Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Одноячеистый мультиплекс обратной транскрипции полимеразной цепной реакции после патч зажим

Published: June 20, 2018 doi: 10.3791/57627
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1
1UPMC Univ Paris 06, INSERM, CNRS, Neuroscience Paris Seine - Institut de Biologie Paris Seine (NPS - IBPS), Sorbonne Université
* These authors contributed equally

Summary

Этот протокол описывает важнейшие шаги и меры предосторожности, необходимые для выполнения одноклеточного мультиплекс обратной транскрипции полимеразной цепной реакции после патч зажим. Эта техника является простой и эффективный метод для анализа выражения профиль заранее определенный набор генов из одной клетки характеризуются патч зажим записей.

Abstract

Головного мозга состоит из многочисленных типов клеток, экспонируется различных морфологических, физиологических и молекулярные особенности. Это разнообразие препятствует простой идентификации и характеристика этих типов клеток, предпосылки для изучения их конкретных функций. Эта статья описывает мультиплекс одной ячейки обратной транскрипции полимеразной цепной реакции (ПЦР) протокол, который позволяет, после фиксации записи в форме долек, обнаружить одновременно выражение десятки генов в одной ячейке. Этот простой метод может быть реализован с морфологическая характеристика и широко применяется для определения фенотипических признаков различных типов клеток и их конкретной клеточной среды, такие как вблизи кровеносных сосудов. Принцип этот протокол является для записи ячейки с техникой патч зажим, чтобы урожай и обратить вспять транскрибировать его цитоплазматических содержание, и обнаружить качественно выражение предопределенный набор генов мультиплексной ПЦР. Это требует тщательной разработки праймеры PCR и внутриклеточных патч зажим решение, совместимое с RT-PCR. Для обеспечения стенограмме селективный и надежного обнаружения, этот метод также требует надлежащего контроля от цитоплазмы заготовки для усиления действия. Хотя необходимо строго соблюдать правила, обсуждаемых здесь, практически любой электрофизиологической лаборатории можно использовать мультиплекс одну ячейку техника RT-PCR.

Introduction

Головного мозга состоит из многочисленных типов клеток, участвующих в различных физиологических процессах. Их определение и характеристика, предварительным условием для понимания их специфических функций, может быть очень сложным ввиду большой морфологических, физиологических и молекулярных разнообразия, что характеризует корковых клеток типы1 ,2,3,4.

Одноклеточных мультиплексной ПЦР-основан на комбинации патч зажим и методов RT-PCR. Она может одновременно зонд выражение более чем 30 предопределенные генов в клетки electrophysiologically выявленных5. Включение трассирующими нейронов в записи пипеткой далее позволяет морфологическая характеристика записанные клеток после гистохимические откровение6,,78,9, 10. это очень полезный метод для классификации типов нейронов, на основе многофакторного анализа их фенотипических признаков5,9,10,11,12 ,,1314. Одна ячейка мультиплексной ПЦР-также подходит для характеризации не нейрональных клеток, таких как астроциты15,16,17и может применяться практически каждый мозг структуры18, 19,20,21,22,23 и ячейки типа, предполагая, они могут быть записаны в целом ячейки конфигурации.

Этот метод очень удобен для выявления клеточных источников и/или цели передачи систем7,8,,1516,20,21, 24,25,26,27,28, особенно, когда отсутствуют специфические антитела. Он опирается на патч зажим записи от визуально выявленных клетки29и таким образом также позволяет ориентации клетки в конкретной клеточной среды8,,1516. Кроме того так как cytoarchitecture ткани мозга сохраняется в срезах головного мозга, этот подход также позволяет исследования анатомических отношений характеризуется клеток с нейронов и не нейрональных элементы7,8 , 18.

Поскольку этот метод является ограниченное количество собранного цитоплазмой и эффективности RT, обнаружение мРНК, выраженные на низких копии номер может быть затруднено. Хотя другие подходы, основанные на RNaseq технологии позволяют анализировать весь транскриптом одиночных клеток3,4,30,31, они не обязательно дорогим секвенсоров высок объём доступны для каждой лаборатории. Так как одну ячейку мультиплексной ПЦР-техника использует конечную точку PCR, он только требует thermocyclers широко доступны. Это могут быть легко разработаны в лабораториях, оснащенных электрофизиологических установок и не требует дорогостоящего оборудования. В течение одного дня, она может обеспечить качественный анализ выражения предопределенный набор генов. Таким образом этот подход предлагает легкий доступ к молекулярная характеристика одиночных клеток в быстрой манере.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все экспериментальные процедуры с использованием животных были выполнены в строгом соответствии с положениями французского (код сельских R214/87-до R214/130) и соответствует этические руководящие принципы Европейского экономического сообщества (86/609/EEC) и французской национальной хартии по этике экспериментов на животных. Все протоколы были утверждены Комитетом по этике Чарльз Дарвин и представлен в Министерство образования и научных исследований (утверждение 2015 061011367540) Франции. IBPS животных центр аккредитован французскими властями (A75-05-24).

1. предварительные соображения

Примечание: Чтобы избежать загрязнений, соответствуют следующие рекомендации до проведения одной ячейки ПЦР-после патч зажим.

  1. Не используйте плазмид, содержащие гены интереса в лаборатории, как они являются потенциальным источником загрязнения.
  2. Резерв лаборатории скамейке от зале электрофореза геля подготовить PCR.
  3. Выделите набор пипетки и устойчивостью аэрозоля фильтр советы для манипулирования ДНК и РНК при концентрациях менее 1 нг/мкл. Никогда не использовать их для анализа продуктов PCR.
  4. Всегда используйте РНКазы - и DNase бесплатных продуктов и носить перчатки.
  5. Используйте выделенный химикаты для подготовки решения внутренней фиксации. Никогда не используйте шпатель, но скорее весом бумаги для взвешивания порошков.
  6. Используйте выделенный рН электрода и рН стандартные решения, как они могут быть источником загрязнения (например, RNase).
  7. Хранить боросиликатного стекла капилляров; 20 мкл длинные, тонкой и гибкие советы; 20 мкл микропипеткой; самодельные экспеллер (патч зажим пипеткой держатель придает шприц 10 мл); 500 мкл ПЦР пробирок; 10 мкл аэрозоля устойчивостью фильтр советы; и тонкие перманентные маркеры в поле выделенные (рис. 1).

2. грунтовка дизайн

Примечание: Мультиплексной ПЦР-опирается на два шага амплификации. Во время первого PCR все гены интереса совместно размножаются путем смешивания вместе все праймеры PCR. Для обнаружения надежно транскрипты от единичных клеток, важно для разработки эффективных и селективного праймеры PCR. Использование вложенных (внутренний) грунты для второго раунда ПЦР улучшает как специфический, так и эффективности амплификации.

  1. Извлечь куратор последовательностями мРНК генов интерес к последовательности данных NCBI32 , а также их соответствующие семьи (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/).
    1. Введите имя gene(s) и видов интерес как запрос и нажмите на Проверено соответствующей последовательности.
    2. Чтобы ограничить анализ кодирующая последовательность gene(s), нажмите на Отправить (в правом верхнем углу) и выберите в качестве формата кодирования последовательностей и FASTA нуклеотидов . Затем нажмите на Создать файл и сохранить последовательность FASTA, используя расширение файла «.nt».
  2. Использование Ара программного обеспечения33 (несколько выравнивания строительство & анализ Workbench) или любого другого несколько выравнивания программного обеспечения для определения регионов гомологии.
    1. Нажмите на файл | Новый проект... и выберите тип последовательности ДНК . Чтобы импортировать последовательности гена, выберите последовательности | Импортировать последовательность... и загрузки файла «.nt». Повторите эту процедуру для всех связанных последовательностей.
    2. Щелкните и перетащите все последовательности в окне схема для выбора всей последовательности.
    3. Поиск в регионах гомологии, выбрав Выравнивание | Поиск блоков... (CTRL + S). Выберите сегмент пара перекрываются в Методе поиска. Отрегулируйте Pairwise Оценка среза относительно высокое значение (например, 1000) и мин seqs. на блок на общее количество последовательностей для выравнивания и нажмите кнопку начать.
    4. В появившемся окне Результатов поиска выберите результаты с высокий балл MP и нажмите на ссылку. Если результат не будет найден, уменьшение Pairwise Оценка среза и/или мин seqs. на блок.
    5. Для облегчения визуализации гомологичных регионов, выберите Выравнивание | Затенение | Значит, оценка.
    6. Выберите несвязанные части последовательности и повторите шаги 2.2.3–2.2.4 потенциально определить другие регионы гомологии с нижней MP-оценка.
    7. Для получения наиболее специфические праймеры, выберите регионы с наименее гомологию последовательностей.
  3. Fetch последовательности всех вариантов сращивания и повторите шаги 2.2.1–2.2.6. Выбор их общих областей для общего обнаружения. Рассмотрим альтернативные кассеты для выделенный соединитель варианты анализа20,34,35,36.
  4. Выровняйте последовательностями мРНК по геному животных моделей, с помощью взрыва37 геномов (основной инструмент поиска местных выравнивание) для определения структуры Интрон экзона генов (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).
    1. Выберите геноме мыши ДОМЕННАЯ, щелкнув мышью и загрузить проверено FASTA последовательность в разделе Ввод последовательности запроса . Выбор программывыберите оптимизировать для очень похожие последовательности (Мегавзрыв), а затем нажмите на кнопку взрыва .
    2. В разделе описания выберите выравнивание с высоким личность (до 100%). Убедитесь, что он соответствует гена интереса, как указано в особенности выравнивания раздела.
    3. Сортировать выравнивание путем запроса стартовую позицию в том же разделе для получения последовательности экзонов последовательности кодирования. Обратите внимание на начальную и конечную позиции всех хитов, которые примерно соответствуют позиции интронов на запрос последовательности (рис. 2A).
  5. Выберите два разных экзонов для чувства и antisense грунты легко дифференцировать cDNA от геномной амплификации ДНК (геномная ДНК), на основе критерия размера (рис. 2).
    Примечание: Амплификации геномная ДНК может произойти на низкой частоте, когда ядро собрано с цитоплазмой. Таким образом крайне важно разработать Интрон overspanning грунтовка пар (рис. 2A). В случае Интрон меньше генов коллекции ядра проблематично, поскольку это может привести к потенциально смешанные результаты. Для решения этой проблемы, включают в себя набор грунты, направленных на усиление intronic последовательности для проверки на наличие геномная ДНК25. Если геномной управления является положительным, результаты для всех генов Интрон менее следует отказаться.
  6. Для достижения эффективной амплификации, выберите грунтовки генерации ампликонов с длиной идеально состоит между 200 и 400 пар оснований (рис. 2).
  7. Для того чтобы усилить одновременно различные cDNAs этапе мультиплексной ПЦР, Дизайн грунты с длиной между 18 и 24 нуклеотидов и температурой плавления (Tm) между 55 и 60 ° C.
  8. Чтобы свести к минимуму образование вторичных структур, которые снижают урожайность амплификации, выберите смысл и анти чувство грунты с минимальными шпильки и дуплекс длины (рис. 2B).
  9. Дизайн внутреннего грунты, используя те же критерии (шаги 2,5-2,8).
  10. Проверка специфичности ПЦР праймеры, совместив грунтовки на базе последовательности РНК ссылка из организма с помощью нуклеотидов взрыв интереса.
    1. В результате взрыва (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) нажмите на нуклеотид взрыва. Вставьте последовательность праймера в Введите последовательность запросов.
    2. В разделе Выберите Поиск набор нажмите на других (nr и т.д.), выберите ссылку РНК последовательности (refseq_rna) в параметр базы данных и укажите организма (например, Mus musculus (taxid:10090) ) для ограничения анализа желаемый вид.
    3. В Выбор программы выберите оптимизировать для несколько аналогичных последовательностей (blastn). В разделе Параметры алгоритма уменьшите Размер слова до 7 увеличить шанс получить хиты.
  11. Для разработки избирательного грунты, храните только те, чьи последовательность имеет по крайней мере 3 несоответствия с нежелательным cDNAs, когда это возможно.
  12. Закажите обессоленной грунтовки в относительно высокой концентрацией (например, 200 мкм), чтобы обеспечить, что все внешние грунты могут быть смешаны вместе в конечной концентрации 1 мкм.

3. Подготовка реагентов RT

  1. 5 x RT-микс: подготовить в РНКазы свободной воды 400 мкл рабочего раствора смеси RT (5 x), содержащий случайных праймеров на 25 мкм и дНТФ на 2,5 мм. Сохранить эту рабочую смесь как 20 мкл аликвоты в 500 мкл трубы.
  2. 20 x Дитиотреитол (DTT): подготовка 1 мл 0,2 М DTT в РНКазы свободной воды и сохранять его как 50 мкл аликвоты.
  3. Хранить как 5 мкл аликвоты 2500 U АБС битор РНКазы (40 U/мкл) и 10,000 U обратной транскриптазы (RTase, 200 U/мкл).
  4. Для обеспечения оптимального качества RT реагентов, храните аликвоты-80 ° c. Используйте их для до 10 клеток и только на один день.

4. ПЦР проверка

  1. Подготовьте cDNAs, делая обратной транскрипции на относительно большой объем всего РНК (обычно 1 мкг) извлечено38 из структуры интереса.
    1. Не используйте пипетки выделенный для одной ячейки ПЦР-для этих предварительных шагов, но использовать пипетки РНКазы бесплатно. Разбавьте всего РНК до 1 мкг/мкл.
    2. В 500 мкл ПЦР-пробирку добавьте 1 мкл разбавленного всего РНК и 8 мкл РНКазы свободной воды. Денатурируйте при 95 ° C за 1 мин и охладить вниз по трубе на льду.
    3. Добавить 4 мкл буфера 5 x RT, поставляемый изготовителем, 4 мкл раствора смеси RT, 1 мкл RTase, 1 мкл АБС битор РНКазы и 1 мкл 200 мм DTT (см. раздел 3).
    4. Флик трубки, спина его и Инкубируйте на ночь на 37 ° C.
    5. Храните cDNAs на-80 ° C до нескольких лет. Подготовьте Алиготе cDNAs разбавляют до 1 нг/мкл всего RNAs эквивалентов.
  2. Смешать и разбавляют пипетки, посвященный одной ячейки ПЦР-каждой пары праймера на 1 мкм. Используйте 20 мкл каждого праймера смеси для 100 мкл ГКДЗ.
  3. На льду, подготовить для каждой пары праймера премикс, содержащий: вода (q.s., 80 мкл), 10 мкл 10 X буфер, 1 мкл 100 x dNTPs (50 мкм каждый), 500 – 1000 pg cDNA разводят в 1 нг/мкл и 0,5 мкл (2,5 U, 5 U/мкл) полимеразы Taq.
  4. Использование ПЦР трубы, которые плотно подходят скважин ПЦР машины для элемента оптимальной температуры. Добавьте 2 капли (~ 100 мкл) минерального масла на премикс, не касаясь стены или крышка ПЦР-пробирку.
  5. Чтобы свести к минимуму образование грунт димеры, выполните горячий старт, поместив ПЦР трубы в Термоциклер, разогретую на 95 ° C. После 30 сек, быстро высылать 20 мкл грунтовка смесь на вершине нефти.
  6. После 3 минут при 95 ° C, запустить 40 циклов (95 ° C, 30 s; 60 ° C, 30 s; 72 ° C, 35 s) последовал последний удлинение шаг в 72 ° C за 5 мин.
  7. Анализировать 10 мкл каждого продуктов ПЦР агарозы gel электрофорез (2%, вес/объем)39. Если некоторые продукты PCR не имеет ожидаемый размер, ре-дизайн другой грунтовки (см. раздел 2).
    Предупреждение: Бромид Ethidium — интеркалирующего химическое вещество, которое может вызвать мутации ДНК. Проконсультироваться с управлением безопасности перед его использованием. Всегда надевайте перчатки при его обработке. Используйте коммерчески доступных решение ethidium бромид (10 мг/мл) раствора вместо порошка для сведения к минимуму риска ингаляции. Аналогично УФ-излучения может быть вредным, поэтому убедитесь, что носить защитные очки УФ-защиты или маску. Снять загрязненную гели, советы, перчатки и буфер в контейнерах, посвященный ethidium отходов.
  8. После того, как все пары праймера индивидуально проверена, испытания мультиплекс протокол (рис. 3).
    1. Смешать и разбавленных все внешние грунтовки вместе на 1 µM. магазине мультиплекс грунтовки смешивают при-20 ° C до нескольких недель.
    2. На льду, подготовить премикс, содержащий: вода (q.s., 80 мкл), 10 мкл 10 X буфер, 1 мкл 100 x dNTPs (50 мкм каждого), 500 – 1000 pg cDNAs разводят в 1 нг/мкл и 0,5 мкл (2,5 U, 5 U/мкл) полимеразы Taq.
    3. Флик ПЦР-пробирку, спина его и добавить две капли (~ 100 мкл) минерального масла.
    4. Выполните горячий старт, как описано в шаге 4.5 с 20 мкл мультиплекс грунтовка смеси. После 3 минут при 95 ° C запустите 20 циклов PCR идентичны шаг 4.6.
    5. Подготовьте ряд ПЦР трубок идентичен количество генов для анализа. Подготовьте премикс как шаг 4.8.2, но с использованием 1 мкл первого продукта ПЦР на ген как шаблон. Настройте все тома по данным количество генов, чтобы проанализировать и рассмотреть возможность использования 10% от объема дополнительной компенсации для дозирования ошибок.
    6. Слегка встряхните, спина трубки, направить 80 мкл премиксов в каждую ПЦР-пробирку и добавить две капли (~ 100 мкл) минерального масла на трубки не касаясь стены или крышка трубки.
    7. Выполнить горячего запуска (см. шаг 4.5) высылающего 20 мкл внутренних грунтовка смеси подготовлен на шаге 4.2. Выполните 35 циклов PCR идентичны к шагу 4.6.
    8. Анализ второй продукты PCR электрофорезом геля агарозы. Убедитесь, что каждый второй ПЦР генерирует ампликон ожидаемого размера. В случае неэффективного или неспецифических амплификаций, ре-дизайн новой грунтовки (шаги 2,5 – 2.12) и проверять их (шаги 4.2 – 4,8).

5. Подготовка и проверка решения внутриклеточных патч зажим

Примечание: Следующий протокол описывается подготовка и проверка K+/gluconate на основе внутреннего решения, но практически любой тип патч зажим решения может использоваться до тех пор, пока это не препятствует эффективности RT-PCR. Перчатки является обязательным для получения свободных РНКазы внутреннего решения.

  1. Для 60 мл раствора внутренней фиксации записи Подготовьте экспромтом 10 мл 0,1 м Кох.
  2. Растворите 11.4 мг EGTA (0,5 мм окончательный) в 0,9 мл 0,1 М Кох.
  3. Добавить бесплатно РНКазы 40 мл воды и распустить 2.02 g K-глюконат (окончательный 144 мм), 143 мг HEPES (последний 10 мм) и 180 мкл 1 М MgCl2 (окончательный 3 мм).
  4. Регулировка рН 7,2, добавив ~ 6 мл 0,1 м Кох.
  5. Отрегулируйте осмолярности до 295 мОсм ~ 13 мл РНКазы свободной воды.
  6. Поскольку внутреннее решение также используется в качестве буфера для обратной транскрипции, тщательно контролировать мг2 + концентрации. Компенсировать низкой мг2 + концентрации в решении внутреннего путем добавления2 MgCl потом, чтобы добраться до конечной концентрации 2 мм в RT реакции.
  7. Для обозначения заготовленных клеток после фиксации записи, добавьте 2-5 мг/мл РНКазы свободный biocytin внутреннее решение, описанные выше (шаги 5.1 – 5.5).
  8. Фильтр (размером пор 0,22 мкм) внутреннего решения и храните его при температуре-80 ° C как 100-250 мкл аликвоты.
  9. Для проверки использования внутреннего решения для одной ячейки RT-PCR, 0.5 мкл всего РНК, разводят в 1 нг/мкл до 6 мкл раствора патч зажим и оставить его на скамейке около 30 мин.
  10. С 2 мкл микропипеткой, добавить 2 мкл 5 x RT-микс, 0.5 мкл 20 x ДДТ, 0.5 АБС битор РНКазы мкл и 0,5 мкл RTase и Инкубируйте на ночь на 37 ° C.
  11. Вращайте трубу. На льду добавьте воду (q.s., 80 мкл), 10 мкл 10 X буфер и 0,5 мкл (2,5 U, 5 U/мкл) полимеразы Taq.
  12. Выполните 40 циклов PCR с помощью набора проверенных грунтовки (шаги 4.4 – 4.6).
  13. Анализ продуктов ПЦР электрофорезом геля агарозы (см. шаг 4.7) и убедитесь, что они имеют ожидаемый размер.
    Примечание: Пропуск 0.5 мкл всего РНК и заменив его 0.5 мкл РНКазы свободной воды обеспечит, что внутреннее решение является свободной от загрязнений РНК и ДНК.

6. острый срез подготовка

Примечание: Этот протокол описывает нарезки процедуры для несовершеннолетних (то есть, менее 28 дней послеродового) Мужские и женские мышей. Другие решения резки, например на основе сахарозы искусственных спинномозговой жидкости (ФАГО) являются также использоваться40.

  1. Приготовить 2 Л фаго, содержащую (в мм) 125 NaCl, 2,5 KCl, 2 CaCl2, 1 MgCl2, 1,25 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 10 глюкозы и 15 сахарозы. Чтобы уменьшить глутаматергические активности во время подготовки срез, приготовляют раствор резки, добавив 1 мм Кинуреновая кислота.
  2. До нарезки, подготовьте рассечение комплект, содержащий хирургические ножницы, ножницы штраф Ирис, две лопатки, щипцы, диск бумажный фильтр и Цианакрилатный клей.
  3. Используйте ледяной резки раствор, насыщенный O2/CO2 (95% / 5%) и охлаждения режущей камеры при-20 ° C.
  4. Анестезировать мыши небольшой бумажной салфеткой, смоченной изофлюрановая. После ~ 2 мин убедитесь, что указатель мыши находится под глубокой анестезии, проверяя отсутствие ответа на лапу щепотку.
  5. Быстро обезглавить мышь. Удалите головы и открыть черепа. Осторожно извлеките мозга и поместите его в небольшой стакан, наполненный ледяной (~ 4 ° C) резки раствор кислородом с O2/CO2.
  6. Удалите режущей камеры от условий-20 ° C и влажности с бумажным полотенцем.
  7. Тщательно анализировать мозг, чтобы изолировать области интереса, приклейте его на режущей камеры и добавить решение ледяной Резка кислородом с O2/CO2.
  8. Вырежьте 300 мкм толстые ломтики с помощью vibratome. Передача их при комнатной температуре в камере покоя, наполненный кислородом резки решения и дать им возможность восстановить для по крайней мере 0,5 ч.

7. одной ячейки ПЦР-после записи патч зажим

  1. Очистить перфузии системы регулярно с ~ 100 мл 30% H2O2 решения и сполосните широко ~ 500 мл дистиллированной воды, чтобы избежать роста бактерий, как это забывают источником загрязнения РНКазы.
  2. Хлорирование накаливания с патч пипетки, заполнены с концентрированной отбеливатель уборочной каждый день. Не используйте микропипеткой для заполнения пипеткой патч, но скорее 20 мкл длинные, штраф, гибкий наконечник прилагается к 1 мл шприц. Затем промойте его широко РНКазы бесплатную воду и насухо тряпкой газа.
  3. Подготовьте небольшую коробку льда, содержащих 5 x 20 x DTT аликвоты и RT-микс. Магазин RTase и РНКазы ингибитор аликвоты при-20 ° C в benchtop прохладнее.
  4. Передача ломтик в записи камеру увлажненную на 1 – 2 мл/мин с кислородом фаго.
  5. Вытяните патч пипетки (1 – 2 мкм открыть диаметра кончика, 3-5 MΩ) из боросиликатного стекла при ношении перчатки и заполнить один из них с 8 мкл внутреннего решения. Имейте в виду, что ручки пулера тележки пипеткой являются источником загрязнения РНКазы.
  6. Поместите пипеткой в пипетку держатель во время новых перчатках и не касаясь накаливания с пальцами.
  7. Подход патч пипетку с положительным давлением и выполнять запись поклеточного характеризовать целевых клеток (рис. 4).
  8. Чтобы сохранить мРНК, ограничивайте время, в целом ячейки конфигурации до 20 мин41.
  9. В конце записи, подготовить 500 мкл ПЦР-пробирку заполнены с 2 мкл 5 x RT Mix 0.5 мкл 20 x DTT, спина его и хранить его на льду.
  10. Урожай в цитоплазму клетки путем применения нежный отрицательного давления (рис. 4). Визуально управления, что содержимое ячейки приходит внутри пипеткой при сохранении герметичное уплотнение.
    1. Избегайте как можно больше собирать ядро, если некоторые гены Интрон менее считаются. В таком случае всегда включайте набор праймеров, направленных на усилительных геномная ДНК для геномной загрязнения.
    2. Если ядро приближается к кончиком пипетки, отпустите отрицательное давление и переместите пипетку от ядра. Обеспечить сохранение герметичности и перезапустите собирать в цитоплазму на новом месте пипеткой.
  11. Остановите сбор когда идет не больше материала и/или до потери герметичности.
  12. Снять пипеткой нежно сформировать вне из патч ограничить загрязнение, внеклеточная мусора (Рисунок 4) и в пользу закрытие клеточной мембраны для последующего гистохимический анализ.
  13. Имейте в виду, что ручки, микроманипуляторы, клавиатуры компьютера, или компьютерной мыши являются потенциальными источниками загрязнения РНКазы. Если они были затронуты во время записи, измените перчатки.
  14. Придавать экспеллер пипетки и изгнать его содержание в ПЦР-пробирку, применяя положительное давление (рис. 1).
  15. Разбейте кончиком пипетки ПЦР-пробирку для коллекции его содержание.
  16. Кратко центрифуга трубки, добавить 0,5 мкл битор РНКазы и 0,5 мкл RTase, осторожно перемешать, центрифуга снова и Инкубируйте на ночь на 37 ° C.
  17. Спина трубки и хранить его на-80 ° C до несколько месяцев до ПЦР анализа.
  18. Выполните первый шаг амплификации непосредственно в пробирку, содержащую ~ 10 мкл RT продуктов путем добавления воды (q.s., 80 мкл), 10 мкл 10 x буфер и 0,5 мкл (2,5 U) полимеразы Taq. Затем следуйте инструкциям, описанным в шагах 4.8.2–4.8.8.

8. гистохимические пятнать записанные ячейки (опционально)

  1. После электрофизиологических записи поддерживать срез для 20 мин в насыщенной кислородом фаго разрешить распространение biocytin в дереве аксональное и дендритных.
  2. Место среза в хорошо 24-ну пластины и исправить его на ночь при 4 ° C с 1 мл 4% параформальдегида в 0,1 М фосфатного буфера.
  3. Вымойте ломтики 4 раза, 5 минут каждый, с 1 мл Фосфатный Buffered (PBS).
  4. В том же хорошо, разрушения и насыщают среза в течение 1 ч при комнатной температуре с 1 мл раствора PBS с 0,25% Тритон X-100 и 0,2% желатина из холодной воды рыба кожи (PBS-GT).
  5. Инкубируйте на ночь с дневно обозначенные авидин разбавлять на 1/400 в 250 – 500 мкл PBS-GT.
  6. Мыть 5 раз, 5 минут каждая, с 1 мл раствора PBS и смонтировать ломтики.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Представитель проверки мультиплексной ПЦР-это показано на рисунке 3. Протокол был разработан одновременно зонда выражение 12 различных генов. Глутамата Везикулярный транспортер vGluT1 было принято как позитивный элемент управления для глутаматергические нейронов42. ГАМК синтеза ферментов (GAD65 и GAD 67), нейропептида Y (NPY) и соматостатина (SOM) были использованы в качестве маркеров ГАМК интернейронов3,5,11. Фермента циклооксигеназы-2 (ЦОГ-2) был использован в качестве маркера в пирамидальной клетке подгрупп населения3,16.

ATP1α1-3 подразделения из Na+/k+ АТФаза и Kir6.2 и SUR1 подразделения СПС чувствительных K+ каналов были выбраны для оценки взаимосвязи между нейронной активности и метаболизма государств43. Так как Kir6.2 ген Интрон менее, Интрон сом был включен в качестве геномной управления. Протокол был протестирован на 1 нг обратной транскрипции всего РНК, извлеченные из весь мозг мыши, который приблизительно соответствует стенограммы 20 клеток44. Мультиплексной ПЦР производится 12 ампликонов ожидаемого размера (рис. 3 и Таблица 1) демонстрирует чувствительность и эффективности протокола. Отрицательный контроль, проводимый без РНК производится не ампликон (данные не показаны).

Пирамидальный нейрон слоя V визуально идентифицировали его большой сома и видные апикальных дендритов (Рисунок 5A, вставка). Вся ячейка записи показали типичные электрофизиологические свойства слоя V регулярные пики нейронов5,45,46 с, особенно, низкое входное сопротивление, потенциалы действия долгосрочных и выраженным Спайк Адаптация частоты (Рисунок 5A). Молекулярный анализ этот нейрон выявил выражение vGluT1 (Рисунок 5B), подтверждающие его глутаматергические фенотип42,46. Этот нейрон также выразил сом, ATP1α1 и 3 субблоки Na+/k+ АТФаза. Biocytin маркировка записанные нейронов подтвердил пирамидальной морфологии (рис. 5 d).

Как и ожидалось от глутаматергические нейронов, молекулярный анализ 26 слой V пирамидных клеток показали выражение VGluT1, но ни один из двух GADs (рис. 5 c). Маркеры интернейронов редко наблюдались5,42,46. ЦОГ-2, главным образом выраженные слоя пирамидальных клеток II-III3,16, не был обнаружен в слой V пирамидальных клеток. Чаще наблюдается чем субъединица ATP1α23ATP1α1 и 3 подразделения. Kir6.2 и SUR1 подразделения редко были обнаружены в пирамидных нейронов слоя V, которая согласуется с их преференциальных выражение в верхних слоях3,43. Уход был доставлен не урожай ядер, что приводит к редким обнаружения интронов сом (3 из 26 клетки, то есть, 12%).

Figure 1
Рисунок 1: Специальный ящик для одной ячейки ПЦР-. Список материалов, зарезервированы для RT-PCR после патч зажим. (1) капилляры боросиликатное стекло, (2) 20 мкл длинные, штраф, гибкие советы, (3) 20 мкл микропипеткой, (4) домашний экспеллер, (5) 500 мкл ПЦР трубы, (6) 10 мкл аэрозоля устойчивостью фильтр советы и (7) перманентные маркеры. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2: стратегия дизайн праймера PCR. (A) схематическое представление кодирующая последовательность кДНК ЦОГ 2 соответствие последовательности хромосоме 2 мыши, содержащие кокс 2 гена. Экзонов представлены черные ящики и интронов на геномная ДНК в белые коробки. Обратите внимание на пробелы в соответствующие intronic последовательности на геномная ДНК cDNA. Типичные примеры плохих и хороших олигонуклеотиды, представлены как красные и зеленые стрелки, соответственно. Стрелки вправо и влево обозначения прямого и обратного грунтовки. (B) последовательности и вторичные структуры олигонуклеотиды, показано в (A). Левой и правой панелями указывают шпилька self взаимодополняемости и self димера формирования, соответственно. B1 олигонуклеотида отображает оба сильные шпилька self взаимодополняемости и димеров формирования в то время как B2 олигонуклеотида показывает только димер формирования. B3 и B4 олигонуклеотиды имеют не шпильки self взаимодополняемости и никакое образование димера; они являются Интрон overspanning (A) и были выбраны в качестве потенциальных праймеры PCR (см. таблицу 1). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3: Проверка мультиплексной ПЦР. 1 нг всего РНК от мыши весь мозг был подвергнут обратной транскрипции, следуют два раунда амплификации PCR. 12 продукты PCR были урегулированы в отдельные полосы электрофорезом геля агарозы параллельно с Φx174 усваивается ХэIII. Второй продукты PCR было размеров (в bp) предсказано в последовательности: 153 (vGluT1), 248 (GAD65), 255 (GAD67), 181 (ЦОГ-2), 220 (NPY), 146 (СОМ), 183 (ATP1a1), 213 (ATP1a2), 128 (ATP1a3), 342 (Kir6.2), 211 (SUR1) и 182 (intсом). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4: патч зажим заготовки в срезах мозга. После того, как клетки визуально идентифицировали, запись пипеткой подошел с положительным давлением во избежание загрязнения сотовой мусора на кончике пипеткой. Обратите внимание, ямочка на мембране Этот нейрон. Положительное давление затем прервали сформировать придает ячейки конфигурации с Gigaohm герметичное уплотнение. Краткий нагнетите применяются переключиться поклеточного конфигурации. В конце записи цитоплазме добывается путем применения нежный отрицательное давление в пипетку при сохранении герметичное уплотнение. Во время уборочной процедуры обратите внимание усадка клетки тела. Затем записи пипеткой осторожно снимается сформировать вне out патч, который способствует клеточной мембраны закрытия для последующих biocytin откровение и сохранение собранного материала в пипетку патч. Воспроизводится с Cauli и Lambolez47 , с разрешения от Королевского общества химии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 5
Рисунок 5: характеристика кортикальное пирамидных клеток слой V. (A) мембрана потенциальный ответ слой V пирамидальной клетке вызванные импульсов тока -100, -40, -10, 60, 120 и 500 Па (следы снизу). Нейрон отображает слабый потенциал прогиб после первоначальной гиперполяризирующий реакции (верхняя следы). В ответ надпорогового деполяризации нейрон выполняет долгосрочные потенциалы действия с медленно развивающейся после гиперполяризации (верхняя трассировки). Вблизи насыщения нейрон сбрасываются с низкой частотой и выставлены произносится адаптации (верхняя серая трассировки). Врезные: инфракрасной фотографии записанные слой V Пирамидальный нейрон. Сетчаточных поверхности — вверх. Линейки: 20 µm. (B) мультиплексной ПЦР-анализ выявления выражение vGluT1, сом, ATP1α1 и ATP1α3. (C) профиль выражение гена в выборке из 26 слой V пирамидных клеток. vGluT1 была выражена в всех нейронов, в то время как GAD65, GAD67 и COX2 никогда не были обнаружены. Редко наблюдались NPY, сом, Kir6.2, SUR1 и сомint . Пирамидных клеток выражена ATP1α3, 1 субблок Na+/k+ АТФаза и ATP1α2 в меньшей степени. (D) максимум интенсивности проекция конфокальный изображения показаны biocytin маркировки нейрона записан в (A). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Джин / GenBank номер Внешние праймеры Размер (bp) Внутренняя праймеры Размер (bp)
vGlut1
NM_182993		 Чувство,-113 259 Смысле, -54 153
GGCTCCTTTTTCTGGGGCTAC ATTCGCAGCCAACAGGGTCT
Анти чувство, 126 Анти чувство, 79
CCAGCCGACTCCGTTCTAAG TGGCAAGCAGGGTATGTGAC
GAD65
NM_008078		 Чувство, 99 375 Чувство, 219 248
CCAAAAGTTCACGGGCGG CACCTGCGACCAAAAACCCT
Анти чувство, 454 Анти чувство, 447
TCCTCCAGATTTTGCGGTTG GATTTTGCGGTTGGTCTGCC
GAD67
NM_008077		 Чувство, 529 598 Чувство, 801 255
TACGGGGTTCGCACAGGTC CCCAGAAGTGAAGACAAAAGGC
Анти чувство, 1109 Анти чувство, 1034
CCCAGGCAGCATCCACAT AATGCTCCGTAAACAGTCGTGC
КОКС 2
NM_011198		 Чувство, 199 268 Чувство, 265 181
CTGAAGCCCACCCCAAACAC AACAACATCCCCTTCCTGCG
Анти чувство, 445 Анти чувство, 426
CCTTATTTCCCTTCACACCCAT TGGGAGTTGGGCAGTCATCT
NPY
NM_023456		 Чувство, 16 294 Чувство, 38 220
CGAATGGGGCTGTGTGGA CCCTCGCTCTATCTCTGCTCGT
Анти чувство, 286 Анти чувство, 236
AAGTTTCATTTCCCATCACCACAT GCGTTTTCTGTGCTTTCCTTCA
СОМ
NM_009215		 Чувство, 43 208 Чувство, 75 146
ATCGTCCTGGCTTTGGGC GCCCTCGGACCCCAGACT
Анти чувство, 231 Анти чувство, 203
GCCTCATCTCGTCCTGCTCA GCAAATCCTCGGGCTCCA
ATP1Α1
NM_144900 		Чувство, 1287 288 Чувство, 1329 183
CAGGGCAGTGTTTCAGGCTAA TAAGCGGGCAGTAGCGGG
Анти чувство, 1556 Анти чувство, 1492
CCGTGGAGAAGGATGGAGC AGGTGTTTGGGCTCAGATGC
ATP1Α2
NM_178405		 Чувство, 1392 268 Чувство, 1430 213
AGTGAGGAAGATGAGGGACAGG AAATCCCCTTCAACTCCACCA
Анти чувство, 1640 Анти чувство, 1623
ACAGAAGCCCAGCACTCGTT GTTCCCCAAGTCCTCCCAGC
ATP1Α3
NM_144921		 Чувство, 127 216 Чувство, 158 128
CGGAAATACAATACTGACTGCGTG TGACACACAGTAAAGCCCAGGA
Анти чувство, 324 Анти чувство, 264
GTCATCCTCCGTCCCTGCC CCACAGCAGGATAGAGAAGCCA
Kir6.2
NM_010602		 Чувство, 306 431 Чувство, 339 342
CGGAGAGGGCACCAATGT CATCCACTCCTTTTCATCTGCC
Анти чувство, 719 Анти чувство, 663
CACCCACGCCATTCTCCA TCGGGGCTGGTGGTCTTG
SUR1
NM_011510		 Чувство, 1867 385 Чувство, 2041 211
CAGTGTGCCCCCCGAGAG ATCATCGGAGGCTTCTTCACC
Анти чувство, 2231 Анти чувство, 2231
GGTCTTCTCCCTCGCTGTCTG GGTCTTCTCCCTCGCTGTCTG
SOMint
X51468		 Чувство, 8 240 Чувство, 16 182
CTGTCCCCCTTACGAATCCC CTTACGAATCCCCCAGCCTT
Анти чувство, 228 Анти чувство, 178
CCAGCACCAGGGATAGAGCC TTGAAAGCCAGGGAGGAACT

Таблицы 1. Последовательности первой и второй ПЦР праймеры. Положение каждого праймера PCR и их последовательностей даны от 5' к 3'. За исключением Интрон соматостатина позиции 1 соответствует первой базы кодон начала каждого гена.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Одной ячейке мультиплексной ПЦР-после того, как патч зажим можно одновременно и надежно зонд выражение более чем 30 генов в клетки electrophysiologically выявленных5. Анализ экспрессии генов на уровне отдельной ячейки требует высокоэффективных праймеры PCR. Одним из наиболее ограничивающим шагов является сбор содержимого ячейки. Его эффективность зависит от диаметра кончика пипетки патч, который должен быть максимально сопоставления размера ячейки. Пипетки с открытым наконечником диаметром 1-2 мкм оказались подходящими для наиболее нейрональных типов. Важно также, чтобы убедиться, что собирается только клеточного содержания и не на окружающие ткани. Это достигается путем контроля electrophysiologically сохранение герметичности во время сбора урожая. Формирование патч вне из конфигурации во время вывода пипеткой далее защищает заготовленной цитоплазме от сотовой мусора. Коэффициент успеха одну ячейку, которую мультиплексной ПЦР-зависит также от mRNAs обилие типа исследуемых клеток. Например урожайность, полученные с астроциты, которые выражают mRNAs в относительно малых количествах3, обычно ниже, чем полученные с нейронами и таким образом требует увеличения выборки размер15,16. Обратная транскрипция, который имеет низкую эффективность в трубы48, ограничивающим реакция одной ячейки мультиплексной ПЦР. Поэтому важно использовать высококачественные реагенты, чтобы хранить их как аликвоты-80 ° c и использовать их только на один день. Наконец ДНК-полимеразной активности RTase является часто упускается из виду источником формирования грунт димер. Для решения этой проблемы, выполняя горячий старт с праймерами имеет решающее значение для повышения эффективности амплификации. Кроме того, это позволит снизить ингибирующее влияние RTase на активность полимеразы дна Taq49.

Одноячеистый мультиплексной ПЦР-техника чрезвычайно универсальным. Он широко использовался в грызунов10,11,13,19,20,34,50,51,52 ,53,54 , но может быть адаптирована к практически все животные модели и гены, предполагая, что ткани и генные последовательности доступны. Различные решения фиксации может использоваться до тех пор, пока они не мешают RT-PCR на сотовый бесплатно анализов. К примеру внутреннего решения, основанные на K+ или Cs+ катионов, Cl– или глюконат были успешно используется6,,3641,55.

Классическая ложные отрицательные результаты обусловлены РНКазы загрязнение патч пипеткой накаливания и/или внутренней фиксации решение. Тщательно хлорирующие нити накала и проверку внутреннего решения обычно решить эту проблему. Ложные отрицательные результаты также может произойти, когда ген выражается на уровне низких одну ячейку, поскольку лишь часть цитоплазмы собирают. Качество уборки может быть увеличен с использованием более крупных пипетки и/или сокращая время записи поклеточного. Качество уборки можно оценить путем включения гена известен выражаться на низком уровне в одиночных клетках20. Ложных положительных результатов может произойти с плохой ткани качества, в котором количество загрязняющих сотовой мусора является высоким. Проверка наличия мусора делается путем вставки патч пипетку в фрагмент без выполнения каких-либо печать и выпускать положительным давлением до удаления пипеткой. Наличие материалов мы затем исследовали мультиплексной ПЦР-42. Праймером пипеткой патч также используется для уменьшения коллекции внеклеточного загрязнители56. Одноячеистый PCR является очень чувствительной технологией, которые можно обнаружить лишь одну копию двойной мель ДНК57. В случае Интрон меньше генов геномная ДНК, содержащихся в ядро может также производить ложных срабатываний. Избегая коллекции геномная ДНК, поместив пипетки от ядра во время уборочной помогает решить эту проблему. Присутствие геномная ДНК может быть надежно исследован путем усиления intronic последовательность25.

Обнаружение молекул мРНК, RT-PCR становится ненадежным в 10 копий44, предположительно из-за низкой эффективности RTase48и может привести к под обнаружения низкого изобилие стенограммы26,42. Это может быть проблематичным в случае Интрон менее генов. Действительно избегая урожай ядра уменьшает количество цитоплазмы, которые могут быть собраны и поэтому чувствительность обнаружения. Сочетание одной ячейки ПЦР-после того, как патч зажим с biocytin маркировки требует, чтобы форма ячейки сохраняется как можно больше (рис. 3). Неизбежно это уменьшает количество материала, которые могут быть собраны, тем самым снижая уровень успеха. Компромисс между цитоплазме сбор и сохранение морфологии клеток является обязательным.

Мультиплексной ПЦР-ячеек не носят количественный характер, поскольку они только дают информацию о том, являются ли cDNAs представить или отсутствует в собранного материала. Однако из-за пределов обнаружения, описанных выше, возникновение обнаружения на уровне населения может отражать обилие генов на уровне отдельной ячейки. Альтернативные подходы позволяют более количественных данных, но технических ограничений, налагаемых их конкретных усиления стратегии (т.е., относительной количественной гомологичных генов или RT-ПЦР) во многом ограничить количество гены, которые могут быть одновременно анализируется41,53,55,,5859,60,,6162,63 ,64,,6566. Последние сочетание патч зажим записей и одной ячейке RNaseq, именуемый патч seq30,31, позволяет анализ количественных транскриптомики electrophysiologically характеризуется клеток. Это новый и перспективный подход, но она требует доступа к высок объём секвенсорами и формирования данных требуют много времени анализа.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgments

Мы благодарим д-р Александр Mourot за его замечания по рукописи. Эта работа была поддержана от грантов от Agence Nationale de la Recherche (НРУ 2011 MALZ 003 01; ANR-15-CE16-0010 и АНР-17-CE37-0010-03), BLG поддерживается стипендий от Fondation pour la Recherche sur Альцгеймера. Мы благодарим животных фонда IBPS (Париж, Франция).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MACAW v.2.0.5 NCBI Multiple alignement for primer design
Dithiothreitol VWR 443852A RT
Random primers Sigma-Aldrich (Merck) 11034731001 RT
dNTPs GE Healthcare Life Sciences 28-4065-52 RT and PCR
RNasin Ribonuclease Inhibitors Promega N2511 RT
SuperScript II Reverse Transcriptase Invitrogen 18064014 RT
Taq DNA Polymerase Qiagen 201205 PCR
Mineral Oil Sigma-Aldrich (Merck) M5904-5ML PCR
PCR primers Sigma-Aldrich (Merck) PCR / desalted and diluted at 200 µM
Tubes, 0.5 mL, flat cap ThermoFisher Scientific AB0350 RT and PCR
BT10 Series - 10 µL Filter Tip Neptune Scientific BT10 RT and PCR
BT20 Series - 20 µL Filter Tip Neptune Scientific BT20 RT and PCR
BT200 Series - 200 µL Filter Tip Neptune Scientific BT200 RT and PCR
BT1000 Series - 1000 µL Filter Tip Neptune Scientific BT1000.96 RT and PCR
DNA Thermal Cylcer Perkin Elmer Cetus PCR
Ethidium Bromide Sigma-Aldrich (Merck) E1510-10ML Agarose gel electrophoresis
Tris-Borate-EDTA buffer Sigma-Aldrich (Merck) T4415-1L Agarose gel electrophoresis
UltraPure Agarose Life Technologies 16500-500 Agarose gel electrophoresis
ΦX174 DNA-Hae III Digest NEB (New England BioLabs) N3026S Agarose gel electrophoresis
EDA 290 Kodak Agarose gel electrophoresis
Electrophoresis Power supply EPS 3500 Pharmacia Biotech Agarose gel electrophoresis
Midi Horizontal Elecrophoresis Unit Model SHU13 Sigma-Aldrich (Merck) Agarose gel electrophoresis
Smooth paper with satin appearance Fisherbrand 1748B Patch clamp internal solution
Potassium Hydroxyde Sigma-Aldrich (Merck) 60377 Patch clamp internal solution
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid Sigma-Aldrich (Merck) E3889 Patch clamp internal solution
HEPES Sigma-Aldrich (Merck) H4034 Patch clamp internal solution
Potassium D-gluconate Sigma-Aldrich (Merck) G4500 Patch clamp internal solution
Magnesium chloride solution Sigma-Aldrich (Merck) M1028 Patch clamp internal solution
5500 Vapor Pressure Osmometer Wescor Patch clamp internal solution
Biocytin Sigma-Aldrich (Merck) B4261 Patch clamp internal solution
Sucrose Sigma-Aldrich (Merck) S5016 Slice preparation
D-(+)-Glucose monohydrate Sigma-Aldrich (Merck) 49159 Slice preparation
Sodium chloride Sigma-Aldrich (Merck) S6191 Slice preparation
Potassium chloride Sigma-Aldrich (Merck) 60128 Slice preparation
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich (Merck) 31437-M Slice preparation
Sodium phosphate monobasic Sigma-Aldrich (Merck) S5011 Slice preparation
Magnesium chloride solution Sigma-Aldrich (Merck) 63069 Slice preparation
Calcium chloride solution Sigma-Aldrich (Merck) 21115 Slice preparation
Kynurenic acid Sigma-Aldrich (Merck) K3375 Slice preparation
Isoflurane Piramal Healthcare UK Slice preparation
VT 1000S Leica Biosystems 14047235613 Slice preparation
Hydrogen peroxide solution Sigma-Aldrich (Merck) H1009 Patch Clamp set-up cleaning
Thin Wall Glass Capillaries with filament World Precision Instruments TW150F-4 Patch Clamp
PP-83 Narishige Patch Clamp
Eppendorf Microloader Eppendorf 5242956003 Patch Clamp
BX51WI Upright microscope Olympus Patch Clamp
XC-ST70/CE CCD B/W VIDEO CAMERA Sony Patch Clamp
Axopatch 200B Amplifier Molecular Devices Patch Clamp
Digidata 1440 Molecular Devices Patch Clamp
pCLAMP 10 software suite Molecular Devices Patch Clamp
10 mL syringe Terumo SS-10ES Expelling
E Series with Straight Body (Holder) Phymep 64-0997 Expelling
Sodium phosphate dibasic Sigma-Aldrich (Merck) S7907 Histochemical revelation
Sodium phosphate monobasic Sigma-Aldrich (Merck) S8282 Histochemical revelation
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich (Merck) P6148 Histochemical revelation
Triton X-100 Sigma-Aldrich (Merck) X100 Histochemical revelation
Gelatin from cold water fish skin Sigma-Aldrich (Merck) G7041 Histochemical revelation
Streptavidin, Alexa Fluor 488 conjugate ThermoFisher Scientific S11223 Histochemical revelation
24-well plate Greiner Bio-One 662160 Histochemical revelation

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ascoli, G. A., et al. Petilla terminology: nomenclature of features of GABAergic interneurons of the cerebral cortex. Nat.Rev.Neurosci. 9 (7), 557-568 (2008).
  2. DeFelipe, J., et al. New insights into the classification and nomenclature of cortical GABAergic interneurons. Nat.Rev.Neurosci. , (2013).
  3. Tasic, B., et al. Adult mouse cortical cell taxonomy revealed by single cell transcriptomics. Nat.Neurosci. , (2016).
  4. Zeisel, A., et al. Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq. Science. , (2015).
  5. Cauli, B., et al. Classification of fusiform neocortical interneurons based on unsupervised clustering. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 97 (11), 6144-6149 (2000).
  6. Cauli, B., et al. Molecular and physiological diversity of cortical nonpyramidal cells. J.Neurosci. 17 (10), 3894-3906 (1997).
  7. Férézou, I., et al. 5-HT3 receptors mediate serotonergic fast synaptic excitation of neocortical vasoactive intestinal peptide/cholecystokinin interneurons. J. Neurosci. 22 (17), 7389-7397 (2002).
  8. Cauli, B., et al. Cortical GABA interneurons in neurovascular coupling: relays for subcortical vasoactive pathways. J.Neurosci. 24 (41), 8940-8949 (2004).
  9. Wang, Y., Gupta, A., Toledo-Rodriguez, M., Wu, C. Z., Markram, H. Anatomical, physiological, molecular and circuit properties of nest basket cells in the developing somatosensory cortex. Cereb.Cortex. 12 (4), 395-410 (2002).
  10. Wang, Y., et al. Anatomical, physiological and molecular properties of Martinotti cells in the somatosensory cortex of the juvenile rat. J.Physiol. 561 (Pt 1), 65-90 (2004).
  11. Karagiannis, A., et al. Classification of NPY-expressing neocortical interneurons. J.Neurosci. 29 (11), 3642-3659 (2009).
  12. Battaglia, D., Karagiannis, A., Gallopin, T., Gutch, H. W., Cauli, B. Beyond the frontiers of neuronal types. Front Neural Circuits. 7, 13 (2013).
  13. Toledo-Rodriguez, M., et al. Correlation maps allow neuronal electrical properties to be predicted from single-cell gene expression profiles in rat neocortex. Cereb.Cortex. 14 (12), 1310-1327 (2004).
  14. Toledo-Rodriguez, M., Goodman, P., Illic, M., Wu, C., Markram, H. Neuropeptide and calcium binding protein gene expression profiles predict neuronal anatomical type in the juvenile rat. J.Physiol. , (2005).
  15. Lecrux, C., et al. Pyramidal neurons are "neurogenic hubs" in the neurovascular coupling response to whisker stimulation. J.Neurosci. 31 (27), 9836-9847 (2011).
  16. Lacroix, A., et al. COX-2-derived prostaglandin E2 produced by pyramidal neurons contributes to neurovascular coupling in the rodent cerebral cortex. J.Neurosci. 35 (34), 11791-11810 (2015).
  17. Matthias, K., et al. Segregated expression of AMPA-type glutamate receptors and glutamate transporters defines distinct astrocyte populations in the mouse hippocampus. J.Neurosci. 23 (5), 1750-1758 (2003).
  18. Rancillac, A., et al. Glutamatergic control of microvascular tone by distinct gaba neurons in the cerebellum. J.Neurosci. 26 (26), 6997-7006 (2006).
  19. Miki, T., et al. ATP-sensitive K+ channels in the hypothalamus are essential for the maintenance of glucose homeostasis. Nat.Neurosci. 4 (5), 507-512 (2001).
  20. Liss, B., Bruns, R., Roeper, J. Alternative sulfonylurea receptor expression defines metabolic sensitivity of K-ATP channels in dopaminergic midbrain neurons. EMBO J. 18 (4), 833-846 (1999).
  21. Gallopin, T., et al. Identification of sleep-promoting neurons in vitro. Nature. 404 (6781), 992-995 (2000).
  22. Gallopin, T., et al. The endogenous somnogen adenosine excites a subset of sleep-promoting neurons via A2A receptors in the ventrolateral preoptic nucleus. Neuroscience. 134 (4), 1377-1390 (2005).
  23. Fernandez, S. P., et al. Multiscale single-cell analysis reveals unique phenotypes of raphe 5-HT neurons projecting to the forebrain. Brain Struct.Funct. , (2015).
  24. Porter, J. T., et al. Selective excitation of subtypes of neocortical interneurons by nicotinic receptors. J.Neurosci. 19 (13), 5228-5235 (1999).
  25. Hill, E. L., et al. Functional CB1 receptors are broadly expressed in neocortical GABAergic and glutamatergic neurons. J.Neurophysiol. 97 (4), 2580-2589 (2007).
  26. Férézou, I., et al. Extensive overlap of mu-opioid and nicotinic sensitivity in cortical interneurons. Cereb.Cortex. 17 (8), 1948-1957 (2007).
  27. Hu, E., et al. PACAP act at distinct receptors to elicit different cAMP/PKA dynamics in the neocortex. Cereb.Cortex. 21 (3), 708-718 (2011).
  28. Louessard, M., et al. Tissue plasminogen activator expression is restricted to subsets of excitatory pyramidal glutamatergic neurons. Mol.Neurobiol. , (2015).
  29. Stuart, G. J., Dodt, H. U., Sakmann, B. Patch-clamp recordings from the soma and dendrites of neurons in brain slices using infrared video microscopy. Pflugers Arch. 423 (5-6), 511-518 (1993).
  30. Cadwell, C. R., et al. Electrophysiological, transcriptomic and morphologic profiling of single neurons using Patch-seq. Nat.Biotechnol. 34 (2), 199-203 (2016).
  31. Fuzik, J., et al. Integration of electrophysiological recordings with single-cell RNA-seq data identifies neuronal subtypes. Nat.Biotechnol. 34 (2), 175-183 (2016).
  32. O'Leary, N. A., et al. Reference sequence (RefSeq) database at NCBI: current status, taxonomic expansion, and functional annotation. Nucleic Acids Res. 44, D733-D745 (2016).
  33. Schuler, G. D., Altschul, S. F., Lipman, D. J. A workbench for multiple alignment construction and analysis. Proteins. 9 (3), 180-190 (1991).
  34. Ruano, D., Lambolez, B., Rossier, J., Paternain, A. V., Lerma, J. Kainate receptor subunits expressed in single cultured hippocampal neurons: molecular and functional variants by RNA editing. Neuron. 14 (5), 1009-1017 (1995).
  35. Porter, J. T., et al. Properties of bipolar VIPergic interneurons and their excitation by pyramidal neurons in the rat neocortex. Eur.J.Neurosci. 10 (12), 3617-3628 (1998).
  36. Ruano, D., Perrais, D., Rossier, J., Ropert, N. Expression of GABA(A) receptor subunit mRNAs by layer V pyramidal cells of the rat primary visual cortex. Eur.J.Neurosci. 9 (4), 857-862 (1997).
  37. Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J. Basic local alignment search tool. J.Mol.Biol. 215 (3), 403-410 (1990).
  38. Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate- phenol-chloroform extraction. Anal Biochem. 162 (1), 156-159 (1987).
  39. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J.Vis.Exp. (62), (2012).
  40. Liss, B., et al. K-ATP channels promote the differential degeneration of dopaminergic midbrain neurons. Nat.Neurosci. 8 (12), 1742-1751 (2005).
  41. Lambolez, B., Audinat, E., Bochet, P., Crepel, F., Rossier, J. AMPA receptor subunits expressed by single Purkinje cells. Neuron. 9 (2), 247-258 (1992).
  42. Gallopin, T., Geoffroy, H., Rossier, J., Lambolez, B. Cortical sources of CRF, NKB, and CCK and their effects on pyramidal cells in the neocortex. Cereb.Cortex. 16 (10), 1440-1452 (2006).
  43. Cunningham, M. O., et al. Neuronal metabolism governs cortical network response state. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 103 (14), 5597-5601 (2006).
  44. Tsuzuki, K., Lambolez, B., Rossier, J., Ozawa, S. Absolute quantification of AMPA receptor subunit mRNAs in single hippocampal neurons. J.Neurochem. 77 (6), 1650-1659 (2001).
  45. McCormick, D. A., Connors, B. W., Lighthall, J. W., Prince, D. A. Comparative electrophysiology of pyramidal and sparsely spiny stellate neurons of the neocortex. Journal of Neurophysiology. 54 (4), 782-806 (1985).
  46. Andjelic, S., et al. Glutamatergic nonpyramidal neurons from neocortical layer VI and their comparison with pyramidal and spiny stellate neurons. J.Neurophysiol. 101 (2), 641-654 (2009).
  47. Cauli, B., Lambolez, B. Chapter 9: Gene Analysis of Single Cells. Unravelling Single Cell Genomics: Micro and Nanotools. Bontoux, N., Potier, M. C. , RSC publishing. Cambridge. 81-92 (2010).
  48. Bontoux, N., et al. Integrating whole transcriptome assays on a lab-on-a-chip for single cell gene profiling. Lab Chip. 8 (3), 443-450 (2008).
  49. Sellner, L. N., Coelen, R. J., Mackenzie, J. S. Reverse transcriptase inhibits Taq polymerase activity. Nucleic Acids Res. 20 (7), 1487-1490 (1992).
  50. Perrenoud, Q., Rossier, J., Geoffroy, H., Vitalis, T., Gallopin, T. Diversity of GABAergic interneurons in layer VIa and VIb of mouse barrel cortex. Cereb.Cortex. , (2012).
  51. Tricoire, L., et al. Common origins of hippocampal ivy and nitric oxide synthase expressing neurogliaform cells. J.Neurosci. 30 (6), 2165-2176 (2010).
  52. Cea-del Rio, C. A., et al. M3 muscarinic acetylcholine receptor expression confers differential cholinergic modulation to neurochemically distinct hippocampal basket cell subtypes. J.Neurosci. 30 (17), 6011-6024 (2010).
  53. Tricoire, L., et al. A blueprint for the spatiotemporal origins of mouse hippocampal interneuron diversity. J.Neurosci. 31 (30), 10948-10970 (2011).
  54. Franz, O., Liss, B., Neu, A., Roeper, J. Single-cell mRNA expression of HCN1 correlates with a fast gating phenotype of hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated ion channels (Ih) in central neurons. Eur.J.Neurosci. 12 (8), 2685-2693 (2000).
  55. Szabo, A., et al. Calcium-permeable AMPA receptors provide a common mechanism for LTP in glutamatergic synapses of distinct hippocampal interneuron types. J.Neurosci. 32 (19), 6511-6516 (2012).
  56. Hodne, K., Weltzien, F. A. Single-Cell Isolation and Gene Analysis: Pitfalls and Possibilities. Int.J.Mol.Sci. 16 (11), 26832-26849 (2015).
  57. Li, H. H., et al. Amplification and analysis of DNA sequences in single human sperm and diploid cells. Nature. 335 (6189), 414-417 (1988).
  58. Bochet, P., et al. Subunit composition at the single-cell level explains functional properties of a glutamate-gated channel. Neuron. 12 (2), 383-388 (1994).
  59. Audinat, E., Lambolez, B., Rossier, J., Crepel, F. Activity-dependent regulation of N-methyl-D-aspartate receptor subunit expression in rat cerebellar granule cells. Eur.J.Neurosci. 6 (12), 1792-1800 (1994).
  60. Jonas, P., Racca, C., Sakmann, B., Seeburg, P. H., Monyer, H. Differences in Ca2+ permeability of AMPA-type glutamate receptor channels in neocortical neurons caused by differential GluR-B subunit expression. Neuron. 12 (6), 1281-1289 (1994).
  61. Geiger, J. R., et al. Relative abundance of subunit mRNAs determines gating and Ca2+ permeability of AMPA receptors in principal neurons and interneurons in rat CNS. Neuron. 15 (1), 193-204 (1995).
  62. Flint, A. C., Maisch, U. S., Weishaupt, J. H., Kriegstein, A. R., Monyer, H. NR2A subunit expression shortens NMDA receptor synaptic currents in developing neocortex. J.Neurosci. 17 (7), 2469-2476 (1997).
  63. Angulo, M. C., Lambolez, B., Audinat, E., Hestrin, S., Rossier, J. Subunit composition, kinetic, and permeation properties of AMPA receptors in single neocortical nonpyramidal cells. J.Neurosci. 17 (17), 6685-6696 (1997).
  64. Lambolez, B., Ropert, N., Perrais, D., Rossier, J., Hestrin, S. Correlation between kinetics and RNA splicing of alpha-amino-3-hydroxy-5-methylisoxazole-4-propionic acid receptors in neocortical neurons. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 93 (5), 1797-1802 (1996).
  65. Liss, B., et al. Tuning pacemaker frequency of individual dopaminergic neurons by Kv4.3L and KChip3.1 transcription. EMBO J. 20 (20), 5715-5724 (2001).
  66. Aponte, Y., Lien, C. C., Reisinger, E., Jonas, P. Hyperpolarization-activated cation channels in fast-spiking interneurons of rat hippocampus. J.Physiol. 574, 229-243 (2006).

Tags

Нейробиологии выпуск 136 профиль выражение гена нейроны астроциты срезы мозга поклеточного конфигурации вложенные полимеразной цепной реакции (ПЦР)
Одноячеистый мультиплекс обратной транскрипции полимеразной цепной реакции после патч зажим
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Devienne, G., Le Gac, B., Piquet,… More

Devienne, G., Le Gac, B., Piquet, J., Cauli, B. Single Cell Multiplex Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction After Patch-clamp. J. Vis. Exp. (136), e57627, doi:10.3791/57627 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter