Summary
Her beskriver vi en protokol for at undersøge prenylation og Guanosinmonofosfat-5'-trifosfat (GTP)-lastning af Rho GTPase. Denne protokol består af to detaljerede metoder, nemlig membran fraktionering og en GTPase-forbundet immunosorbent assay. Protokollen kan bruges til at måle prenylation og GTP indlæsning af forskellige andre små GTPases.
Abstract
Familien Rho GTPase tilhører Ras superfamilien og omfatter cirka 20 medlemmer hos mennesker. Rho GTPases er vigtige i reguleringen af forskellige cellulære funktioner, herunder cytoskeletal dynamics, celle motilitet, celle polaritet, cytoskeletale vejledning, vesikulær handel og cellecyklus kontrol. Ændringer i Rho GTPase signalering spille en væsentlig regulerende rolle i mange patologiske tilstande, såsom kræft, centrale nervesystem sygdomme og immunforsvar-afhængige sygdomme. Den posttranslationelle modifikation af Rho GTPases (dvs., prenylation af mevalonsyre pathway mellemprodukter) og GTP bindende er centrale faktorer, der påvirker aktivering af dette protein. I dette papir tilbydes to væsentlige og enkle metoder til at opdage en bred vifte af Rho GTPase prenylation og GTP bindende aktiviteter. Detaljer om de tekniske procedurer, der er brugt er forklaret trin for trin i dette håndskrift.
Introduction
Rho GTPases er en gruppe af små proteiner (21-25 kDa), som er godt bevaret i hele udviklingen, og danner en unik underfamilie i Ras superfamilien af små GTPases. I hver underfamilie inden for denne superfamilien er der en delt G domæne kerne, der er involveret i GTPase aktiviteter og nukleotid udveksling1. Forskellen mellem familien Rho og andre Ras underfamilierne er tilstedeværelsen af et "Rho Indsæt domæne" inden for de 5th β strand og de 4th α helix i den lille GTPase domæne2.
Baseret på den seneste klassificering, anses Rho GTPases for en familie af signalering proteiner, der passer ind i Ras GTPase superfamilien3. Pattedyr Rho GTPases har 22 medlemmer baseret på deres særlige funktion og generelle karakterisering4 , RhoA, Rac1 og Cdc42 er blandt de mest studerede medlemmer i denne gruppe. Rho GTPases er knyttet til intracellulær signalering veje via en stramt reguleret mekanisme, som er afhængige af molekylære switches via protein posttranslationelle modifikationer5.
GTP lastning og hydrolyse er vigtige mekanismer i aktivering/deaktivering cyklus af små Rho GTPases og er reguleret via aktivering af GTPase proteiner (huller). Hullerne er ansvarlig for GTP hydrolyse og arbejde i koncert med guanin nukleotid exchange faktorer (GEFs), som er ansvarlige for GTP-loading reaktion. Rho BNP dissociation hæmmere (GDIs) giver yderligere regulering af små Rho GTPases via binding til BNP-bundet Rho GTPases. Dette hæmmer BNP dissociation og letter binding af små Rho GTPases væk fra de aktive intracellulære membran websteder. Der er også yderligere regulering af Rho GTPase proteiner med prenylation af GDIs, som regulerer både nukleotid hydrolyse og udveksling og kontrol BNP/GTP cykling1,6,7,8.
Både GTP-loading og Rho GTPase prenylation er involveret i Rho GTPase frie bevægelighed mellem cytosol og cellemembraner ved at ændre de lipofile egenskaber af disse proteiner1,9. De ovennævnte tilsynsmyndigheder interagere med fosfolipider i cellemembranen og andre modulerende proteiner af BNP/GTP exchange aktivitet10. Derudover blokere GDIs, dissociation hæmmere, både GTP hydrolyse og BNP/GTP udveksling. GDIs hæmmer dissociation af de inaktive Rho proteiner fra BNP, og derfor deres interaktion med downstream effektorer. GDIs også regulere cykling af GTPases mellem cytosol og membran i cellen. Aktivitet af Rho GTPases i vid udstrækning afhænger af deres bevægelse til cellemembranen; således betragtes GDIs som kritiske regulatorer, der kan udskille GTPases i cytoplasma gennem skjule deres hydrofobe region/domæner11,12.
Den dynamiske cyklus af GTP-indlæsning/GTP hydrolyse er afgørende for Rho GTPase at have en optimal signalering og funktion i alle faser af dens aktivering cyklus. Nogen form for ændringer i denne proces kan medføre efterfølgende ændringer i cellefunktioner reguleret af Rho GTPase, såsom celle polaritet, spredning, morfogenese, cytokinesis, migration, vedhæftning og overlevelse13,14.
Den nuværende protokol giver læserne med en detaljeret metode til at overvåge små RhoA GTPase aktivering via undersøgelse af deres prenylation og BNP/GTP lastning. Denne metode kan også bruges til at registrere prenylation og GTP bindingen af en bred vifte af små GTPases. GTPase-forbundet immunosorbent assay kan bruges til at måle niveauet af aktivering af andre former for GTPases, Rac1, Rac2, Rac3, H-, K-eller N-Ras, Arf og Rho15. Farmakologiske agent simvastatin bruges som eksempel, da det blev for nylig rapporteret at være involveret i reguleringen af små Rho GTPase prenylation og aktivitet8,9,14,16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. bestemmelse af RhoA lokalisering ved hjælp af membran/Cytosol fraktionering
-
Celle kultur og simvastatin behandling
- Frø 50.000 af U251 celler i en 100 mm fad og kultur dem i Dulbeccos ændrede Eagle's medium (DMEM) (høje glukose, 10% føtal bovint serum [FBS]).
- Når 30% sammenflydende, behandle cellerne ved at fjerne mediet og tilføje simvastatin-holdige medium til det (10 µM af simvastatin opløst i dimethylsulfoxid [DMSO]), og der inkuberes i 36 timer ved 37 ° C8. Bruge DMSO alene som et køretøj kontrol.
Bemærk: 10 millioner celler er nødvendige for cytosol og membran fraktionering af cellerne.
-
Samling af celler
- Fjerne celler fra 37 ° C inkubator. Kig på cellerne under et mikroskop for at bekræfte confluency.
Bemærk: Cellerne skal være 70-80% sammenflydende. - Opsug mediet, vaske cellerne 1 x med kolde fosfatbufferet saltopløsning (PBS). Der tilsættes 5 mL af ethylendiamintetra syre (EDTA) buffer (KCl: 400 mg/L, NaCl: 6800 mg/L, NaHCO3: 2200 mg/L, NaH2PO4. H2O: 140 mg/L, D-glucose: 1.000 mg, EDTA dinatrium: 373 mg/L) pr. plade og sted cellerne tilbage til 37 ° C inkubator i 5 min.
- Efter 5 min inkubation, indsamle EDTA med celler i en 15 mL tube, som indeholder den samme mængde substrat som EDTA.
Bemærk: At have medie i røret neutraliserer EDTA og forhindrer enhver yderligere fordøjelsen af cellemembraner. - Glasset anbringes i en ice box og gå videre til centrifugen.
- Oprette centrifuge til 1.500 x g ved 4 ° C og spin celler i 5 min.
- Fjern supernatanten uden at forstyrre pelleten og tilsæt 1 mL koldt PBS. Bland cellerne godt.
- Overføre celle blanding (opløsning) til en ny 1,5 mL tube, centrifuge på 1.500 x g ved 4 ° C, og spin celler i 5 min.
- Kontrollere pellet størrelse (til vurdering af mængden af buffer til det næste trin). Placer prøverne på is. Supernatanten helt uden at forstyrre pelleten.
- Tilføje iskold buffer I (10 mM Tris-HCl [pH 7,5], 0.1 mM EDTA, 0.1 mM EGTA, 1 mM dithiothreitol og protease hæmmer cocktail), bland prøverne godt af pipettering op og ned, og derefter gå videre til sonikering.
- Fjerne celler fra 37 ° C inkubator. Kig på cellerne under et mikroskop for at bekræfte confluency.
-
Sonikering
- Sæt sonikator til fem cykler, 5 s hver, og Gentag 3 x.
- Udføre sonikering på is. Gå videre til ultracentrifuge.
Bemærk: Is og kolde betingelse bevare proteiner og gøre resultaterne mere pålidelige.
-
Ultracentrifugering
- Brug en ultracentrifuge til at adskille celle homogeniseret i cytoplasmatisk og membran fraktioner. Angiv centrifugen til 100.000 x g i 35 min. ved 4 ° C. Som vist i figur 1, kontrollere pellet størrelse.
Bemærk: Membran brøkdel er på bunden af røret og resten er andre cytoplasmatisk komponenter. - Indsamle supernatanten helt samtidig passe på ikke at forstyrre pelleten. Supernatanten er det cytosole brøkdel. Placer supernatanten i et nyligt mærket rør.
- Tilsæt 300 µL af dissociation buffer (buffer II) (50 mM Tris-HCl [pH 7,5], 0,15 M NaCl, 1 mM dithiothreitol, 1% SDS, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA og protease hæmmer cocktail) til pellet (indeholder membran brøkdel). Bland godt af pipettering op og ned.
- Fortsæt til protein beslutsomhed og vestlige skamplet (immunblot analyse) prøveforberedelse.
- Brug en ultracentrifuge til at adskille celle homogeniseret i cytoplasmatisk og membran fraktioner. Angiv centrifugen til 100.000 x g i 35 min. ved 4 ° C. Som vist i figur 1, kontrollere pellet størrelse.
-
Immunoblotting
- Forberede celle protein ekstrakter fra de separerede fraktioner i lysisbuffer (20 mM Tris-HCl [pH 7,5], 0,5 mM PMSF, 0,5% nonionisk detergent-40, 100 µM β-glycerol-3-fosfat, og 0,5% protease hæmmer cocktail).
- Måle proteinkoncentration bruger Lowry metode8 og beregne mængden af lysisbuffer (20 mM Tris-HCl [pH 7,5], 0,5 mM PMSF, 0,5% nondenaturing vaskemiddel, octylphenoxypolyethoxyethanol, 100 µM β-glycerol-3-fosfat og 0,5% protease hæmmer cocktail) til at normalisere koncentrationen af protein mellem prøverne.
- Opvarme prøverne ved 90 ° C i 5 min og indlæse 15-20 µL af prøver på en 15% SDS-PAGE gel til at adskille proteiner.
Bemærk: Ilæg 1 µg protein for hver prøve. Beregne den diskenhed, der skal køres i overensstemmelse hermed. - Overføre de adskilt proteiner til nylon membraner under reducere betingelser (500 nM glycin, 50 mM Tris-HCl og 20% methanol) i 2 timer ved stuetemperatur (RT) på 100 V.
Bemærk: For at bekræfte den succesfulde protein overførsel, bruge Ponceau pletten eller visualisere protein markør på membranen. - Blokere membraner med 5% nonfat tørmælk og 1 x Tris-bufferet saltvand indeholder vaskemiddel (TBS/0.01% nonionisk detergent; TBST) at blokere uspecifik antistof bindende ved 4 ° C natten over eller på RT for 1 h.
- Tilføj primære antistoffer for immunoblotting analyse og inkuberes natten over ved 4 ° C.
Bemærk: I dette eksperiment, Rac1/2/3, cdc42, RhoA, GAPDH og pan-Cadherin blev brugt på en 1:1,000 fortynding i 1% mælk i 1 x TBST. Pan-Cadherin og GAPDH blev brugt til at bekræfte membran og cytosole brøkdel renhed, henholdsvis. - Vaske membraner 3 x med en vask buffer med 1 x TBST i 20 min.
- Inkuber membraner med anti-kanin peberrodsperoxidase (HRP)-konjugeret sekundær antistof til de respektive primære antistoffer (for 1 h i RT).
- Vask klatter 3 x i 20 min. og udvikle dem med forbedret kemiluminescens (ECL) påvisning.
2. måling af RhoA GTP belastning ved hjælp af en lille G-protein aktivering Assay
- Grev 10.000 celler/mL og kultur parabol U251 celler i en 100 mm.
- Når de er 30% sammenflydende, behandle celler med simvastatin som beskrevet i trin 1.1.2.
- Bringe kultur plader ud af varmeskabet. Se celler under mikroskop for at bekræfte confluency. Sikre, at cellerne er 70-80% sammenflydende. Placere petriskålen på is, Aspirér medierne og vaske cellerne 3 x med iskold PBS (pH 7,2).
- Opsug PBS. Vippe petriskål på is i et ekstra minut til at fjerne alle rester af PBS.
Bemærk: Resterende PBS negativt påvirker dette assay. - Lyse celler i en 700 µL volumen af iskold lysisbuffer indeholdende protease og fosfatase hæmmere.
Bemærk: 700 µL er normalt nok for en 100 mm petriskål. Se tabel 1 for at finde den rette mængde for hvert fartøj, kultur. - Høste cellen lysate med celle skraber. Incline kultur plade til denne teknik.
- Overførsel af lysate til en mærket iskold cryotube og holde det på is.
- Blandes grundigt ved hjælp af en vortex. Holde 10 µL af den lysate for protein-analysen til at måle koncentrationen af protein i prøven.
- Snap-freeze cellen resterende lysate i flydende kvælstof.
Bemærk: Forberede flere delprøver af celle lysate før snap-frysning dem, for at undgå gentagne fryse/tø cykler, som kan føre til tab af aktiviteten af RhoA GTPase. - Overføre den snap-frosne cryotubes til en-80 ° C fryser og gemme prøver til GTPase-forbundet immunosorbent assay.
Bemærk: Opbevar ikke prøver længere end 14 dage. Arbejde hurtigt og aldrig forlade prøverne på isen i mere end 10 min. Aldrig håndtere alle petriskåle samtidigt. - Måle proteinkoncentration bruger Lowry metode8 og beregne mængden af lysisbuffer til at normalisere koncentrationen af protein mellem prøverne.
Bemærk: Den bedste koncentration er sædvanligvis 1 mg/mL; 0,3 - 2 mg/mL kan dog spores. - Forberede et tomt kontrolelement ved at føje 60 µL af lysisbuffer og 60 µL af binding buffer til en microtube.
Bemærk: Blindprøvekontrollen har alle reagenser undtagen antigenet og bruges til subtraktion af baggrunden. - Forbered en positiv kontrol ved at tilføje 12 µL af Rho kontrol protein, 48 µL af lysisbuffer og 60 µL af binding buffer.
Bemærk: Den positive kontrol har alle reagenser plus en bekræftet antigen til Rho-A-GTP. - Tage Rho affinitet plade ud af sin taske og placere den på is.
- Opløse pulveret i brønde med 100 µL iskold destilleret vand. Holde pladen på is.
- Optø de snap-frosne cellelysater i vandbad indstillet til 25 ° C.
- Føje beregnede mængden af iskold lysisbuffer (fra trin 2.11) til hver prøve at normalisere proteinkoncentration.
Bemærk: Fjern PBS efter vask celler (ved hjælp af et vakuum rør indsugningsventil) for at undgå forårsager ændringer i sammensætningen af lysisbuffer. Udligne prøve protein til en fusion mellem 0,8 og 2 mg/mL ved en nøjagtig sammenligning mellem prøver i GTPase aktivering assays. Tabel 2 indeholder oplysninger om bufferen, der skal bruges til dette assay. - Overføre 60 µL af de normaliserede iskolde prøver til microtubes og tilsættes 60 µL af bindende buffer; Bland prøverne grundigt og holde dem på is.
- Helt fjerne vand/løsninger fra mikrotiterplade ved energisk svirpende, efterfulgt af fem til syv hårde haner på en lab mat.
- Tilføje 50 µL af de normaliserede prøver, et tomt kontrolelement og en positiv kontrol brønde i dubletter.
- Pladen anbringes på en orbitalryster i 30 min. ved 4 ° C ved 300 rpm.
Bemærk: Den ryster trin er meget vigtigt, og det anbefales at bruge orbital plade shaker på 300 rpm. - Klart prøverne fra pladen ved at bladre og vaske dem 2 x med 200 µL af vask buffer på RT. energisk fjerne vask buffer fra brøndene efter hver vask ved at bladre, efterfulgt af aflytning, og holde pladen på bænken på RT.
- Tilføje 200 µL af RT antigen-præsenterer buffer til hver brønd og Inkuber i RT i 2 min.
- Svirp ud løsning fra brøndene og vaske wells 3 x med 200 µL af vask buffer på RT.
- Tilsæt 50 µL af frisklavede 1/250 anti-RhoA primære antistof til hver brønd.
- Pladen anbringes på en orbitalryster for 45 min på 300 rpm indstillet til 25 ° C. Svirp ud løsning fra brønden.
- Gentag trinene vask 2 x (trin 2.24).
- Tilsæt 50 µL af frisklavede 1/250 anti-RhoA sekundær antistof til hver brønd.
- Pladen anbringes oven på en orbitalryster for 45 min på 300 rpm indstillet til 25 ° C.
- Forberede HRP påvisning reagens ved at blande lige store mængder reagens A og reagens B.
- Svirp ud løsning fra hver brønd og vaske wells 3 x med 200 µL af vask buffer på RT.
- Tilsæt 50 µL af frisklavede HRP påvisning reagens til hver brønd.
- Læs den selvlysende signal inden for 3-5 min til at opnå den maksimale signal og analysere resultaterne ved hjælp af en passende softwarepakke.
Bemærk: Aflæsninger skal træffes inden for 3-5 min at få den maksimale signal. Køre en "test tallerken" for at bekræfte den ordentlig lysis buffer volumen bliver brugt til cellelysater således at protein koncentrationen er høj nok til at afsløre RhoA GTPase aktivitet. (En test plade er en plade af celler, der bruges til at bestemme, hvis proteinkoncentration falder inden for det acceptable område og også til at afgøre, om mængden af lysisbuffer bliver brugt er passende). Den positive kontrol bør læse 4 til 10 gange højere end de blanke brønde hvis det er i det lineære område. Hvis ikke, derefter justere luminometrisk ved høring af fabrikanten. Indstillingerne for luminometrisk er givet i tabel 3. - Angiv rå data i kolonner, hvor overskrifterne læse prøven, mener, standardafvigelse, rep1, rep2, rep3og rep4, som er at vise antallet flergangsbestemmelser gøres på hver prøve.
- Indtast den formel =average(Xn:Yn) under betyde, hvor X = kolonne-betegnelse for rep1, Y = kolonne-betegnelse for rep4, og n = den række betegnelse for rækken der arbejdes på.
- Under standardafvigelse, indtast formlen = STDAFV (Xn:Yn) hvor X = kolonne-betegnelse for rep1, Y = kolonne-betegnelse for rep4, og n = den række betegnelse for rækken der arbejdes på.
- Indtaste den Repliker data i rep1, rep2, osv.
- Efter indtastning af data, skal du bruge metoden Klik og træk for at vælge Sample, menerog standardafvigelse.
- Vælg derefter funktionen for diagram gør som ligner en firkant med en mini søjlediagram inde i data analyse software.
Bemærk: Dette bringer op diagrammet beslutningsproces hvor det er muligt at design diagrammer baseret på de indtastede data. - Vælg søjlediagram , og for inputværdier, udpege de betyde numre.
Bemærk: Diagram til betyder tallene er først lavet, og derefter kolonnen standardafvigelse for y-aksen fejl barer er udpeget. For at gøre dette, dobbeltklik på grafen barer, Vælg fanen y-aksen fejl , skal du klikke på indstillingen Brugerdefineret og vælge området i regnearket til at angive placeringen af standardafvigelsen data. Forskellen mellem de grupper, der skal sammenlignes kan ses efter oprettelsen af de ønskede diagrammer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Membran fraktionering:
Ultracentrifugering blev brugt til fraktionering af membranen og cytosol komponenter. Som vist i figur 1, supernatanten indeholder det cytosole brøkdel, og pellet membran brøkdel. Overfloden af RhoA i cytosole andmembrane fraktioner fra U251 celler blev undersøgt efter behandlingen med simvastatin ved hjælp af immunoblotting. Renhed og lastning kontrol af membranen og cytosol brøkdel blev bekræftet af pan-Cadherin og GAPDH henholdsvis. Som vist i figur 2, reduceret simvastatin-behandling mængden af membran-bundet RhoA GTPase, mens det øgede sin cytosole indhold. Dette er i overensstemmelse med de kendte virkninger af statiner på omplantning af GTPases baseret på hæmning af RhoA prenylation. Simvastatin hæmmer prenylation af RhoA GTPase, og unprenylated RhoA er derfor ude af stand til at forankre i plasma cellemembraner, hvilket resulterer i sin højere cytosole koncentrationer.
RhoA-GTP bundet:
Vi målte GTP-bundet RhoA protein ved hjælp af en GTPase-forbundet immunosorbent assay og viste at simvastatin betydeligt (P < 0,05) øget GTP-bundet RhoA i U251 celler (figur 3). Derfor, mens simvastatin hæmmede RhoA GTPase protein prenylation (figur 2), det også øget sin GTP lastning i forhold til kontrol celler. Dette peger på det faktum, at prenylation og GTP bindende både spille en rolle i aktivitet og regulering af RhoA GTPase. For yderligere oplysninger om dette fænomen, henvises til den oprindelige publikation ved hjælp af denne protokol8.
Figur 1 : Skematisk oversigt over de cytosole og membran fraktioner efter ultracentrifugering. Pellet indeholder membran brøkdel, og supernatanten cytosole brøken.
Figur 2 : Simvastatin ændrer lokaliseringen af RhoA. U251 celler blev behandlet med simvastatin (10 µM; 12, 24 og 36 h) og overflod af RhoA i membranen og cytosole fraktioner var bestemt af immunoblotting. GAPDH og pan-Cadherin overfloden blev også vurderet til kontrol for lastning i de cytosole og membran fraktioner og bekræfte manglen cytosole forurening i membranen fraktioner. Data er typisk fra tre uafhængige eksperimenter ved hjælp af forskellige primære kulturer. Dette tal er blevet ændret fra Alizadeh et al. 8. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Simvastatin modulerer RhoA GTPase aktivitet. GTPase-forbundet immunosorbent assay blev brugt til at måle GTP-bundet Rho protein i U251 celler. Forskellige forhold blev testet for 36 h, herunder sult og simvastatin (10 µM). Til hvert eksperiment, var et constitutively aktiv RhoA protein findes i kit bruges som positiv kontrol. Resultaterne udtrykkes som den gennemsnit ± SD af to replikater i uafhængige forsøg (* P < 0,001). Dette tal er blevet ændret fra Alizadeh et al. 8.
| Celle kultur fartøj | Areal (cm2) | Lysisbuffer (µl) | |
| Retter | 35 mm | 9 | 100 |
| 60 mm | 21 | 300 | |
| 100 mm | 55 | 700 | |
| 150 mm | 145 | 1500 | |
| Plader | 6-godt | 9.4 / godt | 100 |
| 12-godt | 3.8 / godt | 70 | |
| 24-godt | 1.9 / godt | 40 | |
| Kolber | T-25 | 25 | 250 |
| T-75 | 75 | 1000 | |
| T-150 | 150 | 1500 | |
Tabel 1: Anbefalede mængder af lysisbuffer for U251 celler. Lydstyrken kan justeres til forskellige celletyper.
| Lysis Buffer navn | Lysis Buffer sammensætning | Små G-Protein mål | Noter |
| GL35 | Tris (1 X GL36), MgCl2 (8 X GL36), NaCl (2 X GL36), IGEPAL (1 X GL36), SDS (5 X GL36) | Cdc42 | Identiske komponenter til GL36, sammensætning varierer som følger; |
| GL36 | en navnebeskyttet formulering af Tris pH 7,5, MgCl2, NaCl, IGEPAL og SDS | RalA | Standard buffer, kompatibel med de fleste GTPase-linked immunosorbent assays. |
| GL36 | en navnebeskyttet formulering af Tris pH 7,5, MgCl2, NaCl, IGEPAL og SDS | Rac1 | Standard buffer, kompatibel med de fleste GTPase-linked immunosorbent assays. |
| GL36 | en navnebeskyttet formulering af Tris pH 7,5, MgCl2, NaCl, IGEPAL og SDS | Rac1, 2, 3 | Standard buffer, kompatibel med de fleste GTPase-linked immunosorbent assays. |
| GL36 | en navnebeskyttet formulering af Tris pH 7,5, MgCl2, NaCl, IGEPAL og SDS | RAS | Standard buffer, kompatibel med de fleste GTPase-linked immunosorbent assays. |
| GL36 | en navnebeskyttet formulering af Tris pH 7,5, MgCl2, NaCl, IGEPAL og SDS | RhoA | Standard buffer, kompatibel med de fleste GTPase-linked immunosorbent assays. |
| GL36 | en navnebeskyttet formulering af Tris pH 7,5, MgCl2 | Arf1 | Standard buffer, kompatibel med de fleste GTPase-linked immunosorbent assays. |
Tabel 2: Liste af GTPase-forbundet immunosorbent assay lysis buffere og anbefalede lysis sammensætning for små GTPases.
| Parametre | Noter | ||
| GEVINST | Mulighed for gevinst justerer maskinen følsomhed. De fleste luminometers bruger automatisk kalibrering eller begrænset kalibreringsfunktionen. Brugeren bør læse gevinst på lav, medium og high for at se, om læsningen er inden for det lineære område, som varierer i forskellige instrumenter. | ||
| INTEGRATION TID | Det anbefales at have denne mulighed på sit laveste som de meget høje gange måske læse uden for det lineære område. Dette kræver muligvis unødvendigt arbejde lige ved hjælp af lavere fortynding eller primære og sekundære antistoffer. INTEGRATION tid varierer også i forskellige instrumenter. | ||
| RYSTER | Det anbefales at bruge 5s orbital RYSTER. Det er ikke så kritisk som andre parametre for rigtigheden af analysen. | ||
| TEMPERATUR | Stuetemperatur anbefales | ||
| PLADE TYPE | Bruge ifølge den plade, du bruger. Pladen er normalt 96 brønde, flad og hvid. | ||
| FILTRE | Excitation eller emission filtre er ikke påkrævet for Luminescence. Excitation kan indstilles på alle ønskede værdi og optimale interval for emission er 430-445 nm. Tomt rum af filteret. Hvis dette ikke er en mulighed, | ||
Tabel 3: En detaljeret beskrivelse af indstillinger for luminometrisk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her beskriver vi en nøjagtige metode til at måle små GTPase prenylation og GTP bindende vist som små GTPase subcellulært lokalisering (membran versus cytosol) og Rho GTP lastning. Små GTPases er udtrykt i eukaryote celler og spiller en afgørende rolle i cellulære spredning, motilitet og struktur. Både prenylation og GTP bindende er involveret i reguleringen af GTPase aktivitet; Derfor er assays til at evaluere prenylation og GTP binding af disse proteiner vigtige værktøjer for celle biologer1,8.
Baseret på resultaterne af en nylig undersøgelse, Rho protein GTP indlæsning er celletype specifikke8, og derfor varierer blandt forskellige celletyper. Subcellulært lokalisering og geranylgeranylation (GGT) af Rho proteiner er også de afgørende skridt i reguleringen af deres funktion. Dette er også yderligere reguleret af samspillet mellem effektor proteiner GEF, GAP og GDI til den store GTPases.
Simvastatin er kendt for at øge Rac GTP lastning i THP-1 monocytter, mindske prenylation af Rac i overværelse af amyloid β stimulation og mindske inflammatoriske respons fra disse celler17. Vi ved også, at T-celle funktion påvirkes ikke af Rho GTP lastning, men snarere, GGT Rho bestemmer funktionen18,19. Vi anbefaler derfor, at, for at afsløre Rho GTPase aktivitet, både prenylation og GTP lastning skal samtidig måles i celler.
Bemærk, at opnå høj renhed cytosole og membran fraktioner, er de vigtigste trin i protokollen ultralydbehandling og ultracentrifugering. Til Rho GTP-bindende assay, den mest kritiske trin er snap-frysning cellelysater før sekventiel behandling. Efter disse vigtige skridt vil producere konsekvent og reproducerbare resultater i studiet af GTPases i levende systemer.
Et vigtigt skridt til at undersøge en bestemt intracellulære struktur eller membran protein er adskillelsen af cellulære rum fra hinanden. Fraktionering tager fordel af egenskaberne for hvert cellulære rum, ligesom størrelse og form, overflade massefylde og livlig densitet20. Det er primært baseret på differentierede centrifugering i medier af høj viskositet ved 4 ° C. Metoden membran fraktionering, som blev brugt her er hovedsagelig baseret på størrelsen af hvert rum og gravitationel højhastigheds hvor efter ultracentrifugering, Membranproteiner gå til bunden af røret og de cytosole proteiner forbliver i den supernatanten.
Det er vigtigt at bemærke, at prøver indeholdende højt proteinindhold koncentrationer og, eventuelt, høje niveauer af huller kan potentielt inaktivere mål GTPase. Dette problem kan forekomme, selv i lysisbuffer og kan føre til falsk negative resultater. En af de vigtigste parametre, der bestemmer succes og reproducerbarhed af GTPase aktivitet assay resultater er sundhed og lydhørhed af de celler, der anvendes i forsøg8. Det anbefales kraftigt, at efterforskere identificere optimale/passende vækstbetingelser og fordobling tid for cellerne under undersøgelse for at fastlægge GTPase aktivering/hæmning. Derudover GTPase aktivitet af alle små GTPases er stramt reguleret og er derfor modtagelige for hurtig falder via hydrolyse af GTP-molekyle bundet til enzym via handling af hullerne (under og efter celle lysis procedure ). Denne handling resulterer i hurtige inaktivering af GTPase af interesse. Derfor anbefales det kraftigt at celle lysis udføres hurtigt ved 4 ° C, for at opnå nøjagtige og reproducerbare resultater.
Der er flere faktorer alt efter forsøgsbetingelser, der bestemmer den endelige celle lysate. Første, det samlede beløb af RhoA GTPase i den cellelinie eller specifikke væv: mængden af endogene RhoA GTPase er variabel i forskellige typer af celler og væv; Derfor kan dette resultere i en kraftigere reaktion på en activator eller deactivator. Andet, mængden af aktivering/deaktivering opnåede de eksperimentelle betingelser: det er vigtigt at overveje, at omkring 2-10% af den samlede cellulære små GTPase aktiveres muligvis som svar på en bestemt stimulus8. Mængden af deaktivering også udelukkende afhænger af typen af stimuli og det er variabel i forskellige celler og væv. Derfor, for hver type af små Rho GTPase aktivitet assay, sammensætningen af lysis buffer og cellulære rum er afgørende. Tabel 3 viser den anbefalede sammensætning af lysisbuffer for hver specifik små GTPase protein.
Normaliseret celle lysate proteinkoncentration er et større krav, fordi det giver mulighed for efterforskerne at sammenligne GTPase aktiviteten af forskellige prøver. Derfor, vask celler fra alle prøver i alle betingelser med kolde PBS er obligatorisk at fjerne protein fra vævskultur medier. Det er også vigtigt, at alle reagenser og buffere anvendes ved kolde temperaturer (4 ° C) i alle trin af eksperimentet. Denne kolde temperatur vil minimere hydrolyse af GTPases, herunder Rho GTPase, under forberedelse af prøver. Det er afgørende, at denne behandling af cellelysater er udført hurtigt (i 10-15 min i alt) for at undgå tab af RhoA GTPase aktivitet. Det vigtigste skridt i celle lysate forberedelse er desuden, at snap-freeze delprøver af den lysate i flydende kvælstof til at opretholde den RhoA lille GTPase enzymatisk aktivitet. Dette er især vigtigt, hvis der er forskellige timepoints eller flere prøver i eksperimentet. Efter udarbejdelsen af snap-frosne lysates, kan prøverne opbevares i-80 ° C uden at miste deres Rho GTPase aktivitet.
Den angivne protokol til analyse af membran forankring af RhoA GTPase repræsenterer kun en indirekte værktøj til at måle prenylation af små GTPases og er ikke i stand til direkte at opdage eller kvantificere bindingen af isoprenoid restprodukter til target proteinet. Dette er en af de meget få begrænsninger af denne analyse. Derfor, det giver en vurdering af prenylation af proteiner. Nogle metoder er blevet defineret, er i stand til direkte måling af FT (farnesylation) og/eller GGT farnesyl transferase og/eller geranylgeranyl transferase, henholdsvis, både i kulturperler celler og dyr og menneske-afledte tumorer. Assays brug elektroforese mobilitet Skift, [3H] farnesyl ud og [3H] geranylgeranyl ud og [3H] mevalonic syre mærkning, efterfulgt af immunoprecipitation og SDS-PAGE21.
Vi brugte RhoA GTPase-forbundet immunosorbent assay til at opdage enhver membran forankring og aktivitet af RhoA GTPase. Det består af en Rho-GTP-bindende protein, som er knyttet til wells af en 96-brønd plade. Så, GTP-bundet aktive Rho i celle- eller vævsdel lysates binder til brønde, mens BNP-bundet inaktive Rho er skyllet væk under vask trin. Derefter, den bundne, aktive RhoA i brøndene vil blive opdaget ved hjælp af en RhoA-specifikke antistof og chemiluminescence. Det er muligt at bestemme graden af RhoA aktivering ved at sammenligne aflæsninger fra aktiveret til nonactivated cellelysater. Serum sult (brug af serumfrit medium på kulturperler celler) bruges normalt til at inaktivere RhoA i vævskultur. Det bør også nævnes, at GTPase-forbundet immunosorbent assay række aktivering kræver 10-50 µg protein til påvisning af RhoA GTPase aktivitet.
Det anbefales kraftigt, at ubehandlet prøver har lav basal cellulære niveauer af GTPase aktivitet (kontrol tilstand). Som et eksempel, ordentlig celle sult betingelser kan nedregulere GTPase aktivitet og giver ideelle betingelser for at vise deres aktivering under forsøgsbetingelser. Også, både aktivering og hæmning assays er udført i en tid - og dosis-respons måde at få de bedste GTPase aktivering/hæmning svar. Endnu vigtigere, under cellulære forberedelse, det er meget vigtigt at bruge celler, der ikke er overconfluent (> 70%), for at undgå enhver nonresponsiveness af celler til aktivering/hæmning stimuli.
Luminometers er meget forskellige med hensyn til følsomhed og absolut aflæsninger. Derfor, for at fastslå, at det er i det lineære område, vi foreslår, at kører en GTPase-forbundet immunosorbent assay med en tom og en positiv kontrol. Hvis analysen er ud af den lineære område (den positive kontrol bør være 4 x - 10 x højere end den buffer-kun læsning) eller tom læsning er højere end 9-10 millioner, så det anbefales at bruge yderligere antistof fortyndinger. Vi anbefaler desuden, kalibrere luminometrisk læse inden for det lineære område af analysen før du begynder analysen.
Der er også fordele ved GTPase-forbundet immunosorbent assay, der er værd at nævne. GTPase-forbundet immunosorbent assays forbedre den nuværende eksperimentelle design og aktiverer teknologi til at fremme eksperimenter, der ikke var muligt med gamle pull-downs teknikker22. GTPase-forbundet immunosorbent assays også give opdagelse nøjagtighed og følsomhed, der giver analyser af GTPase aktivitet i præparater tidligere off-grænser for pull-down assays23. Et par af de seneste undersøgelser i forhold GTPase-forbundet immunosorbent aktivering assays med pull-downs og konkluderede, at GTPase-forbundet immunosorbent assay har nogle klare fordele, nemlig som GTPase-forbundet immunosorbent assays er overlegen grund til deres evnen til at bruge små mængder protein22,24, deres større følsomhed24og deres kvantitative målinger23. GTPase-forbundet immunosorbent assay kit er tilgængelig i enten luminometrisk eller kolorimetrisk detektion versioner, hvor luminometrisk assays er mere følsomme. Denne GTPase-forbundet immunosorbent assay er baseret på en temmelig simpel og hurtig protokol, kræver kun små mængder af prøven og udbytter kvantitative og præcise resultater. Derfor kan det være en god idé til at videreudvikle dette assay til påvisning af andre typer af GTPase-baserede proteiner i forskellige cellelinjer og væv kultur celler med en meget højere specificitet og nøjagtighed.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Saeid Ghavami blev støttet af sundhed Science Centre opererer tilskud, CHRIM drift tilskud og forskning Manitoba nye Investigator opererer Grant. Javad Alizadeh blev støttet af forskning Manitoba studentship. Shahla Shojaei blev støttet af en Health Science Foundation opererer grant og den MITACS fremskynde postdoc stipendium. Adel Rezaei Moghadam blev støttet af en NSERC drift tilskud, som blev holdt af Joseph W. Gordon. Amir A. Zeki blev støttet af NIH/NHLBI K08 award (1K08HL114882-01A1). Marek J. Los venligst anerkender støtte fra Rikke yde #2016/21/B/NZ1/02812, støttet af LE STUDIUM Institute for Advanced Studies (region centrum-Val de Loire, Frankrig) gennem sin Smart Loire dalen generelle Program og samfinansieret af Marie Sklodowska-Curie aktioner, yde #665790. Simone da Silva Rosa blev støttet af UMGF studentship.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM high Glucose | VWR (Canada) | VWRL0101-0500 | |
| Fetal Bovine Serum | VWR (Canada) | CA45001-106 | |
| Penicillin/Streptomycin | VWR (Canada) | 97062-806 | |
| EDTA (Ethylenediamine tetraacetic acid) | VWR (Canada) | CA71007-118 | |
| EGTA (Ethylene glycol bis(2-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid) | VWR (Canada) | CAAAJ60767-AE | |
| DTT (DL-Dithiothreitol) | VWR (Canada) | CA97061-340 | |
| Ammonium Persulfate | VWR (Canada) | CABDH9214-500G | |
| Tris-Hydroxymethylaminomethane | VWR (Canada) | CA71009-186 | |
| 30% Acrylamide/Bis Solution | Biorad (Canada) | 1610158 | |
| TEMED | Biorad (Canada) | 1610801 | |
| Protease Inhibitor cocktail | Sigma/Aldrich (Canada) | P8340-5ML | 1:75 dilution |
| Rho-GTPase Antibody Sampler Kit | Cell Signaling (Canada) | 9968 | 1:1000 dilution |
| Pan-Cadherin antibody | Cell Signaling (Canada) | 4068 | 1:1000 dilution |
| GAPDH antibody | Santa Cruz Biotechnology (USA) | sc-69778 | 1:3000 dilution |
| RhoA G-LISA Activation Assay (Luminescence format) | Cytoskeleton Inc. (USA) | BK121 | Cytoskeleton I. G-LISA Activation Assays Technical Guide. 2016. |
| RhoA Antibody | Cell Signaling | 2117 | |
| ECL | Amersham-Pharmacia Biotech | RPN2209 | |
| Anti-Rabbit IgG (whole molecule) Peroxidase antibody | Sigma | A6154-1ML | |
| SpectraMax iD5 Multi-Mode Microplate Reader | Molecular Devices | 1612071A | Spectrophotometer |
| Nonidet P-40 | Sigma | 11332473001 | non-denaturing detergent, octylphenoxypolyethoxyethanol |
| DMSO | Sigma | D8418-50ML | |
| PBS | Sigma | P5493-1L | |
| Phophatase Inhibitor cocktail | Sigma | P5726-5ML | 1:75 Dilution |
References
- Yeganeh, B., et al. Targeting the mevalonate cascade as a new therapeutic approach in heart disease, cancer and pulmonary disease. Pharmacology & Therapeutics. 143 (1), 87-110 (2014).
- Valencia, A., Chardin, P., Wittinghofer, A., Sander, C. The ras protein family: evolutionary tree and role of conserved amino acids. Biochemistry. 30 (19), 4637-4648 (1991).
- Hall, A.
- Rojas, A. M., Fuentes, G., Rausell, A., Valencia, A. The Ras protein superfamily: evolutionary tree and role of conserved amino acids. The Journal of Cell Biology. 196 (2), 189-201 (2012).
- Cherfils, J., Zeghouf, M. Regulation of small GTPases by GEFs, GAPs, and GDIs. Physiological Reviews. 93 (1), 269-309 (2013).
- Shojaei, S., et al. Perillyl Alcohol (Monoterpene Alcohol), Limonene. Enzymes. 36, 7-32 (2014).
- Ghavami, S., et al. Airway mesenchymal cell death by mevalonate cascade inhibition: integration of autophagy, unfolded protein response and apoptosis focusing on Bcl2 family proteins. Biochimica et Biophysica Acta. 1843 (7), 1259-1271 (2014).
- Alizadeh, J., et al. Mevalonate Cascade Inhibition by Simvastatin Induces the Intrinsic Apoptosis Pathway via Depletion of Isoprenoids in Tumor Cells. Scientific Reports. 7, 44841 (2017).
- Ghavami, S., et al. Mevalonate cascade regulation of airway mesenchymal cell autophagy and apoptosis: a dual role for p53. PLoS One. 6 (1), e16523 (2011).
- Tang, Y., Olufemi, L., Wang, M. T., Nie, D. Role of Rho GTPases in breast cancer. Frontiers in Bioscience: A Journal and Virtual Library. 13, 759-776 (2008).
- DerMardirossian, C., Bokoch, G. M. GDIs: central regulatory molecules in Rho GTPase activation. Trends in Cell Biology. 15 (7), 356-363 (2005).
- Garcia-Mata, R., Boulter, E., Burridge, K. The 'invisible hand': regulation of RHO GTPases by RHOGDIs. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12 (8), 493-504 (2011).
- Etienne-Manneville, S., Hall, A.
- Ghavami, S., et al. Geranylgeranyl transferase 1 modulates autophagy and apoptosis in human airway smooth muscle. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 302 (4), L420-L428 (2012).
- Clark, E. A., Golub, T. R., Lander, E. S., Hynes, R. O. Genomic analysis of metastasis reveals an essential role for RhoC. Nature. 406 (6795), 532-535 (2000).
- Ghavami, S., et al. Statin-triggered cell death in primary human lung mesenchymal cells involves p53-PUMA and release of Smac and Omi but not cytochrome c. Biochimica et Biophysica Acta. 1803 (4), 452-467 (2010).
- Cordle, A., Koenigsknecht-Talboo, J., Wilkinson, B., Limpert, A., Landreth, G. Mechanisms of statin-mediated inhibition of small G-protein function. Journal of Biological Chemistry. 280 (40), 34202-34209 (2005).
- Waiczies, S., Bendix, I., Zipp, F. Geranylgeranylation but not GTP-loading of Rho GTPases determines T cell function. Science Signaling. 1 (12), pt3 (2008).
- Waiczies, S., et al. Geranylgeranylation but not GTP loading determines rho migratory function in T cells. Journal of Immunology. 179 (9), 6024-6032 (2007).
- Satori, C. P., Kostal, V., Arriaga, E. A. Review on Recent Advances in the Analysis of Isolated Organelles. Analytica Chimica Acta. 753, 8-18 (2012).
- Berndt, N., Sebti, S. M. Measurement of protein farnesylation and geranylgeranylation in vitro, in cultured cells and in biopsies, and the effects of prenyl transferase inhibitors. Nature Protocols. 6 (11), 1775-1791 (2011).
- Keely, P. J., Conklin, M. W., Gehler, S., Ponik, S. M., Provenzano, P. P. Investigating integrin regulation and signaling events in three-dimensional systems. Methods in Enzymology. 426, 27-45 (2007).
- Oliver, A. W., et al. The HPV16 E6 binding protein Tip-1 interacts with ARHGEF16, which activates Cdc42. British Journal of Cancer. 104 (2), 324-331 (2011).
- Moniz, S., Matos, P., Jordan, P. WNK2 modulates MEK1 activity through the Rho GTPase pathway. Cellular Signalling. 20 (10), 1762-1768 (2008).
