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Neuroscience

Einzelne Zelle Multiplex reversen Transkription Polymerase-Kettenreaktion nach Patch-clamp

Published: June 20, 2018 doi: 10.3791/57627
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1
1UPMC Univ Paris 06, INSERM, CNRS, Neuroscience Paris Seine - Institut de Biologie Paris Seine (NPS - IBPS), Sorbonne Université
* These authors contributed equally

Summary

Dieses Protokoll beschreibt die kritische Schritte und Vorsichtsmaßnahmen erforderlich, einzelne Zelle multiplex reversen Transkription Polymerase-Kettenreaktion nach Patch-Clamp durchzuführen. Diese Technik ist eine einfache und effektive Methode um das Expressionsprofil eines vorgegebenen Satzes Gene aus einer einzigen Zelle zeichnet sich durch Patch-Clamp-Aufnahmen zu analysieren.

Abstract

Die Großhirnrinde besteht aus zahlreichen Zelltypen, die verschiedenen morphologische, physiologische und molekulare Eigenschaften ausstellen. Diese Vielfalt behindert einfache Identifizierung und Charakterisierung dieser Zelltypen, Voraussetzungen, um ihre spezifischen Funktionen zu studieren. Dieser Artikel beschreibt das Multiplex-Einzelzelle reversen Transkription Polymerase Kettenreaktion (RT-PCR) Protokoll, das, nach Patch-Clamp-Aufnahme in Scheiben schneiden, ermöglicht gleichzeitig die Expression von Zehntausenden Gene in einer einzelnen Zelle erkennen. Diese einfache Methode kann mit Morphologische Charakterisierung durchgeführt werden und gilt allgemein für die phänotypische Merkmale der verschiedenen Zelltypen und ihre bestimmten zellulären Umgebung, wie z. B. in der Nähe von Blutgefäßen zu bestimmen. Das Prinzip dieses Protokolls ist aufzeichnen eine Zelle mit der Patch-Clamp-Technik, zu ernten und umkehren transkribieren zytoplasmatischen inhaltlich und qualitativ zu erkennen der Ausdruck der einen vordefinierten Satz von Genen durch multiplex-PCR. Es erfordert eine sorgfältige Planung der PCR Zündkapseln und intrazellulären Patch-Clamp-Lösung kompatibel mit RT-PCR. Um eine selektive und zuverlässige Abschrift zu gewährleisten benötigt-Erkennung, diese Technik auch entsprechende Kontrollen von Zytoplasma Ernte zur Verstärkung Schritte. Obwohl hier beschriebenen Vorsichtsmaßnahmen strikt befolgt werden müssen, kann praktisch alle elektrophysiologischen Labor die Multiplex-einzelne Zelle RT-PCR-Technik verwenden.

Introduction

Die Großhirnrinde besteht aus zahlreichen Zelltypen in verschiedenen physiologischen Prozessen beteiligt. Ihre Identifizierung und Charakterisierung, eine Voraussetzung für das Verständnis ihrer spezifischen Funktionen können sehr anspruchsvoll sein angesichts der großen morphologische, physiologische und molekulare Vielfalt, die kortikale Zelle Arten1 charakterisiert ,2,3,4.

Einzellige Multiplex-RT-PCR basiert auf der Kombination von Patch-Clamp und RT-PCR-Techniken. Es kann gleichzeitig die Expression von mehr als 30 vordefinierte Genen Elektrophysiologisch identifizierten Zellen5Sonde. Die Einbeziehung eines neuronalen Tracers in der Aufnahme-Pipette weiter ermöglicht die Morphologische Charakterisierung der aufgezeichneten Zellen nach histochemische Offenbarung6,7,8,9, 10. es ist eine sehr nützliche Technik für die Klassifizierung von neuronalen Arten anhand der multivariaten Analyse ihrer phänotypischen Merkmale5,9,10,11,12 ,13,14. Einzelne Zelle Multiplex-RT-PCR eignet sich auch zur Charakterisierung von nicht-neuronalen Zellen wie Astrozyten15,16,17und kann praktisch auf jedem Gehirn Struktur18angewendet werden, 19,20,21,22,23 und Zelle Art, vorausgesetzt, sie können in ganz-Zell Konfiguration aufgenommen werden.

Diese Technik ist sehr praktisch für die Identifizierung von zellulären Quellen bzw. Ziele der Übertragung Systeme7,8,15,16,20,21, 24,25,26,27,28, vor allem, wenn spezifische Antikörper fehlen. Es stützt sich auf Patch-Clamp-Aufnahmen von visuell identifizierte Zellen29und ermöglicht somit auch die Ausrichtung der Zellen in einem bestimmten zellulären Umgebung8,15,16. Außerdem da die Cytoarchitecture von Hirngewebe in Gehirnscheiben bewahrt wird, ermöglicht dieser Ansatz auch Studie über die anatomischen Verhältnisse der gekennzeichneten Zellen mit neuronalen und nicht-neuronale Elements7,8 , 18.

Da diese Technik durch die Menge des geernteten Zytoplasma und die Effizienz des RT begrenzt ist, kann der Nachweis von mRNA ausgedrückt bei geringen Kopienzahl schwierig sein. Obwohl andere Ansätze, basierend auf RNaseq-Technologie ermöglichen, um das ganze Transkriptom Einzelzellen3,4,30,31, zu analysieren, benötigen sie Hochdurchsatz-teure Sequenzer nicht unbedingt Jedes Labor zur Verfügung. Da die einzelne Zelle Multiplex-RT-PCR Technik Endpunkt PCR verwendet, erfordert es nur allgemein verfügbar Thermocycler. Es kann leicht in Laboratorien ausgestattet mit elektrophysiologischen Setups entwickelt werden und erfordert keine teure Ausrüstung. Es kann innerhalb eines Tages eine Qualitative Analyse des Ausdrucks einen vordefinierten Satz von Genen bereitstellen. So bietet dieser Ansatz eine gute Anbindung an die molekulare Charakterisierung einzelner Zellen in einer schnellen Weise.

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Protocol

Alle experimentelle Verfahren unter Verwendung von Tieren wurden durchgeführt in strikter Übereinstimmung mit französischen Regelungen (Code Rural R214/87 bis R214/130) und entsprach den ethischen Richtlinien der Europäischen Wirtschaftsgemeinschaft (86/609/EWG) und der französischen Nationalcharta über die Ethik von Tierversuchen. Alle Protokolle wurden von Charles Darwin-Ethik-Kommission genehmigt und dem französischen Ministerium für Bildung und Forschung (Genehmigung 2015 061011367540) vorgelegt. Die IBPS Tierhaus ist von den französischen Behörden (A75-05-24) akkreditiert.

1. Vorüberlegungen

Hinweis: Um Kontaminationen zu vermeiden, richten Sie sich nach den folgenden Empfehlungen vor Unternehmen einzelne Zelle RT-PCR nach Patch-Clamp.

  1. Verwenden Sie keine Plasmide mit Genen von Interesse im Labor sind eine mögliche Quelle der Verschmutzung.
  2. Reservieren Sie einen Labortisch abseits der Gel-Elektrophorese Raum PCRs vorzubereiten.
  3. Widmen Sie einen Satz von Pipetten und Aerosol beständig Filterspitzen, DNA und RNA bei Konzentrationen unter 1 ng/µL zu manipulieren. Verwenden Sie niemals diese PCR-Produkte zu analysieren.
  4. Verwenden Sie RNase - und DNase-freie Produkte und tragen Sie Handschuhe.
  5. Verwenden Sie spezielle Chemikalien für die Zubereitung von internen Patch-Clamp-Lösungen. Nie mit einem Spatel, sondern eher mit einem Gewicht von Papier zu Pulver zu wiegen.
  6. Verwenden Sie eine dedizierte pH-Elektrode und pH-standard-Lösungen, wie sie eine Quelle der Verschmutzung (z.B.RNase) sein können.
  7. Borosilikatglas Kapillaren zu speichern; 20 µL lang, dünn und flexible Tipps; ein 20 µL mikropipette; eine hausgemachte Expeller (Patch-Clamp Pipette Halter befestigt, eine 10 mL Spritze); 500 µL PCR Tubes; 10 µL Aerosol beständig Filterspitzen; und dünnen Permanentmarker in eine eigene Box (Abbildung 1).

2. besser gekleideteres Design

Hinweis: Multiplex RT-PCR beruht auf zwei Verstärker-Stufen. Während der ersten PCR werden die Gene des Interesses Co verstärkt durch Mischen alle PCR-Primer. Um Abschriften von Einzelzellen zuverlässig zu erkennen, gilt es, effiziente und selektive PCR Primer zu entwerfen. Die Verwendung von geschachtelten (intern) Primer für die zweite Runde der PCR verbessert die Spezifität und die Effizienz der Verstärkung.

  1. Die kuratierten mRNA-Sequenzen der Gene des Interesses an NCBI Reihenfolge Referenzdatenbank32 sowie ihrer Verwandten Familie (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/) abrufen.
    1. Geben Sie den Namen der Gendefekt und die Arten von Interesse als Abfrage, und klicken Sie auf die abgerufenen gewünschte Sequenz.
    2. Um die Analyse auf die kodierende Sequenz der DNA zu beschränken, klicken Sie auf Senden an (oben rechts), und wählen Sie Codierung Sequenzen und FASTA Nukleotid als Format. Dann klicken Sie auf Datei erstellen und speichern Sie die FASTA-Sequenz mit einem ".nt"-Datei-Erweiterung.
  2. Verwenden Sie Ara Software33 (mehrere Ausrichtung Bau & Analyse Workbench) oder jede andere mehrere Alignment-Software um zu die Regionen der Homologie zu bestimmen.
    1. Klicken Sie auf -Datei | Neues Projekt... und wählen Sie DNA als Sequenz. Um die Gensequenzen zu importieren, wählen Sie Sequenz | Importieren Sie Sequenz... und eine ".nt" Datei laden. Wiederholen Sie den Vorgang für alle damit verbundenen Folgen.
    2. Klicken Sie und ziehen Sie alle Sequenzen in der schematischen Fenster die ganzen Sequenzen auswählen.
    3. Die Regionen der Homologie durch Auswählen von Ausrichtung suchen | Suche nach Blöcken... (STRG + S). Wählen Sie im Suchmethode Segment paar überlappen . Passen Sie die Pairwise Cutoff score , auf einen relativ hohen Wert (z.B.1.000) und Min. seqs. pro Block auf die Gesamtzahl der Sequenzen richten Sie aus und klicken auf starten.
    4. Wählen Sie im Fenster erscheinenden Suchergebnis die Ergebnisse mit der Höchstnote MP und klicken Sie auf Link. Wenn kein Ergebnis gefunden wird, verringern Sie die Pairwise score Cutoff und/oder der Min. seqs. pro Block.
    5. Um die Visualisierung von Homologen Regionen zu erleichtern, wählen Sie Ausrichtung | Beschattung | Mittelwert.
    6. Wählen Sie Verknüpfung zwischen Teilen der Sequenzen und wiederholen Sie die Schritte 2.2.3–2.2.4 möglicherweise andere Regionen der Homologie mit einem niedrigeren MP-Score ermitteln.
    7. Um die meisten spezifischen Primer zu erhalten, wählen Sie die Regionen mit den geringsten Sequenzhomologie.
  3. Holen Sie die Sequenzen aller Splice-Varianten zu, und wiederholen Sie die Schritte 2.2.1–2.2.6. Wählen Sie ihre gemeinsamen Regionen für eine Gesamt-Erkennung. Prüfen Sie alternative Kassetten für dedizierte Spleiß Varianten Analysen20,34,35,36.
  4. Richten Sie die mRNA-Sequenzen am Tiermodell Genom mit BLAST37 Genomen (grundlegende lokale Ausrichtung Search Tool) zur Bestimmung der Intron-Exon Struktur der Gene (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).
    1. BLAST Maus Genom durch Maus Anklicken auswählen und Hochladen der abgerufenen FASTA Sequenz im Abschnitt Geben Sie Abfrage-Sequenz . Wählen Sie bei der Programmauswahl optimieren für sehr ähnliche Sequenzen (Megadruckwelle), dann klicken Sie auf die Schaltfläche " Explosion ".
    2. Abschnitt " Beschreibungen " wählen Sie die Achse mit der höchsten Identität (bis zu 100 %). Stellen Sie sicher, dass er das Gen des Interesses entspricht wie in Funktionen des Abschnitts Achsen angegeben.
    3. Sortieren Sie die Ausrichtung nach Abfrage die Startposition im gleichen Abschnitt, die Exons Nachfolge der kodierenden Sequenz zu erhalten. Beachten Sie die Anfangs- und Endpositionen der alle Hits, die etwa die Position des Introns auf der Abfrage-Sequenz (Abbildung 2A) entsprechen.
  5. Wählen Sie aus zwei verschiedenen Exons für die Sense und Antisense Primer, cDNA von genomischer DNA (gDNA) Verstärkung anhand eines größenkriteriums (Abbildung 2) leicht zu unterscheiden.
    Hinweis: Die Verstärkung der gDNA kann bei einer niedrigen Frequenz auftreten, wenn der Kern mit dem Zytoplasma geerntet wird. Also unbedingt Intron overspanning Primer-Paaren (Abbildung 2A) zu entwerfen. Bei Intron-weniger Gene ist die Sammlung des Kerns problematisch, da es zu potenziell verwirrende Ergebnisse führen kann. Um dieses Problem zu beheben, enthalten Sie eine Reihe von Grundierungen, die darauf abzielen, eine intronischen Sequenz, die auf das Vorhandensein von gDNA25Sonde verstärken. Wenn die genomische Kontrolle positiv ist, müssen die Ergebnisse für alle Intron-weniger Gene verworfen.
  6. Um eine effiziente Verstärkung zu erreichen, wählen Sie Primer erzeugen Amplifikate mit einer Länge, die im Idealfall umfasste zwischen 200 und 400 Basenpaaren (Abbildung 2).
  7. Um gleichzeitig verschiedene cDNAs während der Multiplex-PCR-Schritt zu verstärken, design-Primer mit einer Länge zwischen 18 und 24 Nukleotide und eine Schmelztemperatur (Tm) zwischen 55 und 60 ° C.
  8. Um die Bildung von Sekundärstrukturen, zu minimieren, die den Ertrag der Verstärkung zu reduzieren, wählen Sie Sinn und Anti-Sense Primer mit minimalen Haarnadel und duplex Längen (Abb. 2 b).
  9. Entwerfen Sie interne Primer anhand der gleichen Kriterien (Schritte 2,5-2,8).
  10. Überprüfen Sie die Spezifität der PCR Primer durch Ausrichten der Primer auf die Referenzdatenbank RNA-Sequenz des Organismus mit einem Nukleotid BLAST.
    1. BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) klicken Sie auf Nukleotid BLAST. Fügen Sie die Sequenz eines Primers in der Abfrage-Sequenz eingeben.
    2. Klicken Sie im Abschnitt Suchgruppe wählen auf andere (nr etc.), wählen Sie Referenz RNA-Sequenzen (Refseq_rna) in die Datenbank -Option und geben Sie den Organismus (z.B., Mus Musculus (Taxid:10090) ), die Analyse auf die gewünschte Art zu beschränken.
    3. Programmauswahl wählen Sie optimieren für ähnliche Sequenzen (Blastn). In den Algorithmus-Parameter reduzieren die Wortgröße bis 7 erhöhen die Chance, Treffer zu erhalten.
  11. Selektive Primer Design, halten Sie nur diejenigen, deren Sequenz hat mindestens 3 Diskrepanzen mit unerwünschten cDNAs wenn möglich.
  12. Bestellen Sie entsalzten Primer bei einer relativ hohen Konzentration (z.B. 200 µM) um sicherzustellen, dass alle externen Primer auf eine Endkonzentration von 1 µM gemischt werden können.

3. Vorbereitung des RT-Reagenzien

  1. 5 x RT-Mix: bereiten Sie sich in RNase-freies Wasser 400 µL RT-Mix Lösung (5 X) mit zufälligen Primern bei 25 µM und dNTPs bei 2,5 mM zu arbeiten. Speichern Sie diese Arbeiten-Mischung als 20 µL-Aliquots in 500 µL Röhren.
  2. 20 x Dithiothreitol (DTT): 1 mL 0,2 M DTT in RNase-freies Wasser vorbereiten und speichern Sie es als 50 µL-Aliquots.
  3. Speichern Sie 2.500 U RNase-Inhibitor (40 U/µL) und 10.000 U der reversen Transkriptase (RTase, 200 U/µL) als 5 µL-Aliquots.
  4. Um eine optimale Qualität der RT Reagenzien zu gewährleisten, speichern Sie die Aliquote bei-80 ° C. Benutzen sie für bis zu 10 Zellen und nur für einen Tag.

(4) PCR-Validierung

  1. Bereiten Sie cDNAs dadurch einer reversen Transkription auf eine relativ große Menge an total RNA (in der Regel 1 µg) extrahiert38 aus der Struktur von Interesse.
    1. Verwenden Sie spezielle Pipetten nicht, um einzelne Zelle RT-PCR für diese vorbereitende Schritte aber die RNase-freie Pipetten verwenden. Gesamt-RNS bis 1 µg/µL zu verdünnen.
    2. Fügen Sie in einem 500 µL PCR-Röhrchen 1 µL verdünnter Gesamt-RNS und 8 µL RNase-freies Wasser hinzu. Bei 95 ° C für 1 min denaturieren und das Rohr auf Eis abkühlen.
    3. Fügen Sie 4 µL RT 5 X Puffer vom Hersteller gelieferten, 4 µL RT-Mix-Lösung 1 µL RTase, 1 µL RNase-Inhibitor und 1 µL 200 mM DTT (siehe Abschnitt 3).
    4. Wechseln Sie das Rohr, drehen Sie es, und über Nacht bei 37 ° c inkubieren
    5. Speichern Sie die cDNAs bei-80 ° C bis zu mehreren Jahren. Bereiten Sie eine Aliquote cDNAs verdünnt bis 1 ng/µL Gesamt RNAs äquivalente.
  2. Mischen Sie und verdünnen Sie jedes Primerpaar bei 1 µM mit den Pipetten gewidmet Einzelzelle RT-PCR. Verwenden Sie 20 µL jeder Grundierung-Mix für 100 µL PCRs.
  3. Auf dem Eis bereiten für jede Primerpaar eine Vormischung mit: Wasser (q.s., 80 µL), 10 µL 10-fach Puffer, 1 µL von 100 X dNTPs (50 µM), 500 – 1000 Pg cDNA 1 ng/µL verdünnt und 0.5 µL Taq Polymerase (2.5 U, 5 U/µL).
  4. Verwenden Sie PCR-Röhren, die die Brunnen der PCR-Maschine für eine optimale Temperaturregelung eng Anliegen. Tropfen Sie 2 (~ 100 µL) von Mineralöl auf die Vormischung ohne Berührung der Wand oder der GAP der PCR-Röhre.
  5. Um die Bildung von Primer-Dimere zu minimieren, führen Sie einen Heißstart indem man die PCR-Röhrchen in den Thermocycler bei 95 ° c vorgewärmt Nach 30 s, 20 µL der Grundierung Mischung auf das Öl schnell zu vertreiben.
  6. Nach 3 min bei 95 ° C laufen 40 Zyklen (95 ° C, 30 s, 60 ° C, 30 s; 72 ° C, 35 s) gefolgt von einer endgültigen Dehnung Schritt bei 72 ° C für 5 min.
  7. Analysieren Sie 10 µL jeder PCR-Produkte von Agarose-Gel-Elektrophorese (2 %, Gewicht/Volumen)39. Wenn einige PCR-Produkte nicht die erwartete Größe verfügen, Re-design anderen Primer (siehe Abschnitt 2).
    Achtung: Interkalation bromid ist eine intercalating Chemikalie, die DNA-Mutationen auslösen kann. Wenden Sie sich an der lokalen Sicherheit Büro, bevor Sie es verwenden. Tragen Sie immer Handschuhe, wenn es zu manipulieren. Verwenden Sie eine handelsübliche Lösung Interkalation Bromid (10 mg/mL) Lösung statt Pulver zur Minimierung des Risikos der Inhalation. UV-Licht kann ebenso schädlich sein, so stellen Sie sicher, UV-Schutz-Schutzbrille oder eine Maske tragen. Zurücktreten Sie, verschmutzte Gele, Tipps, Handschuhe und Puffer in Containern Interkalation Abfälle gewidmet.
  8. Nachdem alle Primer Paare einzeln validiert wurden, testen Sie die Multiplex-Protokoll (Abbildung 3).
    1. Mischen Sie und verdünnen Sie alle externen Primer zusammen auf 1 µM. Store die multiplex Primer bei-20 ° C bis zu mehreren Wochen zu mischen.
    2. Auf dem Eis, bereiten eine Vormischung mit: Wasser (q.s., 80 µL), 10 µL 10-fach Puffer, 100 X dNTPs (jeweils 50 µM) 1 µL, 500 – 1.000 Pg cDNAs verdünnt 1 ng/µL und 0.5 µL Taq Polymerase (2.5 U, 5 U/µL).
    3. Streichen Sie das PCR-Röhrchen, drehen Sie es und fügen Sie zwei Tropfen (~ 100 µL) von Mineralöl.
    4. Führen Sie einen Heißstart, wie unter Punkt 4.5 mit 20 µL des Multiplex-Grundierung-Mix beschrieben. Laufen Sie nach 3 min bei 95 ° C 20 PCR-Zyklen, die identisch mit denen der Schritt 4.6.
    5. Bereiten Sie eine Reihe von PCR Schläuche identisch mit der Anzahl von Genen zu analysieren. Bereiten Sie eine Vormischung wie in Schritt 4.8.2, aber mit 1 µL das erste PCR-Produkt pro gen als Vorlage. Passen Sie die Mengen entsprechend der Anzahl der Gene zu analysieren und zu 10 % mehr Volumen zu pipettieren Fehler kompensieren in Betracht.
    6. Leicht schütteln, drehen Sie das Rohr, Versand 80 µL der Vormischung in jedem PCR-Röhrchen, und fügen Sie zwei Tropfen (~ 100 µL) Mineralöl pro Röhre ohne Berührung der Wand oder der GAP der Rohre.
    7. Führen Sie eine heiße beginnen (siehe Punkt 4.5) durch Ausweisung 20 µL des internen Grundierung-Mix in Schritt 4.2 vorbereitet. Laufen Sie identisch mit Schritt 4.6 35 PCR-Zyklen.
    8. Analysieren Sie die zweite PCR-Produkte von Agarose-Gelelektrophorese. Stellen Sie sicher, dass jeder zweite PCR eine Amplifikate der erwarteten Größe erzeugt. Im Falle einer ineffizienten oder unspezifische Amplifikationen, Re-design neue Primer (Schritte 2,5 – 2.12) und überprüfen sie (Schritte 4.2-4.8).

5. Vorbereitung und Überprüfung der intrazellulären Patch-Clamp-Lösung

Hinweis: Das folgende Protokoll beschreibt die Erstellung und Validierung von einer K+-/gluconate-basierte interne Lösung, aber praktisch jede Art von Patch-Clamp-Lösung kann verwendet werden, solange es die Effizienz der RT-PCR nicht behindert wird. Tragen von Handschuhen ist Pflicht, eine RNase-freie interne Lösung zu erhalten.

  1. Bereiten Sie 60 mL der internen Patch-Clamp Aufzeichnungslösung aus dem Stegreif 10 mL 0,1 M KOH.
  2. 11,4 mg der EGTA (endgültige 0,5 mM) in 0,9 mL 0,1 M KOH auflösen.
  3. 40 mL RNase-freies Wasser und lösen Sie 2,02 g K-Gluconat 144 mM (final), 143 mg HEPES (Letzte 10 mM) und 180 µL 1 M MgCl2 (letzte 3 mM).
  4. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,2 durch Zugabe von ~ 6 mL 0,1 M KOH.
  5. Passen Sie die Osmolarität zu 295 mOsm mit ~ 13 mL RNase-freies Wasser.
  6. Da die interne Lösung auch als Puffer für die reverse Transkription verwendet wird, kontrollieren Sie sorgfältig Mg2 + Konzentration. Kompensieren Sie eine geringere Mg2 + Konzentration in der internen Lösung durch Zugabe von MgCl2 danach um eine Endkonzentration von 2 mM in der RT-Reaktion zu erreichen.
  7. Fügen Sie 2 – 5 mg/mL der RNase-freie Biocytin um die geernteten Zelle nach Patch-Clamp-Aufnahme zu beschriften hinzu, die interne Lösung beschriebenen (Schritte 5.1-5.5).
  8. Filtern Sie (0,22 µm Porengröße) die interne Lösung und Lagern Sie so 100 – 250 µL Aliquots bei-80 ° C.
  9. Um die Nutzung der internen Lösung für einzellige RT-PCR zu validieren, 0,5 µL Gesamt RNAs 1 ng/µL, 6 µL der Patch-Clamp-Lösung verdünnt und lassen Sie es auf der Bank für ca. 30 min.
  10. Mit einer Mikropipette 2 µL hinzufügen 2 µL 5 x 0,5 µL RT-Mix, 0,5 µL 20 X DDT und 0,5 µL RNase-Inhibitor RTase, und über Nacht bei 37 ° c inkubieren
  11. Drehen Sie das Rohr. Fügen Sie auf dem Eis Wasser (q.s., 80 µL), 10 µL 10-fach Puffer und 0.5 µL Taq Polymerase (2.5 U, 5 U/µL).
  12. Führen Sie 40 Zyklen der PCR unter Verwendung eines Satzes von validierten Primern (Schritte 4,4-4,6).
  13. Analysieren Sie die PCR-Produkte durch Agarose-Gelelektrophorese (siehe Punkt 4.7) und stellen Sie sicher, dass sie die erwartete Größe haben.
    Hinweis: Das Weglassen der 0,5 µL Gesamt-RNS und ersetzt sie durch 0,5 µL RNase-freies Wasser werden sichergestellt, dass die interne Lösung frei von RNA bzw. DNA-Kontaminationen ist.

6. akute Slice-Vorbereitung

Hinweis: Dieses Protokoll beschreibt das Slice Verfahren für Jugendliche (d.h.weniger als 28 Tage postnatale) männlichen und weiblichen Mäusen. Andere Lösungen, wie Saccharose-basierten künstlichen Liquor cerebrospinalis (ACFS) sind ebenfalls verwendbar40.

  1. Bereiten Sie 2 L ACFS enthält (in mM) 125 NaCl, 2.5 KCl, 2 CaCl2, 1 MgCl2, 1,25 NaH2PO4, 26 Nahco33, 10 Glukose und 15 Saccharose. Um glutamatergen Aktivität während der Vorbereitung der Scheibe zu reduzieren, bereiten Sie eine Cutting-Lösung durch Zugabe von 1 mM der Kynurenic Säure.
  2. Vor dem Aufschneiden, bereiten Sie ein Dissektion Set, chirurgische Scheren, feine Iris-Schere, zwei Spatel, Zange, einer Disc mit Papierfilter und Cyanacrylat-Klebstoff.
  3. Verwenden Sie eiskalte Lösung gesättigt mit O2Co2 (95 % / 5 %) und Abkühlen der Schneidekammer bei-20 ° C.
  4. Betäuben Sie die Maus mit einem kleinen Papiertuch mit Isofluran getränkt. Stellen Sie nach ~ 2 min sicher, dass die Maus Tiefe Narkose durch die Überprüfung keine Antwort erhalten, Prise Pfote.
  5. Enthaupten Sie schnell die Maus. Entfernen Sie die Kopfhaut und öffnen Sie den Schädel zu. Extrahieren Sie das Gehirn sorgfältig und legen Sie sie in einen kleinen Becher mit eiskalten (~ 4 ° C)-Cutting-Lösung mit O2Co2Sauerstoff gefüllt.
  6. Entfernen Sie die Schneidkammer von-20 ° C Bedingungen und Feuchtigkeit mit einem Papiertuch.
  7. Untersuchen Sie sorgfältig das Gehirn des Interessenbereichs zu isolieren, auf die Schneidkammer kleben und eiskalte Schneidlösung Sauerstoff mit O2Co2hinzufügen.
  8. Geschnitten Sie 300 µm dicke Scheiben mit einem Vibratome. Übertragen Sie sie bei Raumtemperatur in einer ruhenden Kammer mit Sauerstoff angereichertes Schneidlösung gefüllt und lassen sie mindestens 0,5 h wiederherstellen.

7. einzelne Zelle RT-PCR nach der Patch-Clamp-Aufnahme

  1. Reinigen Sie die Perfusion System regelmäßig mit ~ 100 mL 30 % H2O2 Lösung und spülen Sie ausgiebig mit ~ 500 mL destilliertem Wasser auf das Wachstum von Bakterien zu vermeiden, da es eine übersehene Quelle der RNase Kontamination.
  2. Chloren Sie das Filament mit einer Patch-Pipette gefüllt mit konzentriertem Bleichmittel Ernte täglich. Verwenden Sie eine Mikropipette nicht die Patch-Pipette, sondern eher eine 20 µL langen, feinen, flexiblen Spitze befestigt eine 1 mL Spritze füllen. Dann ausgiebig mit RNase freies Wasser spülen Sie und trocknen Sie sie mit einem Gas-Staubtuch.
  3. Bereiten Sie eine kleine Box mit 5 x RT-Mix und 20 X DTT Aliquote Eis. Speichern der RTase und RNase-Inhibitor Aliquote bei-20 ° C in einem Benchtop Kühler.
  4. Übertragen Sie ein Stück in die Aufnahme Kammer bei 1 – 2 mL/min mit Sauerstoff angereichertes ACFS durchblutet.
  5. Ziehen Sie Patch Pipetten (1 – 2 µm öffnen Spitzendurchmesser, 3 – 5 MΩ) aus Borosilikatglas mit Handschuhen und füllen Sie einer von ihnen mit 8 μL der internen Lösung. Denken Sie daran, dass die Knöpfe von der Pipette Abzieher RNase Kontaminationsquelle sind.
  6. Stellen Sie die Pipette in die Pipette Halterung, während neue Handschuhe tragen und nicht das Filament mit den Fingern zu berühren.
  7. Nähern Sie die Patch-Pipette mit einem Überdruck zu und führen Sie ganze Zelle Aufnahme zur Charakterisierung der gezielte Zelle (Abbildung 4).
  8. Zur Wahrung der mRNAs begrenzen Sie die Zeit in ganz-Zell Konfiguration bis 20 min41.
  9. Am Ende der Aufnahme, bereiten Sie eine 500 µL PCR Rohr gefüllt mit 2 µL 5 x RT Mix 0,5 µL 20 X DTT, drehen Sie es und speichern Sie es auf dem Eis.
  10. Ernten Sie die Zelle Zytoplasma durch einen negativen Druck (Abbildung 4). Visuell-Steuerelement, das den Zellinhalt in die Pipette kommt, und gleichzeitig eine gute Abdichtung.
    1. Vermeiden Sie so weit wie möglich den Kern zu sammeln, wenn einige Gene Intron-weniger gelten. In einem solchen Fall immer enthalten Sie eine Reihe von Primer zur Verstärkung gDNA für genomische Kontamination zu untersuchen.
    2. Wenn der Kern in der Nähe der Pipettenspitze kommt, lassen Sie den negativen Druck und bewegen Sie die Pipette entfernt den Kern. Sicherzustellen Sie, dass die Abdichtung erhalten bleibt und neu starten Sie, um das Zytoplasma am neuen Standort der Pipette zu sammeln.
  11. Der Ernte wenn kein weiteres Material kommt und/oder vor dem Verlust der Abdichtung zu stoppen.
  12. Zurückzuziehen Sie die Pipette vorsichtig, um eine außen-Out Patch, Kontamination durch die extrazelluläre Ablagerungen (Abbildung 4) zu begrenzen und zu Gunsten die Schließung der Zellmembran für nachfolgende histochemische Analysen bilden.
  13. Denken Sie daran, dass Knöpfe, Mikromanipulatoren, Computertastatur, oder Computer-Maus sind mögliche Quellen von RNase Kontamination. Wenn sie während der Aufnahme berührt gewesen sein, ändern Sie Handschuhe.
  14. Legen Sie die Pipette auf die Expeller und vertreiben Sie seinen Inhalt in das PCR-Röhrchen zu, durch einen positiven Druck (Abbildung 1).
  15. Brechen Sie die PIPETTENSPITZE in die PCR-Röhre, die Sammlung des Inhalts zu helfen.
  16. Kurz Zentrifugieren Sie das Rohr, dazugeben Sie 0,5 µL RNase-Inhibitor und 0,5 µL RTase, mischen Sie vorsichtig, Zentrifugieren Sie wieder und über Nacht bei 37 ° c inkubieren
  17. Drehen Sie das Rohr und bei-80 ° C bis zu mehreren Monaten bis zur PCR Analyse zu speichern.
  18. Durchführen Sie den ersten Verstärkung Schritt direkt in die Röhrchen mit ~ 10 µL RT-Produkte durch Zugabe von Wasser (q.s., 80 µL), 10 µL 10 X Puffer und 0.5 µL Taq Polymerase (2.5 U). Dann folgen Sie den Anweisungen in 4.8.2–4.8.8 Schritten beschrieben.

8. histochemische Färbung der aufgezeichneten Zelle (Optional)

  1. Im Anschluss an die elektrophysiologischen Aufnahmen halten Sie Stück für 20 min in sauerstoffhaltigen ACFS ermöglicht die Diffusion von Biocytin in der axonalen und dendritische Struktur.
  2. Legen Sie die Scheibe in einem Brunnen von einer 24-Well-Platte und befestigen es über Nacht bei 4 ° C mit 1 mL 4 % Paraformaldehyd in 0,1 M Phosphatpuffer.
  3. Waschen Sie die Scheiben 4 Mal, jeweils 5 min mit 1 mL Phosphat Buffered Saline (PBS).
  4. In der gleichen, permeabilize und sättigen die Scheibe während 1 h bei Raumtemperatur mit 1 mL PBS mit 0,25 % Triton x-100 und 0,2 % Gelatine aus kaltem Wasser Fischhaut (PBS-GT) ergänzt.
  5. Brüten Sie über Nacht mit einem eindringmittel beschrifteten Avidin verdünnt 1/400 in 250 – 500 µL PBS-GT.
  6. Waschen 5 mal 5 min jeweils mit 1 mL PBS und montieren Sie die Scheiben.

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Representative Results

Eine repräsentative Validierung der Multiplex-RT-PCR ist in Abbildung 3dargestellt. Das Protokoll wurde entwickelt, um gleichzeitig die Expression von 12 verschiedenen Genen Sonde. Die vesikuläre Glutamat Transporter vGluT1 wurde als Positivkontrolle für glutamatergen Neuronen42übernommen. Die GABA-Synthese von Enzymen (GAD65 und GAD-67), NEUROPEPTID Y (NPY) und Somatostatin (SOM) dienten als Marker der Gabaergen Interneuronen3,5,11. Das Enzym Cyclooxygenase-2 (COX-2) diente als ein Marker für die pyramidale Zelle Subpopulation3,16.

ATP1α1-3 Untereinheiten des Na+/+ ATPase k und die Kir6.2 und SUR1 Untereinheiten des ATP-sensitiven K+ -Kanäle wurden ausgewählt, um die Beziehung zwischen neuronaler Aktivität und metabolische Staaten43bewerten. Da Kir6.2 ein Intron-Less-gen ist, war die SOM-Intron als genomische Steuerelement enthalten. Das Protokoll wurde getestet auf 1 ng von reverse transkribierten Gesamt-RNS extrahiert vom ganzen Gehirn der Maus, die etwa die Transkripte von 20 entspricht44Zellen. Die Multiplex-PCR produziert 12 Amplifikate der erwarteten Größe (Abbildung 3 und Tabelle 1) zeigt die Empfindlichkeit und die Effizienz des Protokolls. Die negative-Kontrolle durchgeführt, ohne RNA produziert keine Amplifikate (Daten nicht gezeigt).

Eine Schicht V pyramidale Neuron wurde optisch durch seine großen Soma und einem prominenten apikalen Dendriten identifiziert (Abb. 5A, inset). Ganze Zelle Aufnahme zeigte typische elektrophysiologische Eigenschaften der Schicht V regelmäßige spiking Neuronen5,45,46 , vor allem, einen niedrigen Eingangswiderstand, lang anhaltende Aktionspotentiale und ausgeprägte spike Frequenz-Anpassung (Abb. 5A). Die molekulare Analyse von diesem Neuron offenbart die Expression von vGluT1 (Abb. 5 b), bestätigt seine glutamatergen Phänotyp42,46. Dieses Neuron auch ausgedrückt, SOM, ATP1α1 und 3 Untereinheiten des Na+/+ ATPase k. Biocytin Kennzeichnung der aufgezeichneten Neuronen bestätigt eine pyramidale Morphologie (Abbildung 5).

Erwartungsgemäß von glutamatergen Neuronen offenbart die molekulare Analyse von 26 v. Schicht Pyramidenzellen Ausdruck des VGluT1, aber keiner von den beiden GADs (Abbildung 5). Markierungen von Interneuronen wurden5,42,46selten beobachtet. COX-2, vor allem zum Ausdruck von Schicht II-III Pyramidenzellen3,16, wurde nicht in Schicht V Pyramidenzellen erkannt. Die ATP1α1 und 3 Untereinheiten wurden häufiger beobachtet als ATP1α2 Untereinheit3. Die Kir6.2 und SUR1 Untereinheiten wurden selten in Schicht V pyramidale Neuronen, erkannt die steht im Einklang mit ihren bevorzugten Ausdruck in oberen Schichten3,43. Darauf wurde geachtet, nicht um die Kerne, wodurch eine seltene Entdeckung von SOM Introns (3 von 26 Zellen, d.h.12 %) zu ernten.

Figure 1
Abbildung 1: eigene Box für einzelne Zelle RT-PCR. Liste der Materialien, die für die RT-PCR nach Patch-Clamp reserviert. (1) Borosilikatglas Kapillaren, lange (2) 20 µL, fein, flexibel Tipps (3) 20 µL mikropipette, (4) hausgemachte Expeller, (5) 500 µL PCR Tubes, (6) 10 µL Aerosol beständig Filtertips und (7) permanent-Marker. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: PCR Primer Designstrategie. (A) schematische Darstellung der kodierenden Sequenz von COX 2 cDNA ausgerichtet, die Maus-Chromosom 2-Sequenz, die COX-2-Gen enthält. Exons werden durch Black Boxes und Introns auf gDNA von weißen Kästchen dargestellt. Beachten Sie die Lücken in der cDNA, die intronischen Sequenzen auf gDNA entspricht. Repräsentative Beispiele für schlechte und gute Oligonukleotide, die jeweils als rote und grüne Pfeile dargestellt. Rechte und linke Pfeile kennzeichnen forward und reverse Primer. (B) Sequenzen und Sekundärstrukturen der Oligonukleotide in (A) gezeigt. Linken und Rechte Platten zeigen Haarnadel selbst-Komplementarität und selbst-Dimer-Bildung, beziehungsweise. B1 -Oligonukleotid zeigt eine starke Haarnadel selbst-Komplementarität und Dimer der Bildung, während die B2 -Oligonukleotid nur Dimer-Bildung zeigt. B3 und B4 Oligonukleotide haben keine Haarnadel selbst-Komplementarität und keine Dimer-Bildung; Sie sind Intron overspanning (A) und als potenziellen PCR-Primer (siehe Tabelle 1) ausgewählt wurden. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3: Validierung von multiplex PCR. 1 ng von Gesamt-RNS von ganzen Gehirn der Maus eine reverse Transkription, gefolgt von zwei Runden der PCR-Amplifikation unterzogen wurde. Die 12 PCR-Produkte wurden in getrennten Fahrspuren durch Agarose-Gelelektrophorese parallel mit Φx174 von HaeIII verdaut gelöst. Die zweite PCR-Produkte hatte Größen (in bp) von den Sequenzen vorhergesagt: 153 (vGluT1), 248 (GAD65), 255 (GAD67), 181 (COX-2), 220 (NPY), 146 (SOM), 183 (ATP1a1), 213 (ATP1a2), 128 (ATP1a3), 342 (Kir6.2), 211 (SUR1) und 182 (SOMInt). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4: Patch-Clamp Ernte in Hirnschnitten. Sobald eine Zelle visuell erkannt wird, ist die Aufnahme-Pipette mit einem Überdruck näherte, um zelltrümmer Verunreinigungen an der Spitze der Pipette zu vermeiden. Beachten Sie die Grübchen auf der Membran von diesem Neuron. Überdruck wird dann unterbrochen, um eine Zelle-attached Konfiguration Gigaohm dicht zu bilden. Kurze Lenzsauger werden angewendet, um zu ganz-Zell Konfiguration wechseln. Am Ende der Aufzeichnung wird Zytoplasma geerntet, durch die Anwendung eines leichten Unterdrucks in der Pipette unter Beibehaltung der Abdichtung. Beachten Sie die Schrumpfung der Zellkörper während der Ernteverfahren. Die Aufnahme-Pipette wird dann sanft zurückgezogen, um ein außen-Out Patch, bilden die Zellmembran Verschluss für nachfolgende Biocytin Offenbarung und Erhaltung des geernteten Materials in der Patch-Pipette begünstigt. Von Cauli und Lambolez47 reproduziert mit freundlicher Genehmigung von der Royal Society of Chemistry. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 5
Abbildung 5: Charakterisierung der neokortikalen Pyramidenzellen Schicht V. (A) Membran mögliche Antwort einer Schicht V pyramidale Zelle durch Stromimpulse von-100,-40 -10, + 60, 120 und + 500 pA (unteren Spuren) induziert. Das Neuron zeigt eine schwache mögliche Auslenkung nach hyperpolarizing Erstreaktion (obere Spuren). In Reaktion auf eine supraliminal Depolarisation entladen das Neuron lang anhaltende Aktionspotentiale mit langsam entwickelnden nach Hyperpolarisation (obere Spur). In der Nähe von Sättigung das Neuron bei einer niedrigen Frequenz entladen und eine ausgeprägte Anpassung (obere graue Spur) ausgestellt. Einschub: Infrarot-Bilder des aufgezeichneten Schicht V pyramidenförmigen Neurons. Die pial Oberfläche ist nach oben. Maßstabsleiste: 20 µm. (B) Multiplex RT-PCR-Analyse offenbart Ausdruck von vGluT1, SOM, ATP1α1 und ATP1α3. (C) Genexpressionsprofil in einer Stichprobe von 26 Schicht V Pyramidenzellen. vGluT1 wurde in alle Neuronen exprimiert, während GAD65, GAD67 und COX2 nie erkannt wurden. NPY, SOM Kir6.2, SUR1 und SOMInt wurden selten beobachtet. Pyramidenzellen ausgedrückt ATP1α3, 1 Untereinheit des Na+/+ ATPase k und ATP1α2 in geringerem Ausmass. (D) maximale Intensität Projektion der konfokalen Bilder zeigen Biocytin Kennzeichnung des Neurons in (A) aufgezeichnet. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Gen / GenBank Anzahl Externe Primer Größe (bp) Interne Primer Größe (bp)
vGlut1
NM_182993		 Sinn,-113 259 Sinn,-54 153
GGCTCCTTTTTCTGGGGCTAC ATTCGCAGCCAACAGGGTCT
Anti-Sense, 126 Anti-Sense, 79
CCAGCCGACTCCGTTCTAAG TGGCAAGCAGGGTATGTGAC
GAD65
NM_008078		 Sinn, 99 375 Sinn, 219 248
CCAAAAGTTCACGGGCGG CACCTGCGACCAAAAACCCT
Anti-Sense, 454 Anti-Sense, 447
TCCTCCAGATTTTGCGGTTG GATTTTGCGGTTGGTCTGCC
GAD67
NM_008077		 Sinn, 529 598 Sinn, 801 255
TACGGGGTTCGCACAGGTC CCCAGAAGTGAAGACAAAAGGC
Anti-Sense, 1109 Anti-Sense, 1034
CCCAGGCAGCATCCACAT AATGCTCCGTAAACAGTCGTGC
COX 2
NM_011198		 Sinn, 199 268 Sinn, 265 181
CTGAAGCCCACCCCAAACAC AACAACATCCCCTTCCTGCG
Anti-Sense, 445 Anti-Sense, 426
CCTTATTTCCCTTCACACCCAT TGGGAGTTGGGCAGTCATCT
NPY
NM_023456		 Sinn, 16 294 Sinn, 38 220
CGAATGGGGCTGTGTGGA CCCTCGCTCTATCTCTGCTCGT
Anti-Sense, 286 Anti-Sense, 236
AAGTTTCATTTCCCATCACCACAT GCGTTTTCTGTGCTTTCCTTCA
SOM
NM_009215		 Sinn, 43 208 Sinn, 75 146
ATCGTCCTGGCTTTGGGC GCCCTCGGACCCCAGACT
Anti-Sense, 231 Anti-Sense, 203
GCCTCATCTCGTCCTGCTCA GCAAATCCTCGGGCTCCA
ATP1Α1
NM_144900 		Sinn, 1287 288 Sinn, 1329 183
CAGGGCAGTGTTTCAGGCTAA TAAGCGGGCAGTAGCGGG
Anti-Sense, 1556 Anti-Sense, 1492
CCGTGGAGAAGGATGGAGC AGGTGTTTGGGCTCAGATGC
ATP1Α2
NM_178405		 Sinn, 1392 268 Sinn, 1430 213
AGTGAGGAAGATGAGGGACAGG AAATCCCCTTCAACTCCACCA
Anti-Sense, 1640 Anti-Sense, 1623
ACAGAAGCCCAGCACTCGTT GTTCCCCAAGTCCTCCCAGC
ATP1Α3
NM_144921		 Sinn, 127 216 Sinn, 158 128
CGGAAATACAATACTGACTGCGTG TGACACACAGTAAAGCCCAGGA
Anti-Sense, 324 Anti-Sense, 264
GTCATCCTCCGTCCCTGCC CCACAGCAGGATAGAGAAGCCA
Kir6.2
NM_010602		 Sinn, 306 431 Sinn, 339 342
CGGAGAGGGCACCAATGT CATCCACTCCTTTTCATCTGCC
Anti-Sense, 719 Anti-Sense, 663
CACCCACGCCATTCTCCA TCGGGGCTGGTGGTCTTG
SUR1
NM_011510		 Sinn, 1867 385 Sinn, 2041 211
CAGTGTGCCCCCCGAGAG ATCATCGGAGGCTTCTTCACC
Anti-Sense, 2231 Anti-Sense, 2231
GGTCTTCTCCCTCGCTGTCTG GGTCTTCTCCCTCGCTGTCTG
SOMint
X51468		 Sinn, 8 240 Sinn, 16 182
CTGTCCCCCTTACGAATCCC CTTACGAATCCCCCAGCCTT
Anti-Sense, 228 Anti-Sense, 178
CCAGCACCAGGGATAGAGCC TTGAAAGCCAGGGAGGAACT

Tabelle 1. Sequenzen der ersten und zweiten PCR-Primer. Die Position der einzelnen PCR Primer und ihre Sequenzen erfolgen von 5' nach 3'. Mit Ausnahme der Somatostatin-Intron entspricht Position 1 auf den ersten Boden des Start-Codon für jedes Gen.

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Discussion

Einzelne Zelle Multiplex-RT-PCR nach Patch-Clamp zuverlässig und gleichzeitig die Expression von mehr als 30 Genen Elektrophysiologisch identifizierten Zellen5Sonde kann. Analyse der Genexpression auf der Ebene der einzelnen Zelle erfordert hocheffiziente PCR-Primer. Eine der am meisten einschränkenden Maßnahmen ist Sammlung des Zellinhalts. Seine Wirksamkeit hängt vom Durchmesser des Patch-PIPETTENSPITZE, die so groß wie möglich sein muss, während die passende Größe der Zellen. Pipetten mit einem 1-2 µm offene Spitzendurchmesser wurden ausgewiesen, für die meisten neuronalen Arten geeignet. Es ist auch unbedingt darauf zu achten, dass nur die zelluläre Inhalt gesammelt werden, und nicht das umliegende Gewebe. Dies wird erreicht durch die Steuerung Elektrophysiologisch der Erhaltung der dicht bei der Ernte. Die Bildung einer außen-Out Patch-Konfiguration bei der Pipette Entnahme weiter schützt die geerntete Zytoplasma zelltrümmer. Die Erfolgsquote der einzelnen Zelle, die Multiplex-RT-PCR auch von mRNAs Fülle des untersuchten Zelltyps hängt. Zum Beispiel die Ausbeute erhalten mit Astrozyten, die mRNAs in relativ geringen Mengen3zum Ausdruck bringen, ist in der Regel niedriger als die mit Neuronen erhalten und erfordert daher Erhöhung der Probe Größe15,16. Reversen Transkription, hat eine geringe Effizienz in Röhren48ist die begrenzende Reaktion von Single cell Multiplex-RT-PCR. Daher ist es wichtig, hochwertige Reagenzien als Aliquote bei-80 ° C lagern und verwenden sie nur für einen Tag zu verwenden. Schließlich ist die DNA-Polymerase-Aktivität von der RTase oft eine übersehene Quelle der Primer-Dimer-Bildung. Um dieses Problem zu beheben, ist die Durchführung eines hot-Start mit Primer entscheidend zur Steigerung der Effizienz der Verstärkung. Darüber hinaus kann die hemmende Wirkung des RTase auf die Taq-DNA-Polymerase-Aktivität49reduzieren.

Die einzelne Zelle Multiplex-RT-PCR-Technik ist vielseitig einsetzbar. Es wurde ausgiebig in Nagetieren10,11,13,19,20,34,50,51,52 verwendet ,53,54 , aber praktisch alle Tiermodelle und Gene davon aus, dass Gewebe und Gen-Sequenzen zur Verfügung stehen angepasst werden können. Verschiedene Patch-Clamp-Lösungen können verwendet werden, solange sie nicht mit der RT-PCR auf Zelle frei Assays stören. Beispielsweise wurden interne Lösungen basierend auf K+ oder Cs+ kationen, Cl– oder Gluconat erfolgreich verwendeten6,36,41,55.

Klassische falsch-negative Ergebnisse stammen von RNase Kontamination der Patch Pipette Filament und/oder interne Patch-Clamp-Lösung. Sorgfältig das Filament chlorieren und Validierung von in der Regel die interne Lösung dieses Problem lösen. Falsch-negative Ergebnisse können auch auftreten, wenn ein Gen auf einem niedrigen einzelligen Niveau exprimiert wird, da nur ein Teil des Zytoplasmas geerntet wird. Die Ernte Qualität kann durch die Verwendung größerer Pipetten und/oder durch eine Verringerung der gesamten Zelle Buchungszeitpunkt erhöht werden. Qualität ernten kann beurteilt werden, durch die Einbeziehung eines Gens bekannt, auf einem niedrigen Niveau in Einzelzellen20ausgedrückt werden. Falsch-positive Ergebnisse können qualitativ schlechte Gewebe auftreten, in denen die Höhe der Kontamination zelltrümmer hoch ist. Prüfung der Anwesenheit von Schutt erfolgt durch das Einfügen einer Patch-Pipette in die Scheibe ohne Durchführung einer Dichtung und Freigabe der positive Druck vor dem Pipette entfernen. Das Vorhandensein von amplifiable Materialien ist dann von Multiplex-RT-PCR42sondiert. Silanizing der Patch-Pipette wurde auch verwendet, um die Sammlung von extrazellulären Verunreinigungen56zu reduzieren. Einzelne Zelle PCR ist eine sehr sensible Technik, die so wenig wie eine einzelne Kopie der doppelten stranded DNA57erkennen kann. Im Falle der Intron-weniger Gene produzieren die gDNA im Zellkern enthalten auch Fehlalarme. Die Sammlung von gDNA zu vermeiden, indem man die Pipette vom Zellkern während der Ernte hilft, dieses Problem zu lösen. Das Vorhandensein von gDNA kann zuverlässig durch die Verstärkung einer intronischen Sequenz25sondiert werden.

Der Nachweis von mRNA-Moleküle durch RT-PCR wird unzuverlässig auf 10 Exemplare44, vermutlich aufgrund der geringen Effizienz der RTase48und führen zu einer unter Nachweis von niedrig-Fülle Transkripte26,42. Dies kann im Fall von Gene Intron-weniger problematisch sein. In der Tat, reduziert die Ernte des Kerns zu vermeiden die Höhe der Zytoplasma, die gesammelt werden kann und daher die Nachweisempfindlichkeit. Die Kombination von einzelligen RT-PCR nach Patch-Clamp mit Biocytin Kennzeichnung erfordert, dass die Form der Zelle so weit wie möglich beibehalten wird (Abbildung 3). Unvermeidlich, reduziert dies die Menge des Materials, die gesammelt werden kann, wodurch die Erfolgsquote. Ein Kompromiss zwischen Zytoplasma Sammlung und Erhaltung der Zellmorphologie ist obligatorisch.

Multiplex-Einzeller-RT-PCR-Daten sind nicht quantitativ, wie sie nur Informationen geben darüber, ob cDNAs sind vorhanden oder fehlen in das gesammelte Material. Allerdings kann das Auftreten der Erkennung auf Bevölkerungsebene aufgrund der oben beschriebenen Nachweisgrenzen, die Fülle der Gene auf die einzelne Zellenebene widerspiegeln. Alternative Ansätze ermöglichen die Erzeugung mehr quantitative Daten, aber die technischen Zwänge, die durch ihre spezifische Verstärkung Strategien (d.h.relative Quantifizierung der homologen Gene oder RT-qPCR) weitgehend beschränken die Anzahl der Gene, die gleichzeitig sein können analysiert,41,53,55,58,59,60,61,62,63 ,64,65,66. Die aktuelle Kombination von Patch-Clamp-Aufnahmen und einzelne Zelle RNaseq, bezeichnet als Patch-Seq30,31, ermöglicht quantitative transkriptomischen Analyse der Zellen Elektrophysiologisch gekennzeichnet. Es ist eine neue, viel versprechende Ansatz, aber es erfordert Zugriff auf Hochdurchsatz-Sequenzer und erzeugten Daten erfordern zeitraubende Analyse.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Wir danken Dr. Alexandre Mourot für seine Bemerkungen über das Manuskript. Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse von der Agence Nationale De La Recherche (ANR 2011 MALZ 003 01; ANR-15-CE16-0010 und ANR-17-CE37-0010-03), BLG wird von der Fondation Pour la Recherche Sur Alzheimer-Stipendium unterstützt. Wir danken der Tierstation IBPS (Paris, Frankreich).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MACAW v.2.0.5 NCBI Multiple alignement for primer design
Dithiothreitol VWR 443852A RT
Random primers Sigma-Aldrich (Merck) 11034731001 RT
dNTPs GE Healthcare Life Sciences 28-4065-52 RT and PCR
RNasin Ribonuclease Inhibitors Promega N2511 RT
SuperScript II Reverse Transcriptase Invitrogen 18064014 RT
Taq DNA Polymerase Qiagen 201205 PCR
Mineral Oil Sigma-Aldrich (Merck) M5904-5ML PCR
PCR primers Sigma-Aldrich (Merck) PCR / desalted and diluted at 200 µM
Tubes, 0.5 mL, flat cap ThermoFisher Scientific AB0350 RT and PCR
BT10 Series - 10 µL Filter Tip Neptune Scientific BT10 RT and PCR
BT20 Series - 20 µL Filter Tip Neptune Scientific BT20 RT and PCR
BT200 Series - 200 µL Filter Tip Neptune Scientific BT200 RT and PCR
BT1000 Series - 1000 µL Filter Tip Neptune Scientific BT1000.96 RT and PCR
DNA Thermal Cylcer Perkin Elmer Cetus PCR
Ethidium Bromide Sigma-Aldrich (Merck) E1510-10ML Agarose gel electrophoresis
Tris-Borate-EDTA buffer Sigma-Aldrich (Merck) T4415-1L Agarose gel electrophoresis
UltraPure Agarose Life Technologies 16500-500 Agarose gel electrophoresis
ΦX174 DNA-Hae III Digest NEB (New England BioLabs) N3026S Agarose gel electrophoresis
EDA 290 Kodak Agarose gel electrophoresis
Electrophoresis Power supply EPS 3500 Pharmacia Biotech Agarose gel electrophoresis
Midi Horizontal Elecrophoresis Unit Model SHU13 Sigma-Aldrich (Merck) Agarose gel electrophoresis
Smooth paper with satin appearance Fisherbrand 1748B Patch clamp internal solution
Potassium Hydroxyde Sigma-Aldrich (Merck) 60377 Patch clamp internal solution
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid Sigma-Aldrich (Merck) E3889 Patch clamp internal solution
HEPES Sigma-Aldrich (Merck) H4034 Patch clamp internal solution
Potassium D-gluconate Sigma-Aldrich (Merck) G4500 Patch clamp internal solution
Magnesium chloride solution Sigma-Aldrich (Merck) M1028 Patch clamp internal solution
5500 Vapor Pressure Osmometer Wescor Patch clamp internal solution
Biocytin Sigma-Aldrich (Merck) B4261 Patch clamp internal solution
Sucrose Sigma-Aldrich (Merck) S5016 Slice preparation
D-(+)-Glucose monohydrate Sigma-Aldrich (Merck) 49159 Slice preparation
Sodium chloride Sigma-Aldrich (Merck) S6191 Slice preparation
Potassium chloride Sigma-Aldrich (Merck) 60128 Slice preparation
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich (Merck) 31437-M Slice preparation
Sodium phosphate monobasic Sigma-Aldrich (Merck) S5011 Slice preparation
Magnesium chloride solution Sigma-Aldrich (Merck) 63069 Slice preparation
Calcium chloride solution Sigma-Aldrich (Merck) 21115 Slice preparation
Kynurenic acid Sigma-Aldrich (Merck) K3375 Slice preparation
Isoflurane Piramal Healthcare UK Slice preparation
VT 1000S Leica Biosystems 14047235613 Slice preparation
Hydrogen peroxide solution Sigma-Aldrich (Merck) H1009 Patch Clamp set-up cleaning
Thin Wall Glass Capillaries with filament World Precision Instruments TW150F-4 Patch Clamp
PP-83 Narishige Patch Clamp
Eppendorf Microloader Eppendorf 5242956003 Patch Clamp
BX51WI Upright microscope Olympus Patch Clamp
XC-ST70/CE CCD B/W VIDEO CAMERA Sony Patch Clamp
Axopatch 200B Amplifier Molecular Devices Patch Clamp
Digidata 1440 Molecular Devices Patch Clamp
pCLAMP 10 software suite Molecular Devices Patch Clamp
10 mL syringe Terumo SS-10ES Expelling
E Series with Straight Body (Holder) Phymep 64-0997 Expelling
Sodium phosphate dibasic Sigma-Aldrich (Merck) S7907 Histochemical revelation
Sodium phosphate monobasic Sigma-Aldrich (Merck) S8282 Histochemical revelation
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich (Merck) P6148 Histochemical revelation
Triton X-100 Sigma-Aldrich (Merck) X100 Histochemical revelation
Gelatin from cold water fish skin Sigma-Aldrich (Merck) G7041 Histochemical revelation
Streptavidin, Alexa Fluor 488 conjugate ThermoFisher Scientific S11223 Histochemical revelation
24-well plate Greiner Bio-One 662160 Histochemical revelation

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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Devienne, G., Le Gac, B., Piquet, J., Cauli, B. Single Cell Multiplex Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction After Patch-clamp. J. Vis. Exp. (136), e57627, doi:10.3791/57627 (2018).

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