Reparation af dobbelt-strenget DNA pauser er en dynamisk proces, der kræver ikke kun dannelsen af reparation komplekser på pauserne, men også deres beslutning efter læsionen er behandlet. Her bruger vi immunofluorescens mikroskopi for forbigående og langvarig dobbelt-strenget pauser som et redskab til at dissekere denne genom vedligeholdelse mekanisme.
Reparation af dobbelt-strenget pauser (DSBs) i DNA er en meget koordineret proces, nødvendiggør dannelse og opløsning af multi protein reparation komplekser. Denne proces er reguleret af et utal af proteiner, der fremmer foreningen og afstandtagen af proteiner til disse læsioner. Tak for en stor del at evnen til at udføre funktionelle skærme af et stort bibliotek af proteiner, der er en større forståelse af generne, der nødvendige for dobbelt-strenget DNA pause reparation. Ofte knockout eller kemiske hæmmer skærme identificere proteiner involveret i reparationsprocesser ved hjælp af øget toksicitet som markør for et protein, der er nødvendige for DSB reparation. Selv om nyttige til at identificere roman cellulære proteiner involveret i at opretholde genom troskab, kræver funktionel analyse bestemmelse af om protein af interesse fremmer lokalisering, stiftelse eller opløsning af reparation komplekser.
Ophobning af reparation proteiner kan opdages let som særskilte nukleare foci af immunofluorescens mikroskopi. Således kan foreningen og afstandtagen af disse proteiner på lokaliteter af DNA-skader tilgås ved at observere disse nukleare foci repræsentative mellemrum efter induktion af dobbelt-strenget DNA pauser. Denne tilgang kan også identificere mis lokaliserede reparation faktor proteiner, hvis reparation fejl ikke forekommer samtidig med ufuldstændige forsinkelser i reparation. I dette scenario, kan langvarig dobbelt-strenget DNA pauser være manipuleret ved at udtrykke en sjælden skæring liv1975 (fx, SceI) i celler hvor webstedet anerkendelse for det pågældende enzym har været integreret i det cellulære genom. Den resulterende læsion er særligt svært at løse som trofaste reparation vil genindføre enzymets genkendelsessekvens, at spørge en anden runde af kavalergang. Som et resultat, er forskelle i kinetik af reparation elimineret. Hvis reparation komplekser ikke er dannet, har lokalisering været hæmmet. Denne protokol beskriver den metode, der er nødvendige for at identificere ændringer i reparation kinetik samt reparation protein lokalisering.
Hver dag, hver celle i den menneskelige krop er bombarderet med en anslået 10,000 DNA læsioner1. Denne eksistentielle trussel sætter os på risikoen for mutationer, oncogenesis samt celle død. For at beskytte genom troskab, pattedyrceller har udviklet sig til at reagere på DNA skader med en kompleks række protein foreninger og ændringer. Dette svar er organiseret i flere veje, kollektivt kendt som DNA skader svar (DDR)2,3. DDR består af ophobning af DNA reparation proteiner på DNA læsioner, koordineret både tidsmæssigt og rumligt. DDR inducerer ofte celle cyklus anholdelse til undgå spredning eller intensivering af skader, der kan opstå under replikering af beskadigede DNA2,4,5. Til gengæld er det også nødvendigt for cellulære levedygtighed at slukke celle cyklus anholdelse af adskille reparation komplekser efter reparation er afsluttet.
Blandt de forskellige typer af DNA-skader er DSBs de mest skadelige. Manglende evne til at reparere DSBs kan resultere i kromosom rearrangementer eller store sletninger som tabet af hele kromosom våben. Reparation af DSBs er opdelt i to veje6,7,8. Homologe rekombination (HR) kræver en søster kromosom til brug som en DNA-skabelon og er således begrænset til sene S og G2/M faser i cellecyklus9,10. Ikke-homologe ende sammenføjning (NHEJ) har ikke disse restriktioner, men kan forårsage små sletninger, når reparation af DSBs11,12.
DSB reparere specifikt og DDR er generelt aktive områder af undersøgelsen. På trods af at være organiseret i bekvemt adskilt stier, er der en stor del af redundans. Faktisk, mange proteiner (BRCA1, BRCA2, og den komplekse for eksempel RPA) er involveret i flere veje13,14,15,16. Reparation af en læsion af en vej, kan føre til en mellemliggende skader, der skal repareres af en anden vej14. Sammenblanding af disse veje, kombineret med deres komplekse opgave at rekruttere de rigtige proteiner til det rette sted for det nøjagtige beløb af tid, kræver en multi-differentieret reguleringsproces.
En nylig rapport fremhæver snørklede af DDR ved at demonstrere at reparation kompleks dannelse, opløsning og lokalisering kan hver separat være nedsat17. Det overordnede mål med følgende protokol er at endeligt dissekere celler evne til at reparere DSB. Bruger immunofluorescens mikroskopi, kan ophobning af reparation proteiner på steder, hvor skaden visualiseres på repræsentative tid points efter induktion af DSBs.
Denne teknik har flere fordele til almindeligt anvendte metoder. Ofte, er reparation undersøgt på enkelt tidspunkter og ikke i stand til at repræsentere den dynamiske proces forsamlingsfrihed og dissociation af reparation komplekser. Observere hele spektret af reparation fra den første aktivering af den fulde opløsning sikrer, at en forsinkelse i reparation ikke fejlidentificerede som fuldstændig hæmning. Omvendt, det forsikrer, at induktion af en reparation svar, der ikke er i stand til at inaktivere disse svar ikke er fejlidentificerede som normalitet eller overdreven aktivering.
Forsinket protein kompleks dannelse og mis lokaliseringen af reparation proteiner, men kan ikke utvetydigt skelnes med denne tilgang. For at afgøre, om reparation proteiner er mis lokaliserede versus forsinket i deres lokalisering, kan en “langtidsholdbare” DSB indføres gennem enzymatisk kløvningen af cellulære DNA. Den resulterende læsion er recut hver gang det er repareret, hvilket resulterer i en særskilt store nukleare reparation fokus og fjerner den tidsmæssige begrænsning af rekruttering. Dette kan opnås ved at ændre den eksisterende metode med brug af sjældne skæring liv1975 (fx, SceI) til at fremkalde en langvarig DSB. Levetiden af DSBs giver mulighed for visualisering af undvigende reparation proteiner ved immunfluorescens mikroskopi. Den forbedrede overflod kunne også forbedre visualisering, når påvisning hindres af begrænsning i antistof kvalitet, en funktion, der kunne være nyttige, når mindre studerede proteiner er identificeret som havende en indvirkning på DNA reparation.
Især, leverer vi udtrykkelige instruktioner for en gratis billede behandling og analyse-software (fxImageJ). Dette fjerner en væsentlig økonomisk barriere i billedanalyse, åbne afhøring af DNA skade reparation til et bredere publikum.
Analyse af DNA skade reparation i almindelighed og reparation af dobbelt-strenget DNA pauser er specifikt et aktivt område for forskning, fordi dens konsekvenser span tumordannelse til grundlæggende biologi6,20. Dette manuskript detaljer en tilgang, der præcist dissekerer bidrag af RAD51 og γ-H2AX proteiner til løsning af DSBs gennem HR. ser frem, denne metode kan bruges til at belyse yderligere funktioner i reparation proteiner på DSBs14<…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Joel Sanneman og Dr. Philine Wangemann af Konfokal mikroskopi kernen, finansieret af den Kansas State University College of Veterinary Medicine, for deres støtte til bestræbelserne på at udvikle denne teknik. pCBASceI var en gave fra Maria Jasin (Addgene plasmid # 26477) 30. U2OS DR-NGL celler var en slags gave fra Maria Jasin18.
12mm Coverslips | VWR | 89015-725 | |
16% Paraformaldehyde (PFA) | ThermoFisher Scientific | 28908 | |
24-well plate | VWR | 82050-892 | |
96-well glass bottom plate | Cellvis | P96-1.5H-N | |
Anti-H2AX Alexa488 | EMD Millipore | 05-636-AF488 | |
Anti-Rad51 (D4B10) | Cell Signaling Technology | 8875S | |
Bio-formats plugin for ImageJ | National Institute of Health (NIH) | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/index.html | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | VWR | 97061-416 | |
DAPI | ThermoFisher Scientific | D1306 | |
DMEM, High Glucose | ThermoFisher Scientific | 12100046 | |
EDTA | Invitrogen | 15576-028 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | VWR | 89510-194 | |
Goat Anti-Rabbit IgG Alexa594 | ThermoFisher Scientific | A-11012 | |
Hydrogen Peroxide | sigma-Aldrich | 216763-100ML | |
ImageJ Software | National Institute of Health (NIH) | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
I-SceI Expression Vector | Addgene | 26477 | |
Nail Polish- Insta Dri | Sally and Hansen | Clearly Quick (103) | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Bio Basic | PD8117 | |
ProLong Gold Antifade Reagent | Life Technologies | P36930 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich | T4049-500ML | |
TurboFect Transfection Reagent | ThermoFisher Scientific | R0531 | |
Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-500 |