אפיון תהליכי תיקון DNA-ארעי ומעברי DNA ארוך כפול-strand על ידי מיקרוסקופ Immunofluorescence
Summary
תיקון של זוגיות-גדיל DNA מעברי הוא תהליך דינמי, הדורשים לא רק היווצרות תיקון מכלולי השברים, אבל גם הרזולוציה שלהן לאחר הנגע הוא ממוען. כאן, אנו משתמשים מיקרוסקופ immunofluorescence עבור ארעי לטווח ארוך כפול גדילי ומעברי ככלי לנתח מנגנון תחזוקה זה הגנום.
Abstract
התיקון של מעברי גדילי כפול (DSBs) ב- DNA הוא תהליך מאוד מתואמת, המחייב את היווצרות והרזולוציה של מתחמי חלבון רב תיקון. תהליך זה מוסדר על ידי מספר עצום של חלבונים לקדם את העמותה ואת השיוך של חלבונים אלה נגעים. תודה במידה רבה היכולת לבצע מסכי פונקציונלי של ספריה העצום של חלבונים, יש הערכה גדולה יותר של הגנים הדרושים עבור התיקון מעבר DNA כפול-strand. לעיתים קרובות נוקאאוט או כימי המעכב מסכי לזהות חלבונים המעורבים בתהליכים תיקון על-ידי שימוש מוגבר רעילות סמן חלבון הדרוש לתיקון DSB. למרות שימושי עבור מזהים הרומן הסלולר החלבונים המעורבים שמירה על נאמנות הגנום, אנליזה פונקציונלית דורש קביעת אם החלבון עניין מקדמת לוקליזציה, היווצרות או ברזולוציה של מתחמי תיקון.
ההצטברות של חלבונים תיקון ניתן להבחין בקלות באמצעות מיקרוסקופ immunofluorescence כמו foci גרעיני ברורים. לפיכך, השיוך של חלבונים אלה באתרים של נזק לדנ א וארגון ניתן לגשת על ידי התבוננות אלה foci גרעיני במרווחי זמן נציג לאחר אינדוקציה של זוגיות-גדיל DNA מעברי. גישה זו ניתן לזהות חלבונים גורם תיקון בזיהוי שגיאות מקומי, אם תיקון פגמים אינם מתרחשים בו זמנית עם לא שלם עיכובים בתיקון. בתרחיש זה, לטווח ארוך כפול-גדיל DNA מעברי ניתן לתכנן על ידי הבעת של חיתוך נדיר endonuclease (למשל, SceI) בתאים איפה האתר זיהוי האנזים אמר שולב הגנום הסלולר. הנגע וכתוצאה מכך קשה במיוחד לפתור כמו תיקון הנאמן להציג אתר הכרה של האנזים, המבקשת עוד סיבוב של המחשוף. כתוצאה מכך, הבדלים קינטיקה של תיקון נמחקות. אם תיקון מכלולי לא נוצרות, יש כבר המניע לוקליזציה. פרוטוקול זה מתאר את המתודולוגיה נחוץ לזהות שינויים ותיקון קינטיקה, כמו גם תיקון חלבון לוקליזציה.
Introduction
כל יום, כל תא בגוף האדם הוא מופגז עם 10,000 המשוערת DNA נגעים1. האיום הקיומי הזה מעמיד אותנו בסיכון מוטציות, oncogenesis, כמו גם לתא המוות. כדי להגן על נאמנות הגנום, בתרבית של תאים התפתחו להגיב על נזק לדנ א עם סדרה מורכבת של עמותות חלבונים ושינויים. תגובה זו מאורגנת לתוך מספר מסלולים, המכונה באופן קולקטיבי ה-DNA נזק התגובה (DDR)2,3. DDR מורכב ההצטברות של חלבונים תיקון ה-DNA ב DNA נגעים, מתואמים חנותם והן במרחב. DDR גורם לעתים קרובות מחזור התא מעצר כדי למנוע את התפשטות או התעצמות של נזק עלול להתרחש במהלך השכפול של הדנ א פגום2,4,5. בתורו, זה גם הכרחי עבור הכדאיות הסלולר לבטל את מחזור התא מעצר על-ידי ביטול השיוך תיקון מכלולי לאחר תיקון שהושלם.
בין הסוגים השונים של נזק לדנ א, DSBs, המזיקות ביותר. יכול לגרום לכשל כדי לתקן את DSBs rearrangements כרומוזום או מחיקות בקנה מידה גדול כגון האובדן של הזרועות כרומוזום שלם. התיקון של DSBs מחולק לשני מסלולים6,7,8. רקומבינציה הומולוגית (HR) דורש אחות כרומוזום להשתמש כתבנית DNA ולכן הוא מוגבל מאחר G2/מאזו שלבי מחזור התא9,10. Non-הומולוגי סוף מצטרף (NHEJ) אין הגבלות אלה, אך יכול לגרום מחיקות קטן בעת תיקון DSBs11,12.
DSB לתקן באופן ספציפי, DDR באופן כללי הם פעילים תחומי החקירה. למרות להיות מאורגנים בתוך המסלולים מופרדים בנוחות, יש מידה רבה של יתירות. אכן, הרבה חלבונים (BRCA1, BRCA2 ו את RPA מורכבים לדוגמה) מעורבים מספר מסלולים13,14,15,16. התיקון של פגיעה באמצעות שביל אחד, יכול להוביל ביניים נזק זה צריך לתקן על ידי מסלול אחר14. השילוב של מסלולים אלה, בשילוב עם המשימה המורכבת שלהם לגייס את החלבונים הנכון למקום הנכון עבור הסכום המדויק של הזמן הדרוש, דורש תהליך התקינה רב שכבתית.
לאחרונה דווח מדגיש המורכבות של DDR על ידי הפגנת כי היווצרות מורכבות תיקון רזולוציה, לוקליזציה של כל אחד בנפרד ניתן לקוי17. המטרה הכוללת של הפרוטוקול הבא הוא לנתח באופן מוחלט את היכולת של תאי לתקן DSB. באמצעות מיקרוסקופ immunofluorescence, הצטברות של חלבונים תיקון באתרים של נזק, ניתן לאבחן בנקודות זמן נציג בעקבות של אינדוקציה של DSBs.
טכניקה זו היא בעלת מספר יתרונות גישות נפוצות. לעתים קרובות, תיקון הוא ובדוקים בנקודות פעם ולא מסוגל המייצגים את תהליך דינמי של הרכבה דיסוציאציה של מתחמי תיקון. התבוננות בטווח המלא של התיקון של ההפעלה הראשונית לרזולוציה מלאה מבטיחה לא טעינו בזיהוי עיכוב תיקון כמו עיכוב מוחלט. לעומת זאת, היא מבטיחה לא טעינו בזיהוי של אינדוקציה של תגובה לתיקון אין אפשרות להשבית את התגובה אמר הרגיל או הפעלת יתר.
היווצרות מורכבות חלבונים מתעכב, לוקליזציה שגויה של תיקון חלבונים, עם זאת, ייתכן לא חד משמעית להבחין עם גישה זו. כדי לקבוע אם תיקון חלבונים הם בזיהוי שגיאות מקומי לעומת להתעכב על לוקליזציה שלהם, שיוכל DSB “ארוך” דרך המחשוף אנזימטי של DNA. תאית. הנגע וכתוצאה מכך הוא ואז אני יערוך בכל פעם שזה יתוקן, והתוצאה היא מוקד ברורים תיקון גרעיני גדול והסרה ההגבלה הטמפורלי של גיוס. זו יכולה להיות מושגת על ידי שינוי הגישה הקיימת עם השימוש חיתוך נדיר endonuclease (למשל, SceI) כדי לעודד DSB לטווח ארוך. תוחלת החיים של DSBs מאפשר את הפריט החזותי של תיקון חמקמק חלבונים על ידי מיקרוסקופ immunofluorescence. שפע משופרת יכול גם לשפר את הפריט החזותי בעת זיהוי מתעכבת על ידי הגבלה באיכות נוגדן, תכונה אשר יכול להיות שימושי כאשר חלבונים למד פחות מזוהים כבעלי השפעה על תיקון ה-DNA.
ראוי לציין, אנו מספקים הוראות מפורשות על תמונה חופשית עיבוד וניתוח תוכנה (לדוגמה, ImageJ). פעולה זו מסירה את מחסום הפיננסיים העיקריים בניתוח התמונה, פתיחת החקירה של DNA לתקן נזק לקהל רחב יותר.
Protocol
Representative Results
Discussion
הניתוח של ה-DNA נזק תיקון באופן כללי, תיקון כפול גדילי DNA מעברי במיוחד הוא אזור פעיל של מחקר מפני השלכותיה span tumorigenesis ל ביולוגיה בסיסית6,20. זו גישה במדויק מבתר את התרומה של RAD51 וγ-H2AX חלבונים עד הרזולוציה של DSBs באמצעות מר להסתכל קדימה, שיטה זו יכול לשמש כדי להבהיר ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים ג’ואל Sanneman, ד ר Philine Wangemann של גרעין מיקרוסקופ קונפוקלי, הממומן על ידי קנזס סטייט אוניברסיטת במכללה לרפואה וטרינרית, על תמיכתם של המאמצים לפתח טכניקה זו. pCBASceI הייתה מתנת Jasin מריה (Addgene פלסמיד # 26477) 30. תאים U2OS ד ר-GFP היו מתנה די מריה Jasin18.
Materials
| 12mm Coverslips | VWR | 89015-725 | |
| 16% Paraformaldehyde (PFA) | ThermoFisher Scientific | 28908 | |
| 24-well plate | VWR | 82050-892 | |
| 96-well glass bottom plate | Cellvis | P96-1.5H-N | |
| Anti-H2AX Alexa488 | EMD Millipore | 05-636-AF488 | |
| Anti-Rad51 (D4B10) | Cell Signaling Technology | 8875S | |
| Bio-formats plugin for ImageJ | National Institute of Health (NIH) | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/index.html | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | VWR | 97061-416 | |
| DAPI | ThermoFisher Scientific | D1306 | |
| DMEM, High Glucose | ThermoFisher Scientific | 12100046 | |
| EDTA | Invitrogen | 15576-028 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | VWR | 89510-194 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG Alexa594 | ThermoFisher Scientific | A-11012 | |
| Hydrogen Peroxide | sigma-Aldrich | 216763-100ML | |
| ImageJ Software | National Institute of Health (NIH) | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| I-SceI Expression Vector | Addgene | 26477 | |
| Nail Polish- Insta Dri | Sally and Hansen | Clearly Quick (103) | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Bio Basic | PD8117 | |
| ProLong Gold Antifade Reagent | Life Technologies | P36930 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich | T4049-500ML | |
| TurboFect Transfection Reagent | ThermoFisher Scientific | R0531 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-500 |
References
- Lindahl, T. Instability and decay of the primary structure of DNA. Nature. 362 (6422), 709-715 (1993).
- Branzei, D., Foiani, M. Regulation of DNA repair throughout the cell cycle. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (4), 297-308 (2008).
- Ciccia, A., Elledge, S. J. The DNA damage response: making it safe to play with knives. Mol Cell. 40 (2), 179-204 (2010).
- Auclair, Y., Rouget, R., Drobetsky, E. A. ATR kinase as master regulator of nucleotide excision repair during S phase of the cell cycle. Cell Cycle. 8 (12), 1865-1871 (2009).
- Awasthi, P., Foiani, M., Kumar, A. ATM and ATR signaling at a glance. J Cell Sci. 128 (23), 4255-4262 (2015).
- Ceccaldi, R., Rondinelli, B., D’Andrea, A. D. Repair Pathway Choices and Consequences at the Double-Strand Break. Trends Cell Biol. 26 (1), 52-64 (2016).
- Chapman, J. R., Taylor, M. R. G., Boulton, S. J. Playing the End Game: DNA Double-Strand Break Repair Pathway Choice. Mol Cell. 47 (4), 497-510 (2012).
- Daley, J. M., Sung, P. 53BP1, BRCA1, and the Choice between Recombination and End Joining at DNA Double-Strand Breaks. Mol Cell Biol. 34 (8), 1380-1388 (2014).
- Hartlerode, A., Odate, S., Shim, I., Brown, J., Scully, R. Cell Cycle-Dependent Induction of Homologous Recombination by a Tightly Regulated I-SceI Fusion Protein. PLOS ONE. 6 (3), e16501 (2011).
- Brandsma, I., Gent, D. C. Pathway choice in DNA double strand break repair: observations of a balancing act. Genome Integr. 3, 9 (2012).
- Davis, A. J., Chen, D. J. DNA double strand break repair via non-homologous end-joining. Transl Cancer Res. 2 (3), 130-143 (2013).
- Reid, D. A., et al. Organization and dynamics of the nonhomologous end-joining machinery during DNA double-strand break repair. Proc Natl Acad Sci. 112 (20), E2575-E2584 (2015).
- Chen, J. J., Silver, D., Cantor, S., Livingston, D. M., Scully, R. BRCA1, BRCA2, and Rad51 Operate in a Common DNA Damage Response Pathway. Cancer Res. 59 (7 Supplement), 1752s-1756s (1999).
- D’Andrea, A. D. BRCA1: A Missing Link in the Fanconi Anemia/BRCA Pathway. Cancer Discov. 3 (4), 376-378 (2013).
- Gudmundsdottir, K., Ashworth, A. The roles of BRCA1 and BRCA2 and associated proteins in the maintenance of genomic stability. Oncogene. 25 (43), 5864-5874 (2006).
- Liu, S., et al. Distinct roles for DNA-PK, ATM and ATR in RPA phosphorylation and checkpoint activation in response to replication stress. Nucleic Acids Res. 40 (21), 10780-10794 (2012).
- Wallace, N. A., Khanal, S., Robinson, K. L., Wendel, S. O., Messer, J. J., Galloway, D. A. High Risk Alpha Papillomavirus Oncogenes Impair the Homologous Recombination Pathway. J Virol. , (2017).
- Pierce, A. J., Johnson, R. D., Thompson, L. H., Jasin, M. XRCC3 promotes homology-directed repair of DNA damage in mammalian cells. Genes Dev. 13 (20), 2633-2638 (1999).
- Luzhna, L., Kathiria, P., Kovalchuk, O. Micronuclei in genotoxicity assessment: from genetics to epigenetics and beyond. Front Genet. 4, (2013).
- Jasin, M. Homologous repair of DNA damage and tumorigenesis: the BRCA connection. Oncogene. 21 (58), 8981-8993 (2002).
- Wallace, N. A., Robinson, K., Howie, H. L., Galloway, D. A. β-HPV 5 and 8 E6 Disrupt Homology Dependent Double Strand Break Repair by Attenuating BRCA1 and BRCA2 Expression and Foci Formation. PLOS Pathog. 11 (3), e1004687 (2015).
- Wallace, N. A., Robinson, K., Howie, H. L., Galloway, D. A. HPV 5 and 8 E6 Abrogate ATR Activity Resulting in Increased Persistence of UVB Induced DNA Damage. PLoS Pathog. 8 (7), (2012).
- Mah, L. J., Vasireddy, R. S., Tang, M. M., Georgiadis, G. T., El-Osta, A., Karagiannis, T. C. Quantification of γH2AX Foci in Response to Ionising Radiation. J Vis Exp. (38), e1957 (2010).
- Popp, H. D., Brendel, S., Hofmann, W. K., Fabarius, A. Immunofluorescence Microscopy of γH2AX and 53BP1 for Analyzing the Formation and Repair of DNA Double-strand Breaks. J Vis Exp. (129), e56617 (2017).
- Burma, S., Chen, B. P., Murphy, M., Kurimasa, A., Chen, D. J. ATM Phosphorylates Histone H2AX in Response to DNA Double-strand Breaks. J Biol Chem. 276 (45), 42462-42467 (2001).
- Britton, S., Coates, J., Jackson, S. P. A new method for high-resolution imaging of Ku foci to decipher mechanisms of DNA double-strand break repair. J Cell Biol. 202 (3), 579-595 (2013).
- Landthaler, M., Shen, B. W., Stoddard, B. L., Shub, D. A. I-BasI and I-HmuI: two phage intron-encoded endonucleases with homologous DNA recognition sequences but distinct DNA specificities. J Mol Biol. 358 (4), 1137-1151 (2006).
- Lackner, D. H., et al. A generic strategy for CRISPR-Cas9-mediated gene tagging. Nat Commun. 6, 10237 (2015).
- Chan, S. H., Stoddard, B. L., Xu, S. Y. Natural and engineered nicking endonucleases–from cleavage mechanism to engineering of strand-specificity. Nucleic Acids Res. 39 (1), 1-18 (2011).
