Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Cancer Research

אפיון תהליכי תיקון DNA-ארעי ומעברי DNA ארוך כפול-strand על ידי מיקרוסקופ Immunofluorescence

doi: 10.3791/57653 Published: June 8, 2018
* These authors contributed equally

Summary

תיקון של זוגיות-גדיל DNA מעברי הוא תהליך דינמי, הדורשים לא רק היווצרות תיקון מכלולי השברים, אבל גם הרזולוציה שלהן לאחר הנגע הוא ממוען. כאן, אנו משתמשים מיקרוסקופ immunofluorescence עבור ארעי לטווח ארוך כפול גדילי ומעברי ככלי לנתח מנגנון תחזוקה זה הגנום.

Abstract

התיקון של מעברי גדילי כפול (DSBs) ב- DNA הוא תהליך מאוד מתואמת, המחייב את היווצרות והרזולוציה של מתחמי חלבון רב תיקון. תהליך זה מוסדר על ידי מספר עצום של חלבונים לקדם את העמותה ואת השיוך של חלבונים אלה נגעים. תודה במידה רבה היכולת לבצע מסכי פונקציונלי של ספריה העצום של חלבונים, יש הערכה גדולה יותר של הגנים הדרושים עבור התיקון מעבר DNA כפול-strand. לעיתים קרובות נוקאאוט או כימי המעכב מסכי לזהות חלבונים המעורבים בתהליכים תיקון על-ידי שימוש מוגבר רעילות סמן חלבון הדרוש לתיקון DSB. למרות שימושי עבור מזהים הרומן הסלולר החלבונים המעורבים שמירה על נאמנות הגנום, אנליזה פונקציונלית דורש קביעת אם החלבון עניין מקדמת לוקליזציה, היווצרות או ברזולוציה של מתחמי תיקון.

ההצטברות של חלבונים תיקון ניתן להבחין בקלות באמצעות מיקרוסקופ immunofluorescence כמו foci גרעיני ברורים. לפיכך, השיוך של חלבונים אלה באתרים של נזק לדנ א וארגון ניתן לגשת על ידי התבוננות אלה foci גרעיני במרווחי זמן נציג לאחר אינדוקציה של זוגיות-גדיל DNA מעברי. גישה זו ניתן לזהות חלבונים גורם תיקון בזיהוי שגיאות מקומי, אם תיקון פגמים אינם מתרחשים בו זמנית עם לא שלם עיכובים בתיקון. בתרחיש זה, לטווח ארוך כפול-גדיל DNA מעברי ניתן לתכנן על ידי הבעת של חיתוך נדיר endonuclease (למשל, SceI) בתאים איפה האתר זיהוי האנזים אמר שולב הגנום הסלולר. הנגע וכתוצאה מכך קשה במיוחד לפתור כמו תיקון הנאמן להציג אתר הכרה של האנזים, המבקשת עוד סיבוב של המחשוף. כתוצאה מכך, הבדלים קינטיקה של תיקון נמחקות. אם תיקון מכלולי לא נוצרות, יש כבר המניע לוקליזציה. פרוטוקול זה מתאר את המתודולוגיה נחוץ לזהות שינויים ותיקון קינטיקה, כמו גם תיקון חלבון לוקליזציה.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

כל יום, כל תא בגוף האדם הוא מופגז עם 10,000 המשוערת DNA נגעים1. האיום הקיומי הזה מעמיד אותנו בסיכון מוטציות, oncogenesis, כמו גם לתא המוות. כדי להגן על נאמנות הגנום, בתרבית של תאים התפתחו להגיב על נזק לדנ א עם סדרה מורכבת של עמותות חלבונים ושינויים. תגובה זו מאורגנת לתוך מספר מסלולים, המכונה באופן קולקטיבי ה-DNA נזק התגובה (DDR)2,3. DDR מורכב ההצטברות של חלבונים תיקון ה-DNA ב DNA נגעים, מתואמים חנותם והן במרחב. DDR גורם לעתים קרובות מחזור התא מעצר כדי למנוע את התפשטות או התעצמות של נזק עלול להתרחש במהלך השכפול של הדנ א פגום2,4,5. בתורו, זה גם הכרחי עבור הכדאיות הסלולר לבטל את מחזור התא מעצר על-ידי ביטול השיוך תיקון מכלולי לאחר תיקון שהושלם.

בין הסוגים השונים של נזק לדנ א, DSBs, המזיקות ביותר. יכול לגרום לכשל כדי לתקן את DSBs rearrangements כרומוזום או מחיקות בקנה מידה גדול כגון האובדן של הזרועות כרומוזום שלם. התיקון של DSBs מחולק לשני מסלולים6,7,8. רקומבינציה הומולוגית (HR) דורש אחות כרומוזום להשתמש כתבנית DNA ולכן הוא מוגבל מאחר G2/מאזו שלבי מחזור התא9,10. Non-הומולוגי סוף מצטרף (NHEJ) אין הגבלות אלה, אך יכול לגרום מחיקות קטן בעת תיקון DSBs11,12.

DSB לתקן באופן ספציפי, DDR באופן כללי הם פעילים תחומי החקירה. למרות להיות מאורגנים בתוך המסלולים מופרדים בנוחות, יש מידה רבה של יתירות. אכן, הרבה חלבונים (BRCA1, BRCA2 ו את RPA מורכבים לדוגמה) מעורבים מספר מסלולים13,14,15,16. התיקון של פגיעה באמצעות שביל אחד, יכול להוביל ביניים נזק זה צריך לתקן על ידי מסלול אחר14. השילוב של מסלולים אלה, בשילוב עם המשימה המורכבת שלהם לגייס את החלבונים הנכון למקום הנכון עבור הסכום המדויק של הזמן הדרוש, דורש תהליך התקינה רב שכבתית.

לאחרונה דווח מדגיש המורכבות של DDR על ידי הפגנת כי היווצרות מורכבות תיקון רזולוציה, לוקליזציה של כל אחד בנפרד ניתן לקוי17. המטרה הכוללת של הפרוטוקול הבא הוא לנתח באופן מוחלט את היכולת של תאי לתקן DSB. באמצעות מיקרוסקופ immunofluorescence, הצטברות של חלבונים תיקון באתרים של נזק, ניתן לאבחן בנקודות זמן נציג בעקבות של אינדוקציה של DSBs.

טכניקה זו היא בעלת מספר יתרונות גישות נפוצות. לעתים קרובות, תיקון הוא ובדוקים בנקודות פעם ולא מסוגל המייצגים את תהליך דינמי של הרכבה דיסוציאציה של מתחמי תיקון. התבוננות בטווח המלא של התיקון של ההפעלה הראשונית לרזולוציה מלאה מבטיחה לא טעינו בזיהוי עיכוב תיקון כמו עיכוב מוחלט. לעומת זאת, היא מבטיחה לא טעינו בזיהוי של אינדוקציה של תגובה לתיקון אין אפשרות להשבית את התגובה אמר הרגיל או הפעלת יתר.

היווצרות מורכבות חלבונים מתעכב, לוקליזציה שגויה של תיקון חלבונים, עם זאת, ייתכן לא חד משמעית להבחין עם גישה זו. כדי לקבוע אם תיקון חלבונים הם בזיהוי שגיאות מקומי לעומת להתעכב על לוקליזציה שלהם, שיוכל DSB "ארוך" דרך המחשוף אנזימטי של DNA. תאית. הנגע וכתוצאה מכך הוא ואז אני יערוך בכל פעם שזה יתוקן, והתוצאה היא מוקד ברורים תיקון גרעיני גדול והסרה ההגבלה הטמפורלי של גיוס. זו יכולה להיות מושגת על ידי שינוי הגישה הקיימת עם השימוש חיתוך נדיר endonuclease (למשל, SceI) כדי לעודד DSB לטווח ארוך. תוחלת החיים של DSBs מאפשר את הפריט החזותי של תיקון חמקמק חלבונים על ידי מיקרוסקופ immunofluorescence. שפע משופרת יכול גם לשפר את הפריט החזותי בעת זיהוי מתעכבת על ידי הגבלה באיכות נוגדן, תכונה אשר יכול להיות שימושי כאשר חלבונים למד פחות מזוהים כבעלי השפעה על תיקון ה-DNA.

ראוי לציין, אנו מספקים הוראות מפורשות על תמונה חופשית עיבוד וניתוח תוכנה (לדוגמה, ImageJ). פעולה זו מסירה את מחסום הפיננסיים העיקריים בניתוח התמונה, פתיחת החקירה של DNA לתקן נזק לקהל רחב יותר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

שימו לב, פרוטוקול זה נכתב עבור U2OS תאים המכילים של אתר הכרה-SceI18. התאים לא צריך להיות U2OS אבל חייב להכיל את האתר SceI. הפרוטוקול ייתכן שתצטרך להיות מנוכי עונתיות (למשל, מספר התאים נזרע ושעות הדגירה) בהתאם לסוג תאים בשימוש.

1. הגדרת את קינטיקה של DSB תיקון היווצרות מורכבות

  1. לגדל תאים U20S-DRGFP על צלחת תרביות רקמה 10 ס מ עד 85-90% confluent.
  2. הסר את המדיה, דגירה בטמפרטורת החדר (RT) ב- 3 מ"ל של EDTA למשך 2 דקות.
  3. החלף EDTA 1 מ"ל של טריפסין, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 5 דק. ודא כי התאים מנותקים מפני השטח של הלוח על ידי צפייה במיקרוסקופ. לנטרל טריפסין 5 מ של Dulbecco ששינה נשר בינוני (DMEM) בתוספת 10% סרום שור עוברית (FBS) ו- 1% פניצילין/סטרפטומיצין.
  4. לקבוע את הריכוז של תאים ההשעייה באמצעות hemocytometer ואת שיטת מניעה כחול trypan.
  5. זרע 6 x 103 תאים/טוב ב µL 200 של צלחת זכוכית-התחתון 96-ובכן. לחלופין, זרע 4 x 10 תאים6 מ ל 8-12 מ מ coverslips להציב צלחת 10 ס מ.
    הערה: כל טוב או coverslip מייצג נקודת זמן אחד, כולל את הפקד.
  6. לגדל את התאים בן לילה-CO של 37 ° C ו- 5%-2.
  7. גרימת DSBs
    1. להחליף את המדיה מן המנה 96-ובכן צלחת/10 ס מ עם2O H2 מדולל על ריכוז של 25 מיקרומטר עם DMEM + 10% FBS דגירה ב 37 ° C עבור 1 h.
    2. לשטוף את התאים 3 x 1 x PBS והחלף עם DMEM טרי בתוספת 10% FBS ו 1% פניצילין/סטרפטומיצין. דגירה התאים 37 ° C 0, 1, 4, 8, 24 ו 48 ה ודא כי דילולים טריים של2O H2 משמשים עבור כל ניסוי.
      הערה: כדי למנוע הרג תאים על ריכוז2 2O H המשמש כאן, ודא כי המינון של נזק הוא נמוך מספיק כך עיקר התאים יימנע ואפופטוזיס ו הזדקנות ביולוגית. זה חיוני כדי לבחון את תהליך ההחלמה. זו מושגת בצורה הטובה ביותר על ידי מדידת רגישות מגוון רחב של מנות. לבצע assay MTT או אחרים assay הכדאיות תא כדי לקבוע ריכוז מינימלי של מי חמצן יכול לשמש.
  8. תיקון, permeabilizing תאים
    1. לשטוף את התאים 3 פעמים עם 1 x PBS. להסיר את coverslip הצלחת 10 ס מ עבור כל נקודת זמן ולמקם אותו טוב יחיד של צלחת 24-ובכן לתיקון. השתמש במחט מלקחיים בזהירות להסיר את coverslip והימנעות גירוד התאים מעל פני השטח coverslip.
    2. תיקון התאים על ידי המקננת למשך 15 דקות עם 4% paraformaldehyde (PFA) איזור פעמים לאחר 1 h H2O2 חשיפה, החלפת DMEM טריים (0, 1, 4, 8, 24 ו 48 שעות).
    3. לשטוף את coverslips קבוע 3 פעמים עם PBS. Permeabilize התאים עם 0.5% דטרגנט ללא יונית מדולל ב- 1 x PBS. תקופת דגירה של 15 דקות ב- RT, לפני נטילת 3 x עם PBS.
      הערה: לאחר permeabilization, אחסון של coverslips אפשרי ב- PBS ב 4 מעלות צלזיוס למשך לפחות שבוע.
  9. תיקון הדמיית מורכבים
    1. לחסום את 96-ובכן הצלחת/coverslips בריכוז של 3% אלבומין שור (BSA) ו- 0.1% דטרגנט ללא יונית מדולל ב- PBS 1 x (3% BSA פתרון) עבור h 1-RT.
    2. דגירה עם נוגדנים העיקרי שכוונו החלבון תיקון של עניין, מדולל על פי מפרט היצרן בפתרון BSA 3% עבור h 1-RT, לפני נטילת 3 פעמים עם 1 x PBS.
    3. דגירה של 96-ובכן הצלחת/coverslips עם נוגדנים משניים מדולל לפי הפרוטוקול של היצרן בפתרון BSA 3%. לאשר כי fluorophores המשני אין עירור חופפים או ספקטרום הפליטה.
    4. לאחר שטיפת התאים עם PBS 3 פעמים מוסיפים דאפי, מדולל על פי מפרט היצרן ב- 1 x PBS, דגירה-RT במשך 5 דקות.
    5. הר על coverslips על גבי שקופיות עם טיפה של הסוכן הרכבה, מוודא את הפרצופים התא בצד למטה. הקש בקפידה על coverslips ולספוג כל סוכן הרכבה עודף עם מגבון.
    6. חותם על coverslips עם ייבוש מהיר לק שקוף ולהבטיח חותם שלמה של coverslip כאשר השקופית.
    7. קח את התמונות מיקרוסקופ קונפוקלי על-ידי התמקדות בערוץ דאפי, לפני ערוצים אחרים (עם אותות גנים תיקון ה-DNA של עניין) כדי למנוע הטיה ידביקו הניסוי.
    8. לחלופין, ניתן לרכוש תמונות על-ידי לקיחת Z-סעיפים של האזור הרצוי עיבוי התמונה לתוך מטוס בודד לדמיין כל foci לזיהוי.
      הערה: אם DSB רזולוציה או חלבון עניין נצפית לא בנקודות זמן שנבחר, לקבוע מתי DSBs לפתור על-ידי בחירת מגוון רחב של נקודות זמן בתחילה (0 – 48 h פוסט DSB אינדוקציה). זמן מוקדי עניין ישתנו לפי שיטת האינדוקציה DSB, החלבון תיקון של עניין.
  10. השתמש ImageJ תוכנה חופשית כדי להגדיר הגרעינים של תמונות מיקרוסקופ immunofluorescence.
    הערה: כדי לפתוח תמונות מיקרוסקופ, התוסף ביו-תבניות להתקין ב- ImageJ.
    1. פתח את התמונות קונאפוקלית (.czi או. tif) על-ידי גרירת קובץ התמונה לתוך חלון ImageJ, או על-ידי בחירה "ביו-תבניות היבואן" מסרגל הכלים "תוסף" ב- ImageJ.
      הערה: יופיע חלון "ביו-תבניות ייבוא אפשרות".
    2. בחר 'פצל ערוצים' לפצל את התמונה דאפי מכוננת ותמונות פלורסנט בתוך חלון "ביו-תבניות ייבוא אפשרות".
    3. בחר "Colorized" 'אפשרויות צבע' מהתפריט הנפתח. בחר "אישור" כדי לפתוח את דאפי היסטון H2AX (H2AX) תמונות כמו להפריד בין חלונות ובחר את התמונה דאפי.
    4. בחר את סרגל הכלים 'תמונה' "להתאים את הסף" אפשרות לבחירת רב-קוטבי.
      הערה: יופיע חלון "סף".
    5. להתאים את הסף תמונה על-ידי הזזת סרגל התחתון של חלון "סף" לגמרי בצד ימין. התאם את הבר העליון עד הגרעינים מופיעים אדום לגמרי עם קווי מתאר ברורים, הרקע השחור. אל תבחר להחיל. סגור את החלון "להתאים את הסף".
    6. בחר את סרגל הכלים 'נתח' "חלקיקים לנתח" אפשרות. ראה חלון "חלקיקים לנתח" המופיעות על המסך.
    7. קלט הגודל המינימלי של גרעין.
      הערה: חלקיקים מתחת לגודל שלא יהיה, לא תימנה כמו גרעינים.
    8. מהתפריט הנפתח 'הצג', בחר 'קווי מתאר'. בחר באפשרות "הוסף למנהל". לחץ על "אישור" כדי לפתוח את חלון "רועי מנהל".
      הערה: קווי המתאר של גרעינים יופיעו בחלון נפרד.
    9. להקצות מספרי גרעינים שניתן לבחור מתוך חלון "רועי מנהל".
  11. השתמש ImageJ כדי לכמת H2AX foci בתמונות מיקרוסקופ immunofluorescence.
    1. בחר חלון foci "H2AX" (מוכתמים fluorescently מצומדת נוגדנים משניים). לאחר מכן, בחירת סרגל הכלים "תהליך" ובחר "למצוא Maxima" למצוא את foci בתוך האטומים.
      הערה: יפתח חלון "Maxima למצוא".
    2. בחר באפשרות "יחיד נקודות" מתוך התפריט הנפתח 'סוג פלט' ובחר "בחירת נקודת תצוגה מקדימה" כדי להמחיש את מקסימה/מוקדים. קלט ערך "רעש סובלנות" בהתאם עוצמת קרינה פלואורסצנטית של התמונה (איור 1). בדוק המראה של חלון לבן עם נקודות שחורות קטנות.
      הערה: הנקודות מייצגות H2AX foci/מקסימה אשר זוהו. הערך סובלנות רעש חייבת להישמר קבוע לכל התמונות שעוברים ניתוח. סובלנות רעש נמוכה/גבוהה מתארים גם רבים/כמה maxima (foci) בתוך הגרעין, לא יהיה ייצוג מדויק של מוקדים בתוך הגרעין.
    3. בחר גרעינים שעבורו H2AX foci עליך ניתן לכמת עבור מהחלון "רועי מנהל". בחר כל האטומים על ידי סימון האפשרות "הצג הכל".
    4. בחר "מדידה" כדי למדוד את מספר maxima/foci בתוך האטומים שנבחרו.
      הערה: מספר maxima/foci מופיעים כפולות של 255, קרי, אחד לכל היותר יש קריאה "RawIntDen" (צפיפות משולב) של 255.
    5. להעתיק את הערכים "RawIntDen" ולהדביק אותם לתוך תוכנה לניתוח נתונים.

2. ניתוח לוקליזציה אל מעבר לטווח ארוך כפול-גדיל דנ א

  1. תאי הזרע ב 96-ובכן צלחות/coverslips כמפורט בסעיפים 1.1 ו- 1.2.
  2. אינדוקציה של זוגיות-גדיל DNA מעברי
    1. Transfect תאים עם וקטור ביטוי-SceI באמצעות תגובה כימית השומנים מבוססי תקנים על פי מפרט היצרן. המתן 24-72 שעות לאחר תקנים על מנת למקסם את הביטוי endonuclease. לקבוע אם תרביות תאים הצליחה על-ידי איתור תאים עם דגש מיוחד במינו גדול גרעינית וγ-H2AX.
  3. רכישת תמונות
    1. לתקן את permeabilize, לחסום, לשטוף את הצלחת/coverslips 96-ובכן, כמתואר בסעיף 1.8.
    2. שיתוף דגירה תאים עם נוגדן נגד γ-H2AX החלבון תיקון עניין (כאן, נוגדן ראשוני נגד RAD51 שימשה) מדולל על פי מפרט היצרן בפתרון BSA 3%.
    3. לשטוף את 96-ובכן הצלחת/coverslips 3 פעמים עם 1 x PBS. דגירה של 96-ובכן הצלחת/coverslips עם נוגדנים משניים מדולל לפי הפרוטוקול של היצרן בפתרון BSA 3%. לאשר כי fluorophores המשני אין עירור חופפים או ספקטרום הפליטה.
    4. לזהות תאים בעלי דגש גדול גרעינית וγ-H2AX. רק תצלמי תמונות של תאים אלה כדי למנוע הטיה.
  4. ניתוח של טווח ארוך-SceI המושרה מוקדים
    1. לנתח את מוקדים לאורך זמן באופן ידני, על ידי ספירת מספר שני תאים גדולים וγ-H2AX מוקדים של מוקדים משותפת לשפות אחרות של החלבון תיקון עניין.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

איור 1 מציג את מבחר האפליה רעש הנכון על כימות maxima/foci באמצעות ImageJ. התמונות הממוזגות של דאפי החלבון תיקון עניין נמצאים בלוח השמאלי. איור 1A מציג של אפליה רעש של 90, מסמן את המספר הנכון של מוקדים. גרעינים על הקצה (מתואר עם חץ ורוד), מוקדים מחוץ הגרעינים (מתואר עם חץ צהוב) אינם נספרים במהלך כימות. איור 1B מתארת סובלנות רעש נמוך של 50. Maxima רבים מזוהים מחוץ לגרעין, בתוך הגרעין. איור 1C מראה עמידות גבוהה רעש של 220. רק מוקד יחיד (חץ לבן) זוהה. להציע לקורא תחושה של "חיובית" תוצאות "שלילית", ערכנו גם התוצאות נציג באיור2. באופן ספציפי, איור 2A מתארת לוקליזציה שיתוף בין מוקד γ-H2AX (ירוק) חלבון לתיקון עניין (אדום). באופן דומה, תא untransfected מוצג בפינה השמאלית העליונה של חלונית זו, תא עם דגש לא גרעיני (כוזב) וγ-H2AX מוצג העליונה ימינה. אנא הערה micronuclei לשייך DNA נזק מכונות הם מקור סביר של אלה לא גרעיני foci19. איור 2B מספק של הגדלה גבוהה יותר של שני התאים הימני ביותר של איור 2A כדי להוסיף הבהרות לגבי, איך הם נקבעו להיות ופנים את הגרעין, בהתאמה. דוגמה של מוקד γ גרעינית-H2AX ללא שיתוף לוקליזציה של חלבון תיקון מוצג באיור 2C. תיאור סכמטי של פרוטוקול זה מסופק איור 3 שמסכם את גישה זו כדי אפיון תיקון ה-DNA.

Figure 1
איור 1 : ניתוח נציג של כפול-גדיל DNA מעבר לתיקון קינטיקה. תמונות נציג של כימות foci γ-H2AX באמצעות תוכנת ImageJ (עם תוסף ביו-תבניות). הלוחות שמאל הם תמונות ללא הפרדות צבע של גרעינים (40 X הגדלה), מוכתם כחול דאפי, ירוק וγ-H2AX. מרכז מראות הפניה שנותחה האו ם גרעינים עם γ-H2AX foci/מקסימה. (א) בחלונית ' נכון ' מציגה maxima/foci זיהוי עם סובלנות רעש של 90 והוא הנציג של הערכת בפועל של מספר מוקדים בתוך הגרעין. החלונית ' (B) הימין מציגה maxima כימות עם סובלנות רעש נמוך (50). Maxima/foci יכול להתגלות מחוץ לגרעין (חץ צהוב), בעוד רוב מקסימה הממוקמת בתוך הגרעין שאינם ספציפיים רקע אותות. (ג) הזכות החלונית מציגה maxima כימות עם סובלנות רעש גבוהה (220). רק אחד מרבי/מוקד (חץ לבן) מזוהה בתוך הגרעין, אינה מייצגת foci בתוך הגרעין. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2 : נציג אני-SceI המושרה כפול-גדיל DNA מעברי. תמונות נציג של גרעינים מתאי צמח על coverslips (40 X הגדלה). הגרעינים הם מוכתם כחול. תיקון חלבון (RAD51) היא מוכתמת אדום, γ-H2AX היא מוכתמת ירוק. (א) שלושת לוחות הצג באותו השלושה תאים. בפינה השמאלית לוח רוב, גרעינים גלויים. בחלונית ' האמצעי, צביעת עבור RAD51 מוצג. בלוח השמאלי, γ-H2AX מכתים מוצג. הגרעין בפינה הימנית העליונה לא להראות שום סימן של SceI המושרה DSBs. הגרעין במרכז (חץ ורוד) מייצג אירוע חיובי אמיתי שכן יש מוקד גרעיני גדול וγ-H2AX וגם דגש גרעיני RAD51 משותפת לשפות אחרות. גרעין בצד ימין יש דגש שקר גדול וγ-H2AX כפי שהוא extranuclear. מוקדים מחוץ לגרעין אין להשתמש עבור ניתוח לוקאליזציה משותף. (B) זה הגדלה גבוהה יותר של התמונה הממוזגת בחלק א (מרכז, נכון רוב התאים). המוקד גדול צהוב הגרעין המציינת את החפיפה של RAD51 ו- H2AX אות זה מסומן על ידי חץ ורוד. (ג) A תמונה ייצוגית של מוקד γ גרעינית-H2AX מבלי להכתים משותפת של החלבון תיקון ה-DNA של עניין. בניגוד המוקד מסומן עם חץ לבן ב (א) ו- (ב), החץ הצהוב מדגים תוצאות טיפוסי בעת תיקון חלבונים תימנע לוקליזציה לאתרי של נזק. סרגל קנה מידה = 15 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3 : תיאור חזותי של פרוטוקול לניתוח כפול-גדיל DNA מעבר לתקן. השלבים (1) ייצוג של פרוטוקול 1.1 עבור זריעה תאים על coverslips/זכוכית למטה צלחות. (2) איור האינדוקציה של זוגיות-strand הפסקות בטיפול עם מי חמצן (מימין) או גרימת לטווח ארוך כפול-strand מעברי מאת transfecting 3 µg של SceI. (3) ייצוג של פרוטוקול שלבי 1.4 כדי 1.5.3 ויזואליזציה של מעברי כפול-strand. (4a) התמונה המייצגת מיקרוסקופיה קונפוקלית של תא מוכתם דאפי (כחול) וγ-H2AX מוקדים (ירוק). גרעינים (4b) התמונה של יחיד גדול וγ-H2AX מוקדים (ירוק) שוב כתם דאפי (כחול). (5 א) תיאור של הניתוח של מוקדים γ-H2AX באמצעות ImageJ (פרוטוקול צעדים 1.10.1–1.11.5). (5b) תיאור של ספירה ידנית של לאורך זמן גדול וγ-H2AX מוקדים (פרוטוקול שלב 2.4). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

הניתוח של ה-DNA נזק תיקון באופן כללי, תיקון כפול גדילי DNA מעברי במיוחד הוא אזור פעיל של מחקר מפני השלכותיה span tumorigenesis ל ביולוגיה בסיסית6,20. זו גישה במדויק מבתר את התרומה של RAD51 וγ-H2AX חלבונים עד הרזולוציה של DSBs באמצעות מר להסתכל קדימה, שיטה זו יכול לשמש כדי להבהיר פונקציות נוספות של תיקון חלבונים DSBs14פרטים כתב היד. ההשוואה של תיקון קינטיקה ועל הגיוס של תיקון מכונות DSBs אני-SceI המושרה בין תאים שליטה תאים עם החלבון עניין בנוק-אאוט, הייתי מגדיר את התרומה של החלבון הזה כדי הגיוס, לוקליזציה, ו רזולוציה של תיקון גורמים כדי DSBs.

להמחיש קינטיקה תיקון יש כמה יתרונות על פני הגישות הנפוצות. לעתים קרובות, תיקון הוא חקר בנקודות זמן יחיד, אשר אינו מסוגל המייצגים את תהליך דינמי של הרכבה דיסוציאציה של מתחמי תיקון. התבוננות בטווח המלא של תיקון מהפעלה הראשונית עד לרזולוציה מלאה מבטיחה לא טעינו בזיהוי עיכוב תיקון כמו עיכוב מוחלט. לעומת זאת, היא מבטיחה כי אינדוקציה של תגובה תיקון ללא היכולת להשבית כי התגובה היא לא טעינו בזיהוי כמו הפעלה רגילה או מוגזם. אלה הם בעיקר שינויים ביישום של גישה מבוססת, אך השימוש endonuclease חיתוך נדירים כדי לעודד DSB לטווח ארוך הוא כלי הרומן. היא מאפשרת לחוקר לקבוע חד משמעית אם הלוקליזציה של חלבון לתיקון מעוכבת במקום שלה גיוס שעיכבו אותי תקופה קצרה של זמן מעבר המסקנה של הניסוי. SceI המושרה יכול DSB אחרונה במשך ימים, תיאורטית כל עוד האנזים מתבטא (צריך התא מורדם). גם יכול להיות שנצפו על קינטיקה של DSB תיקון באמצעות הדמיה תא חי. עם זאת, למרות בשידור חי תא הדמיה מאפשר זיהוי של תיקון אירועים בזמן אמת, היישום שלה מתעכבת על ידי הדרישה כי חלבונים להיות מתויג עם fluorophore כגון ה-GFP. מניפולציה גנטית כזה יש פוטנציאל לשנות וחלבון לתפקד ומייצג מכשול טכני נוסף.

ניתוח תמונות באמצעות תוכנת ImageJ עלול להיות מסורבל להתמחות. ההוראות צעד אחר צעד עבור תיקון המוקד זיהוי, כימות שימוש בתוכנה זו מסופק בתקווה הסרת המכשול הזה עבור קבוצות אחרות. זה יכול להוביל ניצול מוגבר של התוכנה עוצמה, לחסל את העלות של תוכניות יקר יותר בתקופה של כיווץ בריכות של תמיכה מענק פדרלי.

בעקרון, משך הזמן של DSBs האלה צריך לאפשר את הפריט החזותי של תיקון חמקמק חלבונים על ידי מיקרוסקופ immunofluorescence. זה יכול להיות המקרה חלבונים קשים לצפייה כי הם אינם מצטברים בקול רם מספיק ריכוז יזוהו, למשל, התמדתו של התוצאות DSB אני-SceI המושרה ב גדול יותר הצטברות אופייני של תיקון חלבונים- הנגע. שפע משופרת יכול גם לשפר את הפריט החזותי בעת זיהוי מתעכבת על ידי הגבלה באיכות נוגדן; תכונה זה יכול להיות שימושי במיוחד כאשר פחות חלבונים למדה מזוהים כבעלי השפעה על ה-DNA לתקן. עד כה, גישה זו אומתה עבור 4 ה-DNA לתקן חלבונים, כלומר RAD51, RPA70, BRCA1 ו BRCA2 (נתונים אינה מוצגת באיור 2, הפניה17)

לבסוף, ישנם שינויים זה עשוי להיות פרוטוקול זה כדי להרחיב את סוגי נזק לדנ א זה יכול להיחקר כמו גם סביבות הסלולר. השינוי הבולט ביותר יהיה לשנות את מקור או סוג של נזק לדנ א המושרה. הוכחת העיקרון לשימוש UVB, קרינה מייננת או radiomimetics (phleomycin, bleomycin, ו etoposide) ללמוד את קינטיקה של DNA לתקן כבר פורסם18,19,23,24 , 25. עם שינוי קל, גישה זו ניתן גם להבהיר תיקון חלבון בתגובה על ידי NHEJ DSBs. לחלופין, בריטון. et al. תאר טכניקה מיצוי מראש יכול להיות בשימוש26. יתרה מזאת, שם הם ביות חותך endonucleases (-HmuI או ע) בעלי האתרים הכרה נרחבת, דומה ל- SceI27. הפרידו אותם מ- SceI, אנזימים אלה לגרום יחיד-גדיל DNA מעברי (SSBs). היכרות עם האתר זיהוי של אנזימים אלה לתוך קו תא יאפשר הניתוח של תיקון חלטורה הקבלות הפרוטוקול המתואר בכתב היד לחקירת ארוכות DSBs. ראוי לציין, התהליך של שילוב ההכרה SceI אתר ואימות המבוא של האתר יכולה להיות מייגעת. למרבה המזל ההתקדמות הגנום עריכה טכנולוגיה (כגון מערכות הטיגון/Cas9) הקלו את הנטל28. יש גם שטח מחקר פעיל זה הצליח הנדסה ביות endonucleases לחתוך במיקום הרצוי גנומית, שמציעה את זה בעתיד, אלה החידושים הנדסה, השימוש CRISPR/Cas9 עשוי להוביל שלב שיבוט זה להיות לוותר28,29.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

אנו מודים ג'ואל Sanneman, ד ר Philine Wangemann של גרעין מיקרוסקופ קונפוקלי, הממומן על ידי קנזס סטייט אוניברסיטת במכללה לרפואה וטרינרית, על תמיכתם של המאמצים לפתח טכניקה זו. pCBASceI הייתה מתנת Jasin מריה (Addgene פלסמיד # 26477) 30. תאים U2OS ד ר-GFP היו מתנה די מריה Jasin18.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12 mm Coverslips VWR 89015-725
16% Paraformaldehyde (PFA) ThermoFisher Scientific 28908
24-well plate VWR 82050-892
96-well glass bottom plate Cellvis P96-1.5H-N
Anti-H2AX Alexa488 EMD Millipore 05-636-AF488
Anti-Rad51 (D4B10)  Cell Signaling Technology 8875S
Bio-formats plugin for ImageJ National Institute of Health (NIH)  https://imagej.nih.gov/ij/plugins/index.html
Bovine Serum Albumin (BSA) VWR 97061-416
DAPI ThermoFisher Scientific D1306
DMEM, High Glucose ThermoFisher Scientific 12100046
EDTA Invitrogen 15576-028
Fetal Bovine Serum (FBS) VWR 89510-194
Goat Anti-Rabbit IgG Alexa594 ThermoFisher Scientific  A-11012 
Hydrogen Peroxide sigma-Aldrich 216763-100ML
ImageJ Software National Institute of Health (NIH)  https://imagej.nih.gov/ij/
I-SceI Expression Vector Addgene 26477
Nail Polish- Insta Dri Sally and Hansen Clearly Quick (103)
Phosphate Buffered Saline (PBS) Bio Basic PD8117
ProLong Gold Antifade Reagent Life Technologies P36930
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100-100ML
Trypsin-EDTA Sigma-Aldrich T4049-500ML
TurboFect Transfection Reagent ThermoFisher Scientific R0531
Tween-20 Fisher Scientific BP337-500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lindahl, T. Instability and decay of the primary structure of DNA. Nature. 362, (6422), 709-715 (1993).
  2. Branzei, D., Foiani, M. Regulation of DNA repair throughout the cell cycle. Nat Rev Mol Cell Biol. 9, (4), 297-308 (2008).
  3. Ciccia, A., Elledge, S. J. The DNA damage response: making it safe to play with knives. Mol Cell. 40, (2), 179-204 (2010).
  4. Auclair, Y., Rouget, R., Drobetsky, E. A. ATR kinase as master regulator of nucleotide excision repair during S phase of the cell cycle. Cell Cycle. 8, (12), 1865-1871 (2009).
  5. Awasthi, P., Foiani, M., Kumar, A. ATM and ATR signaling at a glance. J Cell Sci. 128, (23), 4255-4262 (2015).
  6. Ceccaldi, R., Rondinelli, B., D'Andrea, A. D. Repair Pathway Choices and Consequences at the Double-Strand Break. Trends Cell Biol. 26, (1), 52-64 (2016).
  7. Chapman, J. R., Taylor, M. R. G., Boulton, S. J. Playing the End Game: DNA Double-Strand Break Repair Pathway Choice. Mol Cell. 47, (4), 497-510 (2012).
  8. Daley, J. M., Sung, P. 53BP1, BRCA1, and the Choice between Recombination and End Joining at DNA Double-Strand Breaks. Mol Cell Biol. 34, (8), 1380-1388 (2014).
  9. Hartlerode, A., Odate, S., Shim, I., Brown, J., Scully, R. Cell Cycle-Dependent Induction of Homologous Recombination by a Tightly Regulated I-SceI Fusion Protein. PLOS ONE. 6, (3), e16501 (2011).
  10. Brandsma, I., Gent, D. C. Pathway choice in DNA double strand break repair: observations of a balancing act. Genome Integr. 3, 9 (2012).
  11. Davis, A. J., Chen, D. J. DNA double strand break repair via non-homologous end-joining. Transl Cancer Res. 2, (3), 130-143 (2013).
  12. Reid, D. A., et al. Organization and dynamics of the nonhomologous end-joining machinery during DNA double-strand break repair. Proc Natl Acad Sci. 112, (20), E2575-E2584 (2015).
  13. Chen, J. J., Silver, D., Cantor, S., Livingston, D. M., Scully, R. BRCA1, BRCA2, and Rad51 Operate in a Common DNA Damage Response Pathway. Cancer Res. 59, (7 Supplement), 1752s-1756s (1999).
  14. D'Andrea, A. D. BRCA1: A Missing Link in the Fanconi Anemia/BRCA Pathway. Cancer Discov. 3, (4), 376-378 (2013).
  15. Gudmundsdottir, K., Ashworth, A. The roles of BRCA1 and BRCA2 and associated proteins in the maintenance of genomic stability. Oncogene. 25, (43), 5864-5874 (2006).
  16. Liu, S., et al. Distinct roles for DNA-PK, ATM and ATR in RPA phosphorylation and checkpoint activation in response to replication stress. Nucleic Acids Res. 40, (21), 10780-10794 (2012).
  17. Wallace, N. A., Khanal, S., Robinson, K. L., Wendel, S. O., Messer, J. J., Galloway, D. A. High Risk Alpha Papillomavirus Oncogenes Impair the Homologous Recombination Pathway. J Virol. (2017).
  18. Pierce, A. J., Johnson, R. D., Thompson, L. H., Jasin, M. XRCC3 promotes homology-directed repair of DNA damage in mammalian cells. Genes Dev. 13, (20), 2633-2638 (1999).
  19. Luzhna, L., Kathiria, P., Kovalchuk, O. Micronuclei in genotoxicity assessment: from genetics to epigenetics and beyond. Front Genet. 4, (2013).
  20. Jasin, M. Homologous repair of DNA damage and tumorigenesis: the BRCA connection. Oncogene. 21, (58), 8981-8993 (2002).
  21. Wallace, N. A., Robinson, K., Howie, H. L., Galloway, D. A. β-HPV 5 and 8 E6 Disrupt Homology Dependent Double Strand Break Repair by Attenuating BRCA1 and BRCA2 Expression and Foci Formation. PLOS Pathog. 11, (3), e1004687 (2015).
  22. Wallace, N. A., Robinson, K., Howie, H. L., Galloway, D. A. HPV 5 and 8 E6 Abrogate ATR Activity Resulting in Increased Persistence of UVB Induced DNA Damage. PLoS Pathog. 8, (7), (2012).
  23. Mah, L. J., Vasireddy, R. S., Tang, M. M., Georgiadis, G. T., El-Osta, A., Karagiannis, T. C. Quantification of γH2AX Foci in Response to Ionising Radiation. J Vis Exp. (38), e1957 (2010).
  24. Popp, H. D., Brendel, S., Hofmann, W. K., Fabarius, A. Immunofluorescence Microscopy of γH2AX and 53BP1 for Analyzing the Formation and Repair of DNA Double-strand Breaks. J Vis Exp. (129), e56617 (2017).
  25. Burma, S., Chen, B. P., Murphy, M., Kurimasa, A., Chen, D. J. ATM Phosphorylates Histone H2AX in Response to DNA Double-strand Breaks. J Biol Chem. 276, (45), 42462-42467 (2001).
  26. Britton, S., Coates, J., Jackson, S. P. A new method for high-resolution imaging of Ku foci to decipher mechanisms of DNA double-strand break repair. J Cell Biol. 202, (3), 579-595 (2013).
  27. Landthaler, M., Shen, B. W., Stoddard, B. L., Shub, D. A. I-BasI and I-HmuI: two phage intron-encoded endonucleases with homologous DNA recognition sequences but distinct DNA specificities. J Mol Biol. 358, (4), 1137-1151 (2006).
  28. Lackner, D. H., et al. A generic strategy for CRISPR-Cas9-mediated gene tagging. Nat Commun. 6, 10237 (2015).
  29. Chan, S. H., Stoddard, B. L., Xu, S. Y. Natural and engineered nicking endonucleases--from cleavage mechanism to engineering of strand-specificity. Nucleic Acids Res. 39, (1), 1-18 (2011).
אפיון תהליכי תיקון DNA-ארעי ומעברי DNA ארוך כפול-strand על ידי מיקרוסקופ Immunofluorescence
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Murthy, V., Dacus, D., Gamez, M., Hu, C., Wendel, S. O., Snow, J., Kahn, A., Walterhouse, S. H., Wallace, N. A. Characterizing DNA Repair Processes at Transient and Long-lasting Double-strand DNA Breaks by Immunofluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (136), e57653, doi:10.3791/57653 (2018).More

Murthy, V., Dacus, D., Gamez, M., Hu, C., Wendel, S. O., Snow, J., Kahn, A., Walterhouse, S. H., Wallace, N. A. Characterizing DNA Repair Processes at Transient and Long-lasting Double-strand DNA Breaks by Immunofluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (136), e57653, doi:10.3791/57653 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter