Caracterización de procesos de reparación del ADN en transitoria y duradera doble cadena DNA roturas por microscopia de la inmunofluorescencia
Summary
Reparación de roturas del DNA de doble cadena es un proceso dinámico, que requiere no sólo la formación de complejos de reparación en los descansos, pero también su resolución después de la lesión se trata. Aquí, utilizamos microscopia de la inmunofluorescencia para roturas de doble hebra transitorias y duradera como una herramienta para diseccionar este mecanismo de mantenimiento del genoma.
Abstract
La reparación de roturas de doble hebra (distritales) en el ADN es un proceso altamente coordinado, que requiere la formación y resolución de los complejos de multi-proteínas reparación. Este proceso está regulado por una gran variedad de proteínas que promueven la asociación y disociación de las proteínas a estas lesiones. Gracias en gran parte a la capacidad para realizar pantallas funcionales de una vasta biblioteca de proteínas, hay una mayor apreciación de los genes necesarios para la reparación de rotura de ADN de doble cadena. Pantallas a menudo geneticamente o químico inhibidor identifican las proteínas implicadas en procesos de reparación mediante aumento de la toxicidad como un marcador para una proteína que se requiere para la reparación DSB. Aunque útil para identificables nuevas proteínas celulares involucradas en mantener la fidelidad del genoma, análisis funcional requiere la determinación de si la proteína de interés promueve la localización, formación o resolución de los complejos de reparación.
La acumulación de proteínas de reparación puede ser fácilmente detectada como distintos focos nucleares por microscopia de la inmunofluorescencia. Por lo tanto, asociación y disociación de estas proteínas en los sitios de daño del ADN pueden accederse mediante la observación de estos focos nucleares representante a intervalos después de la inducción de roturas del DNA de doble cadena. Este enfoque también puede identificar proteínas de factor de reparación mal localizada, si reparar los defectos no ocurren simultáneamente con incompletos retrasos en la reparación. En este escenario, roturas de DNA de doble cadena larga duración pueden diseñarse expresando una endonucleasa de corte raro (p. ej., SceI) en las células donde el sitio de reconocimiento para la enzima dijo se ha integrado en el genoma celular. La lesión resultante es particularmente difícil de resolver como reparación fiel será reintroducir sitio de reconocimiento de la enzima, lo que provocó otra ronda de escote. Como resultado, se eliminan las diferencias en la cinética de reparación. Si no se forman complejos de reparación, localización ha sido impedida. Este protocolo describe la metodología necesaria para identificar cambios en la cinética de reparación así como localización de la proteína de reparación.
Introduction
Cada día, cada célula en el cuerpo humano es bombardeado con un estimado 10.000 lesiones de ADN1. Esta amenaza existencial nos pone en riesgo de mutaciones, oncogénesis, así como la célula muerte. Para proteger la fidelidad de genoma, células de mamíferos han evolucionado para responder a daños en el ADN con una compleja serie de asociaciones de proteínas y modificaciones. Esta respuesta está organizada en múltiples vías, conocidas colectivamente como la DNA daños respuesta (DDR)2,3. El DDR consiste en la acumulación de proteínas de reparación del ADN en las lesiones del ADN, coordinadas tanto temporal como espacialmente. DDR con frecuencia induce arresto del ciclo celular para evitar la propagación o la intensificación de los daños que pueden ocurrir durante la replicación del ADN dañado2,de4,5. A su vez, también es necesario para la viabilidad celular desactivar la detención del ciclo celular por desvincularlo complejos de reparación después de concluida la reparación.
Entre los distintos tipos de daños en el ADN, distritales son los más perjudiciales. Distritales de reparación, pueden fallar los cambios del cromosoma o eliminaciones a gran escala tales como la pérdida de los brazos del cromosoma entero. La reparación de los distritales se divide en dos vías6,7,8. Recombinación homóloga (HR) requiere una hermana cromosoma para utilizar como una plantilla de ADN y por lo tanto se limita a últimas fases S y G2/M del ciclo celular9,10. No homólogos se terminan uniendo (NHEJ) no tiene estas restricciones, pero puede causar pequeñas canceladuras al reparar distritales11,12.
Reparación de DSB específicamente y el DDR en general son áreas activas de investigación. A pesar de ser organizados en vías convenientemente separadas, hay una gran cantidad de redundancia. De hecho, muchas proteínas (BRCA1, BRCA2 y el EPR complejo por ejemplo) están implicadas en múltiples vías13,14,15,16. La reparación de una lesión por una vía, puede llevar a un daño intermedio que debe ser reparado por otro camino14. El entrelazamiento de estas vías, combinadas con su compleja tarea de reclutar las proteínas adecuadas para el lugar correcto para la cantidad exacta de tiempo necesario, requiere de un proceso regulador multi-con gradas.
Un informe reciente destaca las complejidades de DDR demostrando la formación de complejos de reparación, la resolución y localización de cada uno por separado que pueden deteriorada17. El objetivo general del siguiente protocolo es diseccionar definitivamente la capacidad de las células para reparación de DSB. Usando microscopia de la inmunofluorescencia, acumulación de proteínas de reparación en los sitios de daño puede ser visualizada en los puntos de tiempo representativo después de la inducción de los consejos escolares distritales.
Esta técnica tiene varias ventajas a los enfoques utilizados. Con frecuencia, es investigado en momentos solo e incapaz de representar el proceso dinámico de ensamblaje y disociación de complejos de reparación. Observar la gama completa de la reparación de la activación inicial de la resolución asegura que un retraso en la reparación no es identificado erróneamente como inhibición completa. Por el contrario, asegura que la inducción de una respuesta de reparación que no es capaz de inactivar dicha respuesta no identificado erróneamente como la normal o la activación excesiva.
Formación de complejos proteína retrasada y la localización errónea de proteínas de reparación, sin embargo, no se puedan claramente distinguir con este enfoque. Para determinar si las proteínas de reparación mal localizadas versus demora en su localización, se puede introducir un OSD de “larga duración” a través de la hendidura enzimática del ADN celular. La lesión resultante se corte de nuevo cada vez que se repara, resultando en un enfoque distinto reparación nuclear grande y eliminar la restricción temporal de contratación. Esto puede lograrse mediante la modificación de lo existente con el uso de una endonucleasa de corte raro (p. ej., SceI) para inducir un DSB de larga duración. La longevidad de los consejos escolares distritales permite la visualización de las proteínas de difícil reparación por microscopia de la inmunofluorescencia. La mayor abundancia también podría mejorar la visualización cuando la detección se ve obstaculizada por la limitación en la calidad de anticuerpos, una característica que puede ser útil cuando menos proteínas estudiadas se identifican como teniendo un impacto en la reparación del ADN.
En particular, ofrecemos instrucciones explícitas de una imagen libre procesamiento y análisis de software (por ejemplo, ImageJ). Esto elimina una barrera financiera importante en análisis de imagen, apertura de la interrogación de la reparación del daño de ADN a un público más amplio.
Protocol
Representative Results
Discussion
El análisis de ADN reparación de daños en general y la reparación de roturas del DNA de doble hebra es específicamente un área activa de investigación porque sus consecuencias abarcan tumorigenesis biología básica6,20. Datos de este manuscrito un enfoque que disecciona con precisión la contribución de proteínas RAD51 y H2AX γ a la resolución de los consejos escolares distritales a través de horas esperando, este método puede utilizarse para aclara…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Joel Sanneman y Dr. Philine Wangemann de la base de la microscopia Confocal, financiado por el Kansas estado Universidad Universidad de medicina veterinaria, por su apoyo de los esfuerzos para desarrollar esta técnica. pCBASceI fue un regalo de Maria Jasin (plásmido Addgene # 26477) 30. Las células U2OS DR-GFP eran un regalo bueno Maria Jasin18.
Materials
| 12mm Coverslips | VWR | 89015-725 | |
| 16% Paraformaldehyde (PFA) | ThermoFisher Scientific | 28908 | |
| 24-well plate | VWR | 82050-892 | |
| 96-well glass bottom plate | Cellvis | P96-1.5H-N | |
| Anti-H2AX Alexa488 | EMD Millipore | 05-636-AF488 | |
| Anti-Rad51 (D4B10) | Cell Signaling Technology | 8875S | |
| Bio-formats plugin for ImageJ | National Institute of Health (NIH) | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/index.html | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | VWR | 97061-416 | |
| DAPI | ThermoFisher Scientific | D1306 | |
| DMEM, High Glucose | ThermoFisher Scientific | 12100046 | |
| EDTA | Invitrogen | 15576-028 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | VWR | 89510-194 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG Alexa594 | ThermoFisher Scientific | A-11012 | |
| Hydrogen Peroxide | sigma-Aldrich | 216763-100ML | |
| ImageJ Software | National Institute of Health (NIH) | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| I-SceI Expression Vector | Addgene | 26477 | |
| Nail Polish- Insta Dri | Sally and Hansen | Clearly Quick (103) | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Bio Basic | PD8117 | |
| ProLong Gold Antifade Reagent | Life Technologies | P36930 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich | T4049-500ML | |
| TurboFect Transfection Reagent | ThermoFisher Scientific | R0531 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-500 |
References
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