इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी द्वारा क्षणिक और लंबे समय से स्थायी डबल-किनारा डीएनए टूटता में निस्र्पक डीएनए की मरंमत की प्रक्रिया
Summary
डबल-किनारा डीएनए टूट जाता है की मरंमत एक गतिशील प्रक्रिया है, टूट पर मरंमत परिसरों की न केवल गठन की आवश्यकता है, लेकिन यह भी उनके समाधान के बाद घाव को संबोधित किया है । यहां, हम क्षणिक और लंबे समय से स्थाई के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग एक उपकरण के रूप में इस जीनोम रखरखाव तंत्र काटना के लिए टूट जाता है ।
Abstract
डीएनए में डबल-कतरा टूट (DSBs) की मरंमत एक उच्च समंवित प्रक्रिया है, necessitating गठन और बहु प्रोटीन मरंमत परिसरों के समाधान । इस प्रक्रिया में प्रोटीन है कि संघ और इन घावों को प्रोटीन के संबंध को बढ़ावा देने के असंख्य द्वारा विनियमित है । बड़े हिस्से में प्रोटीन का एक विशाल पुस्तकालय के कार्यात्मक स्क्रीन प्रदर्शन करने की क्षमता के लिए धंयवाद, वहां दोहरे-किनारा डीएनए तोड़ मरंमत के लिए आवश्यक जीन की एक बड़ी प्रशंसा है । अक्सर पीटा या रासायनिक अवरोधक स्क्रीन एक प्रोटीन है कि DSB मरंमत के लिए आवश्यक है के लिए एक मार्कर के रूप में वृद्धि की विषाक्तता का उपयोग करके मरंमत प्रक्रियाओं में शामिल प्रोटीन की पहचान । हालांकि उपंयास सेलुलर जीनोम की निष्ठा को बनाए रखने में शामिल प्रोटीन की पहचान के लिए उपयोगी है, कार्यात्मक विश्लेषण कि ब्याज के प्रोटीन स्थानीयकरण, गठन, या मरंमत परिसरों के समाधान को बढ़ावा देता है के निर्धारण की आवश्यकता है ।
मरंमत प्रोटीन का संचय आसानी से इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी द्वारा अलग परमाणु घावों के रूप में पता लगाया जा सकता है । इस प्रकार, डीएनए के नुकसान की साइटों पर इन प्रोटीन के संघ और संघ के प्रतिनिधि अंतराल पर इन परमाणु घावों पर डबल-किनारा डीएनए टूटता के प्रेरण के बाद देख कर पहुंचा जा सकता है । इस दृष्टिकोण भी गलत-स्थानीयकृत मरंमत कारक प्रोटीन की पहचान कर सकते हैं, अगर मरंमत दोष एक साथ नहीं हो मरंमत में अपूर्ण देरी के साथ । इस परिदृश्य में, लंबे समय तक चलने डबल-किनारा डीएनए टूटता एक दुर्लभ काटने endonuclease (जैसे, मैं-SceI) कोशिकाओं में जहां कहा एंजाइम के लिए मांयता साइट सेलुलर जीनोम में एकीकृत किया गया है व्यक्त द्वारा इंजीनियर किया जा सकता है । परिणामस्वरूप घाव विशेष रूप से हल करने के लिए मुश्किल है के रूप में वफादार मरंमत है एंजाइम मांयता साइट फिर से शुरू होगा, दरार का एक और दौर का संकेत । नतीजतन, मरंमत के कैनेटीक्स में मतभेदों को समाप्त कर रहे हैं । यदि मरंमत परिसरों का गठन नहीं कर रहे हैं, स्थानीयकरण में बाधा गया है । इस प्रोटोकॉल की मरंमत कैनेटीक्स में परिवर्तन की पहचान के रूप में अच्छी तरह से प्रोटीन स्थानीयकरण की मरंमत आवश्यक पद्धति का वर्णन ।
Introduction
प्रत्येक दिन, मानव शरीर में हर कोशिका एक अनुमान के साथ बमबारी है १०,००० डीएनए घावों1। इस अस्तित्व के खतरे हमें उत्परिवर्तनों, oncogenesis के रूप में के रूप में अच्छी तरह से सेल मौत के लिए जोखिम में डालता है । जीनोम निष्ठा की रक्षा के लिए, स्तनधारी कोशिकाओं को प्रोटीन संघों और संशोधनों की एक जटिल श्रृंखला के साथ डीएनए क्षति का जवाब विकसित किया है । यह प्रतिक्रिया कई रास्ते में आयोजित किया जाता है, सामूहिक रूप से डीएनए क्षति प्रतिक्रिया (DDR)2,3के रूप में जाना जाता है । इस DDR डीएनए की मरंमत प्रोटीन के संचय के होते है डीएनए घावों पर, दोनों अस्थाई और स्थानिक समंवित । DDR अक्सर प्रचार या क्षतिग्रस्त डीएनए2,4,5की प्रतिकृति के दौरान हो सकता है कि क्षति के गहनता से बचने के लिए सेल चक्र गिरफ्तारी लाती है । बारी में, यह भी सेलुलर व्यवहार्यता के लिए आवश्यक है मरम्मत के बाद मरंमत परिसरों असंबद्ध द्वारा सेल चक्र गिरफ्तारी बंद बारी करने के लिए पूरा किया गया है ।
डीएनए क्षति के विभिंन प्रकारों के अलावा, DSBs सबसे बचके हैं । DSBs की मरंमत करने में विफलता गुणसूत्र पुनर्व्यवस्था या पूरे गुणसूत्र हथियारों की हानि जैसे बड़े पैमाने पर विलोपन में परिणाम कर सकते हैं । DSBs की मरम्मत को दो मार्ग6,7,8में बांटा गया है । मुताबिक़ पुनर्संयोजन (HR) एक बहन गुणसूत्र एक डीएनए टेम्पलेट के रूप में उपयोग करने की आवश्यकता है और इस प्रकार देर एस और G2 के लिए सीमित है/ नॉन-मुताबिक़ एंड जॉइनिंग (NHEJ) के पास ये प्रतिबंध नहीं है, लेकिन DSBs11,12की मरंमत करते समय छोटे हटाए जाने के कारण हो सकते हैं ।
DSB मरंमत विशेष रूप से और सामांय में DDR जांच के सक्रिय क्षेत्र हैं । सुविधाजनक रूप से अलग रास्ते में संगठित होने के बावजूद, अतिरेक का एक बड़ा सौदा है । दरअसल, कई प्रोटीन (BRCA1, BRCA2, और उदाहरण के लिए RPA परिसर) में शामिल है कई रास्ते13,14,15,16। एक मार्ग द्वारा एक घाव की मरंमत, एक नुकसान मध्यवर्ती कि एक और मार्ग14द्वारा मरंमत की जानी चाहिए करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । इन रास्ते के जुड़वां, आवश्यक समय की सटीक राशि के लिए सही जगह पर सही प्रोटीन की भर्ती के अपने जटिल कार्य के साथ संयुक्त, एक बहु स्तरीय विनियामक प्रक्रिया की आवश्यकता है ।
एक ताजा रिपोर्ट का प्रदर्शन है कि मरंमत परिसर गठन, संकल्प द्वारा DDR की जटिलताओं पर प्रकाश डाला गया, और स्थानीयकरण प्रत्येक अलग17बिगड़ा हो सकता है । निम्नलिखित प्रोटोकॉल का समग्र लक्ष्य निश्चित रूप से DSB की मरंमत करने के लिए कोशिकाओं की क्षमता काटना है । इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का प्रयोग, नुकसान की साइटों पर मरंमत प्रोटीन का संचय DSBs के प्रेरण के बाद प्रतिनिधि समय अंक में visualized किया जा सकता है ।
इस तकनीक आमतौर पर इस्तेमाल किया दृष्टिकोण के लिए कई फायदे हैं । अक्सर, मरंमत एकल समय बिंदुओं पर जांच की है और विधानसभा और मरंमत परिसरों के पृथक्करण की गतिशील प्रक्रिया का प्रतिनिधित्व करने में असमर्थ । पूर्ण समाधान करने के लिए प्रारंभिक सक्रियण से मरम्मत की पूरी रेंज अवलोकन सुनिश्चित करता है कि सुधार में देरी पूर्ण अवरोध के रूप में नहीं पहचाना गया है । इसके विपरीत, यह आश्वासन दिया है कि एक सुधार प्रतिक्रिया है कि निष्क्रिय करने में असमर्थ है की प्रेरण कहा प्रतिक्रिया सामांय या अत्यधिक सक्रियण के रूप में नहीं पहचाना है ।
देरी प्रोटीन जटिल गठन और मरंमत प्रोटीन की एमआईएस स्थानीयकरण, तथापि, स्पष्ट रूप से इस दृष्टिकोण के साथ प्रतिष्ठित नहीं हो सकता है । यह निर्धारित करने के लिए कि मरंमत प्रोटीन गलत-स्थानीयकृत बनाम अपने स्थानीयकरण में देरी, एक “लंबे समय से स्थाई” DSB सेलुलर डीएनए के एंजाइमी दरार के माध्यम से पेश किया जा सकता है । परिणामस्वरूप घाव recut हर बार यह मरंमत की है, एक अलग बड़े परमाणु मरंमत ध्यान में जिसके परिणामस्वरूप और भर्ती से लौकिक प्रतिबंध हटाने है । यह एक दुर्लभ काटने endonuclease (जैसे, मैं SceI) के उपयोग के साथ मौजूदा दृष्टिकोण को संशोधित करने के लिए एक लंबे समय तक चलने DSB प्रेरित द्वारा प्राप्त किया जा सकता है । DSBs की दीर्घायु इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी द्वारा मायावी मरंमत प्रोटीन के दृश्य में सक्षम बनाता है । बढ़ी बहुतायत भी दृश्य में सुधार कर सकता है जब पता लगाने एंटीबॉडी गुणवत्ता, एक विशेषता है कि जब कम अध्ययन प्रोटीन डीएनए की मरंमत पर एक प्रभाव होने के रूप में पहचान कर रहे है उपयोगी हो सकता है में सीमा से रुकावट है ।
विशेष रूप से, हम एक मुक्त छवि प्रसंस्करण और विश्लेषण सॉफ्टवेयर (जैसे, ImageJ) के लिए स्पष्ट निर्देश प्रदान करते हैं । यह छवि विश्लेषण में एक प्रमुख वित्तीय बाधा को हटा, डीएनए क्षति की मरंमत के एक व्यापक दर्शकों के लिए पूछताछ खोलने ।
Protocol
Representative Results
Discussion
सामांय में डीएनए क्षति की मरंमत और दोहरे-असहाय डीएनए टूट की मरंमत के विश्लेषण विशेष रूप से अनुसंधान के एक सक्रिय क्षेत्र है, क्योंकि इसके परिणामों के बुनियादी जीवविज्ञान6,20तक tumorigen…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम योएल Sanneman और डॉ Philine Wangemann फोकल माइक्रोस्कोपी कोर, पशु चिकित्सा के कैनसस राज्य विश्वविद्यालय कॉलेज द्वारा वित्त पोषित के लिए, इस तकनीक को विकसित करने के प्रयासों के उनके समर्थन के लिए धंयवाद । pCBASceI मारिया जसीन (Addgene प्लाज्मिड # 26477) 30 से एक उपहार था । U2OS डॉ-GFP कोशिकाओं मारिया जसीन18से एक तरह का उपहार थे ।
Materials
| 12mm Coverslips | VWR | 89015-725 | |
| 16% Paraformaldehyde (PFA) | ThermoFisher Scientific | 28908 | |
| 24-well plate | VWR | 82050-892 | |
| 96-well glass bottom plate | Cellvis | P96-1.5H-N | |
| Anti-H2AX Alexa488 | EMD Millipore | 05-636-AF488 | |
| Anti-Rad51 (D4B10) | Cell Signaling Technology | 8875S | |
| Bio-formats plugin for ImageJ | National Institute of Health (NIH) | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/index.html | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | VWR | 97061-416 | |
| DAPI | ThermoFisher Scientific | D1306 | |
| DMEM, High Glucose | ThermoFisher Scientific | 12100046 | |
| EDTA | Invitrogen | 15576-028 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | VWR | 89510-194 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG Alexa594 | ThermoFisher Scientific | A-11012 | |
| Hydrogen Peroxide | sigma-Aldrich | 216763-100ML | |
| ImageJ Software | National Institute of Health (NIH) | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| I-SceI Expression Vector | Addgene | 26477 | |
| Nail Polish- Insta Dri | Sally and Hansen | Clearly Quick (103) | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Bio Basic | PD8117 | |
| ProLong Gold Antifade Reagent | Life Technologies | P36930 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich | T4049-500ML | |
| TurboFect Transfection Reagent | ThermoFisher Scientific | R0531 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-500 |
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