Caracterizando os processos de reparação do DNA no transitório e duradouro dobro-Costa quebras de DNA pela microscopia de imunofluorescência
Summary
Reparação de quebras de DNA dobro-costa é um processo dinâmico, que exige não só a formação de complexos de reparação em intervalos, mas também sua resolução após a lesão é dirigida. Aqui, usamos microscopia de imunofluorescência para quebras de dupla-hélice transitórias e duradouro como uma ferramenta para dissecar esse mecanismo de manutenção do genoma.
Abstract
O reparo de quebras de dupla-hélice (DSBs) no DNA é um processo altamente coordenado, exigindo a formação e a resolução de complexos de proteína multi reparo. Este processo é regulado por uma miríade de proteínas que promovem a associação e dissociação de proteínas para essas lesões. Graças, em grande parte para a capacidade de executar telas funcionais de uma vasta biblioteca de proteínas, há uma maior valorização dos genes necessários para a reparação de ruptura do DNA dobro-costa. Telas de inibidor frequentemente nocaute ou química identificam proteínas envolvidas em processos de reparação usando toxicidade aumentada como um marcador para uma proteína que é necessária para o reparo de ORL. Embora úteis para identificar novas proteínas celulares envolvidas na manutenção da fidelidade do genoma, análise funcional exige a determinação de se a proteína de interesse promove a resolução de complexos de reparação, formação ou localização.
O acúmulo de proteínas de reparo pode ser prontamente detectado como distintos focos nucleares pela microscopia de imunofluorescência. Assim, a associação e dissociação destas proteínas nos locais de dano do ADN podem ser acessados por observando estes focos nucleares em intervalos representativos após a indução de quebras de DNA dobro-costa. Esta abordagem também pode identificar proteínas fator de reparação mal localizadas, se a reparação de defeitos não ocorrer simultaneamente com incompletos atrasos na reparação. Neste cenário, quebras de DNA dobro-Costa duradouro podem ser projetadas por expressando uma endonuclease corte raros (por exemplo, eu-SceI) nas células onde o site de reconhecimento para a referida enzima foi integrado no genoma celular. A lesão resultante é particularmente difícil de resolver como fiel reparação irá reintroduzir o sítio de reconhecimento da enzima, solicitando mais uma rodada de clivagem. Como resultado, as diferenças na cinética de reparação são eliminadas. Se não são formados complexos de reparação, localização tem sido impedida. Este protocolo descreve a metodologia necessária para identificar alterações na cinética de reparação, bem como a localização da proteína de reparo.
Introduction
Cada dia, cada célula no corpo humano é bombardeada com um número estimado de 10.000 DNA lesões1. Esta ameaça existencial coloca-nos em risco de mutações, mixomas, bem como a célula morte. Para proteger a fidelidade do genoma, células de mamíferos evoluíram para responder ao dano do ADN com uma complexa série de associações de proteína e modificações. Esta resposta é organizada em várias vias, conhecidas coletivamente como o DNA danos resposta (DDR)2,3. A DDR consiste em acúmulo de proteínas de reparo do DNA em lesões do ADN, coordenadas tanto temporal e espacialmente. DDR frequentemente induz a detenção do ciclo celular para evitar a propagação ou a intensificação de danos que podem ocorrer durante a replicação do DNA danificado2,4,5. Por sua vez, também é necessário para a viabilidade celular desligar a detenção do ciclo celular desassociando complexos de reparação após o reparo foi concluído.
Entre os vários tipos de dano do ADN, DSBs são os mais deletérios. Reparar DSBs pode resultar em rearranjos cromossômicos ou exclusões em grande escala, como a perda dos braços do cromossoma inteiro. A reparação de DSBs é dividida em duas vias6,7,8. Recombinação homóloga (HR) requer uma irmã cromossomo para usar como um modelo de DNA e, portanto, é limitado a fases tardias, S e G2/M do ciclo celular9,10. Non-homologous final juntando (NHEJ) não tem essas restrições, mas pode causar pequenas exclusões ao reparar DSBs11,12.
DSB reparar especificamente e o DDR em geral são ativas áreas de investigação. Apesar de ser organizados em percursos convenientemente separados, há uma grande quantidade de redundância. Com efeito, muitas proteínas (BRCA1, BRCA2 e o RPA complexo por exemplo) estão envolvidas em vários caminhos13,14,15,16. O reparo de uma lesão por uma via, pode levar a um dano intermediário que deve ser reparado por um outro caminho14. O entrelaçamento destas vias, combinadas com sua complexa tarefa de recrutar as proteínas certa para o local correto para a quantidade exacta de tempo necessário, requer um processo de regulamentação de várias camadas.
Um recente relatório destaca os meandros das DDR demonstrando que reparação complexante, resolução e localização podem cada um separadamente ser prejudicada17. O objectivo geral do seguinte protocolo é definitivamente dissecar a capacidade das células para reparar o ORL. Usando microscopia de imunofluorescência, acúmulo de proteínas de reparo aos sítios de dano pode ser visualizado nos pontos de tempo representativo após a indução de DSBs.
Esta técnica tem várias vantagens para abordagens comumente usadas. Frequentemente, reparação é investigado em pontos de tempo único e incapaz de representar o dinâmico processo de montagem e dissociação dos complexos de reparação. Observando a gama completa de reparação de ativação inicial para a completa resolução garante que um atraso na reparação não é incorrectamente identificado como inibição completa. Por outro lado, assegura que a indução de uma resposta de reparação que é incapaz de inativar resposta disse não é incorrectamente identificada como o normal ou a ativação excessiva.
Formação do complexo proteína retardada e a mis localização das proteínas de reparo, no entanto, podem não ser inequivocamente distinguidos com esta abordagem. Para determinar se as proteínas de reparo são mis localizadas contra um atraso em sua localização, um “long-lasting” ORL pode ser introduzido através de clivagem enzimática do DNA celular. A lesão resultante é recut cada vez que está consertado, resultando em um foco distinto grande reparação nuclear e removendo a restrição temporal do recrutamento. Isto pode ser conseguido modificando a abordagem existente com o uso de uma endonuclease de corte raro (por exemplo, eu-SceI) para induzir um ORL de longa duração. A longevidade de DSBs permite a visualização de proteínas de reparo indescritível pela microscopia de imunofluorescência. A maior abundância também poderia melhorar a visualização quando deteção é prejudicada pela limitação da qualidade do anticorpo, um recurso que pode ser útil quando menor proteínas estudadas são identificadas como tendo um impacto na reparação do DNA.
Notavelmente, nós fornecemos instruções explícitas para um software livre imagem processamento e análise (por exemplo, ImageJ). Isso remove a maior barreira financeira na análise de imagem, abrindo o interrogatório de reparação de danos de DNA para um público mais vasto.
Protocol
Representative Results
Discussion
A análise do DNA reparação de danos em geral e o reparo de quebras de DNA dupla-hélice especificamente é uma área ativa de pesquisa porque suas consequências abrangem tumorigênese de biologia básica6,20. Este detalhes de manuscrito, uma abordagem que disseca com precisão a contribuição das proteínas RAD51 e γ-H2AX para a resolução de DSBs através de HR olhando para a frente, esse método pode ser usada para elucidar as funções adicionais de pro…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos Joel Sanneman e Dr. Philine Wangemann do núcleo microscopia Confocal, financiado pelo Kansas estado Universidade faculdade de medicina veterinária, pelo apoio dos esforços para desenvolver esta técnica. pCBASceI foi um presente de Maria Jasin (plasmídeo Addgene # 26477) 30. U2OS DR-GFP células foram um presente tipo de Maria Jasin18.
Materials
| 12mm Coverslips | VWR | 89015-725 | |
| 16% Paraformaldehyde (PFA) | ThermoFisher Scientific | 28908 | |
| 24-well plate | VWR | 82050-892 | |
| 96-well glass bottom plate | Cellvis | P96-1.5H-N | |
| Anti-H2AX Alexa488 | EMD Millipore | 05-636-AF488 | |
| Anti-Rad51 (D4B10) | Cell Signaling Technology | 8875S | |
| Bio-formats plugin for ImageJ | National Institute of Health (NIH) | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/index.html | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | VWR | 97061-416 | |
| DAPI | ThermoFisher Scientific | D1306 | |
| DMEM, High Glucose | ThermoFisher Scientific | 12100046 | |
| EDTA | Invitrogen | 15576-028 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | VWR | 89510-194 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG Alexa594 | ThermoFisher Scientific | A-11012 | |
| Hydrogen Peroxide | sigma-Aldrich | 216763-100ML | |
| ImageJ Software | National Institute of Health (NIH) | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| I-SceI Expression Vector | Addgene | 26477 | |
| Nail Polish- Insta Dri | Sally and Hansen | Clearly Quick (103) | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Bio Basic | PD8117 | |
| ProLong Gold Antifade Reagent | Life Technologies | P36930 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich | T4049-500ML | |
| TurboFect Transfection Reagent | ThermoFisher Scientific | R0531 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-500 |
References
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