Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Basılı Glycan dizi: Anti-karbonhidrat antikorlar küçük hayvanlarda dolaşan repertuar analizi için hassas tekniği

Published: February 14, 2019 doi: 10.3791/57662
Automatic Translation
*1, *2,3, 3, 2, 2, 2, 2, 2, 2,4, 1, 1,5
1Infectious Pathology and Transplantation Division, Bellvitge Biomedical Research Institute (IDIBELL), 2Shemyakin-Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry (IBCh), Russian Academy of Sciences, 3Semiotik LLC, 4Auckland University of Technology, 5Intensive Care Department, Bellvitge University Hospital
* These authors contributed equally

Summary

Bu eser basılı glycan dizi (PGA) teknoloji küçük hayvanlarda Anti-karbonhidrat antikorlar dolaşan analiz için potansiyelini gösterir.

Abstract

Anti-karbonhidrat antikorlar verilen bireyin dolaşan repertuar kez immünolojik durumu ile ilişkilidir. Sadece iç ve dış potansiyel tehlike sinyalleri mücadelede başarı bireysel bağışıklık durumu belirler, ama aynı zamanda anti-glycan antikorlar (ve onların serolojik düzey varyasyon) dolaşan belirli bir desene varlığı olabilir bir önemli nokta başlangıçlı ve patolojik belirli koşullar ilerleme. Burada, glycan hedefler yüzlerce ile çok yüksek duyarlılığı ölçmek için bir fırsat sunuyor Glycan dizi PGA baskılı tabanlı bir metodoloji açıklayan; ortak bir sınırlama mevcut küçük hayvanlar olan örnek, en az bir miktarda kullanarak (sıçanlar, fareler, hamster, vb) adresi yönleri insan hastalıkları ile model olarak kullanılır. Bu yaklaşım bir temsili örnek olarak, biz doğal anti-glycan antikorlar BALB/c farelerde repertuar analizinden elde edilen sonuçları göster. Biz her BALB/c fare olmanın genetik olarak aynı ve aynı koşullarda yapılmaktadır rağmen çalışma dahil belirli bir desene doğal anti-karbonhidrat antikor geliştirir göstermek. Bu eser repertuar (özelliklerine) araştırmak için PGA teknoloji kullanımı ve anti-karbonhidrat antikorlar, hem sağlık hem de herhangi bir patolojik durum sırasında dolaşan düzeylerini genişletmek iddia ediyor.

Introduction

Antikorlar merkezi bir rol özrüne patojenler doğrudan virüs1,2 ve bakteri2,3, Kompleman sistemi4,5 aktive ederek nötralize tarafından istila karşı oynamak ve fagositoz6geliştirme. Ayrıca, onlar kanser hedefleme ve kötü huylu hücreleri7ve homeostasis bakım8,9ortadan kaldırılması önemli unsurlardır.

Bozuklukları bağışıklık sisteminin otoimmün ve inflamatuar hastalıklar10 ve kanser11' neden olabilir. Bu patolojik koşullar ideal olarak komut istemi tanısı için etkili bir tedavi talep ediyorum. Otoimmün hastalıklar söz konusu olduğunda, serolojik otoantikorlar Olguların çoğunda tanı otoimmünite10,12için bir tahmin varlığıdır. Bu antikorlar ile hücre yüzeyine tepki ve hücre dışı autoantigens ve onlar uzun yıllar otoimmün hastalık10,12' sunum öncesi mevcut çoğu kez. Ayrıca bağışıklık eksiklikleri ve kanser kan testleri ile de antikorlar veya onların fonksiyonel etkinlik11gibi bağışıklık öğeleri düzeyini ölçmek tanısı vardır.

Dolaşan antikorları ve serolojik seviyelerine repertuar tanımlaması bir prognoz ve bahsedilen patolojik koşulların tümü ilerlemesini değerlendirmek için her şeyden. Daha önce sorun kaçınarak serolojik örnekleri, geniş hacimli tüketimini en aza PGA tekniği farklı hayvan türlerinin13-16, antikor dolaşan analiz için potansiyelini göstermiştir antikorları olan17 ve izin yüksek üretilen iş antikorlar15geniş bir repertuar profil oluşturma ile ilgili.

Glycan tabanlı uzun ağırlıklı olarak, diğer faktörler arasında kökeni ve üretim benzeşme ve bağlama ligandlar15,18,19,20 belirlemek karbonhidrat tarafından conditioned ,21. Glycan tabanlı uzun süspansiyon (mikroküreler)15,21,22 veya düz aktif yüzeyler15,21,22geliştirilebilir, 23,24. Son ELISA (en geleneksel yöntemlerin) ve PGA içerir. Fazla veri aynı deneysel ayarı15,25,26,27' deki bu metodolojileri karşılaştırma değil. Biz daha önce etkinlik ve bu uzun profil anti-glycan antikorlar bireysel insan plazma örnekleri15için selectivity karşılaştırıldığında var. Bu hedefleme anti-A/B kan grubu gibi bazı karşı antikorlar, tüm uzun onları istatistiksel anlamlılık ile tespit olabilir ve onlar olumlu15,18,21birbirleri ile ilişkili. Bu arada, anti-P1 antikorlar öncelikle en yüksek discriminative gücü ile PGA tarafından tespit edildi ve hiçbir bağlantı içinde farklı glycan tabanlı uzun15,18tarafından, yapılan tespitler yapıldı. 21. bu farklılıklar yöntemleri arasında ağırlıklı olarak antikor/antijen oranı ve glycan yönlendirme15için ilgili olduğunu. Çünkü aşırı antijen antikorlar bu yöntemleri15üzerinden ELISA ve süspansiyon diziler PGA belirsiz bağlama duyarlı vardır. Buna ek olarak, glukanlardir PGA içinde yönünü ELISA ve süspansiyon diziler15' te daha daha olamaz. Çalışma glukanlardir sınırlı bir panel içerdiğinde ELISA uygun olur. Süspansiyon dizileri ile birlikte, ELISA tahlil yeniden yapılandırılması ile ilgili daha geniş esneklik sunar. PGA keşif yaklaşımlar15,18,21,28için son derece uygundur. Bu açık avantajları ve dezavantajları rağmen üç belirtilen uzun glycan-antikor etkileşimleri farklı yönlerini incelemek için kullanılabilir. Son çalışma bir daha uygun yöntemleri yelpazesi rehberlik edecek hedeftir.

Mevcut iş PGA teknoloji kullanımı küçük hayvanlarda anti-glycan antikorlar dolaşan repertuar analizi için genişletmek amaçlamaktadır. Temsil edici bir sonuç olarak, burada doğal anti-karbonhidrat antikorlar PGA tarafından yetişkin BALB/c farelerde repertuar değerlendirmek için detaylı bir protokol mevcut.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Glycochips üretim

  1. Mikrodizi hazırlık
    1. Glukanlardir (50 mM) baskı ve polisakkaritler (10 µg/mL) 300 mM fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS, pH 8,5) 6 çoğaltır kullanarak N-hydroxysuccinimide-derivatized cam slaytlar temassız robotik arrayer (damla birim ~ 900 pL). Her slayt 6 kez tekrar 4 farklı blok alt diziler (Şekil 1A, renklerde) içerir. Her tek alt dizi (8 × 14 sütun satırda) denetimleri de dahil olmak üzere 112 farklı glycan noktalar tarafından oluşturulur (Şekil 1B).
      Not: ek tablo 1' de Glycan ile ilgili bilgiler sağlanır. İçin yazdırma mikroçip kullanılan glycan IBCh takımının uzun vadeli bir sentetik çaba sonucu kütüphanedir; sentez örnekleri ilgili yayınlar29,30,31,32,33,34,35,36 açıklanan ,37,38. Kan grubu antijenleri ve bazı terminal oligosakkaritler, hem de memeli N-O-bağlantılı ve glikoproteinlerin ve glikolipitler, tümör ilişkili karbonhidrat antijenleri, çekirdek motifleri sık sık meydana gelen en glycan Kütüphane dahil ve polisakkaritler patojen bakteriler üzerinden.
    2. Nem kutusunda (bağıl nem % ~ 70) slaytlar kuluçkaya Oda sıcaklığında (25 ° C) 1 h için.
    3. Microarrays engelleme: 1,5 saat oda sıcaklığında (100 mM Borik asit, 25 mM etanolamin, %0,2 (v/v) ara-20 Ultrasaf Su) engelleme arabelleği ile slaytlarını kuluçkaya.
    4. Glycochip Ultrasaf Su ile yıkayın ve yanında soluduğumuz hava kuru.
  2. Glycochip kalite kontrol
    1. Her toplu iş karmaşık immünglobulin hazırlık (CIP, IgG, IgM ve IgA içeren), 1 mg/mL solüsyon kullanarak iki microarrays analiz biotinylated keçi anti-insan immünglobulin 10 µg/mL çözüm olarak ikincil bir antikor (IgM + IgG + IgA), 1 µg/mL tarafından takip karşılık gelen floresan streptavidin eşlenik çözümü (aşağıda açıklanan protokolü üzerinden adım 2 bakınız).
    2. İnceden inceye gözden geçirmek ve çözümlemek (bkz. Adım 3, glycan dizi analizi) glycochips.
    3. İçi ve arası chip korelasyon 0,9 yüksek ile Mikroarray toplu işlemleri kullanın.

2. Glycan dizi tekniği

  1. (İçinde Ultrasaf Su) aşağıdaki sulu çözümler hazırlamak ve oda sıcaklığında (25 ° C) saklayabilirsiniz:
    • Tampon-1: %1 (w/v) Sığır serum albümin (BSA) PBS, (v/v) ara-%20 1 ve % 0,01 (w/v) NaN3 içinde
    • Tampon-2: %1 (w/v) BSA PBS, (v/v) ara-%20 0,1 ve %0,01 (w/v) NaN3.
    • Tampon-3: %0,1 (v/v) ara-20 PBS içinde.
    • Arabellek-4: %0,001 (v/v) ara-20 PBS içinde.
  2. Glycochip ve örnek hazırlama
    1. Oda sıcaklığı (25 ° C) ulaşana kadar depolama kutusu slaytlar ile masaya koy.
      Not: pudra içermeyen lateks eldiven kullanın. Glycochip barkod konumlandırıldığı cam slayt alt bölümü tarafından manipüle gerekir. Barkod sağ tarafındaki, nerede glukanlardir baskılı yüzeyi ile temas kaçınarak belirlemenize yardımcı olacaktır.
    2. Kutuyu açın, glycochip alıp zaten nem odası içinde sabit tutmak için ıslak filtre kağıdı ile şartına kuluçka odasında (25 ° C) yerleştirin.
    3. Bu arada, tampon-1 (1:20) fareler serumla 1,5 mL tüpler oranında seyreltin. Serum çözüm homojenize (5 s) bir girdap karıştırıcı ile.
      Not: bir tek glycochip yüzey tamamen karşılamak için gerekli yaklaşık 1 mL birimdir.
    4. Sonra homojenizasyon, seyreltik serum immünglobulin toplama önlemek için bir su banyosunda 10 dk 37 ° C'de kuluçkaya. Tüpler için 10.000 x g ve 25 ° C ' 3 dk santrifüj kapasitesi, süpernatant toplamak ve herhangi bir zarlarını malzemesini.
    5. Glycochip dikkatle kuluçka odasında yer. Herhangi bir malzeme yüzeyinde oluşan glycochip ortadan kaldırmak için tampon-3 1 mL ile 25 ° C'de 15 dakika kuluçkaya.
    6. Glycochip dikey konumda tutun ve tampon-3 plastik Pasteur pipet kullanarak bazı damla ile rewash. Dikkatli bir şekilde arabellek filtre kağıdı kullanarak glycochip yüzeyden çıkarın.
  3. Reaksiyon: bağlama antikorlar
    1. Glycochip kuluçka odasında yerleştirin. Seyreltik serum örneği bir micropipette kullanarak glycochip yüzeye yayılmış. 1,5 h. Pipet Ucu kullanarak seyreltilmiş serum örneği tarafından kapalı tüm kuru alan glycochip yüzey sağlamak için 37 ° C'de yörünge ajitasyon (30 rpm) ile kuluçkaya.
    2. Aşırı herhangi bir örnek kaldırmak ve glycochip 25 ° C'de 5 dakika içinde tampon-3 için bırakın Sonra bir kapsayıcı arabellek-4 (5 dk) ile glycochip gitmek ve nihayet (5 dk) glycochip Ultrasaf Su ile yıkayın. Glycochip 175 x g ve sıvı kaldırmak için 25 ° C, 1 dk santrifüj kapasitesi.
  4. Algılama: ikincil antikor
    1. Glycochip kuluçka odasında yerleştirin. Glycochip yüzey üzerinde biotin arabellek-2 için Birleşik keçi Anti-fare (IgG + IgM) çözeltisi (5 µg/mL) yayıldı. 1s için 37 ° C'de yörünge ajitasyon (30 rpm) ile kuluçkaya.
    2. İlişkisiz bölümü kaldırmak ve çamaşır adımları yineleyin.
    3. Santrifüjü sonra 2 µg/mL (içinde tampon-2) karşılık gelen fluorochrome etiketli streptavidin çözeltisi ile 45 dk (30 rpm) için 25 ° C'de karanlıkta glycochip kuluçkaya.
    4. Karanlıkta, ilişkisiz bölümü kaldırmak ve çamaşır adımları yineleyin.
    5. Glycochip yanında soluduğumuz hava kuru.
      Not: Glycochip en kısa zamanda taranması. Ama hemen boyama sonra tarama yapmak mümkün değilse, glycochips karanlığın içinde serin ve kuru bir yerde depolanabilir.

3. Glycan dizi analizi

  1. Dizi tarama
    1. Karanlık oda sıcaklığında ulaşana kadar glycochip masaya bırak. Aynı zamanda, slayt tarayıcı ve lazer açın (uyarma dalga boyu 633 nm).
    2. Arkadaki dokunana kadar Mikroarray holding, glycochip yuvaya kaydırın.
    3. Glycochip ("çalışma kolay tarama") tarayın ve tarama olarak kaydetmek bir ". TIFF"dosyası.
  2. Dizi miktar
    1. ScanArray analiz sistemi kullanarak dizi ölçmek. Açık daha önce taranmış görüntüleri, yanında tıkırtı "Eğe"-"yapılandırma ve dosya grubunda" ana penceresinde (Şekil 1B-D)
    2. Karşılık gelen dizi dosya şablonu GAL biçiminde (cam slayt üzerinde basılı glukanlardir bırakılmasını) yük (Şekil 1 c).
    3. Görüntüdeki lekeler ile dizi (ızgaralar) yerleştirerek, dikkatle GAL şablonu ayarlamak ve miktar (Şekil 1 d) başlatın.
    4. Miktar parametreleri seçin:
      • Miktar türü: Çalıştır kolay Quant.
      • Miktar yöntemi: Daire sabit
      • Otomatik noktalar bulabilirsiniz: tüm seçenekleri seçimini kaldırın
      • Normalleştirme Yöntem: LOWESS (yerel olarak ağırlıklı Scatter Arsa yumuşatma).
    5. Quantified veri olarak kaydetme ". CSV"dosyası (Şekil 1 d). Microsoft Excel veya başka bir uygun uygulama kullanarak ortak bir elektronik tablo dosyasındaki bu baðlamanýz gerekebilir.
    6. İnterquartile aralığı (IQR) ana istatistiksel yöntem olarak kullanın: her ligand ve interquartile sapma için tüm sinyaller (DÖRTTEBİRLİK 2) sayılarının hesaplanması (75 ve 25 testlerinde veya alt ve üst Dörttebirlikler Q3 ve Q1, sırasıyla).
    7. Etkileşimli incelenmesi veri hiyerarşik kümeleme Explorer uygulamasını kullanarak gerçekleştirin.
    8. Parametreleri kümeleme kullanımı: ortalama bağlantı (UPGMA) ve benzerlik olarak Öklid mesafe mesafe ölçü birimi. Normalleştirme olmadan satırlara göre hiyerarşik kümeleme gerçekleştirin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Burada, doğal anti-glycan antikorlar 20 BALB/c farelerin bir popülasyondaki repertuar miktar elde edilen temsilcisi sonuçlarının özetini mevcut. Bu çalışmada kullanılan glycochips 419 farklı glycan yapılar içermektedir. Çoğu glukanlardir -CH sentezlenmiş2CH2CH2NH2 spacer Osilahlı-glikosidler, çeşitli durumlarda -CH2CH2NH2 veya NHCOCH -2NH2 glikosidler olarak. Tüm glycan yapıları tarafından yüksek çözünürlüklü karakterize (700 - veya 800 MHz) NMR spektroskopisi, saflaştırılmış ve HPLC tarafından test gösteren onların > % 95 saflık. Biz aynı anda IgM belirledikten + fare serum miktarında bir kısıtlama nedeniyle anti-glycan antikorlar IgG. PGA, 4.000 RFU üzerindeki değerleri (Bu en iyi glukanlardir RFU ~ %10 değerdir) antikor bağlama olumlu bir sinyal olarak kabul. Sonuçları bu çalışmada sunulan en glycan Mikroarray tabanlı veri39bildirdiği için yönergeleri izleyin. Sadece %17 karbonhidrat yapılarının ≥4, PGA (Şekil 2, kırmızı) içinde 000 RFU gösterdi. Yapıları içinde glycochips maruz değildi glycan çoğunu (Şekil 2, mavi ve beyaz)28anti-glycan antikorlar BALB/c farelerin dolaşan repertuar tarafından tanınan. Doğal anti-karbonhidrat antikorlar BALB/c korunmuş desen çok yüksek medyan sinyal yoğunluklarda bağlama antikor (≥10, 000 RFU Tablo 1) ile 12 farklı glycan özelliklerine dahil28.

Figure 1
Resim 1 : (Ölçek) de değil şematik gösterimi glycan dizi yapılandırması, baskı ve analiz. (A)baskılı mikroçip algılama ile uygun bir fluorescently etiketli ikincil antikor ardından 419 farklı glycan yapıların bir kütüphane ile gelişmiştir. Her slayt 6 kere yinelenen alt dizide (renk), 4 farklı blok içeren. Her tek alt dizi denetimleri de dahil olmak üzere 112 farklı glycan noktalar tarafından (8 satır × 14 sütun), oluşur. (B) A temsilcisi örnek görüntüleri elde edilen bir floresan tarayıcı kullanarak mikroçip tarama (görüntü üçüncü bölümü). (C) her tek alt dizinin (şablon ayarlama sırasında miktar) noktalarına "kılavuz" hizalama işlemi. (D) floresan için her nokta algılanır ve sonuçları bir ortak elektronik tablo dosyasına aktarılır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Resim 2 : Doğal dolasimda Anti-karbonhidrat antikorlar BALB/c farelerin repertuar. Fare serum numuneleri (1:20) glycochips ile inkübe ve bir ScanArray okuyucu kullanarak inceden inceye gözden geçirmek. Veri Mikroarray analiz sistemi ile analiz edildi ve sonuçları ortalama ± ortalama mutlak sapma (MAD) (RFU) göreli floresan biriminde ifade edildi. Mavi ve beyaz renkler bağlama sinyalleri 4.000 RFU (arka plan); düşük temsil eder. Kırmızı renk sinyalleri ≥4, 000 RFU (pozitif bağlama) temsil eder. F: erkek; M: erkek (n = 20). Bu rakam Bello-Gil, çoğaltılamaz D. ve ark. 28. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Glycan
NUMARASI (#)		 Yapısı Ortak adı Medyan ve MAD RFU olarak Fareler RFU ≥4000 gösterilen sayısı (%)
60 6-Ey-Su-Galβ-spb 61113 1156 100
271 Galβ1-6Galβ1-4Glcβ-sp 53622 1934 100
802 Galβ1-3GalNAc(furc) β-sp 51348 2324 100
176 3-O-Su-Galβ1-4(6-O-Su) Glcβ-sp 43008 9342 100
166 GlcAβ1-6Galβ-sp 39105 2993 85
150 3-O-su-Galβ1-3GalNAcα-SP 37943 3232 100
437 GalNAcα1-3(Fucα1-2) Galβ1-3GalNAcβ-sp A(Type 4) 33886 3193 90
125 6-Bn-Galβ1-4GlcNAcβ-sp 32674 5389 95
154 3-O-su-Galβ1-3GlcNAcβ-SP 32651 3954 100
177 3-O-Su-Galβ1-4(6-O-Su) GlcNAcβ-sp 32496 7215 100
287 3-O-Su-Galβ1-3(Fucα1-4) GlcNAcβ-sp SuLebir 20063 4962 95
234 Galβ1-4(Fucα1-3) GlcNAcβ-sp Lex 13573 2635 80

Tablo 1: BALB/c fare doğal antikorlar tarafından tanınan üst rütbe glycan yapıları. En az % 80'i içinde 4.000 RFU yukarıda sinyalleri inceledi fareler bağlama ile glukanlardir (n = 20). bsp aminoethyl, aminopropyl veya glycyl spacer anlamına gelir. cfuranose; bir diğer bol kaynağı pyranose halindedir; L-yapılandırma, tüm diğer bol - D-yapılandırma fuc kalıntı vardır. Bu tablo Bello-Gil değiştirildi D. ve ark. 28.

Ek tablo 1: glukanlardir, doğal dolaşan antikorları (IgM + IgG) BALB/c fare için kendi bağlama listesi (n = 20), ortalama ± MAD ve hayvanların aşan sayıda olarak göreli floresans birimleri (RFU) olarak gösterilen kesilmiş (≥4000 RFU). Bu tablo Bello-Gil, çoğaltılamaz D. ve ark. 28. Bu tabloyu indirmek için buraya tıklayınız

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Glycan microarrays protein-glycan etkileşimleri40eğitim için vazgeçilmez araçlar haline gelmiştir. Mevcut çalışma BALB/c farelerde Anti-karbonhidrat antikorların dolaşan repertuar çalışmaya PGA teknolojisi tabanlı bir protokol açıklar. PGA biyolojik olarak bilinmeyen glukanlardir ekran çok sayıda imkanı sunuyor, bir son derece uygun bulma aracı13,15,28oldu. Önerilen yöntem aynı Deneysel ortamda, yüz-in serolojik örnek (50 µL) sınırlı bir miktarda kullanarak glycan yapılar ölçmenin imkanı sunuyor. Bu küçük hayvanlar (küçük dolaşımdaki kan hacmi) söz konusu olduğunda, ya da kan birkaç kez aynı deneysel hayvandan ayıklamak gerekli olduğunda özellikle önemlidir.

Biz temsilcisi sonuçları olarak genetik olarak aynı fare immünolojik eşdeğerleri kabul edilmemelidir gösterdi; Çünkü onlar farklı desenler (sadece 12 glycan özelliklerine korunmuş) doğal anti-karbonhidrat antikor geliştirmek. Doğal anti-karbonhidrat antikorlar repertuar boyunca serolojik düzeyleri önemli ölçüde muayene hayvanlar arasında değişmekteydi. Doğuştan hayvanlar41 gut microbiota analizini bu heterojenlik42,43,44,45,46açıklar. Doğal anti-glycan antikor üretimini microbiota antijenik uyarılması tarafından aracılık ettiği ve bu doğuştan fareler41arasında farklı ise, bu antikorlar iyi özgüllük aynı olması değil.

En büyük dezavantajı PGA geliştirme için iyi tanımlanmış glycan yapıları40,47erişimdir. Biyolojik sistemlerde üretilen glukanlardir heterojen40,47,48vardır ve glycoforms heterojen karışımları kaynaklanan karbonhidrat enzimlerin fark ifade onların biyosentezi dayanan, her biri farklı fizyolojik etkinlik47. Karmaşık kompozisyon ve yapılandırmasını glukanlardir biyolojik sistemlerde mevcut40,,4748zorlu onların üretim yapmak. Kemoterapi enzimatik sentezi ile birlikte, doğal kaynaklardan izole glukanlardir glukanlardir diziler geliştirme40önemli kaynağı olmaya devam edecektir. Sentetik düşük verimleri ve glikoproteinlerin ve glycosphingolipids karmaşık arıtma işleminden zor40,47,48ölçekli glukanlardir geniş verimli üretim yapmak. Bu nedenle, belgili tanımlık availability ve glukanlardir fiyatları bir keşif aracı olarak PGA kullanımı genişletmek için çok kısıtlayıcı bir durum devam ediyor.

Ayrıca, protokolde, kritik adımlara çoğunlukla doğru çözümleri (serum, ikincil antikorlar) dağılımın glycochip yüzey üzerinde dikkatli bir şekilde yürütülmelidir. Metodoloji, en az 1 mL rastlanılmaması bütün kuru alanlarda glycochip yüzey emmek için bu çözümler gerektirir. Bu çok glycan çoğaltır arasında çok az farklılıklar elde etmek ve aşırı arka plan miktar sırasında önlemek için önemlidir.

Belirtilen sınırlamaları rağmen PGA protein-glycan etkileşimleri40çalışmaya veya anti-glycan antikorlar belirli deneysel ayarı veya koşul13repertuar çalışması ile ilgili yaklaşımlar için çok hassas bir araçtır, 15,28. Bu çalışmada dolaşan repertuar tanımlamak için çok yönlü bir metodoloji sağlayan farklı türler (insan örnekleri de dahil olmak üzere) 13,15,23,28, yaygınlaştırılması Anti-karbonhidrat antikorlar.

Biz de bu yaklaşım erken tanıda getirebilir ve bazı patolojik durumlardan nereye antikorlar glycan yapılara yönelik türetilmiş tedavisinde önemli bir rol oynamak gibi görünüyor potansiyelini tahmin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Nailya Khasbiullinave Alexey Nokel çalışanları Semiotik LLC, bu çalışmada kullanılan glycochips biridir.

Acknowledgments

Bu eser "Fondo de Investigaciones Sanitarias" tarafından desteklenmiştir (FIS) PI13/01098 Carlos III Sağlık Enstitüsü, İspanyol Sağlık Bakanlığı vermek. DB-G Avrupa Birliği Yedinci Çerçeve Programı (FP7/2007-2013) hibe sözleşmesi 603049 (bağlantı) altında tarafından finanse edilen bir doktora sonrası araştırma konum yararlanmış. NK, NS ve NB çalışmalarını grant #14-50-00131 Rus Bilim Vakfı tarafından desteklenmiştir. DB-G Marta Broto, J. Pablo Salvador ve mükemmel teknik destek için Ana Sanchis ve Alexander Rakitko yardım istatistiksel analiz için minnettarlığını ifade etmek istiyor. Desteği ile "Pla de Doctorats sanayi de la Secretaria d'Universitats ben Recerca del Departament d'Empresa ben Coneixement de la Generalitat de Catalunya (sayı 2018 vermek DI 021). Eğer programı teşekkür ediyoruz / Generalitat de Catalunya kurumsal destek için.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Antibodies
biotinylated goat anti-human Igs Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA Ref. #: 31782
biotinylated goat anti-mouse IgM + IgG Thermo Fisher Scientific Ref. #: 31807
Equipment
Robotic Arrayer sciFLEXARRAYER S5  Scienion AG, Berlin, Germany http://www.scienion.com/products/sciflexarrayer/
Stain Tray (slide incubation chamber) Simport, Beloeil, QC, Canada Ref. #: M920-2
Centrifuge Eppendorf, Hamburg, Germany  Ref. #: 5810 R
Pipettes Gilson, Middleton, WI, USA http://www.gilson.com/en/Pipette/
Slide Scanner  PerkinElmer, Waltham, MA, USA ScanArray GX Plus 
Shaking incubator Cole-Parmer, Staffordshire, UK Ref. #: SI50
Biological samples
BALB/c mice sera This paper N/ A
Complex Immunoglobulin Preparation (CIP) Immuno-Gem, Moscow, Russia http://www.biomedservice.ru/price/goods/1/17531
Chemicals, Reagents and Glycans 
Glycan library Institute of Bioorganic Chemistry (IBCh), Moscow, Russia N/ A
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich, St. Louis, MO,  Ref. #: A9418
Ethanolamine Sigma-Aldrich Ref. #: 411000
Tween-20 Merck Chemicals & Life Science S.A., Madrid, Spain Ref. #: 655204
Phospahte buffered saline (PBS) VWR International Eurolab S.L, Barcelona, Spain Ref. #: E404
Sodium azide Sigma-Aldrich Ref. #: S2002
Streptavidin Alexa Fluor 555 conjugate  Thermo Fisher Scientific Ref. #: S21381
Streptavidin Cy5 conjugate GE Healthcare, Little Chalfont, Buckinghamshire, UK Ref. #: PA45001
Materials
N-hydroxysuccinimide-derivatized glass slides H  Schott-Nexterion, Jena, Germany Ref. #: 1070936
Whatman filter paper  Sigma-Aldrich Ref. #: WHA10347509
1.5 mL tubes Eppendorf  Ref. #: 0030120086
Software and algorithms
ScanArray Express Microarray Analysis System PerkinElmer http://www.per
kinelmer.com/microarray
Hierarchical Clustering Explorer application University of Maryland, MD, USA http://www.cs.umd.edu/hcil/hce/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Karlsson, G. B., Fouchier, R. A., Phogat, S., Burton, D. R., Sodroski, J., Wyatt, R. T. The challenges of eliciting neutralizing antibodies to HIV-1 and to influenza virus. Nat Rev Microbiol. 6 (2), 143-155 (2008).
  2. Lu, L. L., Suscovich, T. J., Fortune, S. M., Alter, G. Beyond binding: antibody effector functions in infectious diseases. Nat Rev Immunol. 18 (1), 46-61 (2017).
  3. Bebbington, C., Yarranton, G. Antibodies for the treatment of bacterial infections: current experience and future prospects. Curr Opin Biotech. 19 (6), 613-619 (2008).
  4. Murphy, K., Travers, P., Walport, M. The complement system and innate immunity. Janeway's Immunobiology. , 7th, Garland Science. New York. 61-80 (2008).
  5. Botto, M., Kirschfink, M., Macor, P., Pickering, M. C., Wurzner, R., Tedesco, F. Complement in human diseases: lessons from complement deficiencies. Mol Immunol. 46 (14), 2774-2783 (2009).
  6. Borrok, M. J., et al. Enhancement of antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity by endowing IgG with FcαRI (CD89) binding. MAbs. 7 (4), 743-751 (2015).
  7. Weiner, L. M., Murray, J. C., Shuptrine, C. W. Antibody-based immunotherapy of cancer. Cell. 148 (6), 1081-1084 (2012).
  8. Ricklin, D., Hajishengallis, G., Yang, K., Lambris, J. D. Complement: a key system for immune surveillance and homeostasis. Nat Immunol. 11 (9), 785-797 (2010).
  9. Prechl, J. A generalized quantitative antibody homeostasis model: antigen saturation, natural antibodies and a quantitative antibody network. Clin Transl Immunology. 6 (2), e131 (2017).
  10. Vojdani, A. Antibodies as predictors of complex autoimmune diseases. Int J Immunopath Ph. 21 (2), 267-278 (2008).
  11. Liu, W., Peng, B., Lu, Y., Xu, W., Qian, W., Zhang, J. Y. Autoantibodies to tumor-associated antigens as biomarkers in cancer immunodiagnosis. Autoimmun Rev. 10 (6), 331-335 (2011).
  12. Suurmond, J., Diamond, B. Autoantibodies in systemic autoimmune diseases: specificity and pathogenicity. J Clin Invest. 125 (6), 2194-2202 (2015).
  13. Bovin, N., et al. Repertoire of human natural anti-glycan immunoglobulins. Do we have auto-antibodies? Biochim Biophys Acta. 1820 (9), 1373-1382 (2012).
  14. de los Rios, M., Criscitiello, M. F., Smider, V. V. Structural and genetic diversity in antibody repertoires from diverse species. Curr Opin Struc Biol. 33, 27-41 (2015).
  15. Pochechueva, T., et al. Comparison of printed glycan array, suspension array and ELISA in the detection of human anti-glycan antibodies. Glycoconjugate J. 28 (8-9), 507-517 (2011).
  16. Shilova, N., Navakouski, M., Khasbiullina, N., Blixt, O., Bovin, N. Printed glycan array: antibodies as probed in undiluted serum and effects of dilution. Glycoconjugate J. 29 (2-3), 87-91 (2012).
  17. Manimala, J. C., Roach, T. A., Li, Z., Gildersleeve, J. C. High-throughput carbohydrate microarray profiling of 27 antibodies demonstrates widespread specificity problems. Glycobiology. 17 (8), 17C-23C (2007).
  18. Jacob, F., et al. Serum anti-glycan antibody detection of non-mucinous ovarian cancers by using a printed glycan array. Int. J. Cancer. 130 (1), 138-146 (2012).
  19. Lewallen, D. M., Siler, D., Iyer, S. S. Factors affecting protein-glycan specificity: effect of spacers and incubation time. ChemBioChem. 10 (9), 1486-1489 (2009).
  20. Oyelaran, O., Li, Q., Farnsworth, D., Gildersleeve, J. C. Microarrays with varying carbohydrate density reveal distinct subpopulations of serum antibodies. J. Proteome Res. 8 (7), 3529-3538 (2009).
  21. Pochechueva, T. Multiplex suspension array for human anti-carbohydrate antibody profiling. Analyst. 136 (3), 560-569 (2011).
  22. Chinarev, A. A., Galanina, O. E., Bovin, N. V. Biotinylated multivalent glycoconjugates for surface coating. Methods Mol Biol. 600, 67-78 (2010).
  23. Huflejt, M. E. Anti-carbohydrate antibodies of normal sera: findings, surprises and challenges. Mol Immunol. 46 (15), 3037-3049 (2009).
  24. Buchs, J. P., Nydegger, U. E. Development of an ABO-ELISA for the quantitation of human blood group anti-A and anti-B IgM and IgG antibodies. J Immunol Methods. 118 (1), 37-46 (1989).
  25. de Jager, W., Rijkers, G. T. Solid-phase and bead-based cytokine immunoassay: a comparison. Methods. 38 (4), 294-303 (2006).
  26. Galanina, O. E., Mecklenburg, M., Nifantiev, N. E., Pazynina, G. V., Bovin, N. V. GlycoChip: multiarray for the study of carbohydrate binding proteins. Lab Chip. 3 (4), 260-265 (2003).
  27. Willats, W. G., Rasmussen, S. E., Kristensen, T., Mikkelsen, J. D., Knox, J. P. Sugar-coated microarrays: a novel slide surface for the high-throughput analysis of glycans. Proteomics. 2 (12), 1666-1671 (2002).
  28. Bello-Gil, D., Khasbiullina, N., Shilova, N., Bovin, N., Mañez, R. Repertoire of BALB/c mice natural anti-Carbohydrate antibodies: mice vs. humans difference, and otherness of individual animals. Front Immunol. 8, 1449 (2017).
  29. Pazynina, G., et al. Synthetic glyco-O-sulfatome for profiling of human natural antibodies. Carbohydr Res. 445, 23-31 (2017).
  30. Ryzhov, I. M., Korchagina, E. Y., Popova, I. S., Tyrtysh, T. V., Paramonov, A. S., Bovin, N. V. Block synthesis of A (type 2) and B (type 2) tetrasaccharides related to the human ABO blood group system. Carbohydr Res. 430, 59-71 (2016).
  31. Ryzhov, I. M., et al. Function-spacer-lipid constructs of Lewis and chimeric Lewis/ABH glycans. Synthesis and use in serological studies. Carbohyd Res. 435, 83-96 (2016).
  32. Pazynina, G. V., Tsygankova, S. V., Sablina, M. A., Paramonov, A. S., Tuzikov, A. B., Bovin, N. V. Stereo- and regio-selective synthesis of spacer armed α2-6 sialooligosaccharides. Mendeleev Commun. 26 (5), 380-382 (2016).
  33. Pazynina, G. V., Tsygankova, S. V., Sablina, M. A., Paramonov, A. S., Formanovsky, A. A., Bovin, N. V. Synthesis of blood group pentasaccharides ALey, BLey and related tri- and tetrasaccharides. Mendeleev Commun. 26 (2), 103-105 (2016).
  34. Severov, V. V., Pazynina, G. V., Ovchinnikova, T. V., Bovin, N. V. The synthesis of oligosaccharides containing internal and terminal Galβ1-3GlcNAcβ fragments. Russian J. Bioorgan. Chem. 41 (2), 147-160 (2015).
  35. Pazynina, G. V., Tsygankova, S. V., Bovin, N. V. Synthesis of glycoprotein N-chain core fragment GlcNAcβ1-4(Fucα1-6)GlcNAc. Mendeleev Commun. 25 (4), 250-251 (2015).
  36. Solís, D., et al. A guide into glycosciences: How chemistry, biochemistry and biology cooperate to crack the sugar code. Biochim Biophys Acta. 1850 (1), 186-235 (2015).
  37. Pazynina, G. V., et al. Divergent strategy for the synthesis of α2-3-Linked sialo-oligosaccharide libraries using a Neu5TFA-(α2-3)-Gal building block. Synlett. 24 (02), 226-230 (2013).
  38. Blixt, O., et al. Printed covalent glycan array for ligand profiling of diverse glycan binding proteins. P Natl Acad Sci USA. 101 (49), 17033-17038 (2004).
  39. Liu, Y., et al. The minimum information required for a glycomics experiment (MIRAGE) project: improving the standards for reporting glycan microarray-based data. Glycobiology. 27 (4), 280-284 (2017).
  40. Song, X., Heimburg-Molinaro, J., Cummings, R. D., Smith, D. F. Chemistry of natural glycan microarrays. Curr Opin Chem Biol. 18, 70-77 (2014).
  41. Hoy, Y. E., et al. Variation in taxonomic composition of the fecal microbiota in an inbred mouse strain across individuals and time. PLoS One. 10 (11), e0142825 (2015).
  42. D'Argenio, V., Salvatore, F. The role of the gut microbiome in the healthy adult status. Clin Chim Acta. 451 (Pt A), 97-102 (2015).
  43. Khasbiullina, N. R., Bovin, N. V. Hypotheses of the origin of natural antibodies: a glycobiologist's opinion. Biochemistry (Mosc). 80 (7), 820-835 (2015).
  44. Butler, J. E., Sun, J., Weber, P., Navarro, P., Francis, D. Antibody repertoire development in fetal and newborn piglets, III. Colonization of the gastrointestinal tract selectively diversifies the preimmune repertoire in mucosal lymphoid tissues. Immunology. 100 (1), 119-130 (2000).
  45. Bos, N. A., et al. Serum immunoglobulin levels and naturally occurring antibodies against carbohydrate antigens in germ-free BALB/c mice fed chemically defined ultrafiltered diet. Eur J Immunol. 19 (12), 2335-2339 (1980).
  46. van der Heijden, P. J., Bianchi, A. T., Heidt, P. J., Stok, W., Bokhout, B. A. Background (spontaneous) immunoglobulin production in the murine small intestine before and after weaning. J Reprod Immunol. 15 (3), 217-227 (1989).
  47. Krasnova, L., Wong, C. H. Understanding the chemistry and biology of glycosylation with glycan synthesis. Annu Rev Biochem. 85, 599-630 (2016).
  48. Overkleeft, H. S., Seeberger, P. H., et al. Chemoenzymatic synthesis of glycans and glycoconjugates. Essentials of Glycobiology [Internet]. Varki, A., et al. , 3rd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor (NY). Chapter 54 2015-2017 (2017).

Tags

İmmünoloji ve dolaşan anti-glycan antikorlar glycan özelliklerine glycochips enfeksiyon doğal antikorlar 144 desen sayısında glycan dizi PGA fare basılı
Basılı Glycan dizi: Anti-karbonhidrat antikorlar küçük hayvanlarda dolaşan repertuar analizi için hassas tekniği
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Olivera-Ardid, S., Khasbiullina, N., … More

Olivera-Ardid, S., Khasbiullina, N., Nokel, A., Formanovsky, A., Popova, I., Tyrtysh, T., Kunetskiy, R., Shilova, N., Bovin, N., Bello-Gil, D., Mañez, R. Printed Glycan Array: A Sensitive Technique for the Analysis of the Repertoire of Circulating Anti-carbohydrate Antibodies in Small Animals. J. Vis. Exp. (144), e57662, doi:10.3791/57662 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter