وصف عمليات إصلاح الحمض النووي في فواصل الحمض النووي عابرة وطويلة الأمد مزدوجة-حبلا مجهر الفلورة
Summary
إصلاح فواصل مزدوجة-حبلا الحمض النووي عملية دينامية، تتطلب ليس فقط تشكيل مجمعات إصلاح فواصل، ولكن أيضا على القرار بعد معالجة الآفة. هنا، نستخدم مجهرية الفلورة لفواصل مزدوجة-الذين تقطعت بهم السبل عابرة وطويلة الأمد كأداة لتشريح هذه الآلية صيانة الجينوم.
Abstract
إصلاح فواصل مزدوجة-الذين تقطعت بهم السبل (دسبس) في الحمض النووي عملية درجة عالية من تنسيق، مما يستلزم تشكيل والقرار من مجمعات إصلاح البروتين المتعددة. وينظم هذه العملية عدد ضخم بروتينات التي تروج للرابطة وعدم اقتران من البروتينات لهذه الآفات. ويرجع الفضل في جزء كبير منه إلى القدرة على أداء شاشات الوظيفية من مكتبة واسعة من البروتينات، وهناك تقدير أكبر للجينات اللازمة لتصليح كسر مزدوج-حبلا الحمض النووي. شاشات المانع غالباً الضربة القاضية أو الكيميائية تحديد البروتينات المشاركة في عمليات إصلاح باستخدام زيادة السمية كعلامة لبروتين اللازم لإصلاح جهاز تسوية المنازعات. على الرغم من أن مفيدة لتحديد البروتينات الخلوية رواية المشاركة في الحفاظ على الإخلاص الجينوم، التحليل الوظيفي يتطلب البت في ما إذا كان يعزز البروتين لمصلحة التعريب أو تشكيل أو قرار إصلاح المجمعات.
يمكن اكتشاف تراكم البروتينات إصلاح سهولة كبؤر النووية متميزة مجهر الفلورة. وهكذا، يمكن الوصول الرابطة وعدم اقتران هذه البروتينات في مواقع تلف الحمض النووي عن طريق مراقبة هذه البؤر النووية فترات الممثل بعد إدخال مزدوج-حبلا الحمض النووي فواصل. هذا النهج يمكن أيضا تحديد البروتينات عامل إصلاح سوء المترجمة، إذا كان إصلاح العيوب لا تحدث في وقت واحد مع التأخير غير مكتملة في إصلاح. في هذا السيناريو، فواصل الحمض النووي المزدوج-حبلا طويلة الأمد يمكن أن يكون إجراء هندسة عكسية لها بالإعراب عن اندونوكليسي قطع نادرة (مثلاً، SceI) الخلايا حيث تم إدماج الموقع الاعتراف للانزيم المذكور في الجينوم الخلوي. الآفة الناتجة من الصعب بشكل خاص حل كما سيتم إعادة إصلاح المؤمنين الاعتراف بالموقع الإنزيم، مما دفع جولة أخرى من الانقسام. نتيجة لذلك هي القضاء على الاختلافات في حركية الإصلاح. إذا لم يتم تشكيل مجمعات إصلاح، قد أعاق التعريب. ويصف هذا البروتوكول المنهجية اللازمة للتعرف على التغيرات في حركية الإصلاح، فضلا عن إصلاح البروتين التعريب.
Introduction
كل يوم، هو قصف كل خلية في جسم الإنسان مع ما يقدر 10، 000 الحمض النووي آفات1. هذا التهديد الوجودي يضعنا في خطر للطفرات، أونكوجينيسيس، فضلا عن خلية الموت. حماية الجينوم الإخلاص، تطورت خلايا الثدييات التصدي للضرر الحمض النووي مع سلسلة معقدة من البروتين الجمعيات والتعديلات. يتم تنظيم هذه الاستجابة إلى مسارات متعددة، المعروفة ب2،استجابة (DDR) تلف الحمض النووي3. التسريح وإعادة الإدماج يتألف من تراكم البروتينات إصلاح الحمض النووي في الآفات الحمض النووي، تنسيقها زمنياً ومكانيا على حد سواء. وكثيراً ما يدفع التسريح وإعادة الإدماج دورة الخلية اعتقال تجنبا لنشر أو تكثيف للأضرار التي يمكن أن تحدث أثناء النسخ المتماثل من تلف الحمض النووي2،،من45. وفي المقابل، كما أنها ضرورية لبقاء الخلوية لإيقاف دورة الخلية اعتقال قبل إلغاء اقتران إصلاح المجمعات بعد الانتهاء من إصلاح.
بين أنواع مختلفة من تلف الحمض النووي، هي دسبس ضار آخر. يمكن أن يؤدي الفشل في إصلاح دسبس كروموسوم ترتيبات جديدة أو عمليات الحذف الواسعة النطاق مثل فقدان كروموسوم كامل الأسلحة. إصلاح دسبس ينقسم إلى اثنين مسارات6،،من78. يتطلب جزئ المتجانسة (HR) أخت كروموسوم استخدامه كقالب الحمض النووي وبالتالي تنحصر في أواخر مراحل دورة الخلية9،10S و G2/M. نهاية مثلى عدم الالتحاق بالعمل (نج) ليس لديه هذه القيود، لكن يمكن أن يسبب الحذف الصغيرة عند إصلاح دسبس11،12.
إصلاح جهاز تسوية المنازعات على وجه التحديد، والتسريح وإعادة الإدماج بشكل عام هي المناطق النشطة للتحقيق. وعلى الرغم من يجري تنظيمها في مسارات منفصلة مريح، هناك قدرا كبيرا من التكرار. وفي الواقع، العديد من البروتينات (BRCA1، BRCA2، والجيش الوطني الرواندي المعقدة على سبيل المثال) تشارك في عدة مسارات13،،،من1415،16. إصلاح الآفة بمسار واحد، يمكن أن يؤدي إلى تلف وسيطة التي يجب إصلاحها ب مسار آخر14. متشابكة من هذه المسارات، جنبا إلى جنب مع هذه المهمة المعقدة المتمثلة في تجنيد البروتينات الصحيحة إلى المكان الصحيح لكمية محددة من الوقت اللازم، تتطلب عملية تنظيمية متعددة المستويات.
ويبرز تقرير صدر مؤخرا تعقيدات للتسريح وإعادة الإدماج بإثبات أن إصلاح تشكيل معقدة وحلها والتعريب كل على حدة يمكن البصر17. والهدف العام للبروتوكول التالي تشريح شكل نهائي قدرة الخلايا على إصلاح جهاز تسوية المنازعات. باستخدام مجهر الفلورة، يمكن تصور تراكم البروتينات إصلاح في مواقع الضرر في نقاط الوقت الممثل بعد تنصيب دسبس.
هذا الأسلوب له العديد من المزايا للنهج الشائع استخدامها. وكثيراً ما إصلاح التحقيق في نقاط زمنية واحدة وغير قادرة على تمثيل عملية دينامية للجمعية والانفصال من مجمعات لإصلاح. ويضمن مراعاة النطاق الكامل لإصلاح من التنشيط الأولى إلى الدقة الكاملة أن تأخير في إصلاح ضريبي هو ليس تثبيط كاملة. وعلى العكس، فإنه يؤكد أن استحثاث استجابة إصلاح غير قادر على إلغاء تنشيط استجابة المذكور هو ضريبي لا كالمعتاد أو التنشيط المفرط.
البروتين تأخر تشكيل معقدة وسوء الترجمة لإصلاح البروتينات، ومع ذلك، لا يمكن لا لبس فيه تمييز مع هذا النهج. لتحديد ما إذا البروتينات إصلاح سوء المترجمة مقابل تأخر في تلك الترجمة، يمكن إدخال جهاز تسوية المنازعات “طويل الأمد” من خلال انشقاق الانزيمية من الحمض الخلوي. هو recut الآفة الناتجة عن ذلك في كل مرة يتم إصلاحه، أسفر تركيز إصلاح نووية كبيرة متميزة، وإزالة القيد الزمني من التجنيد. يمكن تحقيق هذا عن طريق تعديل النهج المتبع حاليا باستخدام اندونوكليسي قطع نادرة (مثلاً، SceI) للحث جهاز تسوية المنازعات طويلة الأمد. طول عمر دسبس يمكن تصور البروتينات الإصلاح بعيد المنال مجهر الفلورة. يمكن أيضا تحسين وفرة تعزيز التصور عند الكشف عن يعوقها القيد في نوعية الأجسام المضادة، وميزة التي يمكن أن تكون مفيدة عندما تعتبر البروتينات درس أقل أثرا على إصلاح الحمض النووي.
جدير بالذكر أن نقدم تعليمات صريحة لصورة مجانية تجهيز وتحليل برامج (مثلاً، إيماجيج). يؤدي هذا إلى إزالة عقبة مالية رئيسية في تحليل الصور، فتح استجواب إصلاح أضرار الحمض النووي لجمهور أوسع.
Protocol
Representative Results
Discussion
تحليل الحمض النووي إصلاح الضرر بشكل عام، وإصلاح فواصل الحمض النووي المزدوج-الذين تقطعت بهم السبل على وجه التحديد منطقة نشطة للبحث لأن إثارة تمتد توموريجينيسيس للبيولوجيا الأساسية6،20. هذا نهج الذي يشرح بدقة مساهمة البروتينات RAD51 و γ-H2AX لحل دسبس خلال “الساعة …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن نشكر جويل سانيمان والدكتور فيليني وانجيمان الأساسية مجهرية [كنفوكل]، الممولة من قبل “كانساس الدولة جامعة كلية الطب البيطري”، على دعمهم للجهود الرامية إلى تطوير هذه التقنية. بكباسسي وكان هدية من ماريا Jasin (بلازميد أدجيني # 26477) 30. وكانت الزنزانات الدكتور U2OS-التجارة والنقل هدية نوع من Jasin ماريا18.
Materials
| 12mm Coverslips | VWR | 89015-725 | |
| 16% Paraformaldehyde (PFA) | ThermoFisher Scientific | 28908 | |
| 24-well plate | VWR | 82050-892 | |
| 96-well glass bottom plate | Cellvis | P96-1.5H-N | |
| Anti-H2AX Alexa488 | EMD Millipore | 05-636-AF488 | |
| Anti-Rad51 (D4B10) | Cell Signaling Technology | 8875S | |
| Bio-formats plugin for ImageJ | National Institute of Health (NIH) | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/index.html | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | VWR | 97061-416 | |
| DAPI | ThermoFisher Scientific | D1306 | |
| DMEM, High Glucose | ThermoFisher Scientific | 12100046 | |
| EDTA | Invitrogen | 15576-028 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | VWR | 89510-194 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG Alexa594 | ThermoFisher Scientific | A-11012 | |
| Hydrogen Peroxide | sigma-Aldrich | 216763-100ML | |
| ImageJ Software | National Institute of Health (NIH) | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| I-SceI Expression Vector | Addgene | 26477 | |
| Nail Polish- Insta Dri | Sally and Hansen | Clearly Quick (103) | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Bio Basic | PD8117 | |
| ProLong Gold Antifade Reagent | Life Technologies | P36930 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich | T4049-500ML | |
| TurboFect Transfection Reagent | ThermoFisher Scientific | R0531 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-500 |
References
- Lindahl, T. Instability and decay of the primary structure of DNA. Nature. 362 (6422), 709-715 (1993).
- Branzei, D., Foiani, M. Regulation of DNA repair throughout the cell cycle. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (4), 297-308 (2008).
- Ciccia, A., Elledge, S. J. The DNA damage response: making it safe to play with knives. Mol Cell. 40 (2), 179-204 (2010).
- Auclair, Y., Rouget, R., Drobetsky, E. A. ATR kinase as master regulator of nucleotide excision repair during S phase of the cell cycle. Cell Cycle. 8 (12), 1865-1871 (2009).
- Awasthi, P., Foiani, M., Kumar, A. ATM and ATR signaling at a glance. J Cell Sci. 128 (23), 4255-4262 (2015).
- Ceccaldi, R., Rondinelli, B., D’Andrea, A. D. Repair Pathway Choices and Consequences at the Double-Strand Break. Trends Cell Biol. 26 (1), 52-64 (2016).
- Chapman, J. R., Taylor, M. R. G., Boulton, S. J. Playing the End Game: DNA Double-Strand Break Repair Pathway Choice. Mol Cell. 47 (4), 497-510 (2012).
- Daley, J. M., Sung, P. 53BP1, BRCA1, and the Choice between Recombination and End Joining at DNA Double-Strand Breaks. Mol Cell Biol. 34 (8), 1380-1388 (2014).
- Hartlerode, A., Odate, S., Shim, I., Brown, J., Scully, R. Cell Cycle-Dependent Induction of Homologous Recombination by a Tightly Regulated I-SceI Fusion Protein. PLOS ONE. 6 (3), e16501 (2011).
- Brandsma, I., Gent, D. C. Pathway choice in DNA double strand break repair: observations of a balancing act. Genome Integr. 3, 9 (2012).
- Davis, A. J., Chen, D. J. DNA double strand break repair via non-homologous end-joining. Transl Cancer Res. 2 (3), 130-143 (2013).
- Reid, D. A., et al. Organization and dynamics of the nonhomologous end-joining machinery during DNA double-strand break repair. Proc Natl Acad Sci. 112 (20), E2575-E2584 (2015).
- Chen, J. J., Silver, D., Cantor, S., Livingston, D. M., Scully, R. BRCA1, BRCA2, and Rad51 Operate in a Common DNA Damage Response Pathway. Cancer Res. 59 (7 Supplement), 1752s-1756s (1999).
- D’Andrea, A. D. BRCA1: A Missing Link in the Fanconi Anemia/BRCA Pathway. Cancer Discov. 3 (4), 376-378 (2013).
- Gudmundsdottir, K., Ashworth, A. The roles of BRCA1 and BRCA2 and associated proteins in the maintenance of genomic stability. Oncogene. 25 (43), 5864-5874 (2006).
- Liu, S., et al. Distinct roles for DNA-PK, ATM and ATR in RPA phosphorylation and checkpoint activation in response to replication stress. Nucleic Acids Res. 40 (21), 10780-10794 (2012).
- Wallace, N. A., Khanal, S., Robinson, K. L., Wendel, S. O., Messer, J. J., Galloway, D. A. High Risk Alpha Papillomavirus Oncogenes Impair the Homologous Recombination Pathway. J Virol. , (2017).
- Pierce, A. J., Johnson, R. D., Thompson, L. H., Jasin, M. XRCC3 promotes homology-directed repair of DNA damage in mammalian cells. Genes Dev. 13 (20), 2633-2638 (1999).
- Luzhna, L., Kathiria, P., Kovalchuk, O. Micronuclei in genotoxicity assessment: from genetics to epigenetics and beyond. Front Genet. 4, (2013).
- Jasin, M. Homologous repair of DNA damage and tumorigenesis: the BRCA connection. Oncogene. 21 (58), 8981-8993 (2002).
- Wallace, N. A., Robinson, K., Howie, H. L., Galloway, D. A. β-HPV 5 and 8 E6 Disrupt Homology Dependent Double Strand Break Repair by Attenuating BRCA1 and BRCA2 Expression and Foci Formation. PLOS Pathog. 11 (3), e1004687 (2015).
- Wallace, N. A., Robinson, K., Howie, H. L., Galloway, D. A. HPV 5 and 8 E6 Abrogate ATR Activity Resulting in Increased Persistence of UVB Induced DNA Damage. PLoS Pathog. 8 (7), (2012).
- Mah, L. J., Vasireddy, R. S., Tang, M. M., Georgiadis, G. T., El-Osta, A., Karagiannis, T. C. Quantification of γH2AX Foci in Response to Ionising Radiation. J Vis Exp. (38), e1957 (2010).
- Popp, H. D., Brendel, S., Hofmann, W. K., Fabarius, A. Immunofluorescence Microscopy of γH2AX and 53BP1 for Analyzing the Formation and Repair of DNA Double-strand Breaks. J Vis Exp. (129), e56617 (2017).
- Burma, S., Chen, B. P., Murphy, M., Kurimasa, A., Chen, D. J. ATM Phosphorylates Histone H2AX in Response to DNA Double-strand Breaks. J Biol Chem. 276 (45), 42462-42467 (2001).
- Britton, S., Coates, J., Jackson, S. P. A new method for high-resolution imaging of Ku foci to decipher mechanisms of DNA double-strand break repair. J Cell Biol. 202 (3), 579-595 (2013).
- Landthaler, M., Shen, B. W., Stoddard, B. L., Shub, D. A. I-BasI and I-HmuI: two phage intron-encoded endonucleases with homologous DNA recognition sequences but distinct DNA specificities. J Mol Biol. 358 (4), 1137-1151 (2006).
- Lackner, D. H., et al. A generic strategy for CRISPR-Cas9-mediated gene tagging. Nat Commun. 6, 10237 (2015).
- Chan, S. H., Stoddard, B. L., Xu, S. Y. Natural and engineered nicking endonucleases–from cleavage mechanism to engineering of strand-specificity. Nucleic Acids Res. 39 (1), 1-18 (2011).
