Summary
هنا يصف لنا طريقة لفصل وإثراء مكونات من ورم المكروية محصنة وغير المتمتعين بالمناعة في أورام تحت الجلد الراسخة. يسمح هذا الأسلوب لتحليل منفصل من ارتشاح الورم المناعي والكسور الورم غير المتمتعين بالمناعة التي يمكن أن تسمح بتوصيف شامل لورم المكروية محصنة.
Abstract
قد اعترفت مؤخرا وورم المكروية المناعي (الوقت) كوسيط حرجة للاستجابة للمعالجة في الأورام الصلبة، وخاصة بالنسبة إيمونوثيرابيس. التطورات السريرية في العلاج المناعي تسليط الضوء على الحاجة إلى أساليب استنساخه دقة ودقة توصيف الورم وعن التغلغل المناعية المرتبطة بها. ورم الهضم الأنزيمي وتحليل تدفق سيتوميتريك السماح لتوصيف واسع النطاق للعديد من المجموعات الفرعية الخلايا المناعية وتعمل؛ ومع ذلك، هو غالباً ما تكون محدودة عمق التحليل fluorophore القيود المفروضة على تصميم الفريق والحاجة إلى الحصول على عينات الورم كبير لمراقبة السكان محصنة نادرة للفائدة. وبالتالي، قمنا بتطوير طريقة فعالة وعالية إنتاجية لفصل وإثراء ارتشاح الورم المناعي من مكونات الورم غير المتمتعين بالمناعة. وصف الورم الهضم والطرد المركزي القائم على كثافة الفصل تقنية يسمح توصيف منفصلة للورم والورم الكسور ارتشاح محصنة ويحافظ على استمرارية الخلوية، ويوفر بالتالي، وصف واسع للورم الدولة المناعية. تم استخدام هذا الأسلوب لتميز التغايرية محصنة المكانية واسعة النطاق في الأورام الصلبة، مما يدل على زيادة الحاجة إلى تقنيات التنميط المناعية الورم كله متسقة. وبوجه عام، يوفر هذا الأسلوب طريقة فعالة وقابلة للتكيف لتوصيف المناعية تحت الجلد من الأورام الصلبة مورين؛ على هذا النحو، يمكن استخدام هذه الأداة لأفضل تميز ميزات مناعية الأورام وفي التقييم السريري لاستراتيجيات إيمونوثيرابيوتيك الرواية.
Introduction
الوقت القمعية تم الاعتراف مؤخرا باعتباره السمة مميزة للسرطان، ومن المعروف أن تلعب دوراً هاما في التنمية والتقدم، والحماية من السرطانات الصلبة الورم، فضلا عن التخفيف من تعرضها للعلاج المناعي1. الساعة تتكون من العديد من المجموعات الخلوية وتعمل، كلها توفر الحرجة من التبصر في الحالة المناعية للورم. يمكن أن تكون هذه المجموعات الفرعية المناعية طبقات كذلك في خلايا لمفاويات أو النقوي المنشأ، التي تشكل معا الغالبية من الاستجابات المناعية الفطرية وتكيفية2،3. التطورات الحديثة في مجال العلاج المناعي السرطان أظهرت أن استراتيجيات إيمونوثيرابيوتيك (أي نقطة تفتيش محصنة ضد مثبطات، مستضد تشيميريك مستقبلات الخلايا التائية، إلخ) لديها القدرة على حمل السرطان دائم التراجعات؛ ومع ذلك، تظل غير فعالة نسبيا في الأورام الصلبة السرطانات4،5. مجموعات عديدة أظهرت عقبة حاسمة أن الوقت يمكن أن تلعب على العلاج نجاحا6،7، وهكذا، تظل هناك حاجة تقييم دقيق إيمونوثيرابيس جديدة في الإعداد قبل الإكلينيكية تركز بالتحديد على ما القدرة على تعديل أو التغلب على الساعة8.
الجهود الحالية لوصف الوقت عادة ما تستخدم أما الفحص المجهري أو التدفق الخلوي جنبا إلى جنب مع جسم وسم استراتيجيات لتحديد مجموعات فرعية الخلوية المناعية وبها ميزات9،10. هاتين الاستراتيجيتين معلومات فريدة مختلفة، كما مجهرية تسمح التقدير المكاني لمجموعات فرعية الخلوية والتدفق الخلوي يوفر إنتاجية عالية والكمي الأوسع نطاقا للتغيرات الخلوية. على الرغم من التحسينات الأخيرة في فلوري immunohistochemistry متعدد تحسين نظم التصوير الطيفي، التي يمكن أن تدعم الآن المعلمات يصل إلى 7، الفريق محدودة الحجم صعوبة مستوى واسع محصنة ضد التنميط وهكذا هذا الأسلوب غالباً ما محفوظة لأكثر ركزت التحليلات. نتيجة لذلك التدفق الخلوي لا تزال واحدة من الأكثر استخداماً المناعة التنميط تقنيات. وعلى الرغم من استخدامه على نطاق واسع في توصيف الوقت، الأساليب المستخدمة لتجهيز وتلطيخ متغير تماما. استخدام البروتوكولات في أغلب الأحيان ورم الناي بإنزيم (أي، collagenases، الدناز، إلخ) وأساليب تفارق اليدوي لتحقيق تعليق خلية واحدة، تليها تلطيخ وتحليل جسم7. وعلى الرغم من مزايا كل طريقة، أظهرت العديد من الجماعات تباين واسعة النطاق التي يمكن أن يتسبب من خلال هذه التقنيات11. وهذا يجعل المقارنات عبر دراسة الأورام المكروية التنميط صعبة للغاية، حتى عند تقييم الورم مورين نفس النموذج. وعلاوة على ذلك، هذه الأساليب توفير إمكانات محدودة لتقييم الورم الخلوية والمناعية الورم التسلل المكونات بشكل مستقل، حيث يتخلل كل المكونات بعد الهضم. كمية العينة ثم يحد تلطيخ لوحة متعددة والتحليل الذي يصبح موضوعا رئيسيا عند محاولة لوصف مجموعات فرعية المناعية النادرة (أي الخاصة باستئصال ورم الخلايا التائية)12. تقنيات أكثر حداثة مثل الخلوي الشامل، أو الخلوي بوقت الرحلة (سيتوف)، يسمح بتحليل المظهرية عالية ثلاثي الأبعاد لمجموعات فرعية الخلوية مع بعض النظم التي تدعم تصميمات لوحة أكبر من المعلمات المستقلة 4213. على الرغم من قوة هائلة من التكنولوجيا سيتوف في التنميط المناعي، لا يزال محدودا بسبب المصروفات وتحليل الخبرات والحصول على المعدات. وبالإضافة إلى ذلك، العديد من البروتوكولات سيتوف يوصي بتنقية محصنة ضد مجموعات فرعية لتحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء14، وهكذا فإننا نقترح أن لدينا طريقة تخصيب اليورانيوم يمكن أن تستخدم المنبع سيتوف التحليل لتحسين نوعية البيانات.
هذه الوثيقة يصف لنا وجود ورم المكروية الهضم وتحليل الأسلوب الذي يشتمل على الورم المناعي التسلل الانفصال. والغرض من هذا الأسلوب هو السماح المستقلة الفائق التنميط المناعي ارتشاح الورم والورم كسور الخلوية لتوصيف أوسع نطاقا من ورم المكروية. باستخدام هذا الأسلوب، ونحن كذلك أن تبرهن على أهمية إجراء تحليل الورم كله، كما تبين أن تغايرية مهمة المناعية المكانية لنموذج الأورام صلبة تحت الجلد. عموما، هذا الأسلوب أكثر دقة واستمرار مقارنة بين عينات لأنه يثري لمجموعات فرعية الخلوية المناعية داخل الورم ويسمح للتنميط مستقلة من خلية الورم والكسور محصنة من ورم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
عليها جميع الأساليب الموصوفة هنا "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (إياكوك) من "كلية بايلور للطب".
1-الورم الحصاد والهضم
ملاحظة: الوقت اللازم للحصاد ~ 3-5 دقائق/الورم، والوقت اللازم لتجهيز ~ 1 ح + 2-3 دقيقة/الورم.
- Euthanize الفئران باستنشاق غاز ثاني أكسيد الكربون، ورذاذ كل الماوس لأسفل مع الإيثانول 70% قبل الحصاد لمنع تلوث الشعر. جراحيا إزالة أورام تحت الجلد من الفئران والتأكد من وجود الأورام خالية من أي أنسجة ملوثة (أي، الشعر، والجلد، والصفاق، إلخ). ضع كل ورم في 1.8 مل من قاعدة الوسائط ربمي-1640 دون الجنين المصل البقري (FBS) في لوحة 24-جيدا. لحصاد أكبر، تبقى لوحات الباردة على الجليد للمحافظة على استمرارية الخلوية.
ملاحظة: إذا كان مطلوباً العقم، سوف تحتاج كل ورم تشريح المراد تنفيذها في مجال السلامة الأحيائية مجلس الوزراء مع تعقيم الأدوات الجراحية (أي، مقص، ملقط، إلخ)، فضلا عن أي خطوات أخرى. الأورام مع قطر أطول بين 0.5-1 سم الأمثل، وسيتطلب أورام أكبر أو أصغر مقياس من الكواشف. - استخدام مقص لقطع الأورام إلى أقل من 1 ملم3 قطعة داخل كل بئر.
- إعداد 10 × كوكتيل الهضم بتذويب كولاجيناز الأول في 10 ملغ/مل، كولاجيناز الرابع في 2,500 يو/مليلتر، والدناز أنا في 200 يو/مليلتر في قاعدة الوسائط RPMI 1640 (دون FBS).
ملاحظة: هضم كوكتيل يمكن إعدادها في يوم في وقت مبكر والمخزنة في-20 درجة مئوية؛ ومع ذلك، لا ينصح بمخزن لفترات طويلة كما سوف تفقد الإنزيمات النشاط مع مرور الوقت مرة حله. - إضافة 200 ميليلتر من 10 × كوكتيل الانفصال الذي يتضمن كولاجيناز الأول والرابع كولاجيناز والدناز الأول لكل بئر بالقطع3 1 مم.
- تسمح العينات لهضم ح 1 في 37 درجة مئوية بينما تهز طفيفة عند استخدام شاكر لوحة مدارية دورة في الدقيقة 60-100.
ملاحظة: قد يؤدي ارتفاع درجة الحرارة إلى 37 درجة مئوية خلال عملية الهضم الأنزيمي تنشيط الخلايا المناعية. - بعد ح 1، تحييد رد فعل بإضافة 1 مل الإعلام RPMI 1640 تستكمل مع 5% يدتا FBS ومم 2 لكل بئر.
- "الماصة؛" هضم الورم والورم القطع المتبقية إلى مصفاة خلية 40 ميكرومتر يجلس على رأس أنبوب الطرد مركزي 50 مل.
ملاحظة: قطع طرف الخروج من طرف ماصة 1 مل لنقل أسهل لهضم الورم المصفاة. - استخدام المكبس حقنه 10 مل لتصنيف القطع الورم ميكانيكيا من خلال المصفاة. شطف في المصفاة مع 2 مل من وسائل الإعلام RPMI 1640 تستكمل دورياً (التي تحتوي على 5% FBS) وكرر حتى مصفاة خلية الواضح للورم.
ملاحظة: حوالي 4-10 مل من مجموع وسائل الإعلام ينبغي أن تكون كافية شطف على نحو كاف المصفاة للورم.
ملاحظة: وضع العينات في الثلج حتى يتم إكمال هذه الخطوة لجميع العينات للحفاظ على استمرارية الخلوية. - ضبط كل أنبوبة الطرد المركزي 50 مل على نفس وحدة التخزين باستخدام وسائط RPMI 1640 تستكمل.
ملاحظة: تعديل حجم حاسم بالنسبة لموازنة أجهزة الطرد المركزي. تخطي هذه الخطوة يمكن أن يؤدي تلف أجهزة الطرد المركزي أو الإصابة الشخصية. - الطرد المركزي من تعليق خلية (5 دقائق، 805 س ز، 4 درجة مئوية) وتجاهل سوبيرناتانتس، وإعادة تعليق في 2 مل من وسائل الإعلام RPMI 1640 تستكمل.
ملاحظة: مجموع خلايا يمكن أن تشكل بعد الطرد المركزي أن من الصعب على ريسوسبيند. استخدام ماصة 5 مل المصلية ومزيج سريعاً للخروج عنه قبل المتابعة.
2-الفصل بين كسور الخلوية المناعية والورم
ملاحظة: الوقت اللازم لهذه الخطوة حوالي 1 ح.
- أضف 3 مل من الكثافة المتوسطة الانحدار إلى الجزء السفلي من أنبوب الطرد المركزي 15 مل. إعداد وتسمية أنابيب كافية لكل الورم.
- الطبقة 2 مل تعليق خلية ورم فوق المتوسطة الكثافة التدرج قبل بيبيتينج ببطء أسفل الجانب من أنبوب لمنع الاختلاط من الطبقتين.
- بعناية بوضع أنابيب الطبقات في أجهزة الطرد المركزي وتدور لمدة 20 دقيقة في 805 س ز، 20 درجة مئوية، مع لا الفرامل.
ملاحظة: من المهم جداً للتحقق من موازنة سليمة وضمان أن يستخدم لا الفرامل أثناء الطرد المركزي. أي تعطيل لهذه العملية سيؤدي إلى خلط طبقة، وسيكون من الصعب استعادة عينة كاملة. - نقل الورم تسلل الكريات البيض (سمسم) طبقة وطبقة أعلى وسائل الإعلام إلى أنبوب 15 مل جديدة استخدام ماصة نقل بعناية. تجاهل كافة المتبقية الكثافة المتوسطة التدرج وريسوسبيند بيليه ورم في الجزء السفلي من الأنبوب في 2 مل 1640 RPMI تستكمل.
ملاحظة: بعد الطرد المركزي سيكون هناك أربع طبقات مرئية من الأعلى إلى أسفل التي تقابل على التوالي: تيلس والمتوسطة الكثافة المتدرجة، وسائل الإعلام والورم خلية بيليه. انظر الشكل 2A على سبيل مثال من مختلف الطبقات. - الطرد المركزي سمسم حد سواء وعينات الورم في فصل أنابيب (5 دقائق، 805 س ز، 4 درجة مئوية) وتجاهل المادة طافية.
- ريسوسبيند العينة سمسم في 200 ميليلتر وبيليه ورم في 2 مل من وسائل الإعلام RPMI 1640 تستكمل. الحفاظ على الجليد للمحافظة على البقاء.
3-الطلاء والتلوين
ملاحظة: الوقت اللازم للطلاء هو 30 s/الورم؛ الوقت اللازم لتلطيخ السطح ح 1؛ الوقت المطلوب لتلطيخ داخل الخلية 40 دقيقة؛ الوقت اللازم لتحليل التدفق الخلوي هو 1-4 دقيقة/الورم.
- إعداد وحساب التسمية 96-جيدا U-أسفل لوحة لكل المناعي تلطيخ لوحة وصفيحة إضافية للخلية.
ملاحظة: بشكل عام، تعد ثلاث لوحات في المجموع: لوحة لوحة تركز على اللمفاويات ولوحة لوحة تركز على النقوي لوحة عد خلية. - الكوة لوحة تعليق خلية واحدة في كل من تلطيخ لوحات ووحدة تخزين محددة في لوحة العد.
ملاحظة: يتم استخدام لوحة count لحساب إجمالي عدد الخلايا إضافة إلى كل لوحة المصبوغة، مما يسمح لتعداد السكان خلية دقيقة. Cytometer تدفق مع قدرات لوحة 96-كذلك أخذ العينات والتحليل الحجمي يمكن تقديم العدد الخلايا كل ميليلتر في كل عينة، وذلك، حساب عدد الخلايا التي تضاف إلى كل لوحة المصبوغة. يمكن الحصول على لوحات العد في اليوم التالي بعد تثبيت بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية، الشطف مع المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية (الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) بنسبة 2% FBS)، وريسوسبيندينج في تعيين حجم المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية. - تغسل الخلايا مرتين مع 200 ميليلتر من الفوسفات مخزنة المالحة دولبيكو (دببس) كل عينة من سينتريفوجينج (5 دقائق، 805 س ز، 4 درجة مئوية) وتجاهل المادة طافية بين كل شطف لإزالة أي FBS مجاناً.
- إضافة 50 ميليلتر من كتلة Fc، تخلط العينات باستخدام ماصة متعدد القنوات، واحتضان لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية.
- إضافة 50 ميليلتر من 2 x يتركز خارج الخلية جسم الاستهداف وخليط وصمة عار صلاحية يمكن حلها، ماصة متعدد القنوات استخدام مزيج، واحتضان لمدة 30 دقيقة في الظلام في الرايت أو 4 درجات مئوية.
ملاحظة: المصبوغة الظروف الدقيقة للأجسام المضادة تعتمد على إرشادات الشركة المصنعة. يجب أن يكون تخفيف المصبوغة جميع دببس، مع لا FBS إضافة منع تشبع صبغ صلاحية يمكن حلها. يرجى الاطلاع على الجدول للمواد والمعدات لتخفيف الأمثل للفريق المصبوغة المستخدمة في هذه المخطوطة. الأجسام المضادة ويمكن حلها صلاحية تلطيخ الحل مستعدة بتركيز 2 x لتقديم 1 نهائي x تلطيخ التركز في 100 ميليلتر من إجمالي حجم المصبوغة عند إضافة إلى كتلة Fc. - تغسل العينات مرتين مع نظام مراقبة الأصول الميدانية المخزن المؤقت سينتريفوجينج (5 دقائق، 805 س ز، 4 درجة مئوية) وتجاهل supernatants بين كل الشطف.
- ريسوسبيند في 200 ميليلتر من 1 × حل التثبيت/بيرميبيليزيشن واحتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية محمية من الضوء.
ملاحظة: هذه التجربة يمكن أن يكون مؤقتاً بين عشية وضحاها في هذه المرحلة: الاحتفاظ بعينات في 4 درجات مئوية محمية من الضوء. - وفي اليوم التالي الطرد المركزي اللوحات (5 دقائق، 805 س ز، 4 درجة مئوية) وتجاهل المادة طافية.
- يشطف مرة واحدة مع 200 ميليلتر من 1 × permeabilization المخزن المؤقت، وأجهزة الطرد المركزي (5 دقائق، 805 س ز، 4 درجة مئوية)، وتجاهل المادة طافية.
- إضافة 100 ميليلتر 1 x تركيز الأجسام المضادة داخل الخلايا المصبوغة الفريق أعد في المخزن المؤقت بيرميبيليزيشن س 1 واحتضان لمدة 30 دقيقة في الظلام في الرايت أو 4 درجة مئوية (وهذا يتوقف على توصيات المصبوغة من الشركة المصنعة).
- شطف بمجرد تجاهل المخزن المؤقت (5 دقائق، 805 س ز، 4 درجة مئوية)، مع بيرميبيليزيشن 1 x المادة طافية، وشطف لمرة ثانية مع المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية (برنامج تلفزيوني مع 2% FBS).
- ريسوسبيند العينات في 300 ميليلتر من المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية (برنامج تلفزيوني مع 2% FBS) ونقل العينات إلى أنابيب التدفق الخلوي، والقيام بتحليل التدفق الخلوي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
نتائجنا تثبت فائدة كبيرة سمسم انفصال مكونات الورم غير المناعية، كما هو موضح في البروتوكول. بالإضافة إلى ذلك، استخدام الأسلوب وصف نظهر التغايرية مناعية هامة من الأورام الصلبة الراسخة.
مشكلة كبيرة مع العديد من تقنيات تفارق الورم هو فقدان صلاحية العينة، في أغلب الأحيان نتيجة لظروف قاسية الهضم (أي، ارتفاع درجات الحرارة، وعدم كفاية الإمداد بالمواد الغذائية، إلخ). استخدام الأسلوب وصف الهضم، مع أو دون كثافة تخصيب متوسطة متدرجة، يوفر حوالي 70-90% مجموع صلاحية الخلوية حسب تقييم التدفق الخلوي (الشكل 1أ). فيابيليتيس مشابهة لوحظت في سمسم إغناء وإثراء الورم الكسور، مما يوحي بأن هذا الأسلوب يسبب سمية عموما الحد الأدنى (الشكل 1، الشكل 2ج). وعلاوة على ذلك، عززت إثراء الكثافة المتوسطة التدرج أكبر من زيادة إضعاف في CD45 تحليل إيجابية سمسم جزء بسيط من بين مجموع خلايا قابلة للحياة ديجيسشنز الورم مقارنة بغير المخصب (الشكل 1ب، ج). وبالإضافة إلى ذلك، تم العثور على تخصيب اليورانيوم لتعزيز العديد من مجموعات فرعية الخلايا المناعية يقيم عادة في الدراسات المكروية المناعي، بما في ذلك القامع النقوي المستمدة من الخلايا (مدسكس)، والخلايا الجذعية (DCs)، الضامة، والخلايا التائية CD8، وخلايا CD4 خلايا تي ( 1 الرقمد، ه). وهذا يوحي بأن إثراء الكثافة المتوسطة التدرج يشجع الفاسدون سموم العالمية وعدم عزل اللمفاويات محددة أو النقوي السكان (انظر "الشكل تكميلية" 1A، ب لقياس تدفق النابضة الطريقة المستخدمة لتحديد السكان خلية معينة). تجدر الإشارة إلى ذلك، أن العديد من وسائط الإعلام وفصل التدرج الكثافة المتاحة تجارياً يسمح جزءا كبيرا من الكريات الحمراء والمحببة اجتياز المرحلة الفاصلة. وهكذا، إذا كان هؤلاء السكان من الفائدة، كذلك البروتوكول الأمثل قد يكون ضروريا.
الشكل 1 : الإثراء لطيف وفعال من ارتشاح الورم المناعي. وقد اقتطعت المنشأة مير الأورام وهضمها باستخدام الطريقة الموصوفة. وبعد الهضم، قسمت تعليق خلية واحدة أن نصف خضع لتخصيب كثافة متوسطة الانحدار وأخرى نصف كانت الملون مباشرة. (أ) التراكمي التدفق الخلوي تقييم سلامة الخلوية للورم ديجيستيونس مع أو بدون تخصيب كثافة متوسطة متدرجة. (ب) تدفق الممثل الخلوي النابضة قطع عرض تخصيب الخلايا المناعية إيجابية CD45 الهضم ورم واحد مع أو بدون تخصيب كثافة متوسطة متدرجة. (ج) التراكمي التدفق الخلوي CD45 إيجابية الخلية النسب بين مجموع خلايا قابلة للحياة من ورم ديجيستيونس مع أو بدون تخصيب كثافة متوسطة متدرجة. (د) نسب تخصيب مختلف النقوي واللمفاويات محصنة ضد السكان. وقد يهضم الأورام في تعليق خلية واحدة قبل يجري الملون مباشرة أو تشهد كثافة تخصيب التدرج قبل التحليل الخلوي تلطيخ وتدفق. تم حساب نسبة تخصيب خلية من نوع كل بقسمة نسبة سكان خلية معينة (من بين مجموع خلايا قابلة للحياة المقررة) من هضم كثافة الورم المخصب التدرج من نظيرتها غير المخصب. شريط خطوط تمثل الوسيط وحواف الشريط تمثل نسب الحد الأدنى والحد الأقصى. (ﻫ) الجدول التعبير علامة الخلوية المناعية المستخدمة لتحديد كل السكان الخلايا المناعية تحليلها. تم تحديد دلالة إحصائية مع اختبار t مزاوج أو اختبار "مان ويتني". ف < 0.05، * *ف < 0.01، * * *ف < 0.001، * * *ف < 0.0001، (n = 20 الأورام، N = 2 لجميع الرسوم البيانية). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
واحدة من أهم المزايا التي يوفر هذا الأسلوب هو القدرة على الشخصية الكسر الورم غير المتمتعين بالمناعة بشكل مستقل. بعد عزل الكسر الأعلاف غير المناعية الورم الذي يمر بالمرحلة المتوسطة الكثافة التدرج، معقدة الورم التنميط لوحات يمكن أن يؤديها فيها سابقا قد كانت محدودة بعدد فلوروفوري وقيود كمية العينة. الشكل 2 أ يبين مثال لتوصيف الورم التدفق الخلوي مع أكثر 70% البقاء وتخصيب خلية 99% CD45 السلبية. يمكن ثم يمكن لمحة عن الكسر CD45 السلبية للعديد من الميزات الورم مثل عموما الورم صلاحية أو المبرمج (أي، كاسباسي 3، أنيكسين الخامس، إلخ)، وانتشار القدرات (أي Ki67)، والتعبير عن مختلف علامات كآبته (أي برمجة الموت-يجند 1 (PD-L1) أو PD-L2). ومع ذلك، تجدر الإشارة إلى أن الكسر السلبية CD45 تتضمن كلا من الخلايا السرطانية، فضلا عن عناصر أخرى stromal والأوعية الدموية من ورم المكروية. وهكذا، إذا كان مطلوباً توصيف خلية الورم مباشرة، علامة ورم خلية محددة سيلزم المستخدمة (أي، سيتوكيراتين، مستضد المحددة المرتبطة بورم، إلخ). وبالمثل، عناصر stromal الأورام يمكن بسهولة التعرف ويتميز بعد وضع العلامات مع علامة نوع خلية محددة مثل ورم خلايا بطانية والأوعية الدموية (CD31)، وسرطان الليفية المرتبطة بها (العضلات الملساء α أكتين). ومع ذلك، مستوى السلامة وتخصيب خلية السلبية CD45 متسقة عالية عبر عينات متكررة، مما يدل على متانة تقنية فصل التدرج الكثافة لإثراء مكون الورم غير المناعي (الشكل 2ب، ج ).
الشكل 2 : الإثراء والتنميط من ميزات مكون الورم غير المناعية. (أ) صورة الممثل من عينة بعد تخصيب الكثافة المتوسطة التدرج مع طبقة وسائل الإعلام المرئية (الوردي)، سمسم طبقة (رقيقة بيضاء غامضة) وكثافة طبقة متوسطة متدرجة (واضحة) وبيليه ورم في الجزء السفلي من الأنبوب. (ب) الممثل التدفق الخلوي النابضة الاستراتيجية المستخدمة للتنميط مكون الورم غير المناعية، مع الخلية صلاحية مبعثر مؤامرة (أعلى)، CD45 الخلية سلبية الإثراء مبعثر مؤامرة (أسفل اليسار)، وثلاث علامات مستقلة للفائدة التعبير عن طريق قطع الرسم البياني (PD-L1 الأعلى والأوسط PD-L2 أسفل Ki67). FMO المدرج التكراري تمثل عينة الملون بجميع الألوان الأخرى في الفريق ولكن تفتقر إلى العلامة للفائدة. التراكمي التدفق الخلوي تقييم جدوى الخلوية (ج) و CD45 (د) الخلية سلبية النسب بين مجموع خلايا قابلة للحياة الكسر بيليه الورم بعد التدرج تخصيب المتوسطة الكثافة (n = الأورام 7-8). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
وعلى الرغم من الجهود الكبيرة لتوصيف التغاير الجيني للأورام الصلبة، مفصلة إلا القليل من العمل إلى التباين المكاني لمجموعات فرعية المناعية في الأورام الصلبة. ونحن وبالتالي تهدف إلى تحديد كيف النقوي واللمفاويات المناعية تختلف جذريا في جميع أنحاء ورم صلبة واحدة مجموعات فرعية. وبالتالي، ورم مير المنشأة قسمت إلى أربعة أجزاء متساوية مع عناية خاصة لضمان كل قسم الوارد تقريبا متساوية من المناطق داخل الأورام، فضلا عن أجزاء متساوية عن طريق الجلد والبريتوني-التي تواجه (الشكل 3أ). كل قطعة الورم كان يهضم كل على حدة، وثم أثري المتوسطة الكثافة المتدرجة وانقسام بين فريق النقوي واللمفاويات. يسمح هذا التحديد الكمي لميزات مختلفة بما في ذلك عدد من السكان سموم المقررة عادة: خلايا تي، وخلايا CD4 + T، الخلايا CD8 + T، الضامة، وحدات تحكم المجال Dc، مدسكس (انظر "الشكل التكميلية" 1A، ب لقياس تدفق النابضة الاستراتيجية). داخل ورم واحد، كان تقلب خلية كبيرة بين أقسام مختلفة من الورم لاحظ (الشكل 3ب). على سبيل المثال، تم العثور على عدد خلايا إجمالي DC وخلية T تختلف بقدر 4 إلى إضعاف بين أجزاء الورم المجاورة. هذه التغييرات الجذرية كذلك لوحظ عند تحليل الخلية السكان كنسبة مئوية من مجموع خلايا قابلة للحياة (2A الشكل التكميلية) ولوحظ وجود مستويات مماثلة في اثنين من الأورام المستقلة الأخرى ("الشكل التكميلي" 2، ج). تظهر هذه البيانات أهمية عزل وتحليل الورم كاملة عند إجراء التحليلات المكروية المناعي، الذي قد يبدو الحدس إذا البروتوكولات الحالية تشمل تقسيم الورم للسماح بتحليل تكميلي المستقل أساليب (أي، علم الأنسجة، والجيش الملكي النيبالي الكمي، إلخ). وبالإضافة إلى ذلك، هذه البيانات قد يفسر التباين في التحاليل المناعية لورم الخزعات، كما التغايرية المناعية intratumoral الإقليمية يمكن أن تحرف جذريا نتائج خزعة.
الشكل 3 : تقييم التغايرية محصنة ضد الورم المنشأة. (أ) صورة الممثل ورم مير المنشأة بعد الاستئصال الجراحي (يسار) وبعد التقسيم المتساوي في مجاورة 4 قطع (يمين). شريط مقياس من 1 سم، تظهر باللون الأسود على كل صورة. إضعاف (ب) التغييرات المختلفة النقوي وخلية اللمفاويات التهم بين كل جزء من الأجزاء المجاورة الورم 4؛ وخضع كل مقطع الورم نفس الهضم، وكثافة تخصيب متوسطة الانحدار الإجراء وتلطيخ، والتحليل. ويرد كل جزء الورم كتغيير إضعاف عدد خلايا، كما يحدد بقسمة عدد الخلايا في الجزء الورم مع عدد أدنى من خلية تحليل لعدد سكان خلية معينة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الإضافي رقم 1: الممثل التدفق الخلوي النابضة الاستراتيجية المستخدمة للتنميط المناعي مكون الورم. (أ) النابضة استراتيجية مع كل منهما التبعثر مؤامرات المستخدمة للتنميط المناعي اللمفاويات. (ب) النابضة استراتيجية مع كل منهما التبعثر مؤامرات المستخدمة للورم النقوي التنميط المناعي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الإضافي رقم 2: تقييم إضافية لتغاير الورم الراسخة. (أ) النسبة المئوية الخلوية بين التغيير إضعاف مجموع خلايا قابلة للحياة من ورم تساوي 4 أجزاء هو مبين في الشكل 3. (ب) و (ج) هي الأورام مير ثابتة إضافية اثنين مقسمة إلى 4 أجزاء متجاورة وتحليلها للورم المناعي عدم التجانس. خلية العد إضعاف التغييرات (يسار) والنسب المئوية في الخلية مجموع خلايا قابلة للحياة إضعاف التغييرات (يمين) لكل النقوي وتحليل الخلايا اللمفاوية خلية السكان يظهر التباين لكل جزء من الأجزاء المجاورة الورم 4. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الوقت تتألف من المكونات الخلوية المتنوعة والمعقدة والجزيئات. تشير الدلائل الأخيرة إلى أن توصيف دقيق لهذه البيئة يمكن توفير فهم أفضل للعلاج النجاح أو الفشل، وحتى تساعد في التعرف على آليات المقاومة العلاجية. على سبيل المثال، يمكن زيادة مستويات intratumoral الخلايا المثبطة للمناعة المختلفة (أي، مدسكس، والخلايا التنظيمية تي، إلخ) التخفيف من الاستجابات المناعية المستجيب وتلغي آثار إيمونوثيرابيوتيك. من ناحية أخرى، يمكن أن تكون زيادة تواجد intratumoral المستجيب محصنة ضد السكان (مثلاً، الخاصة بالورم CD8 + "تي" الخلايا، والخلايا القاتلة الطبيعية، خلايا مساعد تي) تنبؤ قوية لنجاح العلاج. وصف آخر التي لا تزال تمثل بدقة الحالة المناعية الورم هو السمات المظهرية الخلايا السرطانية نفسها. وهذا يشمل التعبير عن مختلف يغاندس كآبته، والأنزيمات، أو جزيئات تهدف downregulating المستجيب الاستجابات المناعية (أي، PD-L1، PD L2، ديوكسيجيناسي إيندولاميني 2 و 3، وأكسيد النيتريك، إلخ). أخذت معا، وهذا يدل على الحاجة لتوصيف دقيق وواسع من الميزات الخلوية المناعية وورم من الأورام الصلبة.
يسمح هذا الأسلوب يصف لنا هنا الانفصال وإثراء كل من جهاز المناعة والأورام مكونات الخلية من الأورام الصلبة تحت الجلد مورين. ثم تدفق المستقلة سيتوميتريك التنميط يمكن إجراء ذلك بدوام كامل وتفاعل الخلايا السرطانية مع الوقت يمكن أن يكون موضع تقدير. وبعد تخصيب اليورانيوم، يمكن أن يكون الأمثل لوحات الخلوي تدفق حصانة واسعة للسماح لتوصيف المكونات الخلوية النقوي واللمفاوية الرئيسية، فضلا عن مجموعة متنوعة من السمات التي تصف وضعهم المظهرية. وبالمثل، يمكن استخدامها الورم واسعة النطاق الخلية ركز الفريق بشكل مستقل لتقديم توصيف واسع من الميزات خلية الورم كذلك. البساطة النسبية لهذا الأسلوب يسمح للتحليل المتزامن لعدد كبير من الأورام مورين، الذي أمر حاسم لرصد الاتجاهات وعلى الرغم من تنوع بيولوجي نماذج مورين الورم. وبالإضافة إلى ذلك، يوفر تخصيب الورم المناعي التعرف بشكل أفضل من المجموعات المناعية النادرة (أي ورم على حدة سيتوتوكسيك خلايا تي)، التي ممثلة تمثيلاً ناقصاً إلى حد كبير وكثيراً ما داخل الورم مقارنة بسائر مكونات الخلايا المناعية . الأمثل لهذه التقنية يمكن أن تسمح التحاليل المتلقين للمعلومات الإضافية في هذه المجموعات المعزولة التي تتطلب الإثراء، مثل كوكولتوري السابقين فيفو فحوصات، مرناً التنميط، أو دراسات نقل الخلية التبني.
باستخدام هذا الأسلوب في نموذج ورم مورين تحت الجلد، علينا أن نظهر في إثراء كبير لمجموعات فرعية مأمن عالمية ومستقلة. كما نبدي الورم غير المناعية التنميط الذي يمكن أن يتحقق من عينات الورم نفسه. أخيرا، نحن إظهار أهمية التنميط المناعية الورم كله، كما لاحظنا تغايرية مهمة المناعية في الأجزاء المجاورة للورم. من الناحية المثالية، يمكن تطبيق هذا الأسلوب كولاجيناز والهضم على أساس الدناز والانفصال القائم على التدرج من الكسور الورم المناعي والمناعة غير غالبية نماذج الورم موريني، كلا أورثوتوبيك وتحت الجلد. وقد لاحظنا أيضا أن الأورام الصغيرة غير المستقرة وأقل نماذج الورم الكولاجين الكثيفة (أي، B16 الميلانوما) غالباً ما لا تتطلب خطوة هضم الأنزيمي لتوليد تعليق خلية واحدة15؛ مع ذلك، ينفذ تخصيب المناعي القائم على التدرج على قدم المساواة، وكذلك في هذه النماذج الورم، كذلك التحقق من صحة براعة. على الرغم من المخاوف السابقة حول الهضم مستضد كولاجيناز على مجموعات فرعية الخلوية المحددة11، لدينا حتى الآن لمراقبة خسارة ملحوظة في تلطيخ الجودة لأي من العلامات التي كنا قد لمحة عن. ومع ذلك، ينبغي تقييم مستضد حساسية لهذه الشروط الهضم باستخدام عينات المراقبة السليمة غير هضمها قبل اعتماد واسع النطاق لهذا الأسلوب.
وفي الختام، لدينا تقنية تسمح بتوصيف دقيق وواسع النطاق، والفائق الورم المناعي والمناعة غير مكونات الأورام الصلبة مورين. عن طريق إجراء التنميط مستقلة لهذه المجموعات الفرعية، يمكن الباحثين على نطاق واسع تميز الوقت والحصول على أفضل آليا إلى أعمق من الأورام الصلبة العلاج السريري. يمكن بسهولة تطبيق هذا الأسلوب للغالبية العظمى من ورم مورين نماذج لتحليل الإنتاجية العالية من اللمفاويات وتعداد السكان سموم النقوي وتعمل عن طريق التدفق الخلوي، أو فحوصات المتلقين للمعلومات الأخرى التي تحتاج إلى إثراء مجموعة فرعية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
وتسلم جمن الدعم المالي المقدم من المعهد الوطني للعامة الطبية العلوم (T32GM088129) والمعهد الوطني لطب الأسنان والجمجمة البحوث (F31DE026682) كل من "المعاهد الوطنية للصحة". المحتوى هي المسؤولة الوحيدة عن المؤلفين ولا تمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية "المعاهد الوطنية للصحة". بتأييد هذا المشروع أيضا بالخلوي والخلية الأساسية الفرز في "كلية بايلور للطب" بتمويل من المعاهد الوطنية للصحة (P30 AI036211 و P30 CA125123 و S10 RR024574) ومساعدة الخبراء من جويل م. سيديرستروم.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6 to 12 week old male C57BL/6 mice | Jackson Laboratory | N/A | Mice used in our tumor studies |
| MEER Murine Syngeneic Cancer Cell line | Acquired from collaborator | N/A | E6/E7 HPV antigen expressing murine tonsillar epithelial cancer cell line |
| 70% isopropyl alcohol | EMD Milipore | PX1840 | |
| Murine surgical tool kit | World Precision Instruments | MOUSEKIT | Primarily only need scissors, tweezers, and a scalpel. |
| 24-well plate | Denville Scientific Inc. | T1024 | Or any 24-well flat bottom plate. |
| RPMI-1640 media | Sigma-Aldrich | R0883 | |
| Collagenase I | EMD Milipore | 234153 | |
| Collagenase IV | Worthington Biochemical Corporation | LS004189 | |
| DNase I | Sigma-Aldrich | 11284932001 | |
| Low Speed Orbital Shaker | BioExpress (supplier: Genemate) | S-3200-LS | Or any orbital shaker. |
| Thermoregulating incubator | Fisher Scientific | 13-255-27 | Or any other thermo-regulated incubator |
| FBS | Sigma-Aldrich | F8192 | |
| EDTA | AMRESCO | E177 | |
| 1 mL Pipette and tips | Eppendorf | 13-690-032 | Or any other pipette and tips |
| 40 um Cell Strainers | Fisher Scientific | 22363547 | |
| 50 mL Centrifuge Tubes | Denville Scientific Inc. | C1062-P | |
| 15 mL Conical Tubes | Denville Scientific Inc. | C1012 | |
| 10 mL Luer-Lok Syringe without needles | BD | 309604 | |
| Lymphoprep Density Gradient Medium | STEMCELL Technologies | 7811 | |
| Transfer Pipettes | Denville Scientific Inc. | P7212 | |
| 96-well U-bottom plates | Denville Scientific Inc. | ||
| DPBS | Sigma Aldrich | D8573 | |
| FoxP3 Transcription Factor Staining Buffer Set | ThermoFisher Scientific | 00-5523-00 | Fix/Permeabilization Buffer and Permeabilization Buffer |
| Thermoregulated Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
| Attune NxT Flow Cytometer | ThermoFisher Scientific | N/A | For 96-well cell volumetric counting |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) Clone 2.4G2 | ThermoFisher Scientific | 553141 | Fc Block |
| LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, for UV excitation | ThermoFisher Scientific | L34962 | Fixable viability stain |
| CD45 Monoclonal Antibody (30-F11), APC-eFluor 780 | ThermoFisher Scientific | 47-0451-80 | |
| TCR beta Monoclonal Antibody (H57-597), APC | ThermoFisher Scientific | 17-5961-82 | |
| CD8-α Antibody (KT15), PE | Santa Cruz Biotechnology | sc-53473 | |
| CD4 Monoclonal Antibody (GK1.5), PE-Cyanine5 | ThermoFisher Scientific | 15-0041-81 | |
| MHC Class II (I-A/I-E) Monoclonal Antibody (M5/114.15.2), Alexa Fluor 700 | ThermoFisher Scientific | 56-5321-82 | |
| CD11c Monoclonal Antibody (N418), PE-Cyanine5 | ThermoFisher Scientific | 15-0114-82 | |
| F4/80 Monoclonal Antibody (BM8), eFluor 450 | ThermoFisher Scientific | 48-4801-80 | |
| CD11b Monoclonal Antibody (M1/70), APC | ThermoFisher Scientific | 17-0112-81 | |
| Ly-6G (Gr-1) Monoclonal Antibody (RB6-8C5), PE | ThermoFisher Scientific | 12-5931-82 | |
| CD274 (PD-L1, B7-H1) Monoclonal Antibody (MIH5), PE-Cyanine7 | ThermoFisher Scientific | 25-5982-80 | |
| CD273 (B7-DC) Monoclonal Antibody (122), PerCP-eFluor 710 | ThermoFisher Scientific | 46-9972-82 | |
| Ki-67 Monoclonal Antibody (B56), BV711 | BD Biosciences | 563755 |
References
- Fouad, Y. A., Aanei, C. Revisiting the hallmarks of cancer. American Journal of Cancer Research. 7 (5), 1016-1036 (2017).
- Gajewski, T. F., Schreiber, H., Fu, Y. -X. Innate and adaptive immune cells in the tumor microenvironment. Nature Immunology. 14 (10), 1014-1022 (2013).
- Whiteside, T. L. The tumor microenvironment and its role in promoting tumor growth. Oncogene. 27 (45), 5904-5912 (2008).
- Chiou, V. L., Burotto, M. Pseudoprogression and Immune-Related Response in Solid Tumors. Journal of Clinical Oncology. 33 (31), 3541-3543 (2015).
- Menon, S., Shin, S., Dy, G. Advances in Cancer Immunotherapy in Solid Tumors. Cancers. 8 (12), 106 (2016).
- Denkert, C., et al. Tumor-Associated Lymphocytes As an Independent Predictor of Response to Neoadjuvant Chemotherapy in Breast Cancer. Journal of Clinical Oncology. 28 (1), 105-113 (2010).
- Lee, Y., et al. Therapeutic effects of ablative radiation on local tumor require CD8+ T cells: changing strategies for cancer treatment. Blood. 114 (3), 589-595 (2009).
- Stakheyeva, M., et al. Role of the immune component of tumor microenvironment in the efficiency of cancer treatment: perspectives for the personalized therapy. Current Pharmaceutical Design. 23, (2017).
- Gerner, M. Y., Kastenmuller, W., Ifrim, I., Kabat, J., Germain, R. N. Histo-Cytometry: A Method for Highly Multiplex Quantitative Tissue Imaging Analysis Applied to Dendritic Cell Subset Microanatomy in Lymph Nodes. Immunity. 37 (2), 364-376 (2012).
- Bayne, L. J., Vonderheide, R. H. Multicolor Flow Cytometric Analysis of Immune Cell Subsets in Tumor-Bearing Mice. Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (10), (2013).
- Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. Optimization of murine small intestine leukocyte isolation for global immune phenotype analysis. Journal of Immunological Methods. 405, 97-108 (2014).
- Casadevall, A., Fang, F. C. Rigorous Science: A How-To Guide. mBio. 7 (6), 01902-01916 (2016).
- Yao, Y., et al. CyTOF supports efficient detection of immune cell subsets from small samples. Journal of Immunological Methods. 415, 1-5 (2014).
- Kay, A. W., Strauss-Albee, D. M., Blish, C. A. Application of Mass Cytometry (CyTOF) for Functional and Phenotypic Analysis of Natural Killer Cells. Methods Mol. Biol. 1441, 13-26 (2016).
- Pachynski, R. K., Scholz, A., Monnier, J., Butcher, E. C., Zabel, B. A. Evaluation of Tumor-infiltrating Leukocyte Subsets in a Subcutaneous Tumor Model. Journal of Visualized Experiments. (98), (2015).
