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Biochemistry

छोटे GTPase Prenylation और GTP झिल्ली अंश और GTPase से जुड़े Immunosorbent परख का उपयोग बाध्यकारी का पता लगाने

Published: November 11, 2018 doi: 10.3791/57646
Automatic Translation
1,2, 1,2,3, 1, 1,2, 4, 5, 6,7,8, 1,9, 1,2,10
1Department of Human Anatomy and Cell Science, Rady Faculty of Health Sciences, Max Rady College of Medicine, University of Manitoba, 2Biology of Breathing Theme, Children Hospital Research Institute of Manitoba, University of Manitoba, 3Department of Biochemistry, School of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, Isfahan University of Medical Sciences, 4Division of Pulmonary, Critical Care, and Sleep Medicine, Department of Internal Medicine, Center for Comparative Respiratory Biology and Medicine, 5Department of Clinical Biochemistry, School of Medicine, Zahedan University of Medical Sciences, 6Department of Molecular Biology, School of Pharmacy with the Division of Laboratory Medicine in Sosnowiec, Medical University of Silesia, 7Centre de biophysique moléculaire - UPR 4301, Centre national de la recherche scientifique (CNRS) CS80054, 8LinkoCare Life Sciences AB, 9College of Nursing and Children's Hospital Research Institute of Manitoba, Rady Faculty of Health Sciences, University of Manitoba, 10Health Policy Research Center, Institute of Health, Shiraz University of Medical Sciences

Summary

यहां हम prenylation और guanosine-5'-ट्राइफॉस्फेट (GTP)-Rho GTPase के लदान की जांच करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन । इस प्रोटोकॉल दो विस्तृत तरीकों, अर्थात् झिल्ली भिन्नीकरण और एक GTPase-immunosorbent परख से जुड़े होते हैं । प्रोटोकॉल विभिंन अंय छोटे GTPases के prenylation और GTP लदान को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

Abstract

Rho GTPase परिवार रास superfamily से संबंधित है और मनुष्यों में लगभग २० सदस्य शामिल हैं. Rho GTPases विविध सेलुलर कार्यों के विनियमन में महत्वपूर्ण हैं, जिनमें cytoskeletal गतिशीलता, सेल गतिशीलता, कोशिका ध्रुवीयता, axonal मार्गदर्शन, vesicular ्े, और कोशिका चक्र नियंत्रण शामिल हैं । Rho GTPase संकेतन में परिवर्तन कई रोग स्थितियों में एक आवश्यक विनियामक भूमिका निभाते हैं, जैसे कैंसर, केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के रोग, और प्रतिरक्षा प्रणाली पर निर्भर रोगों । Rho GTPases के posttranslational संशोधन (यानी, prenylation द्वारा mevalonate मार्ग मध्यवर्ती) और GTP बंधन प्रमुख कारक हैं जो इस प्रोटीन के सक्रियण को प्रभावित करते हैं. इस पत्र में, Rho GTPase prenylation और GTP बाइंडिंग गतिविधियों की एक व्यापक रेंज का पता लगाने के लिए दो आवश्यक और सरल तरीके प्रदान किए गए हैं । तकनीकी प्रक्रियाओं है कि इस्तेमाल किया गया है का विवरण इस पांडुलिपि में कदम से कदम समझाया जाता है ।

Introduction

Rho GTPases छोटे प्रोटीन का एक समूह है (21-25 केडीए), जो अच्छी तरह से विकास भर में संरक्षित कर रहे हैं, और छोटे GTPases के रास superfamily में एक अनूठा उपपरिवार के रूप में. इस superfamily के भीतर प्रत्येक उपपरिवार में GTPase गतिविधि और न्यूक्लियोटाइड exchange1में शामिल है एक साझा G डोमेन कोर है । Rho परिवार और अंय रास उपपरिवारों के बीच अंतर 5वें β किनारा के भीतर एक "Rho डालने डोमेन" की उपस्थिति और छोटे GTPase डोमेन2में 4वें α कुंडलित है ।

हाल ही में वर्गीकरण के आधार पर, Rho GTPases संकेत प्रोटीन है कि रास GTPase superfamily3में फिट का एक परिवार माना जाता है । स्तनधारी Rho GTPases उनके विशिष्ट समारोह और सामांय लक्षण वर्णन4 जिसमें RhoA, Rac1, और Cdc42 इस समूह में सबसे अधिक अध्ययन किया सदस्यों के बीच में है के आधार पर 22 सदस्य हैं । Rho GTPases एक कसकर विनियमित तंत्र है जो प्रोटीन posttranslational संशोधनों5 के माध्यम से आणविक स्विच पर निर्भर है के माध्यम से intracellular संकेतन रास्ते से जुड़े हुए हैं ।

GTP लोडिंग और hydrolysis छोटे Rho GTPases के सक्रियण/सक्रियण चक्र में आवश्यक तंत्र हैं और GTPase-सक्रिय प्रोटीन (अंतराल) के माध्यम से विनियमित होते हैं । अंतराल GTP hydrolysis और guanine न्यूक्लियोटाइड विनिमय कारकों (GEFs) जो GTP लोड हो रहा है प्रतिक्रिया के लिए जिंमेदार है के साथ संगीत कार्यक्रम में काम के लिए जिंमेदार हैं । Rho सकल घरेलू उत्पाद पृथक्करण अवरोधकों (GDIs) सकल घरेलू उत्पाद के लिए बाध्य GTPases Rho के माध्यम से छोटे Rho GTPases के आगे विनियमन प्रदान करते हैं । यह सकल घरेलू उत्पाद पृथक्करण को रोकता है और सक्रिय intracellular झिल्ली साइटों से दूर छोटे Rho GTPases के sequestering की सुविधा । वहां भी है Rho GTPase GDIs के prenylation जो दोनों न्यूक्लियोटाइड hydrolysis और विनिमय और नियंत्रण सकल घरेलू उत्पाद/GTP सायक्लिंग1,6,7,8का नियमन शामिल प्रोटीन के आगे विनियमन ।

दोनों GTP-लोडिंग और Rho GTPase prenylation इन प्रोटीन्स के Rho गुणों को बदलकर GTPase और कोशिका झिल्ली के बीच cytosol lipophilic के मूवमेंट में शामिल हैं1,9. abovementioned नियामकों सेल झिल्ली के फॉस्फोलिपिड के साथ बातचीत और सकल घरेलू उत्पाद के अंय मॉडुलन प्रोटीन/GTP विनिमय गतिविधि10। इसके अलावा, GDIs, पृथक्करण अवरोधकों, ब्लॉक दोनों GTP hydrolysis और सकल घरेलू उत्पाद/GTP विनिमय । GDIs सकल घरेलू उत्पाद से निष्क्रिय Rho प्रोटीन के पृथक्करण को बाधित और, इसलिए, बहाव प्रभाव के साथ उनकी बातचीत । GDIs कोशिका में cytosol और झिल्ली के बीच GTPases की साइकल को भी विनियमित करता है. Rho GTPases की गतिविधि सेल झिल्ली को अपने आंदोलन पर काफी हद तक निर्भर करता है; इस प्रकार, GDIs महत्वपूर्ण नियामकों के रूप में माना जाता है कि कोशिका द्रव्य में अपने hydrophobic क्षेत्र को छुपाने के माध्यमसे GTPases एकांत कर सकते है/

Rho GTPase के लिए एक इष्टतम संकेतन और अपने सक्रियण चक्र के सभी चरणों में कार्य करने के लिए, GTP के गतिशील चक्र-लोड हो रहा है/GTP hydrolysis महत्वपूर्ण है । इस प्रक्रिया में परिवर्तन के किसी भी प्रकार के सेल Rho GTPase द्वारा विनियमित कार्यों में क्रमिक परिवर्तन में परिणाम हो सकता है, जैसे कोशिका ध्रुवीकरण, प्रसार, morphogenesis, cytokinesis, प्रवास, आसंजन, और अस्तित्व13,14।

वर्तमान प्रोटोकॉल एक विस्तृत विधि के साथ पाठकों को प्रदान करता है अपने prenylation और सकल घरेलू उत्पाद/GTP लोडिंग की जांच के जरिए छोटे RhoA GTPase सक्रियण की निगरानी । इस विधि भी छोटे GTPases की एक विस्तृत श्रृंखला के prenylation और GTP बंधन का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । GTPase-लिंक्ड immunosorbent परख GTPases के अंय प्रकार के सक्रियण के स्तर को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, जैसे Rac1, Rac2, Rac3, एच, कश्मीर, या N-रास, एआरएफ, और Rho15। औषधीय एजेंट simvastatin एक उदाहरण के रूप में प्रयोग किया जाता है, के रूप में यह हाल ही में छोटे Rho GTPase prenylation और गतिविधि8,9,14,16के विनियमन में शामिल होने की सूचना दी थी ।

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Protocol

1. झिल्ली/Cytosol अंश का उपयोग कर RhoA स्थानीयकरण का निर्धारण

  1. सेल कल्चर और simvastatin ट्रीटमेंट
    1. बीज ५०,००० में U251 कोशिकाओं के १०० मिमी पकवान और संस्कृति में उंहें Dulbecco है संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) (उच्च ग्लूकोज, 10% भ्रूण गोजातीय सीरम [FBS]) ।
    2. जब 30% धाराप्रवाह, माध्यम को हटाने और simvastatin जोड़ने के माध्यम से कोशिकाओं का इलाज (dimethyl sulfoxide में भंग simvastatin के 10 µ मीटर [DMSO]), और ३७ ° c8पर ३६ ज के लिए मशीन । एक वाहन नियंत्रण के रूप में अकेले DMSO का प्रयोग करें ।
      नोट: १०,०००,००० कक्षों की cytosol और झिल्ली भिंन कक्षों के लिए आवश्यक हैं ।
  2. कक्षों का संग्रह
    1. ३७ डिग्री सेल्सियस मशीन से कोशिकाओं को हटा दें । एक खुर्दबीन के नीचे कोशिकाओं को देखो को प्रभावित करने की पुष्टि करें ।
      नोट: कोशिकाओं ७०%-८०% धाराप्रवाह होना चाहिए ।
    2. मीडियम महाप्राण, कोल्ड फास्फेट-बफर खारा (पंजाब) के साथ सेल 1x को धो लें । ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA) बफर के 5 मिलीलीटर जोड़ें (KCl: ४०० mg/l, NaCl: ६८०० मिलीग्राम/l, NaHCO3:२२०० mg/l, णः2पीओ4. एच2ओ: १४० मिलीग्राम/एल, डी-ग्लूकोज: १,००० मिलीग्राम, EDTA disodium: ३७३ मिलीग्राम/एल) प्लेट प्रति और कोशिकाओं को वापस ३७ डिग्री सेल्सियस में 5 मिनट के लिए ° c ।
    3. मशीन के 5 मिनट के बाद, एक 15 मिलीलीटर EDTA के रूप में मध्यम की एक ही राशि युक्त ट्यूब में कोशिकाओं के साथ EDTA इकट्ठा ।
      नोट: ट्यूब में मध्यम होने EDTA बेअसर और कोशिका झिल्ली के किसी भी आगे पाचन रोकता है ।
    4. एक आइस बॉक्स में ट्यूब प्लेस और केंद्रापसारक के लिए आगे बढ़ना ।
    5. 4 डिग्री सेल्सियस पर १,५०० x g करने के लिए सेट करें और 5 मिनट के लिए कोशिकाओं स्पिन ।
    6. गोली परेशान बिना supernatant निकालें और ठंडा पंजाबियों की 1 मिलीलीटर जोड़ें । अच्छी तरह से कोशिकाओं को मिलाएं ।
    7. एक नया १.५ एमएल ट्यूब करने के लिए सेल मिश्रण (समाधान) स्थानांतरण, 4 डिग्री सेल्सियस पर १,५०० x g पर केंद्रापसारक, और 5 मिनट के लिए कोशिकाओं स्पिन ।
    8. (अगले चरण के लिए बफ़र की मात्रा का अनुमान लगाने के लिए) गोली का आकार की जांच करें । नमूनों को बर्फ पर लगाएं । पूरी तरह से गोली परेशान बिना supernatant त्यागें ।
    9. बर्फ जोड़ें-शीत बफर मैं (10 मिमी Tris-एचसीएल [pH ७.५], ०.१ mm EDTA, ०.१ mm EGTA, 1 mm dithiothreitol, और चिढ़ाना अवरोधक कॉकटेल), अच्छी तरह से ऊपर और नीचे pipetting द्वारा नमूनों मिश्रण, और फिर, sonication के लिए आगे बढ़ना ।
  3. Sonication
    1. पांच चक्रों, 5 एस प्रत्येक के लिए sonicator सेट, और 3x दोहराने ।
    2. sonication बर्फ पर प्रदर्शन करते हैं । ultracentrifuge के लिए आगे बढ़ें ।
      नोट: बर्फ और ठंड हालत प्रोटीन को बनाए रखने और परिणामों को और अधिक विश्वसनीय बनाते हैं ।
  4. Ultracentrifugation
    1. कक्ष homogenates को cytoplasmic और झिल्ली अंशों में अलग करने के लिए एक ultracentrifuge का उपयोग करें । 4 डिग्री सेल्सियस पर ३५ मिनट के लिए १००,००० x g के लिए केंद्रापसारक सेट करें । के रूप में चित्रा 1में दिखाया गया है, गोली आकार की जांच करें ।
      नोट: झिल्ली अंश ट्यूब के बहुत नीचे है और बाकी अंय cytoplasmic घटक है ।
    2. supernatant पूरी तरह से इकट्ठा करते हुए गोली परेशान नहीं सावधान किया जा रहा है । supernatant cytosolic अंश है । एक नए लेबल ट्यूब में supernatant प्लेस ।
    3. पृथक्करण बफर के ३०० µ एल जोड़ें (बफर द्वितीय) (५० mM Tris-HCl [pH ७.५], ०.१५ M NaCl, 1 mm dithiothreitol, 1% एसडीएस, 1 mm EDTA, 1 mm EGTA, और चिढ़ाना अवरोधक कॉकटेल) को गोली (शामिल झिल्ली अंश) । ऊपर और नीचे pipetting से अच्छी तरह मिलाएं ।
    4. प्रोटीन निर्धारण और वेस्टर्न ब्लाट (immunoblot एनालिसिस) सैंपल तैयार करने के लिए आगे बढ़ें ।
  5. Immunoblotting
    1. lysis बफर (20 मिमी Tris-एचसीएल [pH ७.५], ०.५ mm PMSF, ०.५% गैर-ईओण डिटर्जेंट-४०, १०० µ m β-ग्लिसरॉल 3-फॉस्फेट, और ०.५% चिढ़ाने के कॉकटेल) में अलग भिन्न भागों से सेल प्रोटीन अर्क तैयार करें ।
    2. Lowry विधि8 का उपयोग कर प्रोटीन एकाग्रता उपाय और lysis बफर की मात्रा की गणना (20 मिमी Tris-एचसीएल [पीएच ७.५], ०.५ मिमी PMSF, ०.५% nondenaturing डिटर्जेंट, octylphenoxypolyethoxyethanol, १०० µ m β-ग्लिसरॉल 3-फॉस्फेट, और ०.५% नमूना अवरोधक कॉकटेल) नमूनों के बीच प्रोटीन की एकाग्रता को सामान्य करने के लिए.
    3. 5 मिनट के लिए ९० डिग्री सेल्सियस पर नमूनों गर्मी और प्रोटीन को अलग करने के लिए एक 15% एसडीएस-पृष्ठ जेल पर नमूनों की 15-20 µ एल लोड ।
      नोट: प्रत्येक नमूने के लिए प्रोटीन का 1 µ g लोड करें । तदनुसार चलाने के लिए आवश्यक वॉल्यूम परिकलित करें ।
    4. 2 एच के लिए (५०० एनएम glycine, ५० mM Tris-HCl, और 20% मेथनॉल) को कम करने की स्थिति के तहत नायलॉन झिल्ली को अलग प्रोटीन स्थानांतरण १०० V पर कमरे के तापमान (आरटी) में ।
      नोट: सफल प्रोटीन हस्तांतरण की पुष्टि करने के लिए, Ponceau दाग का उपयोग करें या झिल्ली पर प्रोटीन मार्कर कल्पना ।
    5. ब्लॉक के साथ झिल्ली 5% नोनफेट सूखे दूध और 1x Tris-डिटर्जेंट युक्त खारा (टीबीएस/0.01% गैर ईओण डिटर्जेंट; TBST) 4 ° c रात भर या RT पर 1 h के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी बाइंडिंग ब्लॉक करने के लिए
    6. immunoblotting विश्लेषण के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी जोड़ें और 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर गर्मी ।
      नोट: इस प्रयोग में, Rac1/2/3, cdc42, RhoA, GAPDH, और पैन-Cadherin 1:1000 कमजोर पड़ने पर 1x TBST में 1% दूध में इस्तेमाल किया गया । पान-Cadherin और GAPDH झिल्ली और cytosolic अंश शुद्धता, क्रमशः पुष्टि करने के लिए इस्तेमाल किया गया ।
    7. धो झिल्ली 20 मिनट के लिए 1x TBST के साथ एक कपड़े धोने बफर के साथ 3x ।
    8. विरोधी खरगोश सहिजन peroxidase (एचआरपी) के साथ झिल्ली-संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी संबंधित प्राथमिक एंटीबॉडी के लिए (आरटी में 1 ज के लिए) ।
    9. 20 मिनट के लिए 3x दाग धो और उंहें बढ़ाकर chemiluminescence (ECL) का पता लगाने के साथ विकसित करना ।

2. RhoA GTP लोड का माप एक छोटे से जी प्रोटीन सक्रियकरण परख का उपयोग

  1. गणना १०,००० कोशिकाओं/एमएल और संस्कृति U251 कोशिकाओं में एक १०० mm डिश ।
  2. जब वे 30% धाराप्रवाह हैं, simvastatin के साथ कोशिकाओं का इलाज के रूप में 1.1.2 चरण में वर्णित है ।
  3. संस्कृति मशीन से बाहर लाने के प्लेटें । माइक्रोस्कोप के तहत कोशिकाओं को देखो को प्रभावित करने की पुष्टि करें । सुनिश्चित करें कि कोशिकाओं ७०%-८०% धाराप्रवाह हैं । बर्फ पर पेट्री डिश प्लेस, मीडिया महाप्राण, और बर्फ ठंडा पंजाबियों (पीएच ७.२) के साथ 3x कोशिकाओं धो लो ।
  4. पंजाबियों को महाप्राण । पंजाब के सभी अवशेषों को हटाने के लिए एक अतिरिक्त मिनट के लिए बर्फ पर पेट्री पकवान झुकाव ।
    नोट: अवशिष्ट पंजाबन इस परख पर प्रतिकूल प्रभाव डालता है ।
  5. लाइसे की एक ७०० µ एल मात्रा में बर्फ-शीत lysis बफर और फॉस्फेट अवरोधकों युक्त बफ़र ।
    नोट: ७०० µ एल आमतौर पर एक १०० mm पेट्री डिश के लिए पर्याप्त है । प्रत्येक संस्कृति पोत के लिए उचित मात्रा को खोजने के लिए 1 तालिका देखें ।
  6. सेल खुरचनी के साथ सेल lysate फसल । इस तकनीक के लिए संस्कृति की थाली झुकाव ।
  7. lysate को एक लेबल वाले आइस-कोल्ड cryotube में ट्रांसफर करें और बर्फ पर रखें ।
  8. एक भंवर का उपयोग अच्छी तरह से मिश्रण । प्रोटीन की परख के लिए lysate के 10 µ एल रखें, नमूने में प्रोटीन एकाग्रता को मापने के लिए ।
  9. शेष कोशिका lysate तरल नाइट्रोजन में स्नैप-फ़्रीज़ ।
    नोट: RhoA GTPase की गतिविधि की हानि के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, जो दोहराया फ्रीज/गल चक्र से बचने के लिए, स्नैप-जमने से पहले सेल lysate के कई aliquots तैयार करें ।
  10. a-८० ° c फ्रीजर करने के लिए स्नैप-जमे हुए cryotubes स्थानांतरण और GTPase से जुड़े immunosorbent परख के लिए नमूनों की दुकान ।
    नोट: नमूनों को 14 दिनों से अधिक समय तक स्टोर न करें. जल्दी से काम और बर्फ पर 10 मिनट से अधिक समय के लिए नमूने छोड़ कभी नहीं । कभी भी सभी पेट्री व्यंजन एक साथ संभालें ।
  11. Lowry विधि8 का उपयोग कर प्रोटीन एकाग्रता को मापने और नमूनों के बीच प्रोटीन की एकाग्रता को सामान्य करने के लिए lysis बफर की मात्रा की गणना ।
    नोट: सबसे अच्छा एकाग्रता आमतौर पर है 1 मिलीग्राम/ हालांकि, ०.३-2 मिलीग्राम/एमएल का पता लगाने जा सकता है ।
  12. lysis बफ़र और ६० µ l का एक microtube के लिए बाइंडिंग बफ़र के ६० µ l जोड़कर कोई रिक्त नियंत्रण तैयार करें ।
    नोट: रिक्त नियंत्रण antigen को छोड़ कर सभी एजेंट है और पृष्ठभूमि के घटाव के लिए उपयोग किया जाता है ।
  13. Rho नियंत्रण प्रोटीन, ४८ µ एल के lysis बफर के 12 µ एल जोड़कर एक सकारात्मक नियंत्रण तैयार, और ६० µ बाइंडिंग बफर के एल ।
    नोट: सकारात्मक नियंत्रण के साथ एक Rho-a-GTP के लिए सभी रिएजेंटों की पुष्टि की गई antigen है ।
  14. अपने बैग से बाहर Rho संबध थाली ले लो और यह बर्फ पर जगह है ।
  15. बर्फ के १०० µ एल के साथ कुओं में पाउडर भंग-ठंडा आसुत जल । बर्फ पर प्लेट रखें ।
  16. एक पानी के स्नान में स्नैप-जमे हुए सेल lysates को 25 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें ।
  17. प्रोटीन एकाग्रता को सामान्य करने के लिए प्रत्येक नमूने के लिए (२.११ कदम से) बर्फ शीत lysis बफर की गणना की मात्रा जोड़ें.
    नोट: lysis बफ़र की संरचना में परिवर्तन के कारण से बचने के लिए (एक वैक्यूम ट्यूब aspirator का उपयोग करके) कोशिकाओं को धोने के बाद पंजाबियों को हटा दें । बराबर ०.८ और 2 के बीच एक एकाग्रता के लिए नमूना प्रोटीन GTPase सक्रियण परख में नमूनों के बीच एक सटीक तुलना के लिए मिलीग्राम/ तालिका 2 इस परख के लिए उपयोग किया जा करने के लिए बफ़र के बारे में विवरण प्रदान करता है ।
  18. स्थानांतरण ६० µ के लिए सामान्यीकृत बर्फ ठंडा नमूनों microtubes और जोड़ें ६० µ बाइंडिंग बफ़र के l; नमूनों को अच्छी तरह मिलाएं और उन्हें बर्फ पर रखें ।
  19. पूरी तरह से एक प्रयोगशाला चटाई पर पांच से सात हार्ड नल के बाद, जोरदार झाड़ू से microplate से पानी/
  20. सामान्यीकृत नमूनों, एक रिक्त नियंत्रण, और डुप्लिकेट में कुओं के लिए एक सकारात्मक नियंत्रण के ५० µ एल जोड़ें ।
  21. ३०० rpm पर 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए एक कक्षीय शेखर पर थाली प्लेस ।
    नोट: झटकों कदम बहुत महत्वपूर्ण है, और यह ३०० rpm पर कक्षीय प्लेट शेखर का उपयोग करने की सिफारिश की है ।
  22. झाड़ू से प्लेट से नमूनों को साफ़ करें और rt पर वाशिंग बफर के २०० µ l के साथ उन्हें 2x धो लें. सख्ती से प्रत्येक धोने के बाद कुओं से धोने बफर हटाने, दोहन द्वारा पीछा किया, और आरटी पर बेंच पर थाली रखने के लिए ।
  23. rt के २०० µ एल जोड़ें प्रतिजन-प्रस्तुत करने के लिए बफर प्रत्येक अच्छी तरह से और आरटी पर 2 मिनट के लिए मशीन ।
  24. कुओं से समाधान बाहर झटका और आरटी पर धोने बफर के २०० µ एल के साथ 3x धो लो ।
  25. प्रत्येक कुआं को नए सिरे से तैयार 1/250 एंटी-RhoA प्राथमिक एंटीबॉडी के ५० µ एल जोड़ें ।
  26. ३०० rpm को 25 डिग्री सेल्सियस पर सेट ४५ मिनट के लिए एक कक्षीय शेखर पर प्लेट प्लेस । अच्छी तरह से समाधान बाहर झटका ।
  27. दोहराएं धुलाई कदम 2x (२.२४ कदम) ।
  28. नए सिरे से तैयार की 1/250 विरोधी RhoA माध्यमिक एंटीबॉडी के ५० µ एल जोड़ें ।
  29. ३०० rpm को 25 डिग्री सेल्सियस पर सेट ४५ मिनट के लिए एक कक्षीय शेखर के शीर्ष पर प्लेट प्लेस ।
  30. एचआरपी का पता लगाने एजेंट के बराबर मात्रा में एक एजेंट और रिएजेंट बी के मिश्रण से तैयार करें ।
  31. एक अच्छी तरह से समाधान बाहर झटका और RT पर धोने बफर के २०० µ एल के साथ वेल्स 3x धो लो ।
  32. हौसले से तैयार एचआरपी का पता लगाने के एजेंट के ५० µ एल जोड़ें प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए ।
  33. अधिकतम संकेत प्राप्त करने और एक उपयुक्त सॉफ़्टवेयर पैकेज का उपयोग करके परिणामों का विश्लेषण करने के लिए 3-5 मिनट के भीतर luminescent संकेत पढ़ें.
    नोट: रीडिंग अधिकतम संकेत प्राप्त करने के लिए 3-5 मिनट के भीतर लिया जाना चाहिए । एक "परीक्षण प्लेट" चलाने के लिए उचित lysis बफर वॉल्यूम की पुष्टि करने के लिए उपयोग किया जा रहा है सेल lysates ताकि प्रोटीन एकाग्रता RhoA GTPase गतिविधि का पता लगाने के लिए पर्याप्त उच्च है । (एक टेस्ट प्लेट अगर प्रोटीन एकाग्रता स्वीकार्य सीमा के भीतर गिर जाता है और यह भी निर्धारित करने के लिए उपयोग किया जा रहा lysis बफर की मात्रा उचित है निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल कोशिकाओं की एक थाली है.) सकारात्मक नियंत्रण 4-से 10 गुना अधिक खाली कुओं की तुलना में अगर यह रैखिक रेंज में है को पढ़ने चाहिए । यदि नहीं, तो निर्माता के परामर्श से luminometer समायोजित करें । luminometer के लिए सेटिंग्स तालिका 3में दिए गए हैं ।
  34. स्तंभों में रॉ डेटा दर्ज करें जहां शीर्षकों के नमूने, मतलब, मानक विचलन, rep1, rep2, rep3, और rep4, जो प्रत्येक नमूने पर किया जा रहा दोहराने की संख्या को दिखाने के लिए है पढ़ें ।
  35. माध्यके अंतर्गत, सूत्र = average (Xn: Yn) दर्ज करें जहाँ X = rep1के लिए स्तंभ नियतर, Y = rep4के लिए स्तंभ नियतर, और n = पंक्ति के पंक्ति नियतर पर काम किया जा रहा है.
  36. मानक विचलनके तहत, सूत्र दर्ज करें = stdev (Xn: Yn) जहाँ X = rep1के लिए स्तंभ नियतर, Y = rep4के लिए स्तंभ नियतर, और n = पंक्ति के पंक्ति नियतर पर काम किया जा रहा है.
  37. rep1, rep2, आदि में दोहराने डेटा दर्ज करें ।
  38. डेटा दर्ज करने के बाद, नमूना, माध्य, और मानक विचलनका चयन करने के लिए क्लिक-एंड-ड्रैग विधि का उपयोग करें ।
  39. फिर, डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर में, चार्ट बनाने के लिए समारोह का चयन करें जो अंदर एक मिनी बार चार्ट के साथ एक वर्ग की तरह लग रहा है ।
    नोट: यह चार्ट बनाने की प्रक्रिया है जहां यह संभव है डेटा के आधार पर चार्ट डिजाइन में दर्ज लाता है ।
  40. स्तंभ चार्ट चुनें और, इनपुट मानों के लिए, माध्य संख्याएं निर्दिष्ट करें ।
    नोट: माध्य संख्याओं के लिए चार्ट पहले बनाया गया है, और फिर, y-अक्ष त्रुटि पट्टियों के लिए मानक विचलन स्तंभ निर्दिष्ट किया गया है । ऐसा करने के लिए, ग्राफ़ पट्टियों पर डबल-क्लिक करें, Y-अक्ष त्रुटि टैब चुनें, कस्टम विकल्प क्लिक करें, और मानक विचलन डेटा का स्थान दर्ज करने के लिए कार्यपत्रक में क्षेत्र का चयन करें । समूहों है कि तुलना करने की आवश्यकता के बीच अंतर वांछित चार्ट के निर्माण के बाद देखा जा सकता है ।

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Representative Results

झिल्ली भिन्नीकरण:

Ultracentrifugation झिल्ली और cytosol घटकों के अंश के लिए इस्तेमाल किया गया था । चित्रा 1में दिखाया गया है, supernatant cytosolic अंश शामिल हैं और गोली झिल्ली अंश शामिल हैं. U251 कोशिकाओं से प्राप्त cytosolic andmembrane अंशों में RhoA की बहुतायत simvastatin का उपयोग immunoblotting के साथ उपचार के बाद की जांच की गई. झिल्ली और cytosol अंश की शुद्धता और लोडिंग नियंत्रण में क्रमशः पान-Cadherin और GAPDH की पुष्टि की गई. के रूप में चित्रा 2में दिखाया गया है, simvastatin उपचार झिल्ली बंधे RhoA GTPase की मात्रा कम है, जबकि यह अपनी cytosolic सामग्री में वृद्धि हुई । यह RhoA prenylation के निषेध के आधार पर GTPases के translocation पर statins के ज्ञात प्रभावों के अनुरूप है. Simvastatin RhoA GTPase के prenylation को रोकता है, और इसलिए, unprenylated RhoA सेल प्लाज्मा झिल्ली में लंगर करने में असमर्थ है, जो अपने उच्च cytosolic सांद्रता में परिणाम है ।

RhoA-GTP बाध्य:

हम मापा GTP-बाउंड RhoA प्रोटीन का उपयोग कर एक GTPase-लिंक्ड immunosorbent परख और पता चला कि simvastatin काफी (P < ०.०५) GTP कोशिकाओं में RhoA-बाउंड U251 बढ़ा (चित्रा 3) । इसलिए, जबकि simvastatin RhoA GTPase प्रोटीन prenylation (चित्रा 2) हिचकते हैं, यह भी नियंत्रण कोशिकाओं की तुलना में अपनी GTP लोडिंग वृद्धि हुई है । यह तथ्य यह है कि prenylation और GTP बंधन दोनों गतिविधि और RhoA GTPase के विनियमन में एक भूमिका निभाने के लिए अंक । इस घटना के बारे में अतिरिक्त जानकारी के लिए, कृपया इस प्रोटोकॉल8का उपयोग कर मूल प्रकाशन देखें ।

Figure 1
चित्रा 1 : ultracentrifugation के बाद cytosolic और झिल्ली अंश का योजनाबद्ध दृश्य । गोली झिल्ली अंश है और supernatant cytosolic अंश शामिल हैं ।

Figure 2
चित्रा 2 : Simvastatin परिवर्तन RhoA के स्थानीयकरण । U251 कोशिकाओं simvastatin के साथ इलाज किया गया (10 µ एम; 12, 24, और ३६ ज) और झिल्ली और cytosolic अंशों में RhoA की बहुतायत immunoblotting द्वारा निर्धारित किया गया था । GAPDH और पान-Cadherin बहुतायत cytosolic और झिल्ली भागों में लदान के लिए नियंत्रण और झिल्ली भागों में cytosolic संदूषण की कमी की पुष्टि करने के लिए भी आकलन किया गया था । डेटा विभिंन प्राथमिक संस्कृतियों का उपयोग कर तीन स्वतंत्र प्रयोगों से आम तौर पर कर रहे हैं । यह आंकड़ा Alizadeh एट अल से संशोधित किया गया है । 8. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3

चित्रा 3 : Simvastatin ढा RhoA GTPase गतिविधि । GTPase से जुड़ी immunosorbent परख U251 कोशिकाओं में GTP-बाउंड Rho प्रोटीन को मापने के लिए इस्तेमाल किया गया था । विभिंन स्थितियों ३६ ज, भुखमरी और simvastatin (10 µ एम) सहित के लिए परीक्षण किया गया । प्रत्येक प्रयोग के लिए, किट में उपलब्ध कराए गए एक constitutively सक्रिय RhoA प्रोटीन का उपयोग सकारात्मक नियंत्रण के रूप में किया गया । परिणाम दो स्वतंत्र प्रयोगों में प्रतिकृति के अर्थ ± एसडी के रूप में व्यक्त कर रहे हैं (* * * P < ०.००१). यह आंकड़ा Alizadeh एट अल से संशोधित किया गया है । 8. 

सेल संस्कृति पोत सतह क्षेत्र (cm2) Lysis बफर (µ एल)
व्यंजन ३५ एमएम 9 १००
६० एमएम 21 ३००
१०० एमएम ५५ ७००
१५० एमएम १४५ १५००
प्लेटें 6-खैर ९.४/खैर १००
12-खैर ३.८/खैर ७०
24-खैर 1.9/खैर ४०
बोतल टी-25 25 २५०
टी-७५ ७५ १०००
टी-१५० १५० १५००

तालिका 1: U251 कक्षों के लिए lysis बफ़र की अनुशंसित वॉल्यूम । मात्रा विभिंन प्रकार के सेल के लिए समायोज्य है ।

Lysis बफ़र नाम Lysis बफ़र संरचना छोटे जी प्रोटीन लक्ष्य नोट्स
GL35 Tris (1x GL36), MgCl2 (x GL36), NaCl (2x GL36), IGEPAL (1x GL36), एसडीएस (5x GL36) Cdc42 GL36 करने के लिए समान घटक, संरचना निम्नानुसार भिन्न होता है;
GL36 Tris पीएच ७.५, MgCl2, NaCl, IGEPAL और एसडीएस का मालिकाना निर्माण राला मानक बफर, सबसे GTPase के साथ संगत-immunosorbent परख से जुड़े ।
GL36 Tris पीएच ७.५, MgCl2, NaCl, IGEPAL और एसडीएस का मालिकाना निर्माण Rac1 मानक बफर, सबसे GTPase के साथ संगत-immunosorbent परख से जुड़े ।
GL36 Tris पीएच ७.५, MgCl2, NaCl, IGEPAL और एसडीएस का मालिकाना निर्माण Rac1, 2, 3 मानक बफर, सबसे GTPase के साथ संगत-immunosorbent परख से जुड़े ।
GL36 Tris पीएच ७.५, MgCl2, NaCl, IGEPAL और एसडीएस का मालिकाना निर्माण Ras मानक बफर, सबसे GTPase के साथ संगत-immunosorbent परख से जुड़े ।
GL36 Tris पीएच ७.५, MgCl2, NaCl, IGEPAL और एसडीएस का मालिकाना निर्माण RhoA मानक बफर, सबसे GTPase के साथ संगत-immunosorbent परख से जुड़े ।
GL36 Tris पीएच ७.५, MgCl2 का मालिकाना निर्माण Arf1 मानक बफर, सबसे GTPase के साथ संगत-immunosorbent परख से जुड़े ।

तालिका 2: छोटे GTPases के लिए GTPase-लिंक्ड immunosorbent परख lysis बफ़र्स और अनुशंसित lysis संरचना की सूची ।

पैरामीटर नोट्स
लाभ लाभ विकल्प मशीन संवेदनशीलता समायोजित कर देता है । अधिकांश luminometers स्वचालित अंशांकन या सीमित अंशांकन फ़ंक्शन का उपयोग करते हैं । उपयोगकर्ता कम, मध्यम, और उच्च पर लाभ पढ़ने के क्रम में पढ़ने के लिए अगर पढ़ना रैखिक रेंज है जो विभिंन उपकरणों में बदलता है के भीतर है चाहिए ।
एकीकरण समय यह अपने निंनतम पर इस विकल्प के रूप में बहुत उच्च समय रैखिक सीमा से बाहर पढ़ सकता है की सिफारिश की है । यह कम कमजोर पड़ने या प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी का उपयोग कर की तरह अनावश्यक काम की आवश्यकता हो सकती है । एकीकरण का समय भी विभिन्ना साधनों में बदलता रहता है.
मिलाते हुए यह 5 एस कक्षीय मिलाते का उपयोग करने की सिफारिश की है । यह परख की सटीकता के लिए अंय मापदंडों के रूप में के रूप में महत्वपूर्ण नहीं है ।
तापमान कमरे के तापमान की सिफारिश की है
प्लेट प्रकार आप उपयोग कर रहे हैं थाली के अनुसार उपयोग करें । आमतौर पर प्लेट ९६ है-ठीक है, फ्लैट और सफेद ।
फ़िल्टर उत्तेजना या उत्सर्जन फिल्टर Luminescence के लिए आवश्यक नहीं हैं । उत्तेजना किसी भी वांछित मूल्य पर सेट किया जा सकता है और उत्सर्जन के लिए इष्टतम रेंज 430-445 एनएम है । फ़िल्टर रिक्त स्थान छोड़ें । यदि यह एक विकल्प नहीं है,

तालिका 3: luminometer सेटिंग्स का विस्तृत वर्णन ।

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Discussion

यहाँ हम छोटे GTPase prenylation और GTP बंधन छोटे GTPase उपसेलुलर स्थानीयकरण (झिल्ली बनाम cytosol) और Rho GTP लोडिंग के रूप में दिखाया उपाय करने के लिए एक सटीक विधि का वर्णन । छोटे GTPases eukaryotic कोशिकाओं में व्यक्त कर रहे है और सेलुलर प्रसार, गतिशीलता, और संरचना में आवश्यक भूमिका निभाते हैं । prenylation और GTP बाइंडिंग दोनों GTPase गतिविधि के विनियमन में शामिल हैं; इसलिए, इन प्रोटीन के prenylation और GTP बाइंडिंग का मूल्यांकन करने के लिए परख सेल जीव1,8के लिए महत्वपूर्ण उपकरण हैं ।

हाल ही के एक अध्ययन के परिणामों के आधार पर, Rho प्रोटीन GTP लोडिंग सेल-प्रकार विशिष्ट8है, और इसलिए, विभिन्न प्रकार के सेल के बीच अलग है । इसके अलावा, उपसेलुलर स्थानीयकरण और Rho प्रोटीन के geranylgeranylation (GGT) अपने समारोह के विनियमन में कदम निर्धारित कर रहे हैं । यह भी आगे प्रभावक प्रोटीन जीईएफ, गैप, और GDI के प्रमुख GTPases के लिए का एक नाटक द्वारा विनियमित है ।

Simvastatin THP-1 monocytes में आरएसी GTP लोडिंग बढ़ाने के लिए जाना जाता है, prenylation β उत्तेजना की उपस्थिति में आरएसी के amyloid में कमी, और इन17कोशिकाओं से भड़काऊ प्रतिक्रियाओं को कम । हम यह भी जानते है कि टी सेल समारोह Rho GTP लोड हो रहा है लेकिन, बल्कि, Rho के GGT से प्रभावित नहीं है समारोह18,19निर्धारित करता है । इसलिए, हम अनुशंसा करते हैं कि, क्रम में Rho GTPase गतिविधि का पता लगाने के लिए, prenylation और GTP लोडिंग दोनों एक साथ कक्षों में मापा जाना चाहिए ।

नोट की, उच्च शुद्धता cytosolic और झिल्ली अंशों को प्राप्त करने के लिए, प्रोटोकॉल का सबसे महत्वपूर्ण कदम sonication और ultracentrifugation हैं । Rho GTP-बाध्यकारी परख के लिए, सबसे महत्वपूर्ण कदम है स्नैप-क्रमिक प्रसंस्करण से पहले सेल lysates ठंड । इन महत्वपूर्ण चरणों के बाद रहने वाले सिस्टम में GTPases के अध्ययन में सुसंगत और reproducible परिणाम का उत्पादन होगा ।

एक विशेष intracellular संरचना या झिल्ली प्रोटीन की जांच करने के लिए एक महत्वपूर्ण कदम एक दूसरे से सेलुलर डिब्बों की जुदाई है । भिंन आकार और आकार, सतह प्रभारी घनत्व, और बोया घनत्व20की तरह, प्रत्येक सेलुलर डिब्बे के गुणों का लाभ लेता है । यह मुख्य रूप से 4 डिग्री सेल्सियस पर उच्च चिपचिपापन के मीडिया में अंतर केंद्रापसारक पर आधारित है । झिल्ली अंश विधि जो यहाँ इस्तेमाल किया गया था मुख्य रूप से प्रत्येक डिब्बे के आकार पर और उच्च गुरुत्वाकर्षण गति पर आधारित है, जहां, ultracentrifugation के बाद, झिल्ली प्रोटीन ट्यूब के नीचे करने के लिए जाना और cytosolic प्रोटीन में रहते हैं supernatant.

यह ध्यान रखें कि उच्च प्रोटीन सांद्रता और, संभवतः, अंतराल के उच्च स्तर संभावित लक्ष्य GTPase निष्क्रिय कर सकते है युक्त नमूने महत्वपूर्ण है । यह समस्या भी lysis बफ़र में हो सकता है और false नकारात्मक परिणाम करने के लिए लीड हो सकता है । महत्वपूर्ण मापदंडों में से एक है कि सफलता और GTPase गतिविधि परख परिणामों के reproducibility निर्धारित करने के स्वास्थ्य और जवाबदेही कोशिकाओं का प्रयोग8में इस्तेमाल किया जा रहा है । यह दृढ़ता से सिफारिश की है कि जांचकर्ताओं इष्टतम/उचित विकास की स्थिति और अध्ययन के तहत कोशिकाओं के लिए दोहरीकरण समय GTPase सक्रियण निर्धारित/ इसके अतिरिक्त, सभी छोटे GTPases के GTPase गतिविधि कसकर विनियमित है और है, इसलिए, GTP अणु के hydrolysis के माध्यम से तेजी से घटने के लिए अतिसंवेदनशील अंतराल की कार्रवाई के माध्यम से एंजाइम के लिए बाध्य (के दौरान और सेल lysis प्रक्रिया के बाद ). यह कार्य ब्याज की GTPase की तीव्र निष्क्रियता में परिणाम है । इसलिए, यह दृढ़ता से सिफारिश की है कि सेल lysis तेजी से 4 डिग्री सेल्सियस पर प्रदर्शन किया है, सही और reproducible परिणाम प्राप्त करने के लिए ।

प्रयोगात्मक शर्तों पर निर्भर करता है कि अंतिम सेल lysate निर्धारित कई कारक हैं । सबसे पहले, सेल लाइन या विशिष्ट ऊतक में RhoA GTPase की कुल राशि: अंतर्जात RhoA GTPase की मात्रा कोशिकाओं और ऊतकों के विभिन्न प्रकार में चर रहा है; इसलिए, यह एक उत्प्रेरक या उत्प्रेरक के लिए एक अधिक जोरदार प्रतिक्रिया में परिणाम कर सकते हैं । दूसरा, सक्रियकरण की राशि/प्रयोगात्मक शर्तों के तहत प्राप्त सक्रियण/यह महत्वपूर्ण है पर विचार करने के लिए कि लगभग 2% कुल सेलुलर छोटे GTPase के 10% के लिए संभवतः एक विशिष्ट उत्तेजना8के जवाब में सक्रिय है । निष्क्रियता की मात्रा भी पूरी तरह से उत्तेजनाओं के प्रकार पर निर्भर करता है और यह विभिन्न कोशिकाओं और ऊतकों में चर रहा है । इसलिए, छोटे Rho GTPase गतिविधि परख के प्रत्येक प्रकार के लिए, lysis बफर और सेलुलर डिब्बे की संरचना महत्वपूर्ण है । तालिका 3 प्रत्येक विशिष्ट छोटे GTPase प्रोटीन के लिए lysis बफर की सिफारिश की संरचना से पता चलता है ।

सामान्यीकृत कोशिका lysate प्रोटीन एकाग्रता एक प्रमुख आवश्यकता है क्योंकि यह जांचकर्ताओं को विभिन्न नमूनों की GTPase गतिविधि की तुलना करने में सक्षम बनाता है । इसलिए ठंडे पंजाबियों के साथ सभी शर्तों में सभी नमूनों से कोशिकाओं को धोना, टिशू कल्चर मीडिया से प्रोटीन निकालना अनिवार्य है । यह भी आवश्यक है कि सभी रिएजेंटों और बफ़र्स प्रयोग के सभी चरणों में ठंडे तापमान (4 डिग्री सेल्सियस) पर इस्तेमाल किया जाता है । यह ठंडा तापमान सैंपल तैयार करने के दौरान Rho GTPase सहित GTPases की hydrolysis को कम कर देगा । यह महत्वपूर्ण है कि सेल lysates के इस प्रसंस्करण तेजी से आयोजित किया जाता है (कुल में 10-15 मिनट में) क्रम में RhoA GTPase गतिविधि के नुकसान से बचने के लिए । इसके अलावा, सेल lysate तैयारी का सबसे महत्वपूर्ण कदम RhoA छोटे GTPase एंजाइमी गतिविधि बनाए रखने के लिए तरल नाइट्रोजन में lysate के स्नैप-फ्रीज aliquots है । यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण है अगर वहां विभिंन timepoints या प्रयोग में कई नमूने हैं । स्नैप-जमे हुए lysates की तैयारी के बाद, नमूनों को अपने Rho GTPase गतिविधि को खोने के बिना-८० ° c में रखा जा सकता है ।

RhoA GTPase की झिल्ली एंकरिंग के विश्लेषण के लिए प्रदान की प्रोटोकॉल छोटे GTPases के prenylation को मापने के लिए केवल एक अप्रत्यक्ष उपकरण का प्रतिनिधित्व करता है और सीधे लक्ष्य प्रोटीन के लिए isoprenoid अवशेषों के बंधन का पता लगाने या मात्रा नहीं कर पा रहा है । यह इस परख की बहुत कुछ सीमाओं में से एक है । इसलिए, यह प्रोटीन के prenylation का एक अनुमान देता है । कुछ तरीकों को परिभाषित किया गया है कि सीधे farnesyl ट्रांस्फ़्रेज़ और/या geranylgeranyl ट्रांस्फ़्रेज़ द्वारा एफटी (farnesylation) और/या GGT को मापने के लिए कर रहे हैं, क्रमशः, दोनों संस्कृतिपूर्ण कोशिकाओं में और पशुओं और मानव में प्राप्त ट्यूमर । परख electrophoretic गतिशीलता बदलाव का उपयोग करें, [3H] farnesyl diphosphate और [3H] geranylgeranyl diphosphate, और [3H] mevalonic एसिड लेबलिंग, immunoprecipitation और एसडीएस के बाद-पृष्ठ21।

हम RhoA GTPase-जुड़े immunosorbent परख किसी भी झिल्ली एंकरिंग और RhoA GTPase की गतिविधि का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया । यह एक Rho-GTP-बाध्यकारी प्रोटीन है जो एक ९६-अच्छी तरह से थाली के कुओं से जुड़ा हुआ है के होते हैं । अतः, कोशिका या ऊतक lysates में GTP-बाउंड सक्रिय Rho को कुएँ में बाँधता है, जबकि घरेलू उत्पाद-बाउंड निष्क्रिय Rho को वाशिंग स्टेप्स के दौरान दूर धोया जाता है. इसके बाद कुएं में बंधे, एक्टिव RhoA को RhoA-विशिष्ट एंटीबॉडी व chemiluminescence का प्रयोग कर पता लगाया जाएगा । यह RhoA सक्रियण की डिग्री निष्क्रिय से सक्रिय सेल lysates करने के लिए सक्रिय से रीडिंग की तुलना करके निर्धारित करने के लिए संभव है. सीरम भुखमरी (प्रसंस्कृत कोशिकाओं पर सीरम मुक्त माध्यम का उपयोग) आमतौर पर ऊतक संस्कृति में RhoA को निष्क्रिय करने के लिए प्रयोग किया जाता है । यह भी उल्लेख किया जाना चाहिए कि सक्रियण के GTPase से जुड़े immunosorbent परख रेंज RhoA GTPase गतिविधि का पता लगाने के लिए प्रोटीन की 10-50 µ जी की आवश्यकता है ।

यह दृढ़ता से सिफारिश की है कि अनुपचारित नमूने GTPase गतिविधि (नियंत्रण राज्य) के कम बेसल सेलुलर स्तर है । एक उदाहरण के रूप में, उचित कोशिका भुखमरी की स्थिति GTPase गतिविधि downregulate और आदर्श शर्तों प्रदान करने के लिए प्रयोगात्मक शर्तों के तहत अपने सक्रियण दिखा सकते हैं । इसके अलावा, दोनों सक्रियकरण और संकोच परख एक समय में प्रदर्शन किया है और खुराक-प्रतिक्रिया तरीके से सबसे अच्छा GTPase सक्रियण प्राप्त/ इससे भी महत्वपूर्ण बात, सेलुलर तैयारी के दौरान, यह बहुत महत्वपूर्ण है कोशिकाओं का उपयोग करने के लिए जो overconfluent नहीं कर रहे है (> 70%), सक्रियण के लिए कोशिकाओं की किसी की प्रतिक्रिया से बचने के लिए/

Luminometers संवेदनशीलता और निरपेक्ष रीडिंग के मामले में बहुत अलग । इसलिए, क्रम में यह निर्धारित करने के लिए कि यह रैखिक रेंज में है, हम एक खाली और एक सकारात्मक नियंत्रण के साथ एक GTPase-लिंक्ड immunosorbent परख चलाने का सुझाव देते हैं । यदि परख रैखिक सीमा से बाहर है (सकारात्मक नियंत्रण 4x-10x बफर केवल पढ़ने से अधिक होना चाहिए) या खाली पढ़ने 9-10 करोड़ डॉलर से अधिक है, तो यह आगे एंटीबॉडी कमजोर पड़ने का उपयोग करने की सिफारिश की है । इसके अलावा, हम अत्यधिक परख की शुरुआत से पहले परख के रैखिक रेंज के भीतर पढ़ने के लिए luminometer जांचना सलाह देते हैं ।

वहां भी कर रहे है GTPase से जुड़े immunosorbent परख कि उल्लेख के लायक है लाभ । GTPase-लिंक्ड immunosorbent परख वर्तमान प्रायोगिक डिजाइन में सुधार और प्रौद्योगिकी सक्षम करने के लिए प्रयोग है कि पुराने पुल के साथ संभव नहीं थे की सुविधा22तकनीक चढ़ाव । GTPase-से जुड़े immunosorbent परख भी जांच सटीकता और संवेदनशीलता है कि पहले से ही तैयारी में GTPase गतिविधि के विश्लेषण की अनुमति देता है प्रदान करने के लिए पुल के नीचे23परख । हाल के अध्ययन के एक जोड़े GTPase की तुलना में पुल-चढ़ाव के साथ immunosorbent सक्रियकरण परख से जुड़े और निष्कर्ष निकाला कि GTPase-immunosorbent परख जुड़े कुछ स्पष्ट लाभ है, अर्थात् है कि GTPase-immunosorbent परख से जुड़े बेहतर है उनके कारण 22,24, उनके अधिक से अधिक संवेदनशीलता24, और उनके मात्रात्मक माप23प्रोटीन की छोटी मात्रा का उपयोग करने की क्षमता । GTPase-लिंक्ड immunosorbent परख किट या तो luminometric या वर्णमिति पता लगाने के संस्करणों में उपलब्ध है, जहां luminometric परख अधिक संवेदनशील होते हैं । इस GTPase-immunosorbent परख से जुड़े एक बल्कि सरल और तेजी से प्रोटोकॉल पर आधारित है, नमूना की केवल छोटी मात्रा की आवश्यकता है, और पैदावार मात्रात्मक और सटीक परिणाम । इसलिए, यह एक अच्छा विचार के लिए आगे इस परख विकसित करने के लिए विभिंन सेल लाइनों और एक बहुत उच्च विशिष्टता और सटीकता के साथ ऊतक संस्कृति कोशिकाओं में GTPase आधारित प्रोटीन के अंय प्रकार का पता लगाने हो सकता है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

Saeid Ghavami को स्वास्थ्य विज्ञान केन्द्र संचालन अनुदान, CHRIM संचालन अनुदान एवं अनुसंधान Manitoba नये अन्वेषक परिचालन अनुदान का समर्थन किया गया । जावा Alizadeh अनुसंधान Manitoba के छात्र द्वारा समर्थित किया गया था । शहला Shojaei को हेल्थ साइंस फाउंडेशन ऑपरेटिंग ग्रांट और MITACS postdoctoral फेलोशिप में तेजी लाने का समर्थन किया था । अदेल Rezaei Moghadam यूसुफ डब्ल्यू गॉर्डन द्वारा आयोजित किया गया था जो एक NSERC ऑपरेटिंग अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था । अमीर ए Zeki ने NIH/NHLBI K08 अवार्ड (1K08HL114882-01A1) का समर्थन किया था । ब्रांडों जे लॉस कृपया NCN अनुदान #2016/21/b/nz1/02812 से समर्थन स्वीकार करते हैं, LE STUDIUM इंस्टीट्यूट फॉर एडवांस्ड स्टडीज (क्षेत्र केंद्र-वैल डी लॉयर, फ्रांस) द्वारा अपने स्मार्ट लॉयर घाटी सामान्य कार्यक्रम और सह के माध्यम से वित्त पोषित द्वारा समर्थित Sklodowska-क्यूरी क्रियाएं, अनुदान #665790 । सिमोन दा सिल्वा रोजा को UMGF की छात्राओं ने समर्थन दिया ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM high Glucose VWR (Canada) VWRL0101-0500
Fetal Bovine Serum VWR (Canada) CA45001-106
Penicillin/Streptomycin VWR (Canada) 97062-806
EDTA (Ethylenediamine tetraacetic acid) VWR (Canada) CA71007-118
EGTA (Ethylene glycol bis(2-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid) VWR (Canada) CAAAJ60767-AE
DTT (DL-Dithiothreitol) VWR (Canada) CA97061-340
Ammonium Persulfate VWR (Canada) CABDH9214-500G
Tris-Hydroxymethylaminomethane VWR (Canada) CA71009-186
30% Acrylamide/Bis Solution Biorad (Canada) 1610158
TEMED Biorad (Canada) 1610801
Protease Inhibitor cocktail Sigma/Aldrich (Canada) P8340-5ML 1:75 dilution
Rho-GTPase Antibody Sampler Kit Cell Signaling (Canada) 9968 1:1000 dilution
Pan-Cadherin antibody Cell Signaling (Canada) 4068 1:1000 dilution
GAPDH antibody Santa Cruz Biotechnology (USA) sc-69778 1:3000 dilution
RhoA G-LISA Activation Assay (Luminescence format) Cytoskeleton Inc. (USA) BK121 Cytoskeleton I. G-LISA Activation Assays Technical Guide. 2016.
RhoA Antibody Cell Signaling 2117
ECL Amersham-Pharmacia Biotech RPN2209
Anti-Rabbit IgG (whole molecule) Peroxidase antibody Sigma A6154-1ML
SpectraMax iD5 Multi-Mode Microplate Reader Molecular Devices  1612071A Spectrophotometer
Nonidet P-40 Sigma 11332473001 non-denaturing detergent, octylphenoxypolyethoxyethanol
DMSO Sigma D8418-50ML
PBS Sigma P5493-1L
Phophatase Inhibitor cocktail Sigma P5726-5ML 1:75 Dilution

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References

  1. Yeganeh, B., et al. Targeting the mevalonate cascade as a new therapeutic approach in heart disease, cancer and pulmonary disease. Pharmacology & Therapeutics. 143 (1), 87-110 (2014).
  2. Valencia, A., Chardin, P., Wittinghofer, A., Sander, C. The ras protein family: evolutionary tree and role of conserved amino acids. Biochemistry. 30 (19), 4637-4648 (1991).
  3. Hall, A. Rho family GTPases. Biochemical Society Transactions. 40 (6), 1378-1382 (2012).
  4. Rojas, A. M., Fuentes, G., Rausell, A., Valencia, A. The Ras protein superfamily: evolutionary tree and role of conserved amino acids. The Journal of Cell Biology. 196 (2), 189-201 (2012).
  5. Cherfils, J., Zeghouf, M. Regulation of small GTPases by GEFs, GAPs, and GDIs. Physiological Reviews. 93 (1), 269-309 (2013).
  6. Shojaei, S., et al. Perillyl Alcohol (Monoterpene Alcohol), Limonene. Enzymes. 36, 7-32 (2014).
  7. Ghavami, S., et al. Airway mesenchymal cell death by mevalonate cascade inhibition: integration of autophagy, unfolded protein response and apoptosis focusing on Bcl2 family proteins. Biochimica et Biophysica Acta. 1843 (7), 1259-1271 (2014).
  8. Alizadeh, J., et al. Mevalonate Cascade Inhibition by Simvastatin Induces the Intrinsic Apoptosis Pathway via Depletion of Isoprenoids in Tumor Cells. Scientific Reports. 7, 44841 (2017).
  9. Ghavami, S., et al. Mevalonate cascade regulation of airway mesenchymal cell autophagy and apoptosis: a dual role for p53. PLoS One. 6 (1), e16523 (2011).
  10. Tang, Y., Olufemi, L., Wang, M. T., Nie, D. Role of Rho GTPases in breast cancer. Frontiers in Bioscience: A Journal and Virtual Library. 13, 759-776 (2008).
  11. DerMardirossian, C., Bokoch, G. M. GDIs: central regulatory molecules in Rho GTPase activation. Trends in Cell Biology. 15 (7), 356-363 (2005).
  12. Garcia-Mata, R., Boulter, E., Burridge, K. The 'invisible hand': regulation of RHO GTPases by RHOGDIs. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12 (8), 493-504 (2011).
  13. Etienne-Manneville, S., Hall, A. Rho GTPases in cell biology. Nature. 420 (6916), 629-635 (2002).
  14. Ghavami, S., et al. Geranylgeranyl transferase 1 modulates autophagy and apoptosis in human airway smooth muscle. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 302 (4), L420-L428 (2012).
  15. Clark, E. A., Golub, T. R., Lander, E. S., Hynes, R. O. Genomic analysis of metastasis reveals an essential role for RhoC. Nature. 406 (6795), 532-535 (2000).
  16. Ghavami, S., et al. Statin-triggered cell death in primary human lung mesenchymal cells involves p53-PUMA and release of Smac and Omi but not cytochrome c. Biochimica et Biophysica Acta. 1803 (4), 452-467 (2010).
  17. Cordle, A., Koenigsknecht-Talboo, J., Wilkinson, B., Limpert, A., Landreth, G. Mechanisms of statin-mediated inhibition of small G-protein function. Journal of Biological Chemistry. 280 (40), 34202-34209 (2005).
  18. Waiczies, S., Bendix, I., Zipp, F. Geranylgeranylation but not GTP-loading of Rho GTPases determines T cell function. Science Signaling. 1 (12), pt3 (2008).
  19. Waiczies, S., et al. Geranylgeranylation but not GTP loading determines rho migratory function in T cells. Journal of Immunology. 179 (9), 6024-6032 (2007).
  20. Satori, C. P., Kostal, V., Arriaga, E. A. Review on Recent Advances in the Analysis of Isolated Organelles. Analytica Chimica Acta. 753, 8-18 (2012).
  21. Berndt, N., Sebti, S. M. Measurement of protein farnesylation and geranylgeranylation in vitro, in cultured cells and in biopsies, and the effects of prenyl transferase inhibitors. Nature Protocols. 6 (11), 1775-1791 (2011).
  22. Keely, P. J., Conklin, M. W., Gehler, S., Ponik, S. M., Provenzano, P. P. Investigating integrin regulation and signaling events in three-dimensional systems. Methods in Enzymology. 426, 27-45 (2007).
  23. Oliver, A. W., et al. The HPV16 E6 binding protein Tip-1 interacts with ARHGEF16, which activates Cdc42. British Journal of Cancer. 104 (2), 324-331 (2011).
  24. Moniz, S., Matos, P., Jordan, P. WNK2 modulates MEK1 activity through the Rho GTPase pathway. Cellular Signalling. 20 (10), 1762-1768 (2008).

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छोटे GTPase Prenylation और GTP झिल्ली अंश और GTPase से जुड़े Immunosorbent परख का उपयोग बाध्यकारी का पता लगाने
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