Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Utskrevne Glycan matrise: En følsom teknikk for analyse av repertoaret av sirkulerende anti-karbohydrater antistoffer i små dyr

Published: February 14, 2019 doi: 10.3791/57662
Automatic Translation
*1, *2,3, 3, 2, 2, 2, 2, 2, 2,4, 1, 1,5
1Infectious Pathology and Transplantation Division, Bellvitge Biomedical Research Institute (IDIBELL), 2Shemyakin-Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry (IBCh), Russian Academy of Sciences, 3Semiotik LLC, 4Auckland University of Technology, 5Intensive Care Department, Bellvitge University Hospital
* These authors contributed equally

Summary

Dette arbeidet viser potensialet i trykte glycan matrise (PGA) teknologi for analyse av sirkulerende anti-karbohydrater antistoffer i liten dyrene.

Abstract

Repertoaret av sirkulerende anti-karbohydrater antistoffer av en gitt person er ofte forbundet med statusen immunologiske. Ikke bare den personlige immun tilstanden avgjør suksessen bekjempe interne og eksterne potensielle trusselen signaler, men også eksistensen av et bestemt mønster av sirkulerende anti-glycan antistoffer (og deres serologisk nivå variasjon) kan være en betydelig markør utbruddet og progresjon av visse patologiske forhold. Her beskriver vi en trykt Glycan matrise PGA-basert metode som tilbyr muligheten til å måle hundrevis av glycan mål med svært høy følsomhet; med en minimal mengde utvalget, en vanlig begrensning når liten dyrene (rotter, mus, hamster, etc.) er brukt som modeller adresse aspekter av menneskelige sykdommer. Som et representativt eksempel på denne tilnærmingen viser vi resultatene fra analysen av repertoaret av naturlig anti-glycan antistoffer i BALB/c mus. Viser vi at hver BALB/c musen involvert i studien, til tross for å være genetisk identisk og vedlikeholdt under like forhold, utvikler et bestemt mønster av naturlig anti-karbohydrater antistoffer. Dette arbeidet hevder å utvide bruken av PGA teknologien å undersøke repertoar (særegenheter) og nivåer av sirkulerende anti-karbohydrater antistoffer, både i helse og under en patologisk tilstand.

Introduction

Antistoffer spille en sentral rolle i vårt forsvar mot invaderende patogener ved å nøytralisere direkte virus1,2 og bakterier2,3, ved å aktivere komplement systemet4,5 og styrking av fagocytose6. I tillegg er de grunnleggende elementene i kreft målretting og eliminering av ondartede celler7og homeostase vedlikehold8,9.

Lidelser av immunsystemet kan føre til autoimmune og inflammatoriske sykdommer10 og kreft11. Alle disse pathological betingelser krever ideelt en rask diagnose for en effektiv behandling. Ved autoimmune sykdommer er serologisk tilstedeværelsen av autoantistoffer i de fleste tilfeller en prediktor for diagnose av autoimmunitet10,12. Disse antistoffene reagere med celleoverflaten ekstracellulære autoantigens, og de er ofte tilstede i mange år før presentasjonen av autoimmune sykdommer10,12. Immun mankoen og kreft er også diagnostisert med blodprøver at enten måle nivået av immun elementer som antistoffer eller deres funksjonelle aktiviteten11.

Identifikasjon av repertoaret av sirkulerende antistoffer og serologisk nivåene er viktig å angi en prognose og evaluere utviklingen av alle nevnte pathological betingelser. Vi har tidligere vist potensialet i PGA teknikk for analyse av sirkulerende antistoffer i forskjellige dyrearter13-16, minimere bruken av store mengder serologisk prøver, unngå problemet forbundet med antistoffer kryssreaktivitet17 og tillater høy gjennomstrømming profilering av en omfattende repertoar av antistoffer15.

Glycan-baserte immunanalyser er hovedsakelig betinget, blant andre faktorer, opprinnelse og produksjon av karbohydrater, som bestemmer affinitet og bindende ligander15,18,19,20 ,21. Glycan-basert immunanalyser kan utvikles i suspensjon (mikrosfærer)15,21,22 eller flat-aktivert overflater15,21,22, 23,24. Sist inkluderer ELISA (den mest konvensjonelle disse metodene) og PGA. Det er ikke mye data sammenligne disse metoder i de samme eksperimentelle innstilling15,25,26,27. Vi har tidligere sammenlignet effekten og selektivitet av disse immunanalyser til profil anti-glycan antistoffer i individuelle humant plasma prøver15. For noen antistoffer som de rettet mot anti-A/B-blodtype, alle immunanalyser finner dem med statistisk signifikans og de korrelert positivt med hverandre15,18,21. I mellomtiden anti-P1 antistoffer ble hovedsakelig oppdaget av PGA med høyeste discriminative makt, og det var ingen sammenheng i bestemmelser laget av forskjellige glycan-baserte immunanalyser15,18, 21. disse forskjellene mellom metoder var hovedsakelig knyttet til antistoff/antigen forhold og glycan orientering15. ELISA og hjuloppheng matriser er mer utsatt for uspesifikke bindende enn PGA fordi det er et overskudd av antigen over antistoffer i disse metodene15. Dessuten er retningen på glykaner i PGA mer begrenset enn i ELISA og hjuloppheng matriser15. ELISA er praktisk når studien inkluderer en begrenset panel av glykaner. Suspensjon matriser tilbyr ELISA større fleksibilitet når det gjelder analysen rekonfigurering. PGA er svært praktisk for oppdagelsen tilnærminger15,18,21,28. Til tross for disse klare fordeler og ulemper, kan de tre nevnte immunanalyser brukes til å studere ulike aspekter av glycan-antistoff interaksjoner. Det endelige målet av studien er en guide utvalget av mer egnet metodikken.

I dag fungerer som mål å utvide bruken av PGA teknologi for analyse av repertoaret av sirkulerende anti-glycan antistoffer i liten dyrene. Resultatet representant presenterer vi her en detaljert protokoll for å vurdere repertoaret av naturlig anti-karbohydrater antistoffer i voksen BALB/c mus av PGA.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Glycochips produksjon

  1. Microarray forberedelse
    1. Skrive ut glykaner (50 mM) og polysakkarider (10 µg/mL) i 300 mM fosfat bufrede saltvann (PBS, pH 8.5) i 6 replikerer på N-hydroxysuccinimide-derivatized glass lysbilder, bruker ikke-kontakt robot arrayer (slipp volum ~ 900 pL). Hvert lysbilde inneholder 4 forskjellige blokker sub matriser (figur 1A, i farger) gjentas 6 ganger. Hver enkelt sub rekke er dannet av 112 annerledes glycan flekker, inkludert kontroller (8 rader × 14 kolonner) (figur 1B).
      Merk: Glycan-relatert informasjon er gitt i supplerende tabell 1. Glycan-bibliotek som brukes til utskrift microchips er resultatet av en langsiktig syntetiske innsats av IBCh team; Eksempler på syntese er beskrevet i publikasjoner som hører29,30,31,32,33,34,35,36 ,37,38. Glycan biblioteket inkludert blodtype antigener og noen av de ofte forekommende terminal oligosaccharides, i tillegg til kjernen motiver av pattedyr N - og O-tilknyttede glykoproteiner og glycolipids, tumor-assosiert karbohydrater antigener, og polysakkarider fra patogene bakterier.
    2. Inkuber lysbildene i fuktighet boksen (relativ fuktighet ~ 70%) ved romtemperatur (25 ° C) 1t.
    3. Blokkerer microarrays: ruge lysbilder for 1,5 t med blokkering buffer ved romtemperatur (100 mM borsyre, 25 mM ethanolamine, 0,2% (v/v) Tween-20 i ultrapure vann).
    4. Vask glycochip med ultrapure vann og tørk den fly.
  2. Glycochip kvalitetskontroll
    1. Analysere to microarrays fra hvert parti med 1mg/mL løsning av komplekse immunglobulin forberedelse (CIP, som inneholder IgG og IgM, IgA), 10 µg/mL løsningen av biotinylated geit anti-immunglobuliner som en sekundær antistoff (IgM + IgG + IgA), etterfulgt av 1 µg/mL løsning av den tilsvarende fluorescerende streptavidin konjugert (via protokollen beskrevet nedenfor, se trinn 2).
    2. Skanne og analysere glycochips (se trinn 3, analyse av glycan matrise).
    3. Bruk microarray bunker med intra - og inter - chip korrelasjon høyere enn 0,9.

2. Glycan matrise teknikk

  1. Klargjør følgende vandige løsninger (i ultrapure vann) og lagre dem ved romtemperatur (25 ° C):
    • Buffer-1: 1% (w/v) bovin serum albumin (BSA) i PBS, 1% (v/v) Tween-20 og 0,01% (w/v) NaN3
    • Buffer-2: 1% (w/v) BSA i PBS, 0,1% (v/v) Tween-20 og 0,01% (w/v) NaN3.
    • Buffer-3: 0,1% (v/v) Tween-20 i PBS.
    • Buffer-4: 0,001% (v/v) Tween-20 i PBS.
  2. Glycochip og prøve forberedelse
    1. Sette oppbevaringsboks med lysbildene på bordet til de når romtemperatur (25 ° C).
      Merk: Bruk Pudderfrie gummihansker. Glycochip må bli manipulert av nederst på objektglass, hvor strekkoden er plassert. Strekkoden vil hjelpe deg å identifisere retten, unngå kontakt med overflaten hvor glykaner er skrevet ut.
    2. Åpne boksen, ta på glycochip og plassere den i inkubasjon chamber (25 ° C), allerede klimaanlegg våt filter papir å holde luftfuktigheten konstant inne i kammeret.
    3. I mellomtiden fortynne mus serum Buffer-1 (1:20) i 1,5 mL rør. Homogenize serum løsningen (5 s) med en vortex mikser.
      Merk: Volumet måtte helt dekket en enkelt glycochip overflate er omtrent 1 mL.
    4. Etter homogenisering, ruge utvannet serum ved 37 ° C i 10 min i et vannbad å unngå immunglobulin aggregering. Sentrifuge rør for 3 min på 10.000 x g og 25 ° C, samle nedbryting og forkaste utfelt materiale.
    5. Sted glycochip nøye i inkubasjon kammeret. Inkuber det i 15 min ved 25 ° C med 1 mL av Buffer-3 for å fjerne gjenværende materiale på overflaten av glycochip.
    6. Hold glycochip i vertikal posisjon og rewash det med noen dråper Buffer-3 bruker en plast Pasteur pipette. Fjern forsiktig bufferen fra glycochip overflaten med filter papir.
  3. Reaksjon: antistoffer bindende
    1. Plasser glycochip i inkubasjon kammeret. Utvannet serum prøven fordelt glycochip overflaten ved hjelp av brønnene. Inkuber med orbital agitasjon (30 rpm) på 37 ° C for 1,5 h. Kontroller at alle tørt område av glycochip overflaten er dekket av utvannet serum utvalget med spissen av pipette.
    2. Fjerne enhver overflødig prøven og fordype glycochip i 5 minutter i Buffer-3 på 25 ° C. Deretter flytter du glycochip til en beholder med Buffer-4 (5 min) og endelig vask (5 min) glycochip med ultrapure vann. Sentrifuge glycochip for 1 min på 175 x g og 25 ° C til fjern væsken.
  4. Detection: sekundær antistoff
    1. Plasser glycochip i inkubasjon kammeret. Spredt over glycochip overflaten en løsning (5 µg/mL) geit anti-mus (IgG + IgM) konjugert til biotin i Buffer-2. Inkuber med orbital agitasjon (30 rpm) på 37 ° C 1t.
    2. Fjern ubundet brøken og gjenta vask.
    3. Etter sentrifugering, ruge på glycochip i mørket ved 25 ° C i 45 min (30 rpm) med 2 µg/mL den tilsvarende fluorochrome-merket streptavidin (i Buffer-2).
    4. I mørket, Fjern ubundet brøken og gjenta vask.
    5. Tørr på glycochip med fly.
      Merk: Glycochip skal skannes så snart som mulig. Men hvis det er umulig å søker umiddelbart etter farging, glycochips kan lagres i et kjølig og tørt sted i mørket.

3. analyse av Glycan matrise

  1. Skanne matrisen
    1. La glycochip på tabellen til den når romtemperatur i mørket. Samtidig, slå på lysbildet skanneren og laser (eksitasjon bølgelengden til 633 nm).
    2. Holder microarray, skyv glycochip inn i sporet til det berører bakenden.
    3. Skanner glycochip («enkel kjøre skanning"), og lagre søket som en". TIFF"fil.
  2. Matrise kvantifisering
    1. Kvantifisere matrisen bruker ScanArray analysesystem. Åpne tidligere skannede bilder, ved å velge "Fil" i "Konfigurer & fil gruppen" i hovedvinduet (figur 1B-D)
    2. Laste inn tilsvarende matrise filmal i GAL format (disponering av trykte glykaner på av objektglass) (figur 1 c).
    3. Justere GAL mal ved nøye justere matrise (rutenett) med stedene i bildet og starte kvantifisering (figur 1 d).
    4. Velg parameterne kvantifisering:
      • Kvantifisering type: Kjør lett Quant.
      • Kvantifisering metode: fast sirkel
      • Auto finne steder: unclick alle alternativer
      • Normalisering metode: LOWESS (lokalt vektet Scatter tegne jevne).
    5. Lagre kvantifisert dataene som ". CSV"fil (figur 1 d). Overføre dataene til en felles regnearkfil ved hjelp av Microsoft Excel eller et annet passende program.
    6. Bruke den interquartile rekkevidden (IQR) som den viktigste statistiske metoden: beregne medianen (kvartil 2) til alle signaler for hver ligand og interquartile avvik (75 og 25 persentil eller øvre og nedre kvartiler Q3 og Q1 henholdsvis).
    7. Utføre interaktiv utforsking av data ved hjelp av en hierarkisk Clustering Explorer-programmet.
    8. Bruk klynging parametere: gjennomsnittlig sammenhengen (UPGMA) og euklidsk avstand som likheten avstand mål. Utføre hierarkisk klynger av rader uten normalisering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Her presenterer vi et sammendrag av representant resultatene fra kvantifisering av repertoaret av naturlig anti-glycan antistoffer i en befolkning på 20 BALB/c mus. Glycochips brukt i denne studien inneholdt 419 forskjellige glycan strukturer. De fleste glykaner ble syntetisert som -CH2lm2lm2NH2 avstandsholder-bevæpnet O-glykosider, i flere tilfeller som -CH2lm2NH2 eller -NHCOCH2NH2 glykosider. Alle glycan strukturer ble preget av høy oppløsning (700 - eller 800 MHz) NMR spektroskopi, renset og testet av HPLC, som indikerer deres > 95% renhet. Vi har samtidig bestemt IgM + IgG anti-glycan antistoffer på grunn av en begrensning i musen serum. I PGA vurderte vi verdier over 4000 RFU som et positivt signal antistoff bindingen (denne verdien er ~ 10% av de øverste glykaner RFU). Resultatene presenteres i dette arbeidet følger det meste av retningslinjer for rapportering glycan microarray-basert data39. Bare 17% av karbohydrater strukturer vist ≥4, 000 RFU i PGA (figur 2, i rødt). De fleste av glycan strukturer i glycochips ikke ble gjenkjent av repertoaret av sirkulerende anti-glycan antistoffer av BALB/c mus (figur 2, i blått og hvitt)28. Bevarte mønster av naturlig anti-karbohydrater antistoffer av BALB/c inkludert 12 forskjellige glycan særegenheter, med svært høy median signal intensiteter av antistoffer binding (≥10, 000 RFU tabell 1)28.

Figure 1
Figur 1 : Skjematisk fremstilling (ikke i målestokk) av glycan matrise konfigurasjon, utskrift og analyse. (A) trykt microchips er utviklet med et bibliotek av 419 forskjellige glycan strukturer, etterfulgt av oppdagelsen med et passende fluorescently merket sekundære antistoff. Hvert lysbilde inneholder 4 forskjellige blokker sub matriser (i farger), gjentas 6 ganger. Hver enkelt sub rekke er dannet av 112 annerledes glycan flekker (8 rader × 14 kolonner), inkludert kontroller. (B) en representative eksempel bilder Hentet fra microchip skanning bruker en fluorescens skanner (tredje del av bildet). (C) prosessen med å justere "rutenett" til steder i hvert enkelt sub array (mal justering under kvantifisering). (D) til fluorescens registreres for hver spot og resultatene overføres til en felles regnearkfil. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 : Repertoar av naturlige sirkulerende anti-karbohydrater antistoffer av BALB/c mus. Musen serumprøver (1:20) ble inkubert med glycochips og skannet med en ScanArray-leser. Dataene ble analysert med et microarray analysesystem og resultater ble uttrykt i relativ fluorescens enheter (RFU) som median ± median absolutt avvik (MAD). Blå og hvit fargene representerer bindende signaler lavere enn 4000 RFU (bakgrunn). rød farge representerer signaler ≥4, 000 RFU (positiv bindende). F: kvinne. M: mannlige (n = 20). Dette tallet er gjengitt fra Bello-Gil, D. et al. 28. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Glycan
ID (#)		 Struktur Fellesnavn Median og MAD som RFU Antall mus viser RFU ≥4000 (%)
60 6-O-Su-Galβ-spb 61113 1156 100
271 Galβ1-6Galβ1-4Glcβ-sp 53622 1934 100
802 Galβ1-3GalNAc(furc) β-sp 51348 2324 100
176 3-O-Su-Galβ1-4(6-O-Su) Glcβ-sp 43008 9342 100
166 GlcAβ1-6Galβ-sp 39105 2993 85
150 3-O-Su-Galβ1-3GalNAcα-SP 37943 3232 100
437 GalNAcα1-3(Fucα1-2) Galβ1-3GalNAcβ-sp A(type 4) 33886 3193 90
125 6-Bn-Galβ1-4GlcNAcβ-sp 32674 5389 95
154 3-O-Su-Galβ1-3GlcNAcβ-SP 32651 3954 100
177 3-O-Su-Galβ1-4(6-O-Su) GlcNAcβ-sp 32496 7215 100
287 3-O-Su-Galβ1-3(Fucα1-4) GlcNAcβ-sp SuLeen 20063 4962 95
234 Galβ1-4(Fucα1-3) GlcNAcβ-sp Lex 13573 2635 80

Tabell 1: topp rangering glycan strukturer anerkjent av naturlige antistoffer av BALB/c mus. Glykaner med binding signaler over 4000 RFU i minst 80% av undersøkte mus (n = 20). bbetyr sp aminoethyl, aminopropyl eller glycyl avstand. cfuranose; alle andre monosaccharides er et pyranose skjema. FUC rester har L-konfigurasjon, alle andre monosaccharides - D-konfigurasjonen. Denne tabellen er endret fra Bello-Gil, D. et al. 28.

Supplerende tabell 1: liste over glykaner, deres binding til naturlige sirkulerende antistoffer (IgM + IgG) BALB/c mus (n = 20), uttrykt i relativ fluorescens enheter (RFU) som median ± MAD og antall dyr overstiger kuttet (≥4000 RFU). Denne tabellen er gjengitt fra Bello-Gil, D. et al. 28. Klikk her for å laste ned denne tabellen

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Glycan microarrays har blitt uunnværlig verktøy for å studere protein-glycan vekselsvirkningene40. Dette arbeidet beskriver en protokoll basert på PGA teknologi å studere repertoaret av sirkulerende av anti-karbohydrater antistoffer i BALB/c mus. Siden PGA tilbyr muligheten for skjermen av biologisk ukjent glykaner, er det en svært praktisk oppdagelsen verktøyet13,15,28. Den foreslåtte metoden tilbyr muligheten til å måle, i samme eksperimentelle innstilling, hundrevis av glycan strukturer ved hjelp av en redusert mengde serologisk utvalg (50 µL). Dette er spesielt viktig når det gjelder små dyr (liten sirkulerende blodvolum), eller når det er nødvendig å trekke blod flere ganger fra samme eksperimentelle dyr.

Vi viste, som representant resultater, at genetisk identisk mus ikke skal betraktes som immunologiske ekvivalenter; fordi de utvikle ulike mønstre av naturlig anti-karbohydrater antistoffer (bare 12 glycan særegenheter ble bevart). Serologisk nivåer for resten av repertoaret av naturlig anti-karbohydrater antistoffer variert betydelig blant undersøkt dyrene. Analyse av tarmen bakterieflora innavlet dyr41 kunne forklare denne heterogene42,43,44,45,46. Hvis produksjonen av naturlig anti-glycan antistoffer er formidlet av antigen stimulering av bakterieflora, og dette er forskjellige blant innavlet mus41, vil fine spesifisitet av disse antistoffene ikke være identiske.

Det hovedavdeling ulempen for PGA utvikling er tilgang til veldefinerte glycan strukturer40,47. Glykaner produsert i biologiske systemer er heterogene40,47,48, og deres biosyntesen avhengig differensial uttrykk for karbohydrat enzymer, noe som resulterer i heterogene blandinger av glycoforms, hver med en distinkte fysiologisk aktivitet47. Komplekse sammensetning og konfigurasjonen av glykaner i de biologiske systemene gjør deres produksjoner utfordrende40,47,48. Sammen med kjemoterapi-enzymatisk syntese, vil glykaner isolert fra naturlige kilder fortsette å være den viktigste kilden til glykaner for matriser utvikling40. Lav syntetiske gir og en kompleks renselsesprosess glykoproteiner og glycosphingolipids gjøre en effektiv produksjon av glykaner i stor skala vanskelig40,47,48. Dermed fortsetter tilgjengeligheten og prisene på glykaner å være en svært begrensende betingelse for å utvide bruken av PGA som oppdagelsen verktøyet.

I tillegg i protokollen, må avgjørende skritt mest knyttet til riktig fordeling av løsninger (serum, sekundær antistoffer) over glycochip overflaten utføres med forsiktighet. Metodene krever minst 1 mL av disse løsningene, homogenously suge alle tørre områder av glycochip overflaten. Dette er avgjørende for å få minimalt forskjellene mellom glycan gjentak og unngå overdreven bakgrunn under kvantifisering.

Til tross for den nevnte begrensninger er PGA et svært følsomme verktøy for tilnærminger studere protein-glycan vekselsvirkningene40, eller studere repertoaret av anti-glycan antistoffer i en bestemt eksperimentelle innstilling eller tilstand13, 15,28. Denne studien kan ekstrapolert ulike arter (inkludert prøver fra mennesker) 13,15,23,28, gir en allsidig metode for å identifisere repertoaret av sirkulerende anti-karbohydrater antistoffer.

Vi tror potensialet som denne tilnærmingen kan bringe i tidlig diagnostikk og avledede behandling i noen av de patologiske forholdene der antistoffer mot glycan strukturer synes å spille en viktig rolle.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Nailya Khasbiullinaog Alexey Nokel er ansatte i Semiotik LLC, som er leverandør av glycochips som er brukt i denne studien.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av "Fondo de Investigaciones Sanitarias" (FIS) gi PI13/01098 fra Carlos III Health Institute, spanske Helsedepartementet. DB-G var godt fra en post-doc forskning finansiert av EU syvende rammeprogram (FP7/2007-2013) under Grant avtalen 603049 (TRANSLINK). NK, NS, og NB ble støttet av tildeling #14-50-00131 av russisk Science Foundation. DB-G ønsker å uttrykke sin takknemlighet Marta Broto, J. Pablo Salvador og Ana Sanchis for utmerket kundestøtte og Alexander Rakitko hjelp med statistisk analyse. Med støtte fra den "Pla de Doctorats Industrials de la Secretaria d'Universitats jeg Recerca del Departament d'Empresa jeg Coneixement de la Generalitat de Catalunya (gi nummer 2018 DI 021). Vi takker hjerter program / Generalitat de Catalunya for institusjonelle støtte.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Antibodies
biotinylated goat anti-human Igs Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA Ref. #: 31782
biotinylated goat anti-mouse IgM + IgG Thermo Fisher Scientific Ref. #: 31807
Equipment
Robotic Arrayer sciFLEXARRAYER S5  Scienion AG, Berlin, Germany http://www.scienion.com/products/sciflexarrayer/
Stain Tray (slide incubation chamber) Simport, Beloeil, QC, Canada Ref. #: M920-2
Centrifuge Eppendorf, Hamburg, Germany  Ref. #: 5810 R
Pipettes Gilson, Middleton, WI, USA http://www.gilson.com/en/Pipette/
Slide Scanner  PerkinElmer, Waltham, MA, USA ScanArray GX Plus 
Shaking incubator Cole-Parmer, Staffordshire, UK Ref. #: SI50
Biological samples
BALB/c mice sera This paper N/ A
Complex Immunoglobulin Preparation (CIP) Immuno-Gem, Moscow, Russia http://www.biomedservice.ru/price/goods/1/17531
Chemicals, Reagents and Glycans 
Glycan library Institute of Bioorganic Chemistry (IBCh), Moscow, Russia N/ A
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich, St. Louis, MO,  Ref. #: A9418
Ethanolamine Sigma-Aldrich Ref. #: 411000
Tween-20 Merck Chemicals & Life Science S.A., Madrid, Spain Ref. #: 655204
Phospahte buffered saline (PBS) VWR International Eurolab S.L, Barcelona, Spain Ref. #: E404
Sodium azide Sigma-Aldrich Ref. #: S2002
Streptavidin Alexa Fluor 555 conjugate  Thermo Fisher Scientific Ref. #: S21381
Streptavidin Cy5 conjugate GE Healthcare, Little Chalfont, Buckinghamshire, UK Ref. #: PA45001
Materials
N-hydroxysuccinimide-derivatized glass slides H  Schott-Nexterion, Jena, Germany Ref. #: 1070936
Whatman filter paper  Sigma-Aldrich Ref. #: WHA10347509
1.5 mL tubes Eppendorf  Ref. #: 0030120086
Software and algorithms
ScanArray Express Microarray Analysis System PerkinElmer http://www.per
kinelmer.com/microarray
Hierarchical Clustering Explorer application University of Maryland, MD, USA http://www.cs.umd.edu/hcil/hce/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Karlsson, G. B., Fouchier, R. A., Phogat, S., Burton, D. R., Sodroski, J., Wyatt, R. T. The challenges of eliciting neutralizing antibodies to HIV-1 and to influenza virus. Nat Rev Microbiol. 6 (2), 143-155 (2008).
  2. Lu, L. L., Suscovich, T. J., Fortune, S. M., Alter, G. Beyond binding: antibody effector functions in infectious diseases. Nat Rev Immunol. 18 (1), 46-61 (2017).
  3. Bebbington, C., Yarranton, G. Antibodies for the treatment of bacterial infections: current experience and future prospects. Curr Opin Biotech. 19 (6), 613-619 (2008).
  4. Murphy, K., Travers, P., Walport, M. The complement system and innate immunity. Janeway's Immunobiology. , 7th, Garland Science. New York. 61-80 (2008).
  5. Botto, M., Kirschfink, M., Macor, P., Pickering, M. C., Wurzner, R., Tedesco, F. Complement in human diseases: lessons from complement deficiencies. Mol Immunol. 46 (14), 2774-2783 (2009).
  6. Borrok, M. J., et al. Enhancement of antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity by endowing IgG with FcαRI (CD89) binding. MAbs. 7 (4), 743-751 (2015).
  7. Weiner, L. M., Murray, J. C., Shuptrine, C. W. Antibody-based immunotherapy of cancer. Cell. 148 (6), 1081-1084 (2012).
  8. Ricklin, D., Hajishengallis, G., Yang, K., Lambris, J. D. Complement: a key system for immune surveillance and homeostasis. Nat Immunol. 11 (9), 785-797 (2010).
  9. Prechl, J. A generalized quantitative antibody homeostasis model: antigen saturation, natural antibodies and a quantitative antibody network. Clin Transl Immunology. 6 (2), e131 (2017).
  10. Vojdani, A. Antibodies as predictors of complex autoimmune diseases. Int J Immunopath Ph. 21 (2), 267-278 (2008).
  11. Liu, W., Peng, B., Lu, Y., Xu, W., Qian, W., Zhang, J. Y. Autoantibodies to tumor-associated antigens as biomarkers in cancer immunodiagnosis. Autoimmun Rev. 10 (6), 331-335 (2011).
  12. Suurmond, J., Diamond, B. Autoantibodies in systemic autoimmune diseases: specificity and pathogenicity. J Clin Invest. 125 (6), 2194-2202 (2015).
  13. Bovin, N., et al. Repertoire of human natural anti-glycan immunoglobulins. Do we have auto-antibodies? Biochim Biophys Acta. 1820 (9), 1373-1382 (2012).
  14. de los Rios, M., Criscitiello, M. F., Smider, V. V. Structural and genetic diversity in antibody repertoires from diverse species. Curr Opin Struc Biol. 33, 27-41 (2015).
  15. Pochechueva, T., et al. Comparison of printed glycan array, suspension array and ELISA in the detection of human anti-glycan antibodies. Glycoconjugate J. 28 (8-9), 507-517 (2011).
  16. Shilova, N., Navakouski, M., Khasbiullina, N., Blixt, O., Bovin, N. Printed glycan array: antibodies as probed in undiluted serum and effects of dilution. Glycoconjugate J. 29 (2-3), 87-91 (2012).
  17. Manimala, J. C., Roach, T. A., Li, Z., Gildersleeve, J. C. High-throughput carbohydrate microarray profiling of 27 antibodies demonstrates widespread specificity problems. Glycobiology. 17 (8), 17C-23C (2007).
  18. Jacob, F., et al. Serum anti-glycan antibody detection of non-mucinous ovarian cancers by using a printed glycan array. Int. J. Cancer. 130 (1), 138-146 (2012).
  19. Lewallen, D. M., Siler, D., Iyer, S. S. Factors affecting protein-glycan specificity: effect of spacers and incubation time. ChemBioChem. 10 (9), 1486-1489 (2009).
  20. Oyelaran, O., Li, Q., Farnsworth, D., Gildersleeve, J. C. Microarrays with varying carbohydrate density reveal distinct subpopulations of serum antibodies. J. Proteome Res. 8 (7), 3529-3538 (2009).
  21. Pochechueva, T. Multiplex suspension array for human anti-carbohydrate antibody profiling. Analyst. 136 (3), 560-569 (2011).
  22. Chinarev, A. A., Galanina, O. E., Bovin, N. V. Biotinylated multivalent glycoconjugates for surface coating. Methods Mol Biol. 600, 67-78 (2010).
  23. Huflejt, M. E. Anti-carbohydrate antibodies of normal sera: findings, surprises and challenges. Mol Immunol. 46 (15), 3037-3049 (2009).
  24. Buchs, J. P., Nydegger, U. E. Development of an ABO-ELISA for the quantitation of human blood group anti-A and anti-B IgM and IgG antibodies. J Immunol Methods. 118 (1), 37-46 (1989).
  25. de Jager, W., Rijkers, G. T. Solid-phase and bead-based cytokine immunoassay: a comparison. Methods. 38 (4), 294-303 (2006).
  26. Galanina, O. E., Mecklenburg, M., Nifantiev, N. E., Pazynina, G. V., Bovin, N. V. GlycoChip: multiarray for the study of carbohydrate binding proteins. Lab Chip. 3 (4), 260-265 (2003).
  27. Willats, W. G., Rasmussen, S. E., Kristensen, T., Mikkelsen, J. D., Knox, J. P. Sugar-coated microarrays: a novel slide surface for the high-throughput analysis of glycans. Proteomics. 2 (12), 1666-1671 (2002).
  28. Bello-Gil, D., Khasbiullina, N., Shilova, N., Bovin, N., Mañez, R. Repertoire of BALB/c mice natural anti-Carbohydrate antibodies: mice vs. humans difference, and otherness of individual animals. Front Immunol. 8, 1449 (2017).
  29. Pazynina, G., et al. Synthetic glyco-O-sulfatome for profiling of human natural antibodies. Carbohydr Res. 445, 23-31 (2017).
  30. Ryzhov, I. M., Korchagina, E. Y., Popova, I. S., Tyrtysh, T. V., Paramonov, A. S., Bovin, N. V. Block synthesis of A (type 2) and B (type 2) tetrasaccharides related to the human ABO blood group system. Carbohydr Res. 430, 59-71 (2016).
  31. Ryzhov, I. M., et al. Function-spacer-lipid constructs of Lewis and chimeric Lewis/ABH glycans. Synthesis and use in serological studies. Carbohyd Res. 435, 83-96 (2016).
  32. Pazynina, G. V., Tsygankova, S. V., Sablina, M. A., Paramonov, A. S., Tuzikov, A. B., Bovin, N. V. Stereo- and regio-selective synthesis of spacer armed α2-6 sialooligosaccharides. Mendeleev Commun. 26 (5), 380-382 (2016).
  33. Pazynina, G. V., Tsygankova, S. V., Sablina, M. A., Paramonov, A. S., Formanovsky, A. A., Bovin, N. V. Synthesis of blood group pentasaccharides ALey, BLey and related tri- and tetrasaccharides. Mendeleev Commun. 26 (2), 103-105 (2016).
  34. Severov, V. V., Pazynina, G. V., Ovchinnikova, T. V., Bovin, N. V. The synthesis of oligosaccharides containing internal and terminal Galβ1-3GlcNAcβ fragments. Russian J. Bioorgan. Chem. 41 (2), 147-160 (2015).
  35. Pazynina, G. V., Tsygankova, S. V., Bovin, N. V. Synthesis of glycoprotein N-chain core fragment GlcNAcβ1-4(Fucα1-6)GlcNAc. Mendeleev Commun. 25 (4), 250-251 (2015).
  36. Solís, D., et al. A guide into glycosciences: How chemistry, biochemistry and biology cooperate to crack the sugar code. Biochim Biophys Acta. 1850 (1), 186-235 (2015).
  37. Pazynina, G. V., et al. Divergent strategy for the synthesis of α2-3-Linked sialo-oligosaccharide libraries using a Neu5TFA-(α2-3)-Gal building block. Synlett. 24 (02), 226-230 (2013).
  38. Blixt, O., et al. Printed covalent glycan array for ligand profiling of diverse glycan binding proteins. P Natl Acad Sci USA. 101 (49), 17033-17038 (2004).
  39. Liu, Y., et al. The minimum information required for a glycomics experiment (MIRAGE) project: improving the standards for reporting glycan microarray-based data. Glycobiology. 27 (4), 280-284 (2017).
  40. Song, X., Heimburg-Molinaro, J., Cummings, R. D., Smith, D. F. Chemistry of natural glycan microarrays. Curr Opin Chem Biol. 18, 70-77 (2014).
  41. Hoy, Y. E., et al. Variation in taxonomic composition of the fecal microbiota in an inbred mouse strain across individuals and time. PLoS One. 10 (11), e0142825 (2015).
  42. D'Argenio, V., Salvatore, F. The role of the gut microbiome in the healthy adult status. Clin Chim Acta. 451 (Pt A), 97-102 (2015).
  43. Khasbiullina, N. R., Bovin, N. V. Hypotheses of the origin of natural antibodies: a glycobiologist's opinion. Biochemistry (Mosc). 80 (7), 820-835 (2015).
  44. Butler, J. E., Sun, J., Weber, P., Navarro, P., Francis, D. Antibody repertoire development in fetal and newborn piglets, III. Colonization of the gastrointestinal tract selectively diversifies the preimmune repertoire in mucosal lymphoid tissues. Immunology. 100 (1), 119-130 (2000).
  45. Bos, N. A., et al. Serum immunoglobulin levels and naturally occurring antibodies against carbohydrate antigens in germ-free BALB/c mice fed chemically defined ultrafiltered diet. Eur J Immunol. 19 (12), 2335-2339 (1980).
  46. van der Heijden, P. J., Bianchi, A. T., Heidt, P. J., Stok, W., Bokhout, B. A. Background (spontaneous) immunoglobulin production in the murine small intestine before and after weaning. J Reprod Immunol. 15 (3), 217-227 (1989).
  47. Krasnova, L., Wong, C. H. Understanding the chemistry and biology of glycosylation with glycan synthesis. Annu Rev Biochem. 85, 599-630 (2016).
  48. Overkleeft, H. S., Seeberger, P. H., et al. Chemoenzymatic synthesis of glycans and glycoconjugates. Essentials of Glycobiology [Internet]. Varki, A., et al. , 3rd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor (NY). Chapter 54 2015-2017 (2017).

Tags

Immunologi og infeksjon problemet 144 mønster av naturlige antistoffer sirkulerende anti-glycan antistoffer glycan særegenheter glycochips trykt glycan matrise PGA mus
Utskrevne Glycan matrise: En følsom teknikk for analyse av repertoaret av sirkulerende anti-karbohydrater antistoffer i små dyr
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Olivera-Ardid, S., Khasbiullina, N., … More

Olivera-Ardid, S., Khasbiullina, N., Nokel, A., Formanovsky, A., Popova, I., Tyrtysh, T., Kunetskiy, R., Shilova, N., Bovin, N., Bello-Gil, D., Mañez, R. Printed Glycan Array: A Sensitive Technique for the Analysis of the Repertoire of Circulating Anti-carbohydrate Antibodies in Small Animals. J. Vis. Exp. (144), e57662, doi:10.3791/57662 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter