.6.
    8. לנתח את המוצרים PCR השני על ידי agarose בג'ל. ודא כי כל PCR השני יוצר של אמפליקון הגודל הצפוי. במקרה של amplifications לא יעיל או לא ספציפית, עיצוב מחדש חדשה תחל (שלבים 2.5-2.12) ולאמת אותם (שלבים 4.2 – 4.8).

5. הכנה ובדיקת של פתרון תיקון תאיים-קלאמפ

הערה: פרוטוקול הבאים מתאר את ההכנה, אימות של /gluconate K+המבוסס על הפתרון הפנימי, אבל כמעט כל סוג של פתרון תיקון-קלאמפ יכול לשמש כל עוד זה לא ה"בלתי את היעילות של RT-PCR. לבש כפפות הוא חובה להשיג פתרון פנימי ללא RNase.

  1. עבור 60 מ של פתרון הקלטה תיקון פנימי-קלאמפ, להכין את extemporaneously 10 מ"ל של 0.1 M KOH.
  2. להמיס 11.4 מ"ג EGTA (סופי 0.5 מ"מ) ב- 0.9 מ של 0.1 M KOH.
  3. להוסיף 40 מ"ל RNase ללא מים, להמיס 2.02 גר' K-gluconate (144 מ"מ הסופי), 143 מ ג של HEPES (10 מ מ הסופי), 180 µL של 1 מ' MgCl2 (3 מ מ הסופי).
  4. להתאים את ה-pH ל 7.2 על-ידי הוספת ~ 6 מ ל 0.1 M KOH.
  5. להתאים את osmolarity כדי mOsm 295 עם ~ 13 מיליליטר מים RNase-חופשית.
  6. מאז הפתרון הפנימי משמש גם כאמצעי שעתוק לאחור, בזהירות לשלוט מ ג2 + ריכוז. לפצות על Mg2 + ריכוז נמוך יותר בפתרון פנימי על-ידי הוספת MgCl2 לאחר מכן להגיע ריכוז סופי של 2 מ מ בהתגובה RT.
  7. להוספת תווית התא שנקטפו לאחר תיקון-קלאמפ הקלטה, להוסיף 2 – 5 מ"ג/מ"ל של biocytin נטולת RNase הפתרון הפנימי המתואר לעיל (שלבים 5.1 – 5.5).
  8. סינון (גודל הנקבוביות מיקרומטר 0.22) הפתרון פנימי ואחסן אותו ב-80 מעלות צלזיוס כמו 100 – 250 µL aliquots.
  9. כדי לאמת את השימוש של הפתרון הפנימי החד-תאיים RT-PCR, להוסיף 0.5 µL של RNAs הכולל מדולל ב ng/µL 1 עד 6 µL של פתרון תיקון-קלאמפ ולהשאיר אותו על הספסל במשך כ 30 דקות.
  10. עם micropipette 2 µL, להוסיף 2 µL של 5 x RT-מיקס, 0.5 µL של 20 x DDT, מעכב RNase µL 0.5 ו- 0.5 µL RTase, דגירה בין לילה ב 37 º C.
  11. לסובב את הצינור. על קרח מוסיפים מים (q.s., 80 µL), µL 10 של 10 X מאגר, 0.5 µL (2.5 U, U 5/µL) של אנזימים.
  12. לבצע 40 מחזורי PCR באמצעות קבוצת המאומת תחל (שלבים 4.4 – 4.6).
  13. לנתח את המוצרים PCR ידי agarose בג'ל (ראה שלב 4.7) ולוודא שיש להם את הגודל הצפוי.
    הערה: השמטת את µL 0.5 של RNA הכולל והחלפתו 0.5 µL נטולת RNase מים יבטיחו כי הפתרון הפנימי הינו ללא מציג RNA או DNA.

6. חריפה פרוסה הכנה

הערה: פרוטוקול זה מתאר את השגרה עם פרוסות לנוער (כלומר, פחות מ 28 ימים לאחר הלידה) עכברים זכר ונקבה. פתרונות חיתוך אחרים, כגון מבוססי סוכרוז מלאכותי השדרתי (כלנית חדד) הם גם שמיש40.

  1. להכין 2 ל' של חנה המבר המכיל (במ מ) 125 NaCl, 2.5 אשלגן כלורי, 2 CaCl2, 1 MgCl2, NaH 1.252PO4, 26 NaHCO3, גלוקוז 10 ו- 15 סוכרוז. כדי לצמצם את פעילות glutamatergic במהלך ההכנה פרוסה, להכין פתרון חיתוך על-ידי הוספת 1 מ מ של חומצה kynurenic.
  2. לפני עם פרוסות, להכין ערכת לנתיחה המכיל מספריים כירורגיים, מספריים איריס בסדר, שפכטלים שני, מלקחיים, דיסק של מסנן נייר, דבק מגע, דבק.
  3. להשתמש בפתרון חיתוך כקרח רווי O2/CO2 (95% / 5%) וקריר למטה לחדר חיתוך ב-20 ° C.
  4. עזים ומתנגד העכבר עם מגבת נייר קטן ספוגה איזופלוריין. לאחר ~ 2 דק ', ודא כי העכבר נמצא תחת הרדמה עמוקה על-ידי אימות היעדר תגובה ל כף של קורט.
  5. במהירות לערוף את העכבר. הסר את הקרקפת, לפתוח את הגולגולת. תמצית המוח בזהירות ומניחים אותו לתוך חבית קטנה מלאה קר כקרח (~ 4 ° C) חיתוך פתרון חמצן ב- O-2-/CO-2.
  6. להסיר את התא חיתוך מ-20 ° C תנאים ולהסיר לחות עם מגבת נייר.
  7. בזהירות לנתח את המוח כדי לבודד את האזור של הריבית, להדביק את זה. על תא חיתוך ולהוסיף פתרון חיתוך כקרח חמצן ב- O-2-/CO-2.
  8. לחתוך 300 מיקרומטר עבים פרוסות משתמש של vibratome. להעביר אותם בטמפרטורת החדר בחדר המנוחה מלא עם חיתוך מחומצן פתרון ולאפשר להם להתאושש במשך לפחות 0.5 h.

7. ותא RT-PCR לאחר תיקון-קלאמפ הקלטה

  1. לנקות את המערכת זלוף באופן קבוע עם ~ 100 מ"ל של 30% H2O2 פתרון ולשטוף בהרחבה עם ~ 500 מ ל מים מזוקקים כדי למנוע גידול חיידקים, כפי שהוא מקור תסולא בפז RNase זיהום.
  2. Chlorinate חוט הלהט עם פיפטה תיקון מלא עם אקונומיקה מרוכזת כל יום האיסוף. אל תשתמש micropipette כדי למלא את פיפטה תיקון אבל מעדיף 20 µL ארוך, בסדר, גמיש טיפ מצורף מזרק 1 מ"ל. לאחר מכן, לשטוף אותו בהרחבה עם מים חינם RNase, לייבש אותו עם מטלית גז.
  3. הכנת קופסה קטנה של קרח המכילה 5 x RT-מיקס, 20 x DTT aliquots. אחסן aliquots מעכב את RTase ואת RNase ב-20 ° C benchtop קריר יותר.
  4. העברת פרוסה לתוך החדר הקלטה perfused ב 1-2 מ ל/דקה עם חנה המבר מחומצן.
  5. משוך תיקון מכשור ניסוי ברטט (1 – 2 מיקרומטר פתח בקוטר עצה, MΩ 3-5) מ זכוכית בורוסיליקט בעת לבישת כפפות, למלא אחד מהם 8 μL של הפתרון הפנימי. זכור כי בידית של פולר פיפטה מהווים מקור לזיהום RNase.
  6. למקם את פיפטה המחזיק פיפטה תוך כדי לבש כפפות חדש, לא נוגע הלהט עם האצבעות.
  7. הגישה של פיפטה תיקון עם לחץ חיובי ולבצע הקלטה תאים שלמים כדי לאפיין את התא יישוב (איור 4).
  8. על מנת לשמר את mRNAs, להגביל את משך הזמן בתצורת כל-תא ל- 20 דקות41.
  9. בסוף ההקלטה, הכן צינור PCR 500 µL מלא עם 2 µL של 5 x מיקס RT ו- 0.5 µL של 20 x DTT, לסובב אותו, ואחסן אותו בקרח.
  10. הקציר הציטופלסמה תא על-ידי החלת לחץ שלילי עדין (איור 4). מבחינה ויזואלית שליטה שמגיע בתוך פיפטה תוכנו של התא תוך שמירה על חותם צר.
    1. להימנע ככל האפשר איסוף הגרעין אם כמה גנים אינטרון-פחות נחשבים. במקרה כזה יש לכלול תמיד ערכה של תחל מכוון הגברה gDNA כדי לחקור זיהום גנומית.
    2. הגרעין בא קרוב לקצה פיפטה, לשחרר את הלחץ השלילי ולהעביר את פיפטה הרחק מהגרעין. להבטיח כי החותם חזק נשמר והפעל מחדש כדי לאסוף את הציטופלסמה במקום פיפטה החדש.
  11. תפסיקי לגזום את כאשר אין עוד חומר מגיע ו/או לפני איבוד החותם חזק.
  12. למשוך את פיפטה בעדינות כדי ליצור תיקון בחוץ-אאוט כדי להגביל זיהום על-ידי ההריסות חוץ-תאית (איור 4) וכדי טובה הסגר על קרום התא לניתוח פתולוגיה עוקבות.
  13. זכור את ידיות, micromanipulators, מקלדת מחשב, או עכבר המחשב הם מקורות RNase זיהום פוטנציאליים. אם הם היו נגע במהלך ההקלטה, לשנות כפפות.
  14. לצרף את פיפטה expeller ולגרש את תוכנו לתוך הצינור PCR על-ידי החלת בלחץ חיובי (איור 1).
  15. לפרוץ את קצה פיפטה הצינור PCR כדי לעזור את האוסף של התוכן שלה.
  16. בקצרה centrifuge ברכבת התחתית להוסיף 0.5 µL של מעכב RNase ו 0.5 µL של RTase, מערבבים בעדינות, צנטריפוגה שוב, דגירה בין לילה ב 37 º C.
  17. לסובב את הצינור ואחסן אותו ב-80 מעלות צלזיוס במשך אפילו מספר חודשים עד ניתוח ה-PCR.
  18. ביצוע השלב הראשון הגברה ישירות הצינור המכיל את µL ~ 10 של RT מוצרים על-ידי הוספת מים (q.s., 80 µL), µL 10 x 10 המאגר, 0.5 µL (2.5 U) של אנזימים. לאחר מכן, בצע את ההוראות המתוארות שלבים 4.8.2–4.8.8.

8. פתולוגיה מכתים של התא מוקלטות (אופציונלי)

  1. בעקבות ההקלטות אלקטרופיזיולוגיות, לשמור על הפרוסה למשך 20 דקות בחנה המבר מחומצן כדי לאפשר פעפוע של biocytin בעץ עצב ו דנדריטים.
  2. מניחים הפרוסה בבאר של צלחת 24-ובכן ו תיקון זה לינה ב 4 ° C עם 1 מ"ל של 4% paraformaldehyde 0.1 M מאגר פוספט.
  3. לשטוף את הפרוסות 4 פעמים, 5 דקות כל אחד, עם 1 מ ל תמיסת מלח Buffered פוספט (PBS).
  4. באותו, permeabilize וירווה את הפרוסה במהלך h 1 בטמפרטורת החדר עם 1 מ"ל של PBS בתוספת 0.25% טריטון ג'לטין X-100 ו- 0.2% מן העור דגים מים קרים (PBS-GT).
  5. דגירה בין לילה עם אבידין fluorescently שכותרתו מדולל ב- 1/400 ב- 250-500 µL של PBS-GT.
  6. לשטוף 5 פעמים, 5 דקות כל אחד, עם 1 מ"ל של PBS והר הפרוסות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

אימות נציג של מולטיפלקס RT-PCR מוצג באיור3. הפרוטוקול תוכנן כדי לחקור בו זמנית את הביטוי של גנים שונים 12. VGluT1 טרנספורטר גלוטמט vesicular נלקח בתור פקד חיובי עבור הנוירונים glutamatergic42. גאבא סינתזה אנזימים (GAD65 ו- 67 גד), Neuropeptide Y (NPY) ו Somatostatin (סום) שימשו כסמנים של GABAergic interneurons3,5,11. האנזים cyclooxygenase-2 (COX-2) שימש סמן התא כפירמידה תת אוכלוסיה3,16.

Subunits ATP1α1-3 של Na+/K+ ATPase, את subunits Kir6.2 ואת SUR1 של ערוצי תלויית ATP K+ נבחרו כדי להעריך את הקשר בין פעילות. עצבית מצבים מטבוליים43. מאחר Kir6.2 ג'ין אינטרון-פחות, אינטרון סום נכללה כפקד גנומית. הפרוטוקול נבדק על 1 ng של לאחור RNA הכולל משועתקים שחולצו מן העכבר כל המוח, התואם בקירוב התמלילים של 20 תאים44. ה-PCR מולטיפלקס המיוצר amplicons 12 של הגודל הצפוי (איור 3 ו לטבלה 1) הממחיש את הרגישות והיעילות של הפרוטוקול. הפקד שלילי מבוצע ללא RNA הפיק אין אמפליקון (נתונים לא מוצג).

נוירון כפירמידה שכבה V חזותית זוהה על ידי שלה גדול וראשה דנדריט הפסגה הבולטת של (איור 5A, הזחה). התא כולו הקלטה חשף אופיינית אלקטרופיזיולוגיות מאפייני שכבה V רגיל עולה נוירונים5,45,46 , ובייחוד, התנגדות קלט נמוך, פוטנציאל פעולה לטווח ארוך ואת ספייק בולטת תדירות עיבוד (איור 5A). ניתוח מולקולרית של נוירון זה חשף את הביטוי של vGluT1 (איור 5B), המאשר את42,פנוטיפ glutamatergic46. נוירון זה באה לידי ביטוי גם סום, ATP1α1 ו- subunits 3 של Na+/K+ ATPase. Biocytin תיוג של הנוירונים מוקלטות אישר מורפולוגיה כפירמידה (איור 5D).

כצפוי מן הנוירונים glutamatergic, ניתוח המולקולרי של התאים כפירמידה שכבה V 26 חשף הביטוי של VGluT1, אך לא גאדס שני (איור 5C). סמנים של interneurons נצפו לעתים רחוקות5,42,46. COX-2, באה לידי ביטוי בעיקר על ידי שכבה II-III תאים כפירמידה3,16, לא זוהה בתאים כפירמידה שכבה V. ATP1α1 את 3 subunits היו שנצפו בתדירות גבוהה יותר מאשר יחידת משנה של ATP1α23. Subunits Kir6.2 ואת SUR1 אותרו רק לעתים נדירות בנוירונים כפירמידה שכבה V, וזה מתאים לביטוי מועדף ב-3,השכבות העליונות43. טיפול נלקח לא לקצור הגרעינים, והתוצאה זיהוי נדיר אינטרונים סום (3 מתוך 26 תאים, כלומר, 12%).

Figure 1
איור 1: תיבת ייעודי עבור תא בודד RT-PCR- רשימת חומרים שמורות RT-PCR לאחר תיקון-קלאמפ. (1) זכוכית בורוסיליקט נימים ארוך (2) 20 µL, טיפים בסדר, גמיש, micropipette µL (3) 20, expeller (4) מתוצרת בית, המבחנות µL 500 (5), (6) 10 µL אירוסול עמיד המסנן טיפים, פרמננטיים (7). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: ה-PCR פריימר עיצוב אסטרטגיה. (א) ייצוג סכמטי של רצף קידוד של cDNA 2 קוקס מיושרת רצף כרומוזום 2 העכבר המכילים את הגן קוקס 2. Exons מיוצגים על-ידי תיבות שחורות אינטרונים על gDNA על-ידי תיבות לבנות. הערה הפערים cDNA התואם רצפי intronic על gDNA. דוגמאות מייצגות של רע וטוב oligonucleotides שמיוצגות חיצים אדומים וירוקים, בהתאמה. חיצים ימינה ושמאלה מציינות תחל ואחורה. רצפים (B) ומבנים המשני של oligonucleotides המוצגים באותיות (A). לוחות שמאלה וימינה מציינים מכבנה העצמי-משלימים את החסר היווצרות העצמי-דימר, בהתאמה. Oligonucleotide B1 מציג שני סיכת ראש חזק העצמי-משלימים את החסר דיימר היווצרות ואילו oligonucleotide B2 מראה רק היווצרות דימר. Oligonucleotides B3 ו- B4 יש אין מכבנה העצמי-משלימים את החסר ויצירת דיימר אין; אינטרון overspanning (א) והן נבחרו כמו פוטנציאליים תחל PCR (ראה טבלה 1). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: אימות של ה-PCR מולטיפלקס. 1 ng של RNA הכולל של העכבר כל המוח היה נתון של שעתוק במהופך ואחריו שני סיבובים של PCR הגברה. המוצרים PCR 12 שנפתרו במסלולים נפרדים על-ידי agarose בג'ל במקביל Φx174 מתעכל על ידי Haeהשלישי. המוצרים PCR השני היו גדלים (ב- bp) שמנבאת את רצפי: 153 (vGluT1), 248 (GAD65), 255 (GAD67), 181 (2 קוקס), 220 (NPY), 146 (סום), 183 (ATP1a1), 213 (ATP1a2), 128 (ATP1a3), 342 (Kir6.2), 211 (SUR1) ו- 182 (סוםint). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4: תיקון-קלאמפ קציר פרוסות המוח. ברגע תא מזוהה מבחינה ויזואלית, פיפטה הקלטה ניגש עם לחץ חיובי על מנת למנוע זיהום הסלולר פסולת בקצה פיפטה. הערה של גומת חן על הקרום של נוירון זה. . לחץ אוויר חיובי ואז תיפסק כדי ליצור תצורת צמוד-תא עם חותם צר ג'יגה אוהם. ראספים קצר מוחלים כדי לעבור לתצורה תאים שלמים. בסוף ההקלטה, הציטופלסמה האיסוף על-ידי החלת לחץ שלילי עדין לתוך פיפטה תוך שמירה על החותם חזק. הערה הצטמקות של גוף התא במהלך ההליך האיסוף. פיפטה הקלטה ואז נסוגה בעדינות כדי ליצור תיקון בחוץ-אאוט, אשר מעדיף קרום התא הסגר על התגלות biocytin עוקבות, ושימור חומר שנקטפו פיפטה תיקון. מרובה מן Cauli ולא Lambolez47 , ברשות החברה המלכותית לכימיה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5: אפיון של תאים כפירמידה neocortical שכבה V. ממברנה (A) פוטנציאל התגובה של תא כפירמידה שכבה V המושרה על ידי פולסים הנוכחי של-100,-40,-10, +60, +120 +500 הרשות הפלסטינית (עקבות התחתון). הנוירון מציג אפשרות סטיה פוטנציאל חלש לאחר התגובה הראשונית hyperpolarizing (עקבות העליון). בתגובה דפולריזציה שנע, הנוירון משוחררים פוטנציאל פעולה לטווח ארוך עם לאט לאט לפתח לאחר-hyperpolarization (trace העליון). ליד רוויה, הנוירון משוחררים בתדירות נמוכה, הציג של הסתגלות בולטת (trace אפור עליון). שיבוץ: תמונות אינפרא-אדום של הנוירון כפירמידה מוקלטות שכבה V. פני השטח pial היא כלפי מעלה. סרגל קנה מידה: 20 מיקרומטר. (B) ניתוח מולטיפלקס RT-PCR לחשוף ביטוי של vGluT1, סום, ATP1α1 ו- ATP1α3. (ג') פרופיל ביטוי גנטי במדגם של 26 שכבה V תאים כפירמידה. vGluT1 בא לידי כל הנוירונים בזמן GAD65, GAD67 ו- COX2 מעולם לא אותרו. NPY, סום, Kir6.2, SUR1 וסוםint נצפו לעתים נדירות. תאים כפירמידה הביע ATP1α3, 1 יחידה משנית של Na+/K+ ATPase, ATP1α2 פחותה. (ד) מקסימום הטלה בעוצמה של תמונות קונאפוקלית מציג biocytin תיוג של הנוירון טלקוה (A). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

גנים / מספר GenBank צבעי יסוד חיצוני גודל (bp) תחל פנימי גודל (bp)
vGlut1
NM_182993		 הגיוני,-113 259 הגיוני, הערך-54 153
GGCTCCTTTTTCTGGGGCTAC ATTCGCAGCCAACAGGGTCT
חוש אנטי, 126 חוש אנטי, 79
CCAGCCGACTCCGTTCTAAG TGGCAAGCAGGGTATGTGAC
GAD65
NM_008078		 הגיוני, 99 375 הגיוני, 219 248
CCAAAAGTTCACGGGCGG CACCTGCGACCAAAAACCCT
חוש אנטי, 454 חוש אנטי, 447
TCCTCCAGATTTTGCGGTTG GATTTTGCGGTTGGTCTGCC
GAD67
NM_008077		 הגיוני, 529 598 הגיוני, 801 255
TACGGGGTTCGCACAGGTC CCCAGAAGTGAAGACAAAAGGC
חוש אנטי, 1109 חוש אנטי, 1034
CCCAGGCAGCATCCACAT AATGCTCCGTAAACAGTCGTGC
קוקס 2
NM_011198		 הגיוני, 199 268 הגיוני, 265 181
CTGAAGCCCACCCCAAACAC AACAACATCCCCTTCCTGCG
חוש אנטי, 445 חוש אנטי, 426
CCTTATTTCCCTTCACACCCAT TGGGAGTTGGGCAGTCATCT
NPY
NM_023456		 הגיוני, 16 294 הגיוני, 38 220
CGAATGGGGCTGTGTGGA CCCTCGCTCTATCTCTGCTCGT
חוש אנטי, 286 חוש אנטי, 236
AAGTTTCATTTCCCATCACCACAT GCGTTTTCTGTGCTTTCCTTCA
סום
NM_009215		 הגיוני, 43 208 הגיוני, 75 146
ATCGTCCTGGCTTTGGGC GCCCTCGGACCCCAGACT
חוש אנטי, 231 חוש אנטי, 203
GCCTCATCTCGTCCTGCTCA GCAAATCCTCGGGCTCCA
ATP1Α1
NM_144900 		הגיוני, 1287 288 הגיוני, 1329 183
CAGGGCAGTGTTTCAGGCTAA TAAGCGGGCAGTAGCGGG
חוש אנטי, 1556 חוש אנטי, 1492
CCGTGGAGAAGGATGGAGC AGGTGTTTGGGCTCAGATGC
ATP1Α2
NM_178405		 הגיוני, 1392 268 הגיוני, 1430 213
AGTGAGGAAGATGAGGGACAGG AAATCCCCTTCAACTCCACCA
חוש אנטי, 1640 חוש אנטי, 1623
ACAGAAGCCCAGCACTCGTT GTTCCCCAAGTCCTCCCAGC
ATP1Α3
NM_144921		 הגיוני, 127 216 הגיוני, 158 128
CGGAAATACAATACTGACTGCGTG TGACACACAGTAAAGCCCAGGA
חוש אנטי, 324 חוש אנטי, 264
GTCATCCTCCGTCCCTGCC CCACAGCAGGATAGAGAAGCCA
Kir6.2
NM_010602		 הגיוני, 306 431 הגיוני, 339 342
CGGAGAGGGCACCAATGT CATCCACTCCTTTTCATCTGCC
חוש אנטי, 719 חוש אנטי, 663
CACCCACGCCATTCTCCA TCGGGGCTGGTGGTCTTG
SUR1
NM_011510		 הגיוני, 1867 385 הגיוני, 2041 211
CAGTGTGCCCCCCGAGAG ATCATCGGAGGCTTCTTCACC
חוש אנטי, 2231 חוש אנטי, 2231
GGTCTTCTCCCTCGCTGTCTG GGTCTTCTCCCTCGCTGTCTG
SOMint
X51468		 הגיוני, 8 240 הגיוני, 16 182
CTGTCCCCCTTACGAATCCC CTTACGAATCCCCCAGCCTT
חוש אנטי, 228 חוש אנטי, 178
CCAGCACCAGGGATAGAGCC TTGAAAGCCAGGGAGGAACT

טבלה 1. רצפים של הראשון והשני תחל PCR. המיקום של כל פריימר PCR והרצפים שלהם מקבלים מ 5' ל 3'. פרט אינטרון סומטוסטטין, עמדה 1 מקביל הבסיס הראשון של codon ההתחלה של כל הגן.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

יחיד תא מולטיפלקס RT-PCR לאחר תיקון-קלאמפ יכול בו זמנית ובאמינות לחקור את הביטוי של גנים יותר מ-30 תאים מזוהה electrophysiologically5. ניתוח ביטוי גנים ברמת תא בודד דורש תחל PCR יעילים ביותר. אחד הצעדים המגביל ביותר הוא אוסף של תוכנו של התא. היעילות שלה תלוי הקוטר של קצה פיפטה תיקון, אשר חייב להיות גדול ככל האפשר תוך התאמת גודל התא. מדי סוכר עם 1-2 מיקרומטר עצה פתוחה קוטר הוכח להיות מתאים עבור סוגי ביותר עצביים. זה גם חיוני כדי לוודא כי רק את התוכן הסלולר נאסף, ואת לא הרקמה שמסביב. זו מושגת על ידי שליטה electrophysiologically על שימור חותם צר בעת הקציר. היווצרות תצורת בחוץ-אאוט תיקון במהלך פיפטה נסיגה נוספת מגן הציטופלסמה שנקטפו פסולת הסלולר. שיעור ההצלחה של התא הבודד שמולטיפלקס RT-PCR תלויה גם mRNAs שפע של סוג התא ובדוקים. למשל, התשואה שהושג עם האסטרוציטים, המבטאות mRNAs כמויות נמוכות יחסית3, בדרך כלל נמוכה יותר מזו שהושג עם נוירונים, ולכן דורש הגדלת מדגם בגודל15,16. שעתוק במהופך, אשר מכיל את יעילות נמוכה של צינורות48, היא התגובה המגביל של יחיד תא מולטיפלקס RT-PCR. לכן חיוני להשתמש איכותיים ריאגנטים, לאחסן אותם כמו aliquots ב-80 מעלות צלזיוס, וכדי להשתמש בהם רק ליום אחד. לבסוף, פעילות ה-DNA פולימראז RTase היא לעיתים קרובות מקור תסולא בפז של היווצרות פריימר דיימר. כדי לטפל בבעיה זו, מבצע התחלה חם עם תחל הוא קריטי כדי להגביר את היעילות הגברה. בנוסף פעולה זו תקטין את ההשפעה המעכבת של RTase על the Taq DNA פולימראז פעילות49.

טכניקת ה-RT-PCR תא בודד מולטיפלקס היא רב תכליתי. זה שימש בהרחבה במכרסמים10,11,13,19,20,34,50,51,52 53, ,54 , אבל ניתן להתאים כמעט כל בבעלי חיים וגם הגנים בהנחה כי רקמת וג'ין רצפים זמינים. תיקון-קלאמפ פתרונות שונים יכול לשמש כל עוד הם לא מפריעים עם RT-PCR על מבחני חינם התא. למשל פנימי פתרונות המבוססים על K+ או קטיונים Cs+ , Cl– או gluconate כבר בשימוש בהצלחה6,36,41,55.

תוצאות שליליות שווא קלאסית נובעים RNase זיהום פילמנט פיפטה תיקון ו/או פתרון תיקון פנימי-קלאמפ. Chlorinating נימה ובזהירות אימות הפתרון הפנימי בדרך כלל לפתור את הבעיה. תוצאות שליליות שגויות יכול להתרחש גם כאשר הגן מבוטא ברמה נמוכה תא בודד, מאז האיסוף רק שיעור של הציטופלסמה. ניתן להגדיל את איכות האיסוף באמצעות פיפטות גדול יותר ו/או על-ידי הפחתת זמן ההקלטה תאים שלמים. קציר איכות יכול להיות מוערך על ידי כולל גן בשם לבוא לידי ביטוי ברמה נמוכה עוד תאים בודדים20. תוצאות חיוביות שגויות יכול להתרחש עם איכות רקמת רע, שבו כמות מזהם פסולת הסלולר היא גבוהה. בדיקת הנוכחות של פסולת נעשית על-ידי הוספת פיפטה תיקון של הפרוסה ללא ביצוע שום חותם ושחרור הלחץ חיובית לפני הסרת פיפטה. הנוכחות של חומרים amplifiable הוא נחקר אז RT-PCR מולטיפלקס42. Silanizing פיפטה תיקון גם שימש כדי לצמצם את האוסף של מזהמים חוץ-תאית56. תא בודד PCR היא טכניקה מאוד רגיש שיכול לזהות רק עותק אחד של זוגי נטושים דנ א57. במקרה של גנים אינטרון-פחות, gDNA הכלול בגרעין גם להפיק תוצאות חיוביות שגויות. הימנעות האוסף של gDNA על-ידי הצבת את פיפטה הרחק מהגרעין במהלך האיסוף מסייע לפתור בעיה זו. הנוכחות של gDNA פתור באופן אמין על ידי הגברה של רצף intronic25.

הגילוי של מולקולות ה-mRNA מאת RT-PCR הופך לא אמין-10 עותקים44, ככל הנראה בשל יעילות נמוכה RTase48, והוא יכול להוביל תחת זיהוי של תעתיקים נמוך-שפע26,42. זה יכול להיות בעייתי במקרה של גנים אינטרון-פחות. אכן, הימנעות הקציר של הגרעין מפחית את כמות הציטופלסמה הניתנים לאיסוף ולכן הרגישות זיהוי. השילוב של תא בודד RT-PCR לאחר תיקון-קלאמפ עם תיוג biocytin דורש הצורה של התא נשמר ככל האפשר (איור 3). . גיטימציה, זה מפחית את כמות החומר הניתנים לאיסוף, ובכך להפחית את שיעור ההצלחה. פשרה בין ציטופלזמה איסוף ושימור מורפולוגיה תאים הוא חובה.

מולטיפלקס נתונים RT-PCR תא בודד אינם כמותיים הם רק לתת מידע על האם cDNAs להציג או נעדר בחומר שנאסף. עם זאת, בגלל לגבולות הזיהוי המתואר לעיל, המופע של זיהוי ברמת האוכלוסייה ניתן לשקף השפע של גנים ברמת תא בודד. גישות אלטרנטיביות תאפשר את הדור של נתונים כמותיים יותר, אך טכנית האילוצים שהטיל את האסטרטגיות הגברה מסוימת שלהם (כלומר, כימות היחסי של הגנים הומולוגיים או RT-qPCR) במידה רבה להגביל את מספר גנים זה יכול להיות בו זמנית ניתח41,53,55,58,59,60,61,62,63 ,-64,-65,-66. שילוב זה התבצעה תיקון-קלאמפ הקלטות עם תא בודד RNaseq, המכונה תיקון-seq30,31, מאפשר ניתוח כמותי transcriptomic של תאים מאופיין electrophysiologically. זאת גישה חדשה ומבטיחה, אך זה דורש גישה סקוונסרים תפוקה גבוהה, הנתונים שהופקו דורשים ניתוח זמן רב.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

אנו מודים ד ר אלכסנדר Mourot על דבריו על כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים סוכנות הידיעות נאסיונאל דה לה רשרש (ANR 2011 MALZ 003 01; ANR-15-CE16-0010 ו- ANR-17-CE37-0010-03), בניין נתמך על-ידי אחוות מ Fondation pour la רשרש סור אלצהיימר. אנו מודים את המתקן בעלי חיים IBPS (פריז, צרפת).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MACAW v.2.0.5 NCBI Multiple alignement for primer design
Dithiothreitol VWR 443852A RT
Random primers Sigma-Aldrich (Merck) 11034731001 RT
dNTPs GE Healthcare Life Sciences 28-4065-52 RT and PCR
RNasin Ribonuclease Inhibitors Promega N2511 RT
SuperScript II Reverse Transcriptase Invitrogen 18064014 RT
Taq DNA Polymerase Qiagen 201205 PCR
Mineral Oil Sigma-Aldrich (Merck) M5904-5ML PCR
PCR primers Sigma-Aldrich (Merck) PCR / desalted and diluted at 200 µM
Tubes, 0.5 mL, flat cap ThermoFisher Scientific AB0350 RT and PCR
BT10 Series - 10 µL Filter Tip Neptune Scientific BT10 RT and PCR
BT20 Series - 20 µL Filter Tip Neptune Scientific BT20 RT and PCR
BT200 Series - 200 µL Filter Tip Neptune Scientific BT200 RT and PCR
BT1000 Series - 1000 µL Filter Tip Neptune Scientific BT1000.96 RT and PCR
DNA Thermal Cylcer Perkin Elmer Cetus PCR
Ethidium Bromide Sigma-Aldrich (Merck) E1510-10ML Agarose gel electrophoresis
Tris-Borate-EDTA buffer Sigma-Aldrich (Merck) T4415-1L Agarose gel electrophoresis
UltraPure Agarose Life Technologies 16500-500 Agarose gel electrophoresis
ΦX174 DNA-Hae III Digest NEB (New England BioLabs) N3026S Agarose gel electrophoresis
EDA 290 Kodak Agarose gel electrophoresis
Electrophoresis Power supply EPS 3500 Pharmacia Biotech Agarose gel electrophoresis
Midi Horizontal Elecrophoresis Unit Model SHU13 Sigma-Aldrich (Merck) Agarose gel electrophoresis
Smooth paper with satin appearance Fisherbrand 1748B Patch clamp internal solution
Potassium Hydroxyde Sigma-Aldrich (Merck) 60377 Patch clamp internal solution
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid Sigma-Aldrich (Merck) E3889 Patch clamp internal solution
HEPES Sigma-Aldrich (Merck) H4034 Patch clamp internal solution
Potassium D-gluconate Sigma-Aldrich (Merck) G4500 Patch clamp internal solution
Magnesium chloride solution Sigma-Aldrich (Merck) M1028 Patch clamp internal solution
5500 Vapor Pressure Osmometer Wescor Patch clamp internal solution
Biocytin Sigma-Aldrich (Merck) B4261 Patch clamp internal solution
Sucrose Sigma-Aldrich (Merck) S5016 Slice preparation
D-(+)-Glucose monohydrate Sigma-Aldrich (Merck) 49159 Slice preparation
Sodium chloride Sigma-Aldrich (Merck) S6191 Slice preparation
Potassium chloride Sigma-Aldrich (Merck) 60128 Slice preparation
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich (Merck) 31437-M Slice preparation
Sodium phosphate monobasic Sigma-Aldrich (Merck) S5011 Slice preparation
Magnesium chloride solution Sigma-Aldrich (Merck) 63069 Slice preparation
Calcium chloride solution Sigma-Aldrich (Merck) 21115 Slice preparation
Kynurenic acid Sigma-Aldrich (Merck) K3375 Slice preparation
Isoflurane Piramal Healthcare UK Slice preparation
VT 1000S Leica Biosystems 14047235613 Slice preparation
Hydrogen peroxide solution Sigma-Aldrich (Merck) H1009 Patch Clamp set-up cleaning
Thin Wall Glass Capillaries with filament World Precision Instruments TW150F-4 Patch Clamp
PP-83 Narishige Patch Clamp
Eppendorf Microloader Eppendorf 5242956003 Patch Clamp
BX51WI Upright microscope Olympus Patch Clamp
XC-ST70/CE CCD B/W VIDEO CAMERA Sony Patch Clamp
Axopatch 200B Amplifier Molecular Devices Patch Clamp
Digidata 1440 Molecular Devices Patch Clamp
pCLAMP 10 software suite Molecular Devices Patch Clamp
10 mL syringe Terumo SS-10ES Expelling
E Series with Straight Body (Holder) Phymep 64-0997 Expelling
Sodium phosphate dibasic Sigma-Aldrich (Merck) S7907 Histochemical revelation
Sodium phosphate monobasic Sigma-Aldrich (Merck) S8282 Histochemical revelation
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich (Merck) P6148 Histochemical revelation
Triton X-100 Sigma-Aldrich (Merck) X100 Histochemical revelation
Gelatin from cold water fish skin Sigma-Aldrich (Merck) G7041 Histochemical revelation
Streptavidin, Alexa Fluor 488 conjugate ThermoFisher Scientific S11223 Histochemical revelation
24-well plate Greiner Bio-One 662160 Histochemical revelation

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ascoli, G. A., et al. Petilla terminology: nomenclature of features of GABAergic interneurons of the cerebral cortex. Nat.Rev.Neurosci. 9 (7), 557-568 (2008).
  2. DeFelipe, J., et al. New insights into the classification and nomenclature of cortical GABAergic interneurons. Nat.Rev.Neurosci. , (2013).
  3. Tasic, B., et al. Adult mouse cortical cell taxonomy revealed by single cell transcriptomics. Nat.Neurosci. , (2016).
  4. Zeisel, A., et al. Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq. Science. , (2015).
  5. Cauli, B., et al. Classification of fusiform neocortical interneurons based on unsupervised clustering. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 97 (11), 6144-6149 (2000).
  6. Cauli, B., et al. Molecular and physiological diversity of cortical nonpyramidal cells. J.Neurosci. 17 (10), 3894-3906 (1997).
  7. Férézou, I., et al. 5-HT3 receptors mediate serotonergic fast synaptic excitation of neocortical vasoactive intestinal peptide/cholecystokinin interneurons. J. Neurosci. 22 (17), 7389-7397 (2002).
  8. Cauli, B., et al. Cortical GABA interneurons in neurovascular coupling: relays for subcortical vasoactive pathways. J.Neurosci. 24 (41), 8940-8949 (2004).
  9. Wang, Y., Gupta, A., Toledo-Rodriguez, M., Wu, C. Z., Markram, H. Anatomical, physiological, molecular and circuit properties of nest basket cells in the developing somatosensory cortex. Cereb.Cortex. 12 (4), 395-410 (2002).
  10. Wang, Y., et al. Anatomical, physiological and molecular properties of Martinotti cells in the somatosensory cortex of the juvenile rat. J.Physiol. 561 (Pt 1), 65-90 (2004).
  11. Karagiannis, A., et al. Classification of NPY-expressing neocortical interneurons. J.Neurosci. 29 (11), 3642-3659 (2009).
  12. Battaglia, D., Karagiannis, A., Gallopin, T., Gutch, H. W., Cauli, B. Beyond the frontiers of neuronal types. Front Neural Circuits. 7, 13 (2013).
  13. Toledo-Rodriguez, M., et al. Correlation maps allow neuronal electrical properties to be predicted from single-cell gene expression profiles in rat neocortex. Cereb.Cortex. 14 (12), 1310-1327 (2004).
  14. Toledo-Rodriguez, M., Goodman, P., Illic, M., Wu, C., Markram, H. Neuropeptide and calcium binding protein gene expression profiles predict neuronal anatomical type in the juvenile rat. J.Physiol. , (2005).
  15. Lecrux, C., et al. Pyramidal neurons are "neurogenic hubs" in the neurovascular coupling response to whisker stimulation. J.Neurosci. 31 (27), 9836-9847 (2011).
  16. Lacroix, A., et al. COX-2-derived prostaglandin E2 produced by pyramidal neurons contributes to neurovascular coupling in the rodent cerebral cortex. J.Neurosci. 35 (34), 11791-11810 (2015).
  17. Matthias, K., et al. Segregated expression of AMPA-type glutamate receptors and glutamate transporters defines distinct astrocyte populations in the mouse hippocampus. J.Neurosci. 23 (5), 1750-1758 (2003).
  18. Rancillac, A., et al. Glutamatergic control of microvascular tone by distinct gaba neurons in the cerebellum. J.Neurosci. 26 (26), 6997-7006 (2006).
  19. Miki, T., et al. ATP-sensitive K+ channels in the hypothalamus are essential for the maintenance of glucose homeostasis. Nat.Neurosci. 4 (5), 507-512 (2001).
  20. Liss, B., Bruns, R., Roeper, J. Alternative sulfonylurea receptor expression defines metabolic sensitivity of K-ATP channels in dopaminergic midbrain neurons. EMBO J. 18 (4), 833-846 (1999).
  21. Gallopin, T., et al. Identification of sleep-promoting neurons in vitro. Nature. 404 (6781), 992-995 (2000).
  22. Gallopin, T., et al. The endogenous somnogen adenosine excites a subset of sleep-promoting neurons via A2A receptors in the ventrolateral preoptic nucleus. Neuroscience. 134 (4), 1377-1390 (2005).
  23. Fernandez, S. P., et al. Multiscale single-cell analysis reveals unique phenotypes of raphe 5-HT neurons projecting to the forebrain. Brain Struct.Funct. , (2015).
  24. Porter, J. T., et al. Selective excitation of subtypes of neocortical interneurons by nicotinic receptors. J.Neurosci. 19 (13), 5228-5235 (1999).
  25. Hill, E. L., et al. Functional CB1 receptors are broadly expressed in neocortical GABAergic and glutamatergic neurons. J.Neurophysiol. 97 (4), 2580-2589 (2007).
  26. Férézou, I., et al. Extensive overlap of mu-opioid and nicotinic sensitivity in cortical interneurons. Cereb.Cortex. 17 (8), 1948-1957 (2007).
  27. Hu, E., et al. PACAP act at distinct receptors to elicit different cAMP/PKA dynamics in the neocortex. Cereb.Cortex. 21 (3), 708-718 (2011).
  28. Louessard, M., et al. Tissue plasminogen activator expression is restricted to subsets of excitatory pyramidal glutamatergic neurons. Mol.Neurobiol. , (2015).
  29. Stuart, G. J., Dodt, H. U., Sakmann, B. Patch-clamp recordings from the soma and dendrites of neurons in brain slices using infrared video microscopy. Pflugers Arch. 423 (5-6), 511-518 (1993).
  30. Cadwell, C. R., et al. Electrophysiological, transcriptomic and morphologic profiling of single neurons using Patch-seq. Nat.Biotechnol. 34 (2), 199-203 (2016).
  31. Fuzik, J., et al. Integration of electrophysiological recordings with single-cell RNA-seq data identifies neuronal subtypes. Nat.Biotechnol. 34 (2), 175-183 (2016).
  32. O'Leary, N. A., et al. Reference sequence (RefSeq) database at NCBI: current status, taxonomic expansion, and functional annotation. Nucleic Acids Res. 44, D733-D745 (2016).
  33. Schuler, G. D., Altschul, S. F., Lipman, D. J. A workbench for multiple alignment construction and analysis. Proteins. 9 (3), 180-190 (1991).
  34. Ruano, D., Lambolez, B., Rossier, J., Paternain, A. V., Lerma, J. Kainate receptor subunits expressed in single cultured hippocampal neurons: molecular and functional variants by RNA editing. Neuron. 14 (5), 1009-1017 (1995).
  35. Porter, J. T., et al. Properties of bipolar VIPergic interneurons and their excitation by pyramidal neurons in the rat neocortex. Eur.J.Neurosci. 10 (12), 3617-3628 (1998).
  36. Ruano, D., Perrais, D., Rossier, J., Ropert, N. Expression of GABA(A) receptor subunit mRNAs by layer V pyramidal cells of the rat primary visual cortex. Eur.J.Neurosci. 9 (4), 857-862 (1997).
  37. Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J. Basic local alignment search tool. J.Mol.Biol. 215 (3), 403-410 (1990).
  38. Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate- phenol-chloroform extraction. Anal Biochem. 162 (1), 156-159 (1987).
  39. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J.Vis.Exp. (62), (2012).
  40. Liss, B., et al. K-ATP channels promote the differential degeneration of dopaminergic midbrain neurons. Nat.Neurosci. 8 (12), 1742-1751 (2005).
  41. Lambolez, B., Audinat, E., Bochet, P., Crepel, F., Rossier, J. AMPA receptor subunits expressed by single Purkinje cells. Neuron. 9 (2), 247-258 (1992).
  42. Gallopin, T., Geoffroy, H., Rossier, J., Lambolez, B. Cortical sources of CRF, NKB, and CCK and their effects on pyramidal cells in the neocortex. Cereb.Cortex. 16 (10), 1440-1452 (2006).
  43. Cunningham, M. O., et al. Neuronal metabolism governs cortical network response state. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 103 (14), 5597-5601 (2006).
  44. Tsuzuki, K., Lambolez, B., Rossier, J., Ozawa, S. Absolute quantification of AMPA receptor subunit mRNAs in single hippocampal neurons. J.Neurochem. 77 (6), 1650-1659 (2001).
  45. McCormick, D. A., Connors, B. W., Lighthall, J. W., Prince, D. A. Comparative electrophysiology of pyramidal and sparsely spiny stellate neurons of the neocortex. Journal of Neurophysiology. 54 (4), 782-806 (1985).
  46. Andjelic, S., et al. Glutamatergic nonpyramidal neurons from neocortical layer VI and their comparison with pyramidal and spiny stellate neurons. J.Neurophysiol. 101 (2), 641-654 (2009).
  47. Cauli, B., Lambolez, B. Chapter 9: Gene Analysis of Single Cells. Unravelling Single Cell Genomics: Micro and Nanotools. Bontoux, N., Potier, M. C. , RSC publishing. Cambridge. 81-92 (2010).
  48. Bontoux, N., et al. Integrating whole transcriptome assays on a lab-on-a-chip for single cell gene profiling. Lab Chip. 8 (3), 443-450 (2008).
  49. Sellner, L. N., Coelen, R. J., Mackenzie, J. S. Reverse transcriptase inhibits Taq polymerase activity. Nucleic Acids Res. 20 (7), 1487-1490 (1992).
  50. Perrenoud, Q., Rossier, J., Geoffroy, H., Vitalis, T., Gallopin, T. Diversity of GABAergic interneurons in layer VIa and VIb of mouse barrel cortex. Cereb.Cortex. , (2012).
  51. Tricoire, L., et al. Common origins of hippocampal ivy and nitric oxide synthase expressing neurogliaform cells. J.Neurosci. 30 (6), 2165-2176 (2010).
  52. Cea-del Rio, C. A., et al. M3 muscarinic acetylcholine receptor expression confers differential cholinergic modulation to neurochemically distinct hippocampal basket cell subtypes. J.Neurosci. 30 (17), 6011-6024 (2010).
  53. Tricoire, L., et al. A blueprint for the spatiotemporal origins of mouse hippocampal interneuron diversity. J.Neurosci. 31 (30), 10948-10970 (2011).
  54. Franz, O., Liss, B., Neu, A., Roeper, J. Single-cell mRNA expression of HCN1 correlates with a fast gating phenotype of hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated ion channels (Ih) in central neurons. Eur.J.Neurosci. 12 (8), 2685-2693 (2000).
  55. Szabo, A., et al. Calcium-permeable AMPA receptors provide a common mechanism for LTP in glutamatergic synapses of distinct hippocampal interneuron types. J.Neurosci. 32 (19), 6511-6516 (2012).
  56. Hodne, K., Weltzien, F. A. Single-Cell Isolation and Gene Analysis: Pitfalls and Possibilities. Int.J.Mol.Sci. 16 (11), 26832-26849 (2015).
  57. Li, H. H., et al. Amplification and analysis of DNA sequences in single human sperm and diploid cells. Nature. 335 (6189), 414-417 (1988).
  58. Bochet, P., et al. Subunit composition at the single-cell level explains functional properties of a glutamate-gated channel. Neuron. 12 (2), 383-388 (1994).
  59. Audinat, E., Lambolez, B., Rossier, J., Crepel, F. Activity-dependent regulation of N-methyl-D-aspartate receptor subunit expression in rat cerebellar granule cells. Eur.J.Neurosci. 6 (12), 1792-1800 (1994).
  60. Jonas, P., Racca, C., Sakmann, B., Seeburg, P. H., Monyer, H. Differences in Ca2+ permeability of AMPA-type glutamate receptor channels in neocortical neurons caused by differential GluR-B subunit expression. Neuron. 12 (6), 1281-1289 (1994).
  61. Geiger, J. R., et al. Relative abundance of subunit mRNAs determines gating and Ca2+ permeability of AMPA receptors in principal neurons and interneurons in rat CNS. Neuron. 15 (1), 193-204 (1995).
  62. Flint, A. C., Maisch, U. S., Weishaupt, J. H., Kriegstein, A. R., Monyer, H. NR2A subunit expression shortens NMDA receptor synaptic currents in developing neocortex. J.Neurosci. 17 (7), 2469-2476 (1997).
  63. Angulo, M. C., Lambolez, B., Audinat, E., Hestrin, S., Rossier, J. Subunit composition, kinetic, and permeation properties of AMPA receptors in single neocortical nonpyramidal cells. J.Neurosci. 17 (17), 6685-6696 (1997).
  64. Lambolez, B., Ropert, N., Perrais, D., Rossier, J., Hestrin, S. Correlation between kinetics and RNA splicing of alpha-amino-3-hydroxy-5-methylisoxazole-4-propionic acid receptors in neocortical neurons. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 93 (5), 1797-1802 (1996).
  65. Liss, B., et al. Tuning pacemaker frequency of individual dopaminergic neurons by Kv4.3L and KChip3.1 transcription. EMBO J. 20 (20), 5715-5724 (2001).
  66. Aponte, Y., Lien, C. C., Reisinger, E., Jonas, P. Hyperpolarization-activated cation channels in fast-spiking interneurons of rat hippocampus. J.Physiol. 574, 229-243 (2006).

Tags

מדעי המוח גיליון 136 פרופיל ביטוי גנטי נוירונים האסטרוציטים פרוסות המוח תאים כל תצורה תגובת שרשרת של פולימראז מקוננים (PCR)
תגובת שרשרת של פולימראז מולטיפלקס שעתוק במהופך תא בודד לאחר תיקון-קלאמפ
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Devienne, G., Le Gac, B., Piquet,… More

Devienne, G., Le Gac, B., Piquet, J., Cauli, B. Single Cell Multiplex Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction After Patch-clamp. J. Vis. Exp. (136), e57627, doi:10.3791/57627 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter