Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

מערך Glycan המודפס: טכניקה רגישה לניתוח של הרפרטואר של מחזורי נוגדנים אנטי-פחמימות בבעלי חיים קטנים

Published: February 14, 2019 doi: 10.3791/57662
Automatic Translation
*1, *2,3, 3, 2, 2, 2, 2, 2, 2,4, 1, 1,5
1Infectious Pathology and Transplantation Division, Bellvitge Biomedical Research Institute (IDIBELL), 2Shemyakin-Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry (IBCh), Russian Academy of Sciences, 3Semiotik LLC, 4Auckland University of Technology, 5Intensive Care Department, Bellvitge University Hospital
* These authors contributed equally

Summary

עבודה זו מציגה את הפוטנציאל של טכנולוגיית מערך (PGA) glycan המודפס על הניתוח של מחזורי נוגדנים אנטי-פחמימות בבעלי חיים קטנים.

Abstract

הרפרטואר של מחזורי נוגדנים אנטי-פחמימות של אדם נתון קשורה לעיתים קרובות עם מעמדה אימונולוגי. לא רק תנאי המערכת החיסונית בודדים קובע את ההצלחה במאבק פנימי וחיצוני אותות איום פוטנציאלי, אלא גם קיומו של דפוס מסוים של מחזורי נוגדנים anti-glycan (וגם וריאציה רמת סרולוגית שלהם) יכול להיות סמן משמעותי של התפתחות, התקדמות של מצבים פתולוגיים מסוימים. כאן, אנו מתארים מתודולוגיה מבוססת-מודפס Glycan מערך PGA מציעה את ההזדמנות כדי למדוד מאות מטרות glycan עם רגישות גבוהה מאוד; באמצעות כמות מזערית של מדגם, אשר בעלי חיים נוכח בעת קטנות הגבלת נפוצות (חולדות, עכברים, אוגר, וכו ') משמשים כמודלים להיבטים כתובת של מחלות אנושיות. דוגמה מייצגת של גישה זו, אנו מראים את התוצאות שהתקבלו הניתוח של הרפרטואר של נוגדנים אנטי טבעי-glycan בעכברים BALB/c. נדגים כי כל עכבר BALB/c מעורב במחקר, למרות להיות זהים גנטית ומתוחזק תחת באותם התנאים, מפתחת דפוס מסוים של נוגדנים אנטי-פחמימות טבעי. עבודה זו טוענת להרחיב את השימוש בטכנולוגיה PGA לחקור רפרטואר (specificities) ואת רמות ומגבלותיהם נוגדנים אנטי-פחמימות, בריאות והן במהלך כל מצב פתולוגי.

Introduction

נוגדנים לשחק תפקיד מרכזי בהגנה שלנו נגד פולשים גורמי מחלה על ידי ישירות לנטרל וירוסים1,2 ו חיידקים2,3, על ידי הפעלת המשלים מערכת4,5 השיפור של phagocytosis6. בנוסף, הם מרכיבים חיוניים סרטן מיקוד, חיסול של תאים ממאירים7, והומאוסטזיס תחזוקה8,9.

הפרעות של מערכת החיסון יכול לגרום מחלות אוטואימוניות דלקתיות10 וסרטן11. כל התנאים פתולוגיים אידיאלי דורשים אבחנה בקשה לטיפול יעיל. במקרה של הפרעות אוטואימוניות, נוכחות סרולוגית עצמיים ברוב המקרים הוא מנבא על אבחון של מחלת חיסון עצמי10,12. נוגדנים אלה מגיבים עם פני השטח של התא, autoantigens חוץ-תאית, והם לעיתים קרובות קיים במשך שנים רבות לפני המצגת של מחלות אוטואימוניות10,12. ליקויים החיסונית וסרטן מאובחנים גם עם בדיקות דם גם למדוד את רמת מרכיבי מערכת החיסון כגון נוגדנים, או שלהם פעילות פונקציונלית11.

הזיהוי של הרפרטואר של מחזורי נוגדנים ורמות סרולוגית שלהם הם הכרחיים כדי לקבוע פרוגנוזה וכדי להעריך את ההתקדמות של כל התנאים שהוזכרו פתולוגי. בעבר הראו את הפוטנציאל של PGA טכניקת הניתוח של מחזורי נוגדנים מיני בעלי חיים שונים13–16, צמצום כמויות גדולות של דגימות סרולוגית, מתחמק מהבעיה הקשורים נוגדנים אשיג17 ו תפוקה גבוהה המאפשר פרופיל של רפרטואר נרחב של נוגדנים15.

מבוסס-Glycan immunoassays הם בעיקר מותנה, בין היתר, מקור וייצור של פחמימות, הקובעות את הזיקה ואיגוד של ליגנדים15,18,19,20 ,21. ניתן לפתח immunoassays Glycan מבוססי ההשעיה (microspheres)15,21,22 או משטחים מופעל שטוח15,21,22, 23,24. האחרון נמנים אליסה (המקובל ביותר של שיטות אלה) PGA. אין הרבה נתונים השוואת מתודולוגיות אלה אותה הגדרה ניסיוני15,25,26,27. בעבר השווינו את היעילות ואת מידת הבררנות של אלה immunoassays על פרופיל נוגדנים anti-glycan דוגמאות בודדות לפלסמה אנושית15. נוגדנים מסוימים כגון אלה מיקוד סוג הדם anti-A/B, כל immunoassays יכולה לזהות אותם עם מובהקות סטטיסטית, הם בקורלציה חיובית עם השני15,18,21. בינתיים, נוגדנים anti-P1 אותרו בעיקר על ידי PGA עם הכוח שמסווגת הגבוה ביותר, ולא היה שום קורלציה ב האישושים שנעשו על ידי15,immunoassays שונים מבוססי glycan18, 21. ההבדלים בין השיטות שהיו קשורים בעיקר אנטיגן נוגדן/יחס ואת glycan התמצאות15. אליסה ומתלים מערכים רגישים יותר מחייב לא ספציפי יותר PGA כי יש עודף של אנטיגן על נוגדנים אלה שיטות15. בנוסף, כיוון glycans ב PGA הוא מוגבל יותר מאשר מערכים של אליסה ומתלים -15. אליסה נוח כאשר המחקר כולל פאנל מוגבלת של glycans. מערכים ההשעיה, אליסה מציע גמישות רחבה יותר לגבי שינוי תצורה וזמינותו. PGA נוח במיוחד עבור גילוי גישות15,18,21,28. למרות ברור יתרונות וחסרונות אלה, immunoassays שהוזכרו שלוש יכול לשמש כדי לחקור היבטים שונים של אינטראקציות glycan-נוגדן. המטרה הסופית של המחקר הוא שאחד ינחה את הבחירה של המתודולוגיה מתאימה יותר.

ההווה פועלים שואפת להרחיב את השימוש בטכנולוגיה PGA לניתוח של הרפרטואר של מחזורי נוגדני anti-glycan חיות קטנות. כתוצאה מכך נציג, אנו מציגים כאן פרוטוקול נתונים היסטוריים כדי להעריך את הרפרטואר של נוגדנים אנטי-פחמימות טבעי בעכברים BALB/c למבוגרים מאת PGA.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Glycochips ייצור

  1. הכנה Microarray
    1. הדפס את glycans (50 מ מ), ללא סוכרים (10 µg/mL) ב-300 מ מ פוספט תמיסת מלח במאגר (PBS, pH 8.5) ב-6 משכפל על גבי שקופיות זכוכית N-hydroxysuccinimide-derivatized, באמצעות מגע arrayer רובוטית (טיפה נפח ~ 900 pL). כל שקופית מכיל 4 בלוקים שונים של מערכי המשנה (איור 1A, בצבעים) 6 פעמים. כל מערך תת יחידה נוצרת על ידי 112 נקודות glycan שונים, כולל פקדים (8 שורות × 14 עמודות) (איור 1B).
      הערה: מידע הקשור ל- Glycan מסופק משלים טבלה 1. ספריית glycan המשמש להטסת ההדפסה היא התוצאה של מאמץ סינתטי לטווח ארוך של הקבוצה IBCh; דוגמאות של סינתזה מתוארים והפרסומים הנלווים29,30,31,32,33,34,35,36 37, ,38. ספריית glycan כללה קבוצת הדם אנטיגנים וחלק ביותר לעתים קרובות המתרחשים oligosaccharides מסוף, כמו גם מוטיבים הליבה של יונקים N-O-מקושרים glycoproteins, glycolipids, אנטיגנים סרטניים הקשורים פחמימות, ו סוכרים מחיידקים פתוגניים.
    2. דגירה השקופיות בתיבה לחות (לחות יחסית ~ 70%) בטמפרטורת החדר (25 ° C) לשעה.
    3. חסימת מיקרו-מערכים: דגירה השקופיות עבור h 1.5 עם מאגר חסימה בטמפרטורת החדר (חומצה בורית 100 מ מ, 25 מ מ ethanolamine, 0.2% (v/v) Tween-20 במים הנדסה גנטית).
    4. לשטוף את glycochip עם מים הנדסה גנטית, לייבש אותו בדרך האוויר.
  2. בקרת איכות Glycochip
    1. לנתח שני מיקרו-מערכים של כל אצווה באמצעות 1 מ"ג/מ"ל תמיסת בנוגדנים מורכבות הכנה (CIP, המכיל IgG, IgM, איגה), 10 µg/mL פתרון של biotinylated העז האנטי-האדם immunoglobulins נוגדנים משניים (IgM IgG + איגה), ואחריו 1 µg/mL פתרון של המספר המתאים המשלים streptavidin פלורסנט (באמצעות פרוטוקול המתואר להלן, ראה שלב 2).
    2. לסרוק ולנתח את glycochips (ראה שלב 3, ניתוח מערך glycan).
    3. השתמש microarray אצוות chip "אינטרה" בין קורלציה גבוהה יותר 0.9.

2. Glycan מערך טכניקה

  1. להכין את הפתרונות הבאים מימית (במים הנדסה גנטית) ולאחסן אותם בטמפרטורת החדר (25 ° C):
    • מאגר-1: 1% (w/v) שור אלבומין (BSA) ב- PBS, 1% (v/v) Tween-20 ו- 0.01% (w/v) נאן3
    • מאגר-2: 1% (w/v) BSA ב- PBS, 0.1% (v/v) Tween-20 ו 0.01% (w/v) נאן3.
    • מאגר-3: 0.1% (v/v) Tween-20 ב- PBS.
    • מאגר-4: 0.001% (v/v) Tween-20 ב- PBS.
  2. הכנה Glycochip, ולטעום
    1. שים את תיבת אחסון עם השקופיות על השולחן עד שיגיעו לטמפרטורת החדר (25 ° C).
      הערה: השתמש כפפות לטקס ללא אבקה. Glycochip חייב להיות המניפולציה בחלק התחתון של השקופית זכוכית, היכן שממוקם הברקוד. הברקוד יסייע לך לזהות הצד הימני, הימנעות ממגע עם פני השטח שבו glycans מודפסים.
    2. פתח את תיבת, לקחת את glycochip והנח אותו בחדר דגירה (25 ° C), כבר ממוזגים עם נייר סינון רטוב כדי לשמור על לחות קבועה בתוך החדר.
    3. בינתיים, לדלל את הנסיוב עכברים עם מאגר-1 (1:20) 1.5 mL צינורות. Homogenize הפתרון סרום (5 s) עם מערבל מערבולת.
      הערה: אמצעי האחסון הדרושים כדי לכסות לגמרי את משטח glycochip יחיד הוא כ 1 מ"ל.
    4. לאחר המגון, דגירה הסרום מדולל ב 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות באמבט מים כדי למנוע צבירת בנוגדנים. Centrifuge הצינורות במשך 3 דקות ב 10,000 x g ו- 25 ° C, לאסוף את תגובת שיקוע ולמחוק כל חומר precipitated.
    5. מניחים את glycochip בקפידה בבית הבליעה הדגירה. דגירה למשך 15 דקות ב- 25 ° C עם 1 מ"ל של מאגר-3 כדי לחסל כל חומר שיורית על פני השטח של glycochip זה.
    6. להחזיק את glycochip בצורה מאונכת, rewash אותו עם כמה טיפות של מאגר-3 באמצעות פיפטה פלסטיק של פסטר. הסר בזהירות את המאגר מפני השטח glycochip באמצעות נייר סינון.
  3. תגובה: נוגדנים איגוד
    1. מניחים את glycochip בבית הבליעה הדגירה. להפיץ את דגימת נסיוב מדולל על פני glycochip באמצעות micropipette. דגירה עם עצבנות מסלולית (30 סל ד) ב 37 ° C עבור ה 1.5, ודא כי כל אזור יבש של פני השטח glycochip מכוסה על ידי המדגם סרום מדולל משתמש קצה פיפטה.
    2. הסר דוגמה עודף, לטבול את glycochip במשך 5 דקות מאגר-3 ב 25 º C. לאחר מכן, להעביר glycochip את מיכל עם מאגר-4 (5 דקות), ולבסוף לשטוף (5 דקות) glycochip במים הנדסה גנטית. Centrifuge את glycochip עבור 1 דקות ב- 175-g ו- 25 ° C כדי להסיר את הנוזל.
  4. זיהוי: נוגדנים משניים
    1. מניחים את glycochip בבית הבליעה הדגירה. התפשטה על פני glycochip פתרון (5 µg/mL) של עז אנטי עכבר (IgG + IgM) מצומדת כדי ביוטין מאגר-2. דגירה עם עצבנות מסלולית (30 סל ד) ב- 37 מעלות לשעה.
    2. הסר את השבר לא מאוגד, חזור על השלבים כביסה.
    3. לאחר צנטריפוגה, דגירה של glycochip באפלה ב 25 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות (30 סל ד) עם 2 µg/mL של הפתרון המתאים התווית על-ידי fluorochrome streptavidin (ב מאגר-2).
    4. באפלה, להסיר את השבר לא מאוגד, חזור על השלבים כביסה.
    5. יבש את glycochip באוויר.
      הערה: Glycochip צריך לסרוק במהירות האפשרית. אבל אם זה בלתי אפשרי לסרוק מיד לאחר צביעת, glycochips ניתן לאחסן במקום קריר ויבש בחשכה.

3. ניתוח מערך Glycan

  1. לסרוק את המערך
    1. להשאיר את glycochip על השולחן עד שהוא מגיע לטמפרטורת החדר בחושך. במקביל, הפעל את סורק שקופיות ואת הלייזר (אורך גל עירור של 633 ננומטר).
    2. אוחזת microarray את, להחליק את glycochip לתוך החריץ עד שייגע מאחור.
    3. לסרוק את glycochip "(ריצה קלה" סרוק), ולשמור את הסריקה כמו ". קובץ TIFF".
  2. מערך כמת
    1. לכמת את המערך באמצעות מערכת ניתוח ScanArray. פתח בעבר סריקת תמונות, על-ידי לחיצה על "קובץ" בקבוצה"קביעת תצורה של & קובץ" על החלון הראשי (איור 1B-D)
    2. לטעון את תבנית הקובץ המתאימה מערך בתבנית גל (הוצאת glycans המודפס על השקופית זכוכית) (איור 1C).
    3. התאמת תבנית גל על ידי בקפידה יישור המערך (רשתות) עם המקומות בתמונה וליזום כמת (איור 1D).
    4. בחר את הפרמטרים כמת:
      • כימות סוג: ריצה קלה חשבים.
      • כימות שיטה: קבוע מעגל
      • אוטומטי למצוא כתמים: בטל את כל האפשרויות
      • נורמליזציה שיטה: LOWESS (פיזור מקומי משוקלל מגרש החלקה).
    5. לשמור את הנתונים כימות בתור ". קובץ CSV"(איור 1D). להעביר הנתונים לתוך קובץ גיליון אלקטרוני נפוצות באמצעות Microsoft Excel או אחר היישום המתאים.
    6. להשתמש את טווח בין רבעוני (IQR) כמו השיטה הסטטיסטית העיקרית: חישוב החציון (הרביעון 2) של כל הסימנים כל ליגנד, הסטייה בין רבעוני (25 ו-75 percentiles, או רביעונים העליון והתחתון Q3 ו- Q1, בהתאמה).
    7. לבצע חקר נתונים אינטראקטיביים באמצעות יישום Explorer קיבוץ באשכולות הירארכי.
    8. שימוש קיבוץ באשכולות פרמטרים: הצמדה הממוצע (UPGMA), מרחק אוקלידי כמו דמיון מרחק מדידה. לבצע קיבוץ באשכולות היררכי על שורות ללא נורמליזציה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כאן, אנו מציגים סיכום של תוצאות נציג המתקבל כימות של הרפרטואר של נוגדנים אנטי טבעי-glycan בקרב אוכלוסיה של 20 עכברים BALB/c. Glycochips השתמשו במחקר זה הכיל 419 מבנים glycan שונים. רוב glycans היו מסונתז כמו -CH2CH2CH2NH2 מרווח חמוש O-glycosides, בכמה מקרים כמו -CH2CH2NH2 או - NHCOCH2NH2 glycosides. כל המבנים glycan התאפיינו ברזולוציה גבוהה (700 - או 800 מגה-הרץ) NMR ספקטרוסקופיה, מטוהרים ונבדק על ידי HPLC, המציין שלהם > 95% טוהר. אנחנו במקביל קבעו IgM + אג נוגדנים anti-glycan עקב הגבלה בסכום של העכבר סרום. ב PGA, שקלנו ערכים מעל 4,000 RFU כאיתות חיובית של איגוד נוגדנים (ערך זה הוא ~ 10% glycans העליון RFU). התוצאות שהוצגו בעבודה זו פעל רוב הנחיות דיווח נתונים מבוססי microarray glycan39. רק 17% מבני פחמימות הוכיח ≥4, 000 RFU ב PGA (איור 2, באדום). רוב glycan מבנים חשופים ב glycochips לא היו מזוהים על-ידי הרפרטואר של מחזורי נוגדנים anti-glycan של עכברים BALB/c (איור 2, כחול ולבן)28. הדפוס ההכפלה של נוגדנים אנטי-פחמימות טבעית של BALB/c כללה 12 specificities glycan שונים, עם עוצמות האות החציוני גבוהה מאוד של נוגדנים מחייב (≥ 10, 000 RFU טבלה 1)28.

Figure 1
איור 1 : ייצוג סכמטי (לא בקנה מידה) של תצורת מערך glycan, הדפסה, ניתוח. (א) מודפסים בשבבים מפותחים עם ספריה של מבנים שונים glycan 419, ואחריו את הזיהוי עם נוגדן המתאים משני fluorescently שכותרתו. כל שקופית מכיל 4 בלוקים שונים של מערכי המשנה (בצבעים), 6 פעמים. כל מערך משנה יחיד נוצר על ידי 112 נקודות glycan שונים (8 שורות × 14 עמודות), כולל פקדים. (B) A דוגמה מייצגת של התמונות המתקבל שבב סריקה באמצעות סורק קרינה פלואורסצנטית (החלק השלישי של התמונה). (ג) התהליך של יישור "הרשת" למקומות במערך משנה כל יחיד (התאמת תבנית במהלך כימות). (ד) ידי קרינה פלואורסצנטית מזוהה עבור כל נקודה, תוצאות מועברים לקובץ הגיליון האלקטרוני הנפוצים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2 : רפרטואר של נוגדנים אנטי-פחמימות במחזור הטבעי של עכברים BALB/c. הדוגמאות סרום העכבר (1:20) היו מודגרות עם glycochips וייסרק באמצעות קורא ScanArray. הנתונים נותחו באמצעות מערכת ניתוח microarray, התוצאות היו המבוטא ביחידות יחסית קרינה פלואורסצנטית (RFU) ± חציון החציון מוחלטת הסטייה (MAD). הצבעים כחול ולבן מייצג את איגוד אותות נמוך מ 4,000 RFU (רקע); הצבע האדום מייצג את אותות ≥4, 000 RFU (חיובי מחייב). F: נקבה; M: זכר (n = 20). איור זה שוחזר מ- Bello-גיל, ד ואח. 28. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Glycan
מזהה (#)		 מבנה השם המקובל חציון, MAD כמו RFU מספר עכברים מציג RFU ≥4000 (%)
60 6-O-Su-Galβ-spb 61113 1156 100
271 Galβ1-6Galβ1-4Glcβ-sp 53622 1934 100
802 Galβ1-3GalNAc(furc) β-sp 51348 2324 100
176 3-O-Su-Galβ1-4(6-O-Su) Glcβ-sp 43008 9342 100
166 GlcAβ1-6Galβ-sp 39105 2993 85
150 3-O-Su-Galβ1-3GalNAcα-sp 37943 3232 100
437 GalNAcα1-3(Fucα1-2) Galβ1-3GalNAcβ-sp A(type 4) 33886 3193 90
125 6-בסון-Galβ1-4GlcNAcβ-sp 32674 5389 95
154 3-O-Su-Galβ1-3GlcNAcβ-sp 32651 3954 100
177 3-O-Su-Galβ1-4(6-O-Su) GlcNAcβ-sp 32496 7215 100
287 3-O-Su-Galβ1-3(Fucα1-4) GlcNAcβ-sp סולה 20063 4962 95
234 Galβ1-4(Fucα1-3) GlcNAcβ-sp Lex 13573 2635 80

טבלה 1: מבנים glycan הדרגה העליונה מוכר על ידי נוגדנים טבעיים של עכברים BALB/c. Glycans עם איגוד אותות מעל 4,000 RFU לפחות 80% בחן עכברים (n = 20). ב'אומר sp מרווח aminoethyl, aminopropyl או glycyl. cfuranose; כל monosaccharides אחרים נמצאים בטופס pyranose; שאריות Fuc יש תצורה L, כל monosaccharides אחרים - D-תצורה. טבלה זו שונתה מ- Bello-גיל, ד ואח. 28.

משלים טבלה 1: רשימת glycans, שלהם מחייב נוגדנים במחזור טבעי (IgM + IgG) של עכברים BALB/c (n = 20), ביטוי יחידות קרינה פלואורסצנטית היחסי (RFU) ± החציוני MAD, וכן מספר החיות העולה על לחתוך (≥4000 RFU). השולחן הזה שוחזר מ- Bello-גיל, ד ואח. 28. אנא לחץ כאן כדי להוריד את השולחן הזה

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מיקרו-מערכים Glycan הפכו להיות כלי הכרחי לימוד אינטראקציות חלבון-glycan40. העבודה הנוכחית מתאר פרוטוקול מבוסס על טכנולוגיית PGA ללמוד את הרפרטואר של מחזורי של נוגדנים אנטי-פחמימות בעכברים BALB/c. מאז PGA מציעה את האפשרות מסך לכמויות גדולות של glycans ביולוגית לא ידוע, זה גילוי נוח במיוחד כלי13,15,28. השיטה המוצעת מציעה את האפשרות למדוד, באותה סביבה נסיוני, מאות מבנים glycan באמצעות כמות מופחתת של מדגם סרולוגית (50 µL). . זה קריטי במיוחד במקרה של חיות קטנות (נפח הדם במחזור קטן), או כאשר יש צורך לחלץ את הדם מספר פעמים של אותה חיה ניסיוני.

הפגנו, כתוצאות ייצוגית, כי אין להתייחס זהים גנטית עכברים כמקבילות אימונולוגי; . כי הם מפתחים דפוסים שונים של נוגדנים אנטי-פחמימות טבעי (רק 12 glycan specificities היו והתפאורה). רמות סרולוגית עבור שאר הרפרטואר של נוגדנים אנטי-פחמימות טבעי שונות במידה ניכרת בין החיות שנבדקו. ניתוח של microbiota הבטן של חיות המפגרים41 יכול להסביר את הטרוגניות42,43,44,45,46. אם הייצור של נוגדנים אנטי טבעי-glycan מתווך על ידי גירוי antigenic של microbiota, זה שונה בין עכברים המפגרים41, יחודיות בסדר של נוגדנים אלה לא יהיו זהים.

החיסרון העיקרי לפיתוח PGA הוא הגישה glycan מוגדרים היטב מבני40,47. Glycans המיוצר במערכות ביולוגיות הן הטרוגנית40,47,48, ביוסינטזה שלהם מסתמך על הביטוי דיפרנציאלית של אנזימים פחמימות, וכתוצאה מכך תערובות הטרוגניות של glycoforms, כל אחד עם הפעילות הפיזיולוגית ברורים47. הרכב מורכב והתצורה של glycans נוכח המערכות הביולוגיות להפוך שלהם הפקות מאתגרות40,47,48. יחד עם כימותרפיה-אנזימטי סינתזה, glycans מבודד ממקורות טבעיים ימשיך להיות המקור העיקרי של glycans פיתוח מערכים40. נמוך סינתטי תשואות ולעשות תהליך טיהור מורכב מ glycoproteins ו glycosphingolipids ייצור יעיל glycans בכללותו קנה מידה קשה40,47,48. לפיכך, הזמינות ומחירים של glycans להמשיך להיות תנאי מגביל מאוד כדי להרחיב את השימוש PGA ככלי גילוי.

בנוסף, בתוך הפרוטוקול, שלבים קריטיים בעיקר הקשורים להתפלגות הנכון של פתרונות (סרום, נוגדנים משניים) על פני glycochip צריך להתבצע בזהירות. המתודולוגיה דורשת, לפחות 1 מ"ל של פתרונות אלו, למשל להשרות בכל תחומי השטח glycochip יבש. דבר זה חיוני כדי להשיג מינימלי ההבדלים בין glycan משכפל וגם למנוע רקע מופרז במהלך כמת.

למרות המגבלות שהוזכרו, PGA הוא כלי מאוד רגיש גישות הקשורים ללמוד אינטראקציות חלבון-glycan40, או ללמוד את הרפרטואר של נוגדנים אנטי-glycan הגדרה מסוימת ניסויית או תנאי13, 15,28. מחקר זה יכול להיות אקסטרפולציה מינים שונים (כולל דוגמאות אנושי) 13,15,23,28, מתן מתודולוגיה רב-תכליתי עבור זיהוי הרפרטואר של מחזורי נוגדנים אנטי-פחמימות.

אנו צופים גם לפוטנציאל גישה זו יביא באבחון מוקדם, נגזר הטיפול בחלק מן התנאים פתולוגי שבו נוגדנים ביים למבנים glycan נראה תפקיד חשוב.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Nailya Khasbiullina, אלכסיי Nokel עובדים של Semiotik LLC, אשר הוא הספק של glycochips השתמשו במחקר זה.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי "Fondo דה Investigaciones Sanitarias" (FIS) מענק PI13/01098 של קרלוס השלישי מכון בריאות, משרד הבריאות הספרדי. DB-G היה נהנו ממיקום מחקר פוסט דוקטורט במימון האיחוד האירופי תכנית המסגרת השביעית (האיחוד FP7/2007-2013) תחת גרנט הסכם 603049 (TRANSLINK). עבודתו של NK, NS, ו NB נתמך על ידי מענק #14-50-00131 של קרן המדע הרוסי. DB-G רוצה להביע את תודתי מרתה מתפוצץ, ג'יי פבלו סלבדור אנה Sanchis לסיוע טכני מעולה ושל אלכסנדר Rakitko לקבלת סיוע בניתוח סטטיסטי. עם התמיכה של "פלה דה Doctorats Industrials de la Secretaria d'Universitats אני Recerca דל Departament d'Empresa אני Coneixement de la Generalitat דה קטלוניה (להעניק מספר 2018 DI 021). אנו מודים סרקא תכנית / Generalitat דה קטלוניה לתמיכה מוסדית.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Antibodies
biotinylated goat anti-human Igs Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA Ref. #: 31782
biotinylated goat anti-mouse IgM + IgG Thermo Fisher Scientific Ref. #: 31807
Equipment
Robotic Arrayer sciFLEXARRAYER S5  Scienion AG, Berlin, Germany http://www.scienion.com/products/sciflexarrayer/
Stain Tray (slide incubation chamber) Simport, Beloeil, QC, Canada Ref. #: M920-2
Centrifuge Eppendorf, Hamburg, Germany  Ref. #: 5810 R
Pipettes Gilson, Middleton, WI, USA http://www.gilson.com/en/Pipette/
Slide Scanner  PerkinElmer, Waltham, MA, USA ScanArray GX Plus 
Shaking incubator Cole-Parmer, Staffordshire, UK Ref. #: SI50
Biological samples
BALB/c mice sera This paper N/ A
Complex Immunoglobulin Preparation (CIP) Immuno-Gem, Moscow, Russia http://www.biomedservice.ru/price/goods/1/17531
Chemicals, Reagents and Glycans 
Glycan library Institute of Bioorganic Chemistry (IBCh), Moscow, Russia N/ A
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich, St. Louis, MO,  Ref. #: A9418
Ethanolamine Sigma-Aldrich Ref. #: 411000
Tween-20 Merck Chemicals & Life Science S.A., Madrid, Spain Ref. #: 655204
Phospahte buffered saline (PBS) VWR International Eurolab S.L, Barcelona, Spain Ref. #: E404
Sodium azide Sigma-Aldrich Ref. #: S2002
Streptavidin Alexa Fluor 555 conjugate  Thermo Fisher Scientific Ref. #: S21381
Streptavidin Cy5 conjugate GE Healthcare, Little Chalfont, Buckinghamshire, UK Ref. #: PA45001
Materials
N-hydroxysuccinimide-derivatized glass slides H  Schott-Nexterion, Jena, Germany Ref. #: 1070936
Whatman filter paper  Sigma-Aldrich Ref. #: WHA10347509
1.5 mL tubes Eppendorf  Ref. #: 0030120086
Software and algorithms
ScanArray Express Microarray Analysis System PerkinElmer http://www.per
kinelmer.com/microarray
Hierarchical Clustering Explorer application University of Maryland, MD, USA http://www.cs.umd.edu/hcil/hce/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Karlsson, G. B., Fouchier, R. A., Phogat, S., Burton, D. R., Sodroski, J., Wyatt, R. T. The challenges of eliciting neutralizing antibodies to HIV-1 and to influenza virus. Nat Rev Microbiol. 6 (2), 143-155 (2008).
  2. Lu, L. L., Suscovich, T. J., Fortune, S. M., Alter, G. Beyond binding: antibody effector functions in infectious diseases. Nat Rev Immunol. 18 (1), 46-61 (2017).
  3. Bebbington, C., Yarranton, G. Antibodies for the treatment of bacterial infections: current experience and future prospects. Curr Opin Biotech. 19 (6), 613-619 (2008).
  4. Murphy, K., Travers, P., Walport, M. The complement system and innate immunity. Janeway's Immunobiology. , 7th, Garland Science. New York. 61-80 (2008).
  5. Botto, M., Kirschfink, M., Macor, P., Pickering, M. C., Wurzner, R., Tedesco, F. Complement in human diseases: lessons from complement deficiencies. Mol Immunol. 46 (14), 2774-2783 (2009).
  6. Borrok, M. J., et al. Enhancement of antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity by endowing IgG with FcαRI (CD89) binding. MAbs. 7 (4), 743-751 (2015).
  7. Weiner, L. M., Murray, J. C., Shuptrine, C. W. Antibody-based immunotherapy of cancer. Cell. 148 (6), 1081-1084 (2012).
  8. Ricklin, D., Hajishengallis, G., Yang, K., Lambris, J. D. Complement: a key system for immune surveillance and homeostasis. Nat Immunol. 11 (9), 785-797 (2010).
  9. Prechl, J. A generalized quantitative antibody homeostasis model: antigen saturation, natural antibodies and a quantitative antibody network. Clin Transl Immunology. 6 (2), e131 (2017).
  10. Vojdani, A. Antibodies as predictors of complex autoimmune diseases. Int J Immunopath Ph. 21 (2), 267-278 (2008).
  11. Liu, W., Peng, B., Lu, Y., Xu, W., Qian, W., Zhang, J. Y. Autoantibodies to tumor-associated antigens as biomarkers in cancer immunodiagnosis. Autoimmun Rev. 10 (6), 331-335 (2011).
  12. Suurmond, J., Diamond, B. Autoantibodies in systemic autoimmune diseases: specificity and pathogenicity. J Clin Invest. 125 (6), 2194-2202 (2015).
  13. Bovin, N., et al. Repertoire of human natural anti-glycan immunoglobulins. Do we have auto-antibodies? Biochim Biophys Acta. 1820 (9), 1373-1382 (2012).
  14. de los Rios, M., Criscitiello, M. F., Smider, V. V. Structural and genetic diversity in antibody repertoires from diverse species. Curr Opin Struc Biol. 33, 27-41 (2015).
  15. Pochechueva, T., et al. Comparison of printed glycan array, suspension array and ELISA in the detection of human anti-glycan antibodies. Glycoconjugate J. 28 (8-9), 507-517 (2011).
  16. Shilova, N., Navakouski, M., Khasbiullina, N., Blixt, O., Bovin, N. Printed glycan array: antibodies as probed in undiluted serum and effects of dilution. Glycoconjugate J. 29 (2-3), 87-91 (2012).
  17. Manimala, J. C., Roach, T. A., Li, Z., Gildersleeve, J. C. High-throughput carbohydrate microarray profiling of 27 antibodies demonstrates widespread specificity problems. Glycobiology. 17 (8), 17C-23C (2007).
  18. Jacob, F., et al. Serum anti-glycan antibody detection of non-mucinous ovarian cancers by using a printed glycan array. Int. J. Cancer. 130 (1), 138-146 (2012).
  19. Lewallen, D. M., Siler, D., Iyer, S. S. Factors affecting protein-glycan specificity: effect of spacers and incubation time. ChemBioChem. 10 (9), 1486-1489 (2009).
  20. Oyelaran, O., Li, Q., Farnsworth, D., Gildersleeve, J. C. Microarrays with varying carbohydrate density reveal distinct subpopulations of serum antibodies. J. Proteome Res. 8 (7), 3529-3538 (2009).
  21. Pochechueva, T. Multiplex suspension array for human anti-carbohydrate antibody profiling. Analyst. 136 (3), 560-569 (2011).
  22. Chinarev, A. A., Galanina, O. E., Bovin, N. V. Biotinylated multivalent glycoconjugates for surface coating. Methods Mol Biol. 600, 67-78 (2010).
  23. Huflejt, M. E. Anti-carbohydrate antibodies of normal sera: findings, surprises and challenges. Mol Immunol. 46 (15), 3037-3049 (2009).
  24. Buchs, J. P., Nydegger, U. E. Development of an ABO-ELISA for the quantitation of human blood group anti-A and anti-B IgM and IgG antibodies. J Immunol Methods. 118 (1), 37-46 (1989).
  25. de Jager, W., Rijkers, G. T. Solid-phase and bead-based cytokine immunoassay: a comparison. Methods. 38 (4), 294-303 (2006).
  26. Galanina, O. E., Mecklenburg, M., Nifantiev, N. E., Pazynina, G. V., Bovin, N. V. GlycoChip: multiarray for the study of carbohydrate binding proteins. Lab Chip. 3 (4), 260-265 (2003).
  27. Willats, W. G., Rasmussen, S. E., Kristensen, T., Mikkelsen, J. D., Knox, J. P. Sugar-coated microarrays: a novel slide surface for the high-throughput analysis of glycans. Proteomics. 2 (12), 1666-1671 (2002).
  28. Bello-Gil, D., Khasbiullina, N., Shilova, N., Bovin, N., Mañez, R. Repertoire of BALB/c mice natural anti-Carbohydrate antibodies: mice vs. humans difference, and otherness of individual animals. Front Immunol. 8, 1449 (2017).
  29. Pazynina, G., et al. Synthetic glyco-O-sulfatome for profiling of human natural antibodies. Carbohydr Res. 445, 23-31 (2017).
  30. Ryzhov, I. M., Korchagina, E. Y., Popova, I. S., Tyrtysh, T. V., Paramonov, A. S., Bovin, N. V. Block synthesis of A (type 2) and B (type 2) tetrasaccharides related to the human ABO blood group system. Carbohydr Res. 430, 59-71 (2016).
  31. Ryzhov, I. M., et al. Function-spacer-lipid constructs of Lewis and chimeric Lewis/ABH glycans. Synthesis and use in serological studies. Carbohyd Res. 435, 83-96 (2016).
  32. Pazynina, G. V., Tsygankova, S. V., Sablina, M. A., Paramonov, A. S., Tuzikov, A. B., Bovin, N. V. Stereo- and regio-selective synthesis of spacer armed α2-6 sialooligosaccharides. Mendeleev Commun. 26 (5), 380-382 (2016).
  33. Pazynina, G. V., Tsygankova, S. V., Sablina, M. A., Paramonov, A. S., Formanovsky, A. A., Bovin, N. V. Synthesis of blood group pentasaccharides ALey, BLey and related tri- and tetrasaccharides. Mendeleev Commun. 26 (2), 103-105 (2016).
  34. Severov, V. V., Pazynina, G. V., Ovchinnikova, T. V., Bovin, N. V. The synthesis of oligosaccharides containing internal and terminal Galβ1-3GlcNAcβ fragments. Russian J. Bioorgan. Chem. 41 (2), 147-160 (2015).
  35. Pazynina, G. V., Tsygankova, S. V., Bovin, N. V. Synthesis of glycoprotein N-chain core fragment GlcNAcβ1-4(Fucα1-6)GlcNAc. Mendeleev Commun. 25 (4), 250-251 (2015).
  36. Solís, D., et al. A guide into glycosciences: How chemistry, biochemistry and biology cooperate to crack the sugar code. Biochim Biophys Acta. 1850 (1), 186-235 (2015).
  37. Pazynina, G. V., et al. Divergent strategy for the synthesis of α2-3-Linked sialo-oligosaccharide libraries using a Neu5TFA-(α2-3)-Gal building block. Synlett. 24 (02), 226-230 (2013).
  38. Blixt, O., et al. Printed covalent glycan array for ligand profiling of diverse glycan binding proteins. P Natl Acad Sci USA. 101 (49), 17033-17038 (2004).
  39. Liu, Y., et al. The minimum information required for a glycomics experiment (MIRAGE) project: improving the standards for reporting glycan microarray-based data. Glycobiology. 27 (4), 280-284 (2017).
  40. Song, X., Heimburg-Molinaro, J., Cummings, R. D., Smith, D. F. Chemistry of natural glycan microarrays. Curr Opin Chem Biol. 18, 70-77 (2014).
  41. Hoy, Y. E., et al. Variation in taxonomic composition of the fecal microbiota in an inbred mouse strain across individuals and time. PLoS One. 10 (11), e0142825 (2015).
  42. D'Argenio, V., Salvatore, F. The role of the gut microbiome in the healthy adult status. Clin Chim Acta. 451 (Pt A), 97-102 (2015).
  43. Khasbiullina, N. R., Bovin, N. V. Hypotheses of the origin of natural antibodies: a glycobiologist's opinion. Biochemistry (Mosc). 80 (7), 820-835 (2015).
  44. Butler, J. E., Sun, J., Weber, P., Navarro, P., Francis, D. Antibody repertoire development in fetal and newborn piglets, III. Colonization of the gastrointestinal tract selectively diversifies the preimmune repertoire in mucosal lymphoid tissues. Immunology. 100 (1), 119-130 (2000).
  45. Bos, N. A., et al. Serum immunoglobulin levels and naturally occurring antibodies against carbohydrate antigens in germ-free BALB/c mice fed chemically defined ultrafiltered diet. Eur J Immunol. 19 (12), 2335-2339 (1980).
  46. van der Heijden, P. J., Bianchi, A. T., Heidt, P. J., Stok, W., Bokhout, B. A. Background (spontaneous) immunoglobulin production in the murine small intestine before and after weaning. J Reprod Immunol. 15 (3), 217-227 (1989).
  47. Krasnova, L., Wong, C. H. Understanding the chemistry and biology of glycosylation with glycan synthesis. Annu Rev Biochem. 85, 599-630 (2016).
  48. Overkleeft, H. S., Seeberger, P. H., et al. Chemoenzymatic synthesis of glycans and glycoconjugates. Essentials of Glycobiology [Internet]. Varki, A., et al. , 3rd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor (NY). Chapter 54 2015-2017 (2017).

Tags

אימונולוגיה זיהום גיליון 144 דפוס של נוגדנים טבעיים במחזור נוגדנים anti-glycan glycan specificities glycochips מודפסים glycan מערך PGA עכברים
מערך Glycan המודפס: טכניקה רגישה לניתוח של הרפרטואר של מחזורי נוגדנים אנטי-פחמימות בבעלי חיים קטנים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Olivera-Ardid, S., Khasbiullina, N., … More

Olivera-Ardid, S., Khasbiullina, N., Nokel, A., Formanovsky, A., Popova, I., Tyrtysh, T., Kunetskiy, R., Shilova, N., Bovin, N., Bello-Gil, D., Mañez, R. Printed Glycan Array: A Sensitive Technique for the Analysis of the Repertoire of Circulating Anti-carbohydrate Antibodies in Small Animals. J. Vis. Exp. (144), e57662, doi:10.3791/57662 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter