Summary
Här beskriver vi isolering av enteriska-glial celler från intestinal-submucosa använda sekventiell EDTA inkubationer för att kelat divalenta katjoner och sedan inkubation i icke-enzymatiska cell återställningslösning. Plätering resulterande cellsuspension på poly-D-lysin och laminin resulterar i en höganrikat kultur av submukösa gliaceller för funktionell analys.
Abstract
Det enteriska nervsystemet (ENS) består av nervceller och enteriska gliaceller (EGCs) som finns i glatt muskulatur väggen, submucosa och lamina propria. EGCs spelar viktiga roller i gut homeostas genom frisättning av olika trofiska faktorer och bidrar till den epiteliala barriären integritet. De flesta studier av primära enteriska gliaceller kulturer använder celler som isolerats från plexus myenteric efter enzymatisk dissociation. Här beskrivs en icke-enzymatisk metod att isolera och kultur EGCs från intestinal submucosa och lamina propria. Efter manuell borttagning av längsgående muskellagrar befriades EGCs från lamina propria och submucosa använder sekventiell HEPES-buffrat EDTA inkubationer följt av inkubation i kommersiellt tillgängliga icke-enzymatiska cell återställningslösning. De EDTA inkubationer var tillräckliga för att beröva de flesta av epitelial slemhinnan från lamina propria, så att cellen återhämtning lösningen att befria de submukösa EGCs. Eventuella kvarvarande lamina propria och glatt muskulatur var kasseras tillsammans med den myenteric glia. EGCs var lätt identifieras genom sin förmåga att uttrycka glial fibrillary sura protein (Fredsgenomförande). Endast omkring 50% av cellsuspensionen innehöll Fredsgenomförande + celler efter avslutad vävnad inkubationer och före plätering på poly-D-lysin/laminin substraten. Men efter 3 dagar att odla cellerna i glial cell neurotrofa faktorn (GDNF)-som innehåller kultur media, cell befolkningen följa substrat-belagda plattorna består av > 95% enteriska glia. Vi skapat en hybrid mus linje genom avel en hGFAP-Cre mus till raden ROSA-tdTomato reporter att spåra procentandelen Fredsgenomförande + celler med hjälp av endogena cell fluorescens. Således kan icke-myenteric enteriska glia vara isolerad av icke-enzymatiska metoder och odlade i minst 5 dagar.
Introduction
Intresset för funktionen av enteriska gliaceller (EGCs) har ökat stadigt på grund av deras erkända roller i gut integritet och homeostas1,2. Dessutom varierar EGCs enligt deras läge längs längden av GI-tarmkanalen3,4. EGCs release olika trofiska faktorer inklusive glial cell neurotrofa faktorn (GDNF), bidra till att tarmen motilitet1,5 och svara på mikrobiell biprodukter6,7. Studier har visat att EGC befolkningen är heterogena och att deras funktion varierar beroende på huruvida de submukösa eller uppehålla sig inom den myenteric plexus1,7. Till exempel bidra EGCs inom submucosa till åtsittande föreningspunkter8. Differentiell Fredsgenomförande uttryck och fosforylering i EGCs har kopplats till Parkinsons sjukdom, vilket tyder på deras möjlig länk till gut fenotypen av denna sjukdom9. Nyligen konstaterades att förlusten av den nukleära protein menin i isolerade kulturer av EGCs från proximala intestinal submucosa var tillräcklig för att framkalla uttryck av hormonet gastrin10. Därför föreslogs att EGCs kan vara ursprunget till duodenal gastrinomas, en typ av neuroendokrin tumör10. Sammantaget understreck dessa exempel relevansen av studera beteende och funktion av isolerade EGCs neuropatisk sjukdomar och cancer11.
Utmaningen i fältet är fortfarande hur man isolera och studera eller båda EGC populationer i vitro. Lineage trace experiment visat att EGCs i submucosa och lamina propria härrör från stamceller i myenteric plexus7. Även om det finns flera publicerade isolering protokoll tillgängliga att generera kulturer av myenteric EGCs12,13,14,15,16,17, 18,19, ingen specifikt riktar isolering av submukösa/lamina propria EGC befolkningen. Befintliga protokoll för EGC isolering använda specifikt en kombination av mekanisk separation eller lokalt av den glatta muskulaturen i kombination med enzymatisk dissociation, så småningom kasta det slemhinna celllagrar.
Målet med detta manuskript är att Visa stegen för att icke-enzymatiskt isolera primära EGCs från lamina propria för in vitro- studier. Eftersom det finns inga markörer som specifikt särskilja myenteric EGCs från i submucosa, var rumsliga separation av epitelial slemhinnan från den glatta muskulaturen utnyttjas för att isolera submukosala EGCs. Dessutom, genom att kombinera EDTA kelering med icke-enzymatiska dissociation, isolerades EGCs från submucosa i motsats till den glatta muskulaturen, vilket var kasseras tillsammans med de associerade inter-myenteric EGCs. Ytterligare separation av submucosa och lamina propria EGCs uppstod genom att odla cellerna på glial cell-vänlig substrat, t.ex., poly-D-lysin och laminin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurförsök beskrivs godkändes av University of Michigans kommittén för användning och vård av djur.
1. beredning av sterila Poly-D-lysin (PDL) och Laminin lösningar
- Minst en dag före cell isolering, förbereda poly-D-lysin (PDL) och laminin belagda plattor.
Obs: Både 6-väl och 12-väl plattor var beredda beroende på de experimentella mål. Normalt användes 12 brunnar för kvantitativ analys med hjälp av western blotting; medan 6-brunnar användes för att hålla autoklaveras (steril) coverslips för immunohistokemi. 24 brunnar användes till kultur EGCs för Ca2 + flux imaging. - Späd stamlösningar med ultrarent vävnadsodling grade, DNAS-fri och RNase-fritt vatten i vävnadsodling huva med HEPA-filtrerad luft.
-
Sterilisering glas coverslips
- Håll täckglaset med steril pincett och fördjupa coverslips i en bägare 100% etanol för 15 min. Tillåt etanolen avdunsta i vävnadsodling huven och sedan placera i 6-väl plattorna.
- Alternativt kan du placera flera coverslips individuellt på 2 mm tjocka läskpapper i en plastbehållare och sedan autoklav.
2. beläggning plattor
Obs: utföra stegen under en steril vävnadsodling LAF.
- Tina 1 mg/mL PDL lager och späd 1:10 med sterilt, vävnadsodling grade vatten så att den slutliga koncentrationen är 100 µg/mL. Använd 2 mL per brunn för att bestryka 6-väl tallrikar, 1 mL att täcka ett väl 12-well platta och 0,5 mL för en brunn i de 24 brunnar. Lagra de återstående utspädda PDL i 12 mL alikvoter vid-20 ° C.
- Efter att PDL att bestryka brunnarna för minst 1 h, ta bort PDL med en steril pipett. Låt plattorna till luft torka helt under en vävnadskultur LAF.
Obs: Efter att ta bort PDL lösningen med en steril pipett, kan det vara används två gånger mer inom 1 vecka efter passerar genom ett 0,22 µm filter och lagras vid 4 ° C. - Tina laminin beståndet på is för att undvika gel bildas.
Obs: Outspädd laminin blir fast när värmde över 8 ° C. - Späd den laminin lager (0,5 mg/mL) 1:50 med steril Dulbeccos fosfat buffrad koksaltlösning (DPBS) att erhålla en slutlig koncentration på 10 µg/mL. Lagra den utspädda laminin i 12 mL alikvoter vid-20 ° C.
- Lägg till utspädda laminin till brunnarna som innehåller torkad PDL. Använd 1 mL att täcka 6-väl yta och 0,5 mL att täcka botten av 12-väl plattorna. För coverslips, lägga till 400 µL utspädda laminin i coverslips att uppnå yttäckning.
- Inkubera belagda plattorna vid 37 ° C i 2 h, om plattan används samma dag (snabb beläggning). Om inte, förslut plattorna med plastfolie och förvara över natten vid 4 ° C (långsam beläggning).
Obs: Tätning är avgörande för att undvika uttorkning och kontamination. - Ta bort laminin lösningen noggrant med en pipett för att undvika att repa. Försiktigt Tvätta brunnarna tre gånger med sterila DPBS.
- Lägga till komplett gliaceller tillväxtmassmedia till varje brunn och upprätthålla plattorna vid 37 ° C tills det att lägga till EGC suspensionen.
Obs: Poly-D lysin och laminin belagda plåtar kan lagras i 3 dagar vid 4 ° C. Täck plattorna flera dagar framåt och sedan förvaras vid 4 ° C, tvätta plattorna med sterila DPBS tre gånger. Tillsätt 2 mL steril DPBS till varje brunn efter den sista tvättningen. Försegla plattan med parafilm och förvaras vid 4 ° C. Det är viktigt att säkerställa att laminin inte torkar ut.
3. beredning av isolering lösningar
- Bered den EDTA/HEPES/DPBS dissociation. För 500 mL lösning, använda sterila DPBS (utan kalcium och magnesium) att göra en slutlig lösning av 10 mM HEPES och 5 mM EDTA. 490 mL av DPBS, tillsätt 5 mL 1 M HEPES buffert och 5 mL 0,5 M EDTA stamlösning. Förvaras vid 4 ° C fram till användning.
- Förbered glial cell resuspension med reagens som anges i tabell 1.
- Förbered gliaceller tillväxt med reagens som anges i tabell 2.
Obs: Gliaceller tillväxt medier som innehåller GDNF kan lagras under en vecka vid 4 ° C.
4. borttagning av Intestinal segmentet
Obs: Möss fick fri tillgång till mat och vatten innan dödshjälp av isofluran släpp-metoden och avlägsnande av ett viktigt organ. C57BL/6 möss större än 8 veckor användes. Båda könen användes utan märkbara skillnader i preparatet.
- Avliva musen med en överdos av isofluran och placera liggande i en dissekera bricka. Fästa extremiteter och sterilisera buken med 70% etanol. Tält i huden med pincett och sedan öppna buken med sax.
- Lyft levern och identifiera distala magsäcken/pylorus. Ta sedan bort 7 cm av proximala tarmen. Var noga med att inte riva tarmen.
-
Håll pylorus med pincett medan snipping bort tarmkäxet.
- Använd trubbig dissektion med baksidan av en sax för att skrapa bort fastsittande bukspottkörteln.
- Placera intestinal segmentet i iskall DPBS utan Ca2 + eller Mg2 + (figur 1A).
Obs: Andra segment av tarmen eller kolon kan också tas bort med hjälp av samma teknik.
- Använd en 5 eller 10 mL spruta bifogas med en nål med trubbiga änden 20 G att spola ut fekalt innehåll med is kallt DPBS (figur 1B).
- Dela upp tarmen i 3 cm segment för att ta bort den längsgående muskler med hjälp av teknik som först beskrevs av Smith et al. 12 och ändrat i Malin o.a. 10.
Obs: Intestinal segment från upp till två möss används per 30 mL HEPES/EDTA/DPBS isolering lösning. - Bryta ca 4 cm till separata träpinne från bomull spets. Blötlägg träpinne i DPBS (figur 1 c).
- Glid en av segmenten intestinal smidigt till fuktade minnet (figur 2A-C).
- Ta bort fastsittande krös fortfarande sitter med nål-näsa tång (figur 2D).
-
Använd en ren rakblad eller skalpell att göra två längsgående nicks längs tarmen där krös var fäst (figur 2E).
- Våt bomull spets med DPBS. Gnugga den fuktade bomull spetsen längdriktningen längs muskeln att lossa plexus längsgående muskel/myenteric (LMMP). Flytta sedan bomull spets horisontellt för att retas bort LMMP från cirkulära muskeln längs längden av intestinal segmentet under LMMP borttagning.
- Håll spetsen på pinnen mellan tummen och pekfingret medan stabilisera segmentet med mellersta och fjärde fingret (figur 2F). När du är klar, kommer LMMP enkelt lossnar intestinal segmentet.
- Kassera LMMP strippad från intestinal röret och bifogas bomullstuss om skörd EGCs från plexus myenteric önskas.
- Använd ett rakblad för att flay öppna segmentet intestinal längsled för att ta bort från träpinne.
- Lagra den avskalade Tarmvävnaden (huvudsakligen mucosa och submucosa plus cirkulär muskel) i DPBS på is. Upprepa steg 4,4 – 4.11 tills alla intestinal segment är beredda.
5. avlägsnande av epitelial slemhinnan
- Skär tarmarna i mindre bitar av ~0.5 cm med fina sax.
- Placera vävnaden i ett sterilt 50 mL koniskt centrifugrör innehållande 30 mL iskallt EDTA/HEPES/DPBS lösning.
- Rock den vävnad-innehållande lösningen vid 4 ° C i 10 min på ~ 60 vippar per minut.
- Pre Fukta 5 mL plast pipett av pipettering EDTA/HEPES/DPBS bufferten upp och ner en gång, och sedan använda pre-fuktad pipetten för att Pipettera vävnaden och buffert suspension upp och ner (sönderdelning) 20 gånger rubba epitelial slemhinnan.
- Samla in vävnaden från EDTA inkubering av hälla blandningen genom en 100 µm nylon cell SIL. Kassera den grumliga slemhinnor-fyllda genomströmning (figur 3).
- Placera den vävnad kvar i silen i en ny 50 mL koniskt centrifugrör innehållande 30 mL is kallt EDTA/HEPES/DPBS med hjälp av nål-näsa tång.
- Upprepa EDTA/HEPES/DPBS ruvning en andra gång genom att vagga vävnaden vid 4 ° C i 10 min på ~ 60 vippar per min till remsor av ytterligare epitelial slemhinna.
- Pre Fukta en 5 mL pipett med bufferten och sedan Pipettera vävnad suspensionen upp och ner 20 gånger rubba slemhinnor celler.
Obs: Vävnaden tenderar att hålla sig inne i pipetten som mer av epitelet avlägsnas. - Samla in vävnaden efter den andra inkubationen genom att hälla blandningen genom en 100 µm nylon cell sil och kasta flödet genom. Den andra genomflöde bör vara märkbart mindre grumligt än först (figur 3).
- Upprepa i 10 min EDTA inkubationer tills lösningen är nästan klart (ca 3 till 4 inkubationer beroende på mängden vävnad och effektiviteten av sönderdelning) (figur 3).
6. insamling av enteriska gliaceller från Lamina Propria och Submucosa
- Överföra vävnad från nylon silen till en 15 mL koniskt centrifugrör innehållande 5 mL av kommersiellt tillgängliga cell återställningslösning och rock för 25 – 30 min vid 4 ° C.
-
Pulverisera försiktigt 10 x för att dissociera enteriska gliacellerna från lamina propria.
- Filtrera genom ett 40 µm filter och samla upp filtratet i en ren 50 mL tub.
- Skölj vävnaden på nylon filtret med 1 mL DPBS.
- Kassera vävnaden och överföra ~ 5 – 6 mL av filtratet till en ren 15 mL koniskt centrifugrör.
- Snurra filtratet vid 2000 x g i en svängande hink Centrifugera under 5 minuter vid 4 ° C.
- Re centrifugerade glial cell-innehållande i minst 1 mL resuspension buffert av försiktigt pipettering pelleten upp och ner med en 500 µL pipettspetsen. Undvika att införa bubblor.
Obs: Volymen resuspension som behövs för antalet brunnar och plattor. Exempelvis 1,2 mL för en 6-well platta; 2,4 mL för två 6-väl plåtar. 2,4 mL för en 12-bra platta. - Pipettera över 200 µL cellsuspension till varje brunn på den 6-väl eller 100 µL för en 12-väl PDL-laminin belagda plåtar som innehåller gliaceller tillväxt medier.
- Stör inte rätterna efter att lägga till celler till plattorna och placera i 37 ° C inkubatorn att tillåta det maximala antalet celler att följa.
Obs: En hälsosam beredning av celler kommer att bifoga inom 6 – 8 h men vänta minst 24 h innan du ändrar media av försiktigt pipettering av media tillsammans med icke-anhängare celler. - Använda cellerna för experiment 3 – 4 dagar efter att de placeras i kulturen (figur 4). Utföra Immunofluorescerande analys med hjälp av antikroppar av intresse för specifika protein markörer (tabell 3). Exempelvis användes Fredsgenomförande, S100b och p75NTR eller Sox10 här. E-cadherin eller alfa smooth muscle aktin antikroppar användes för att bedöma graden av förorening från andra celltyper.
7. Immunofluorescerande färgning
- Aspirera media av kulturerna och skölj två gånger med PBS.
- Fixa kulturerna i 20 min i rumstemperatur med 4% PARAFORMALDEHYD.
- Ta bort fixeringsvätskan och skölj sedan 3 gånger med PBS.
- Permeabilize cellerna med PBS som innehåller 0,2% Triton x-100 vid rumstemperatur.
- Inkubera permeabilized cellerna med blockerande lösningar består av anti kyckling IgY, anti-kanin eller antimus IgG för 2 h i rumstemperatur.
-
Inkubera cellerna med primära antikroppar övernattning, exempelvis Fredsgenomförande (1:1, 000).
- Skölj cellerna 3 gånger med PBS. Om utför colocalization vidare till steg 7,7.
- Inkubera nästa uppsättning av primära antikroppar för minst 2 h i rumstemperatur, men helst över natten vid 4 ° C. Använda en 1: 1000 utspädning av kanin anti-S100 eller en 1: 500 utspädning av musen anti-p75NTR.
Obs: Alla antikroppar späds i PBS. - Skölj cellerna 3 gånger med PBS ta bort primär antikroppar. Sedan Inkubera sköljda cellerna med lämpligt fluorescently-taggade sekundära antikropparna för 2 h i rumstemperatur (tabell 3).
- Skölj 3 gånger med PBS ta bort sekundära antikropparna.
- Montera coverslips på diabilder med 1 – 2 droppar av montering media med DAPI och Visa cellerna i fluorescerande Mikroskop.
8. flödescytometri
- Ta bort fastsittande gliaceller för flödescytometri av sköljning cellerna en gång med DPBS och Lägg sedan till 0,25% trypsin-EDTA per tillverkarens protokollet. Inkubera cellerna i trypsin-EDTA-lösningen vid 37 ° C i 3 min. avsluta matsmältningen genom att samla cellerna i komplett glial cell tillväxt medier.
- Samla in cellerna genom centrifugering vid 400 x g i 5 min och sedan resuspendera cellerna i PBS.
- Fixa cellerna med 4% PARAFORMALDEHYD i 10 min och sedan permeabilize med 0,2% Triton x-100 i PBS som beskrivs i steg 7,4.
- Blockera cellerna med PBS med 1% BSA och den vävnad specifika immunglobulin för 20 min, t.ex. åsna anti kyckling IgY (IgG) (H + L) (1:1, 000) eller åsna anti get IgG (H + L) (1:1, 000).
- Inkubera cellerna med de primära antikropparna Fredsgenomförande (1:2, 000), E-cadherin (1: 400), α-smooth muscle aktin (1: 500) eller Pgp9.5 (1: 500) under natten vid 4 ° C.
-
Tvätta bort antikroppen med PBS.
- Inkubera i antigen / antikroppkomplex med fluorescently-taggade sekundära antikroppar inkuberas vid rumstemperatur i 30 min.
- Använd en separat alikvot av cellerna inkuberas med sekundär antikropp för att tjäna som isotypen kontroll. Båda populationerna av cellerna tvättas och resuspended i PBS före flödescytometri.
- Analysera de två populationerna av celler på en flödescytometer av gating i levande celler.
9. förbereda mus vävnader från hGFAP-Cre:tdTomato möss
Obs: Den Lox-STOP-Lox-tdTomato cDNA uttrycks från den ROSA locus22,23 (Jackson Labs, #007914) och genererar endogena fluorescens när bred till en mus som uttrycker den Cre-recombinase (hGFAP-Cre). In situ analysen utförs genom att generera frysta vävnadssnitt.
- Fixa Tarmvävnaden i 4% PARAFORMALDEHYD för 1 h och sedan torka över natten i 1 M sackaros i PBS.
- Bädda in vävnaden i kommersiellt köpt optimal styckning vävnad (ULT) förening består av 10% polyvinylalkohol och 4,2% polyetylenglykol och sedan snap frysa i flytande kväve.
- Förbereda 5 µm kryosnitt och montera sedan använder en antifade montering media med DAPI.
- För flödescytometri, förbereda EGCs från hGFAP-Cre:tdTomato+ möss enligt beskrivningen i steg 4.1 – 6,5.
- Trypsinize cellerna från plattan efter 3 dagar i kulturer som i steg 8,1 och sedan fixa i 10 min i 4% PARAFORMALDEHYD.
- Analysera celler isolerade från Cre negativa möss parallellt med celler isolerade från hGFAP-Cre:tdTomato+ möss på en flödescytometer.
Obs: Gates konstruerades för att undvika döda celler och skräp.
10. Ca2 + Flux Imaging
- Inkubera EGCs klädd på en 24-well platta med 3 µM Fluo-4-AM vid 37 ° C i 30 min.
- Bild Ca2 + signalen i kommersiellt tillgängliga Tyrodes lösning med ett snurrande bricka confocal Mikroskop och en magnetisering våglängd 480 nm (F480) efter tillägger CCK eller gastrin peptid. Bildanalys rapporterades hos Malin o.a. 10 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Preps ansågs misslyckade om Fredsgenomförande +-celler inte följa och sprida inom 24 h (figur 4A). Numrera av gliaceller kan inte fastställas förrän efter 24 h när cellerna följs och visade tecken på spridning i platta aggregat (figur 4B). Celler i utkanten av klustren tenderade att förlänga långa processer och uttryckte klassiska gliaceller markörer, exempelvis Fredsgenomförande, S100b och p75NTR (figur 4 c, 4 D)10,16. 2nd dag följs gliaceller tätt till ytan så att den icke-anhängare befolkningen att sköljas bort med PBS. De flesta flytande cellerna var epitel och lamina propria celler tillsammans med cellfragment. Förekomsten av dessa flytande cell klumpar minskade avkastningen av vidhäftande gliaceller som betonar vikten av att utföra de EDTA inkubationer förrän genomströmmande är nästan klart, signalering att epitelcellerna har tagits bort från lamina propria kärna. Dessutom centrifugering vid hastigheter lägre än 1 500 x g efter inkubation i cell återhämtning lösning inte effektivt samla alla livskraftiga celler i en pellet som leder till minskad avkastning. Typiskt, 40.000 till 100.000 celler morfologiskt överensstämmer med EGCs följs ordentligt av dag 3 i kultur.
Immunhistokemisk analys med gliaceller-associerade antikroppar, anges att cellen kluster som var anhängare av dag 3 var Fredsgenomförande, S100b och Sox 10 positiva10,16 (figur 5A). I den aktuella studien observerades denna samma grad av renhet av permeabilizing celler och analys av flödescytometri (figur 5B-F). Omedelbart efter att isolera submukosala/Lamina propria gliacellerna, visade flödescytometri att omkring 51% av cellerna var Fredsgenomförande + (figur 5B), tyder förekomsten av Fredsgenomförande-negativ celltyper, t.ex., epitelial, hematopoetiska, endotelceller, neuronala celler, myofibroblaster känt att det finns i epitel och lamina propria. Efter 3 dagar i kultur, antalet Fredsgenomförande + celler representerade över 95% av cell befolkningen analyseras efter att ta bort det ursprungliga mediet, försiktigt skölja med PBS och sedan lägga till färska media (bild 5 c). Intressant nog avslöjade Flödesanalys höga och låga Fredsgenomförande protein-uttryckande populationer (figur 5 c). Immunofluorescerande analys av celler visade faktiskt att peripheryen av klustren tenderade att uttrycka högre nivåer av Fredsgenomförande (figur 4 c, 4 D). Tillsammans, kan de två typerna av analys tyda skillnader i EGC mognad eller differentiering status. Sammantaget procentandelen av α-SMA + (myofibroblast cell markör), E-cadherin + (epitelceller markör), och Pgp 9,5 + (neuronala cell markör) celler var mindre än 5% (figur 5 d-F). Dessa resultat överensstämde med den föregående studien utförs med hjälp av immunofluorescens märkning av EGCs visar ca 93% Fredsgenomförande + celler 10. Flödesanalys understryker vikten av att låta cellerna att följa plattorna eftersom det tillåter borttagning av kontaminerande cellpopulationer bestående av cirka 5% av kulturer.
Ett mål i denna studie var att använda Fredsgenomförande-aktiverat reporter att underlätta flödescytometri av cellerna för vidare analys och jämföra graden av EGC berikning med en endogen fluorescerande markör (figur 6). HGFAP-Cre mus linjen beskrevs ursprungligen av Messing och medarbetare 20. I korthet placerades den Cre recombinase under kontroll av 2,2 kb av promotorn mänskliga glial fibrillary acid protein (hGFAP). Således, valfri cell transkribera denna hGFAP promotorn uttryckt den röda fluorescerande reporter tdTomato. Cell befolkningen märkt med tdTomato reporter var visualiserat i situ Använd frysta delar av tarmen och kolon (figur 6A, 6B) innan du utför EGC isolering procedurer beskrivs ovan. Efter utför EDTA deponicell återhämtning isolering och odla cellerna i 3 dagar, var EGCs från dessa möss lätt identifieras genom deras endogena fluorescens (figur 6 c). Även om Fredsgenomförande + celler är utan tvekan mer talrika i proximala inälvan4,21, tdTomato + EGCs observerades också i tjocktarmen (figur 6B). Med den tdTomato+ fluorescerande reporter aktiveras av den hGFAP-Cre avslöjade också en bimodal befolkning på hGFAP-tdTomato + celler (figur 6 d) som observerats med hjälp av immunofluorescens analys av både protein (figur 5 c). Även om det har rapporterats att inte alla EGCs express Fredsgenomförande protein4, kan denna punkt återspegla skillnader i nivån på Fredsgenomförande uttryck. I genomsnitt uppvisade cirka 66% av cellerna analyseras den högsta nivån av tdTomato fluorescens. EDTA deponicell återhämtning protokollet kunde därför användas för att isolera grupper av EGCs i hela tunntarmen och tjocktarmen märkt av reportern att undersöka skillnader i genuttryck.
Detta protokoll genereras ett tillräckligt antal relativt ren Fredsgenomförande + gliaceller för biokemiska studier och western blot analys 10. för att demonstrera glial cell lyhördhet, en 3-dagars glial cell prep behandlades med hormoner cholecystokinin (CCK) eller gastrin inducera Ca2 + flux (figur 7A-7B)10. Resultaten visade att dessa Fredsgenomförande + vidhäftande celler svarat på extracellulära agonister demonstrera sin förmåga att ställa ut kända enteriska gliaceller funktion.
Figur 1: Ställ upp och beredning av mus tarmar. (A) bild av isolering på isen inklusive extraherade tarmar. (B) bild av 5 mL-spruta bifogas en 20 G trubbiga änden nål att spola ut fekalt innehåll. (C) ingenjören slutet av trä bomullspinne (~ 4 cm) blötläggning i DPBS bufferten. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: stegen för att rengöra tarmarna och ta bort den längsgående muskel/myenteric plexus (LMMP). (A-C) Glidande en intestinal segment på en fuktad träpinne. (D) avlägsnande av vidhäftande krös. (E) Hack tarmen med ett rakblad. (F) att ta bort LMMP med en fuktig bomullstuss. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: sekventiella flöde-genomföringar efter EDTA inkubationer. Visas är exempel på den flöde-genomföringar från 4 sekventiell inkubationer med hjälp av tre 7 cm intestinal segment inkuberas i 10 min med 5 mM EDTA / 10mM HEPES i DPBS och sedan den triturated 20 gånger. Representativa flöde-genomföringar efter hälla genom en 100 µm nylon mesh SIL visas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: EGC bilder 24 h efter plätering. Ljus mikroskopisk undersökning av återsuspenderade celler 24 h efter bordläggningen. (A) visas är ett representativt exempel på en dålig prep visar flytande epitelial cell klumpar (pil) och skräp. Inga anhängare EGCs observerades efter 24 h. (B) visas är ett representativt exempel på en utmärkt prep 24 h efter cell isolering och resuspension som fläckar av EGCs följs den PDL/Laminin belagda plattor. Bilder fångades på en inverterad fluorescerande Mikroskop med en digitalkamera. Skala barer = 500 µm (A-B). (C) hög effekt bild av en lapp av EGC cellerna färgas med Fredsgenomförande antikropp (grön) visar celler i periferin med en högre intensitet av märkning. Flera av cellerna visade dubbla kärnor (pilspets, DAPI, blå). (D) Colocalization av Fredsgenomförande (grön) med S100 (röd) eller p75NTR (röd). Skala barer = 20 µm (C-D). Cellerna var monterade med antifade reagens och DAPI (blå kärnor). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: flödescytometri av enteriska gliaceller som isolerats från duodenal lamina propria av vuxen musen. (A) immunofluorescens av förpliktelserna, S100B och Sox10 på EGC kulturer efter 3 dagar. Pilarna anger Sox 10 positiva kärnor. Skala barer = 20 µm (används med tillstånd från Malin o.a. 10). (B) procent av förpliktelserna positiva celler före plätering på plattorna (fluorescensintensiteten (eller framåt scatter, x-axeln) kontra side scatter (y-axeln). (C) procentandelen Fredsgenomförande positiva (D) α-SMA positiva (E) E-cadherin positiva (F) och Pgp 9,5 positiva celler 3 daysafter plätering. Gates konstruerades för att undvika döda celler och skräp. Visas är den genomsnittliga andelen av fluorescerande befolkningen i förhållande till antalet celler (side scatter). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: Identifiering av enteriska gliaceller som isolerats från duodenal lamina propria av den hGFAP-Cre+: tdTomato+ vuxen mus. Endogena tdTomato fluorescerande (röd) bilder fångades på fas kontrast fluorescerande Mikroskop med en digital kamera i tarmen (A). (infälld) Samma som A utom samman med DAPI bild (blå kärnor). (B) kolon samman med DAPI. (C) Enteric gliaceller (röd) isolerade från hGFAP-Cre:dtTomato+ möss och odlade i 3 dagar på PDL/Laminin substrat. Skala barer = 50 µm. (D) flöde flödescytometrisk analys av tdTomato celler. Visas är den genomsnittliga % av Fredsgenomförande + celler ± SEM för 3 olika preparat (3 möss per prep). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7: Video av Ca2 + Flusser efter hormonbehandling. EGCs pläterade på 24-väl PDL och laminin belagda plåtar odlades i gliaceller tillväxt medier i 3 dagar. Cellerna var förinstallerad med 3 µM för Fura-2-AM under 20 minuter vid 37 ° C och sedan behandlas med (A) 100 nM cholecystokinin (CCK) eller (B) 100 nM gastrin. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.
| Komponenter | Volym som ska läggas till | Slutlig koncentration |
| DMEM/F12 | 44,5 mL | _ |
| Fetalt bovint Serum (FBS) | 5 mL | 10% |
| Penicillin-Streptomycin | 500 ΜL | 100 IE/mL injektionspenna |
| Streptomycin | 100 µg/mL Strep | |
| Gentamicin (50 mg/mL lager) | 20 ΜL | 20 µg/mL |
Tabell 1: Sammansättningen av Glial Cell Resuspension Media.
| Komponenter | Volym som ska läggas till | Slutlig koncentration |
| DMEM/F12 | 44 mL | _ |
| Fetalt bovint Serum (FBS) | 5 mL | 10% |
| Penicillin-Streptomycin (100 x) | 500ΜL | 100 IE/mL (Pen) |
| 100 µg/mL (Strep) | ||
| Gentamicin (50 mg/mL lager) | 20 ΜL | 20 µg/mL |
| GDNF (10 µg/mL lager) | 50 ΜL | 10 ng/mL |
| L-glutamin (200 mM lager) | 500ΜL | 2 mM |
Tabell 2: Sammansättning av Glial Cell tillväxt medier.
| Komponenter | Immunofluorescens utspädning | Flöde flödescytometri utspädning |
| Kyckling anti-Fredsgenomförande | 1 till 500 | 1-2000 |
| Kanin anti-S100 | 1 till 500 | 1 till 500 |
| Musen anti-p75 NTR | 1 till 500 | 1 till 500 |
| Geten anti-E-cadherin | 1 till 400 | |
| Musen anti-Pgp9.5 | 1 till 500 | |
| Geten anti-a-Smooth Muscle aktin | 1 till 500 | |
| Alexa Fluor 488 get anti kyckling IgY | 1 till 1000 | 1 till 1000 |
| Alexa Fluor 568 get antimus IgG | 1 till 1000 | 1 till 1000 |
| Alexa Fluor 594 Donkey anti-kanin IgG | 1 till 1000 | |
| Alexa Fluor 488 Donkey anti get IgG | 1 till 1000 |
Tabell 3: Lista av antikroppar
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
EGCs spelar viktiga roller i gut homeostas, och det är viktigt att isolera och studera dem in vitro. I detta protokoll infördes en enkel metod för att isolera EGCs från lamina propria av vuxen mus tarmen för att studera enteriska gliaceller funktion.
Ta bort fastsittande krös och LMMP med en bomullspinne tar bort några av de inter-myenteric glia bosatta mellan längsgående och cirkulära muskeln, ökar tillgängligheten till buffertar till submukosala ytan och tar bort mycket av större kapillärerna . Det senare minskar antalet röda blodkroppar förorena de slutliga kulturerna. Serien av EDTA inkubationer remsa bort epitelial slemhinnan utsätta i lamina propria och submukosala glia, vilket kan vara bräcklig efter exponering för kelaterande lösningarna. Agitation antingen genom att skaka, vortexa eller triturating (repetitiva upp och ner pipettering) måste utföras noggrant och tidsmässigt för att undvika skador på celler. Trituration användes här eftersom tekniken resulterade i en mer konsekvent avkastning av vidhäftande, livskraftiga gliaceller. Skakar tenderade att införa bubblor och minska cellernas viabilitet utvärderas morfologiskt av cell adherencen till belagda plattorna. Vävnaden måste skäras i bitar < 0.5 cm till effektivt pulverisera vävnaden med 5 mL pipetten.
Allmänhet, 7 cm segment från minst 3 möss är tillräcklig för att generera tillräckligt EGCs för att täcka en 6-well platta ca 20 – 30% konfluens, som sedan kan användas för immuncytokemi och qPCR. Fler celler kan dock krävas för biokemiska metoder såsom western blotting beroende på uttrycket av genen studerade. Även om typ 1 kollagen eller Matrigel undersöktes kort som ett alternativ till poly-D-lysin/Laminin substratet, större följsamhet av epitelial cell befolkningen observerades, i slutändan ökar kontaminering av EGC kulturer med andra celltyper . Dessutom typ 1 kollagen klibbade inte fast att plattorna och var enkelt lossnar från ytan vid byte av media. Fibronektin är en annan substrat som har varit begagnad24, men testades inte här. Laminin tydligen förbättrar bindningen och differentiering av neurala-crest härrör celler25. Massor av laminin kan emellertid variera, påverkar cell följsamhet och avkastning. Mikrobiell kontamination av kulturerna uppstod ca 5% av tiden och hölls till ett minimum genom användning av sterila reagenser, teknik och antibiotika. Den svampdödande reagens var frivillig.
Den största begränsningen av protokollet här är standardisering av agitationen ta bort epitelet utan att skada de underliggande EGCs. Bedömning av preparatet inte kan dessutom göras omedelbart eftersom den beror på cell adherence till belagda plattorna. Tre områden att fokusera på när felsökning är: 1) användning av färska PDL och laminin för att bestryka plåtarna. (2) minimera tiden från dissektion till början av EDTA inkubationer genom att öka antalet biträden; (3) kvantifiera tidpunkt och metod som används för att agitera vävnaden för att effektivt avlägsna epitelet och sedan EGCs. Förlänger tiden i något av dessa steg ökar EGC bräcklighet och sannolikheten för att de inte kommer att återhämta sig när klädd i tillväxt medier. Även om metoden trituration att sära på epitelet användes här, skakar och vortexa också testades med inkonsekventa resultat kanske eftersom det är mer operatör beroende och svår att kvantifiera. När pläterade avkastningen av vidhäftande celler var större om cellerna inte stördes för 16 – 24 h.
Metoden presenteras här ändrades enligt ursprungliga studien av Smith et al. 12, som fokuserade på isolera LMMP. Metoden Smith användes här bara att ta bort och kassera LMMP så att de flesta av gliacellerna isolerade skulle härröra från submucosa och lamina propria. Dessutom utan enzymatisk nedbrytning är de myenteric EGCs inte lätt befriade12. Ändå, eftersom det finns inga specifika markörer för myenteric kontra submukosala glia, förekomsten av gliaceller från plexus inter-myenteric kan inte uteslutas. Rosenbaum et al. rapporterade flöde flödescytometrisk analys av EGCs uttrycker förbättrade grönt fluorescerande protein (andra) från hGFAP arrangören. De använde mycket unga möss (postnatal dag 7) och isoleras EGCs från hela tarmen genom enzymatisk nedbrytning19. Dessutom utfördes flöde flödescytometrisk analys efter två veckor att upprätthålla villkor som främjade friflytande neurosphere bildning. Även om författarna rapporterade att neurospheres mycket uttryckte både Fredsgenomförande och S100b, uttryckte flytande cell aggregaten också starkt α-SMA, vilket tyder på att expansionen av myofibroblast cell befolkningen uppmuntras gliosphere utveckling i kontrast platta blad-liknande morfologi som beskrivs här. Därför, samtidigt intressant, studien är inte direkt jämförbara med detta protokoll. Däremot morfologi av celler tillsammans med betydligt mindre α-SMA +-celler tyder på att de EGCs som beskrivs i detta protokoll inte uppvisar den 3-dimensionella morfologin under perioden 3 till 5 - dagars kultur. Men, både protokollet här och metoden Rosenbaum använda fluorescerande reporter att identifiera och isolera Fredsgenomförande + celler som förbättrar prövarens förmåga att live cell profilering.
Sammanfattningsvis beskriver det nuvarande protokollet isolering av enteriska gliaceller från submucosa med en icke-enzymatisk metod. Hela protokollet tar ca 3 h från mus dissektion till inledande plätering på förhand belagda vävnadsodling plattorna. Den mest intensiva tidssteg i protokollet är den borttagning och beredning av tarmar för första EDTA ruvning. Förbereda plattorna och lagra i DPBS rekommenderas starkt. Framgången av preparatet beror på effektivt avlägsnande av epitelet utan att skada de underliggande EGCs och adherencen till PDL/Laminin belagda plattorna inom 24 h. primära EGCs är användbara för in vitro- studier såsom biokemisk analys, Ca2 + flussmedel och adenovirala transfections10. Det förväntas att förmågan att isolera EGCs från antingen submucosa eller LMMP kommer att tillåta ytterligare studier för att definiera skillnader i EGC tillväxt egenskaper, differentiering och morfologi med hjälp av hela genomet metoder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Författarna vill uppmärksamma stöd från R37 DK045729 (till JLM), R01 AR060837 (att HX) och University of Michigan Gastrointestinal forskning Center molekylär Core P30 DK034933.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly-D lysine (1 mg/mL stock) | Sigma | A-003-E | Dilute 1:10 |
| Laminin (0.5 mg/mL stock) | Sigma | L4544 | Dilute to 10 µg/mL on ICE |
| EDTA (0.5 M) | Lonza | 51201 | Dilute 1:100 in DPBS |
| HEPES (1 M) | Corning | 36216004 | Dilute 1:100 in DPBS |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | HyClone | SH30028.02 | |
| DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 11320033 | |
| Penicillin-Streptomycin (100x) | Life Technologies | 15140-122 | |
| Gentamicin (50 mg/mL stock) | Life Technologies | 15750060 | |
| GDNF (10 µg stock) | Sigma | SRP3200 | |
| L-Glutamine (200 mM stock) | Life Technologies | 25030-081 | |
| Chicken anti-GFAP | Thermo Fisher Scientific | PA1-10004 | |
| Goat anti-a-Smooth Muscle Actin | Abcam | ab112022 | |
| Mouse anti-Pgp9.5 | Novus Biologicals | NB600-1160 | |
| Goat anti-E-cadherin | R&D Systems | AF748 | |
| Rabbit S100 | Abcam | ab34686 | |
| Mouse p75 NTR | Millipore | MAB5592 | |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Chicken IgY | Invitrogen | A-11039 | |
| Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Goat IgG | Invitrogen | A-11055 | |
| Alexa Fluor 568 Goat Anti-Mouse IgG | Invitrogen | A-11004 | |
| Alexa Fluor 594 Donkey Anti-Rabbit IgG | Invitrogen | R-37119 | |
| Prolong Gold antifade Reagent with DAPI | Thermo Fisher Scientific | P36931 | |
| Fungizone (Amphotericin B) 250 µg/mL | Life Technologies | 15290-018 | |
| L-Fura-2-AM | Invitrogen | F-14201 | |
| CCK peptide | Anaspec, Fremont, CA | AS-20741 | |
| Gastrin peptide (Gastrin-17) | Abbiotec, Bloomington, IN | 350188 | |
| Nylon Mesh Celll Strainer (100 µm) | Fisher Scientific | 22363549 | |
| Nylon Mesh Celll Strainer (40 µm) | Fisher Scientific | 22363547 | |
| Disposable Serologic Pipet 5 mL | Fisher Scientific | 13-678-11D | |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x) | Life Technologies | 25200-056 |
References
- Grubisic, V., Gulbransen, B. D. Enteric glia: the most alimentary of all glia. Journal of Physiology. 595 (2), 557-570 (2017).
- Gulbransen, B. D., Sharkey, K. A. Novel functional roles for enteric glia in the gastrointestinal tract. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 9 (11), 625-632 (2012).
- Rao, M., et al. Enteric Glia Regulate Gastrointestinal Motility but Are Not Required for Maintenance of the Epithelium in Mice. Gastroenterology. 153 (4), 1068-1081 (2017).
- Rao, M., et al. Enteric glia express proteolipid protein 1 and are a transcriptionally unique population of glia in the mammalian nervous system. Glia. , (2015).
- McClain, J., et al. Ca2+ responses in enteric glia are mediated by connexin-43 hemichannels and modulate colonic transit in mice. Gastroenterology. 146 (2), 497-507 (2014).
- Cunha Franceschi, R., et al. Enteric glial reactivity to systemic LPS administration Changes in GFAP and S100B protein. Neuroscience Research. 119, 15-23 (2017).
- Kabouridis, P. S., et al. Microbiota controls the homeostasis of glial cells in the gut lamina propria. Neuron. 85 (2), 289-295 (2015).
- Yu, Y. B., Li, Y. Q. Enteric glial cells and their role in the intestinal epithelial barrier. World Journal of Gastroenterology. 20 (32), 11273-11280 (2014).
- Clairembault, T., et al. Enteric GFAP expression and phosphorylation in Parkinson's disease. Journal of Neurochemistry. 130 (6), 805-815 (2014).
- Sundaresan, S., et al. Gastrin Induces Nuclear Export and Proteasome Degradation of Menin in Enteric Glial Cells. Gastroenterology. 153, 1555-1567 (2017).
- Gulbransen, B. D. Enteric Glia: The Origin of Duodenal Gastrinomas? Gastroenterology. , (2017).
- Smith, T. H., Ngwainmbi, J., Grider, J. R., Dewey, W. L., Akbarali, H. I. An in vitro preparation of isolated enteric neurons and glia from the myenteric plexus of the adult mouse. Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).
- Fried, D. E., Gulbransen, B. D. In situ Ca2+ imaging of the enteric nervous system. Journal of Visualized Experiments. (95), (2015).
- Bernstein, C. N., Vidrich, A. Isolation, identification, and culture of normal mouse colonic glia. Glia. 12 (2), 108-116 (1994).
- Jaeger, C. B. Isolation of enteric ganglia from the myenteric plexus of adult rats. Journal of Neural Transplantation & Plasticity. 5 (4), 223-232 (1995).
- Almond, S., Lindley, R. M., Kenny, S. E., Connell, M. G., Edgar, D. H. Characterisation and transplantation of enteric nervous system progenitor cells. Gut. 56 (4), 489-496 (2007).
- Ruhl, A., Trotter, J., Stremmel, W. Isolation of enteric glia and establishment of transformed enteroglial cell lines from the myenteric plexus of adult rat. Neurogastroenterology & Motility. 13 (1), 95-106 (2001).
- Boyen, G. B., et al. Distribution of enteric glia and GDNF during gut inflammation. BMC Gastroenterology. 11, 3 (2011).
- Rosenbaum, C., et al. Activation of Myenteric Glia during Acute Inflammation In Vitro and In Vivo. Public Library of Science One. 11 (3), e0151335 (2016).
- Zhuo, L., et al. hGFAP-cre transgenic mice for manipulation of glial and neuronal function in vivo. Genesis. 31 (2), 85-94 (2001).
- Boesmans, W., Lasrado, R., Vanden Berghe, P., Pachnis, V. Heterogeneity and phenotypic plasticity of glial cells in the mammalian enteric nervous system. Glia. 63 (2), 229-241 (2015).
- Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nature Biotechnology. 22 (12), 1567-1572 (2004).
- Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).
- Kabouridis, P. S., et al. The gut microbiota keeps enteric glial cells on the move; prospective roles of the gut epithelium and immune system. Gut Microbes. 6 (6), 398-403 (2015).
- Pomeranz, H. D., Sherman, D. L., Smalheiser, N. R., Tennyson, V. M., Gershon, M. D. Expression of a neurally related laminin binding protein by neural crest-derived cells that colonize the gut: relationship to the formation of enteric ganglia. The Journal of Comparative Neurology. 313 (4), 625-642 (1991).
