Summary
Здесь мы описываем метод для разделения и обогатить компоненты иммунной и неиммунизированных микроокружения опухоли в установленных подкожной опухоли. Эта техника позволяет для отдельного анализа иммунной инфильтрата опухоли и опухоли неиммунизированных фракций, допускающие всеобъемлющей характеристика иммунной микроокружения опухоли.
Abstract
Иммунных микроокружения опухоли (время) недавно был признан критическим посредника лечения реакции в солидных опухолей, особенно для immunotherapies. Последние клинические достижения в иммунотерапии подчеркивают необходимость для воспроизводимых методы точно и тщательно характеризовать опухоли и ее ассоциированных иммунной инфильтрата. Опухоль ферментативного пищеварения и анализ потока гранулярных позволяют широкий характеристика многочисленных подмножеств иммунных клеток и фенотипы; Однако глубина анализа часто ограничивается Флюорофор ограничений на дизайн панели и необходимость приобретения большой опухоли образцы наблюдать редких иммунитета населения интерес. Таким образом мы разработали метод эффективной и высокой пропускной способности для разделения и обогащение иммунной инфильтрата опухоль от компонентов неиммунизированных опухоли. Описанные опухоли пищеварение и центробежной сепарации на основе плотности техника позволяет отдельные характеристики опухоли и опухоли иммунной инфильтрата фракций и сохраняет клеточной жизнеспособности и таким образом, обеспечивает широкую характеристику опухоли Иммунологические состояние. Этот метод был использован для характеристики обширные пространственные иммунной гетерогенность в солидных опухолей, который еще раз демонстрирует необходимость последовательного всей опухоли иммунологические методы профилирования. В целом этот метод обеспечивает метод эффективной и гибкой для иммунологической характеристики подкожной мышиных солидных опухолей; Таким образом, этот инструмент может использоваться для лучше характеризуют опухолевой иммунологические особенности и в доклинической оценке новых иммунотерапевтических стратегий.
Introduction
ЭТИМ супрессивной недавно было признано в качестве отличительной чертой рака и известен играть значительную роль в разработке, прогрессии и защита твердых опухоли рака, а также уменьшить их подверженность иммунотерапия1. ВРЕМЯ состоит из многочисленных клеточных подмножеств и фенотипы, все из которых обеспечивают критический взгляд в состояние иммунологической опухоли. Эти иммунологические подмножества может быть далее разбиты на клетки лимфоцита или миелоидной происхождения, которые вместе составляют большинство врожденного и адаптивного иммунного ответа2,3. Последние достижения в области рака иммунотерапия продемонстрировали, что иммунотерапевтических стратегии (т.е., иммунных КПП ингибиторы, химерных антигена рецепторов Т-клетки и т.д.) имеют потенциал, чтобы побудить прочный рака регрессии; Однако они по-прежнему относительно неэффективными в твердые опухоли рака4,5. Многочисленные группы показали критическое препятствие, что время может играть на успех лечения6,7, и таким образом, сохраняется необходимость точно оценить новые immunotherapies в параметре доклинические, уделяя особое внимание их возможность модулировать или преодолеть время8.
Нынешние попытки характеризовать время обычно используют либо микроскопии или проточная цитометрия наряду с антитела обозначая стратегии выявления клеточных иммунных подмножеств и их особенности9,10. Эти две стратегии обеспечивают уникально различную информацию, как микроскопии позволяет пространственных признательность сотовой подмножеств и проточной цитометрии обеспечивает высокую пропускную способность и более широкой количественная оценка клеточных изменений. Несмотря на недавние улучшения в флуоресцентные мультиплекс иммуногистохимии, оптимизации спектральных тепловизионных систем, которые теперь может поддерживать до 7 параметры, ограниченной группы размер затрудняет широкий уровень иммунной профилирования и таким образом эта техника часто зарезервировано для более сосредоточены анализы. В результате проточной цитометрии остается одним из наиболее широко используемых иммунной, методы профилирования. Несмотря на широкое использование в характеристике времени методы, используемые для обработки и окраски являются довольно переменной. Чаще всего протоколы используют опухоль отделения фермента (то есть, коллагеназы, DNase, и т.д.) и ручной диссоциации методы для достижения одной ячейки суспензий, следуют антитело пятная и анализ7. Несмотря на преимущества каждого метода многочисленные группы показали большой изменчивости, который может быть вызван через эти методы11. Это крайне затрудняет сопоставление кросс исследование профилирования микроокружения опухоли, даже при оценке той же модели мышиных опухоли. Кроме того эти методы предоставляют ограниченный потенциал для оценки опухоли сотовой и опухоли иммунной проникновения компонентов независимо друг от друга, поскольку оба компонента перемежаются после переваривания. Количество образцов затем ограничивает мультипанельные окрашивание и анализа, который становится серьезной проблемой при попытке характеризовать редкие иммунологические подмножеств (то есть, опухоль – специфичные Т-клетки)12. Более последние методы массового цитометрии, или цитометрии на время полета (CyTOF), позволяют высокой мерного фенотипического анализа сотовой подмножеств с некоторых систем, поддерживающих конструкций группа более чем 42 независимых параметров13. Несмотря на огромную мощь CyTOF технологии в иммунной профилирование он остается ограниченным из-за расходов, анализ опыта и доступ к оборудованию. Кроме того, многие протоколы CyTOF рекомендуем очистки иммунных подмножеств для улучшения соотношения сигнал шум14, и поэтому мы предлагаем, что наш метод обогащения могут быть использованы вверх по течению от CyTOF анализа для повышения качества данных.
Здесь мы описываем пищеварение микроокружения опухоли и анализа, метод, который включает в себя опухоли иммунной проникновения разделения. Цель данного метода должна позволить независимым высок объём профилирование иммунной инфильтрата опухоли и опухоли сотовой фракций для широкого характеристика микроокружения опухоли. С помощью этого метода, мы еще больше продемонстрировать важность проведения анализа всей опухоли, как модель подкожной твердых опухолей было установлено значительное пространственная неоднородность иммунологические. В целом этот метод можно более точно и последовательно сравнить между выборками потому что оно обогащает иммунной сотовой подмножеств внутри опухоли и позволяет для независимого профилирования опухолевых клеток и иммунных фракций опухоли.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все методы, описанные здесь были одобрены институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC) колледж Бейлор.
1. опухоли урожай и пищеварение
Примечание: Время, необходимое для урожая составляет ~ 3-5 мин/опухоли и время, необходимое для обработки ~ 1 ч + 2-3 мин/опухоли.
- Усыпить мышей углекислый газ вдыханием и спрей каждой мыши вниз с 70% этанол до сбора урожая для предотвращения загрязнения волос. Хирургического удаления подкожной опухоли от мышей и убедитесь, что опухоли, свободны от каких-либо загрязняющих ткани (то есть, волос, кожи, брюшины, и т.д.). Место каждого опухоли в 1,8 мл базового RPMI 1640 СМИ без плода бычьим сывороточным (ФБС) в 24-ну пластине. Для больших урожаев Держите пластины холодной на льду сохранять клеточной жизнеспособности.
Примечание: Если требуется стерильности, все опухоли Анатомирование будет нужно выполнить в области биобезопасности, кабинет с стерильные хирургические инструменты (т.е., ножницы, пинцет и т.д.), а также любые дальнейшие шаги. Опухоли с длинной диаметром 0,5 - 1 см являются оптимальными, и потребует больших или меньших опухолей, масштабирование реагентов. - Используйте ножницы, чтобы вырезать опухоли на менее чем 1 мм3 штук в каждой скважине.
- Подготовка 10 x коктейль пищеварение, растворяя коллагеназы я в 10 мг/мл, коллагеназа IV на 2500 ЕД/мл и DNase I на 200 ед/мл в базовый RPMI 1640 СМИ (без FBS).
Примечание: Пищеварение коктейль могут быть подготовлены заранее день и хранятся при температуре-20 ° C; Однако длительного хранения не рекомендуется как ферменты потеряет деятельности с течением времени один раз распущен. - Добавить 200 мкл 10 x диссоциации коктейль, содержащий коллагеназы I, IV коллагеназы и DNase I к каждой скважины с 1 мм3 штук.
- Разрешить образцов дайджест за 1 ч при 37 ° C при слегка покачивая на 60-100 об/мин с помощью орбитальных пластины шейкер.
Примечание: Повышение температуры до 37 ° C в течение ферментативного пищеварения может привести к активации иммунных клеток. - После 1 h нейтрализации реакции, добавив 1 мл RPMI 1640 СМИ с 5% ЭДТА FBS и 2 мм для каждой скважины.
- Пипетка опухоли пищеварение и оставшиеся части опухоли в стрейнер клеток 40 мкм, сидящего на вершине 50 мл пластиковых пробирок.
Примечание: Отрежьте кончик офф кончик Пипетка 1 мл опухоли пищеварения проще передать ситечко. - Используйте 10 мл шприц плунжерный механически дезагрегировать части опухоли через стрейнер. Периодически промывать фильтр с 2 мл дополнениями RPMI 1640 СМИ (содержащая 5% FBS) и повторять до тех пор, пока ячейка ситечко ясно опухоли.
Примечание: Примерно 4-10 мл всего СМИ должно быть достаточно для адекватного промойте ситечко опухоли.
Примечание: Место образцы на льду до завершения этого шага для всех образцов для сохранения клеточной жизнеспособности. - Настройте каждый 50 мл пластиковых пробирок на том же, используя дополнениями RPMI 1640 средств массовой информации.
Примечание: Регулировка громкости имеет решающее значение для балансировки центрифуги. Пропустить этот шаг может привести к центрифуге повреждения или травмы. - Центрифуга для клеточных суспензий (5 мин, 805 x g, 4 ° C), отменить supernatants и вновь приостановить в 2 мл дополнениями RPMI 1640 средств массовой информации.
Примечание: Мобильный агрегат может образоваться после центрифугирования, что трудно Ресуспензируйте. Используйте 5 мл Серологические Пипетки и перемешать быстро разорвать его перед продолжением.
2. разделение фракций иммунной и опухоли сотовой
Примечание: Время, необходимое для этого шага составляет примерно 1 час.
- Добавьте 3 мл средний градиент плотности в нижней части пластиковых пробирок 15мл. Подготовить и ярлык достаточно трубы для каждого опухоли.
- Слой 2 мл суспензии клеток опухоли на вершине градиент средней плотности, закупорить медленно вниз стороне трубки для предотвращения смешивания двух слоев.
- Осторожно поместите многослойных труб в центрифуге и спина на 20 мин в 805 x g, 20 ° C, без тормозов.
Примечание: Очень важно для проверки надлежащего баланса и убедитесь, что тормоза не используется во время центрифугирования. Любое нарушение этого процесса приведет к слоя смешивания и полный пример восстановления будет сложно. - Тщательно передачи опухоли, проникнув лейкоцитов (сезам) слой и слой Топ СМИ к новой трубки 15 мл с помощью пипетки передачи. Отменить все оставшиеся среднего градиента плотности и Ресуспензируйте Пелле опухоли в нижней части трубки в 2 мл дополнениями RPMI 1640.
Примечание: После центрифугирования там будет четыре видимые слои сверху донизу, который соответственно соответствуют: СМИ, Тилс, средний градиент плотности и Пелле опухолевых клеток. Смотрите Рисунок 2A для примера различных слоев. - Центрифуга для обоих TIL и образцы опухоли в отдельные трубки (5 мин, 805 x g, 4 ° C) и удалить супернатант.
- Ресуспензируйте TIL образца в 200 мкл и Пелле опухоли в 2 мл дополнениями RPMI 1640 средств массовой информации. Держите на льду сохранять жизнеспособность.
3. покрытие и окрашивания
Примечание: Время, необходимое для покрытия составляет 30 s/опухоли; время, необходимое для окрашивания поверхности составляет 1 ч; время, необходимое для окрашивания внутриклеточных — 40 мин; время, необходимое для анализа потока цитометрии 1 - 4 мин/опухоли.
- Подготовить и подсчитывает лейбл 96-Ну U-дно пластина для каждого иммунной, окрашивание группа и дополнительные пластины для ячейки.
Примечание: Как правило, три тарелки подготовлены в общей сложности: лимфоцитов сосредоточена группа тарелку, миелоидной сосредоточена группа тарелку и блюдо количество клеток. - Аликвота сингл клеточных суспензий в каждый из окрашивание панель плиты и набор тома в пластину игр.
Примечание: Количество пластина используется для вычисления общее количество ячеек добавляется каждый окрашивание панель, тем самым позволяя точной клеток населения. Проточный цитометр с 96-луночных пластины выборки и объемный анализ возможностей может обеспечить количество клеток / мкл каждого образца и таким образом, подсчитать количество ячеек добавляется каждый окрашивание панели. Количество пластин может быть приобретено на следующий день после фиксации на ночь при 4 ° C, полоскание с СУИМ буфера (фосфат буфер солевой раствор (PBS) с 2% FBS) и resuspending в набор объем буфера СУИМ. - Вымойте клетки дважды с 200 мкл Дульбекко фосфатный буфер (DPBS) на сэмпл, центрифугирование (5 мин, 805 x g, 4 ° C) и отменяя супернатант между каждой промыть, чтобы удалить любые бесплатные FBS.
- Добавьте 50 мкл ФК блока, смешать образцов с помощью многоканальных дозаторов и проинкубируйте втечение 20 мин при 4 ° C.
- Добавьте 50 мкл 2 x сосредоточены внеклеточного таргетинга антитела и поправимо жизнеспособности пятно смесь, смешайте с помощью многоканальных дозаторов и Инкубируйте 30 мин в темноте на RT или 4 ° C.
Примечание: Точного окрашивания условия для антитела зависит от инструкции производителя. Все окрашивание разведений должны быть в DPBS, с не добавлен FBS для предотвращения насыщения поправимо жизнеспособности красителя. Пожалуйста, смотрите Таблицу материалы/оборудование для оптимального разведений окрашивание панели, используемые в этой рукописи. В 2 x концентрации антител и поправимо жизнеспособности, окрашивание раствора готов предоставить окончательный 1 x пятнать концентрация в 100 мкл окрашивание объема при добавлении блока ФК. - Стирать образцы дважды с буфером СУИМ, центрифугирование (5 мин, 805 x g, 4 ° C) и отменяя supernatants между каждой промывки.
- Ресуспензируйте в 200 мкл 1 x фиксации/permeabilization решение и инкубировать на ночь при 4 ° C, защищать от света.
Примечание: Эксперимент может быть приостановлена на ночь на данный момент: хранить пробы на 4 ° C, защищать от света. - На следующий день, центрифуга пластины (5 мин, 805 x g, 4 ° C) и удалить супернатант.
- После промойте 200 мкл 1 x permeabilization буфера, центрифуг (5 мин, 805 x g, 4 ° C) и удалить супернатант.
- 100 мкл 1 x концентрации внутриклеточного антитело пятная группы подготовленный в буфере 1 x permeabilization и Инкубируйте 30 мин в темноте на RT или 4 ° C (это зависит от окрашивания рекомендаций от производителя).
- Промыть после того, как с 1 x permeabilization буфера (5 мин, 805 x g, 4 ° C), удалить супернатант и полоскать во второй раз с буфером СУИМ (PBS с 2% FBS).
- Ресуспензируйте образцы в 300 мкл буфера СУИМ (PBS с 2% FBS), передавать образцы цитометрии расходомерных трубок и выполнять анализ цитометрия потоков.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Наши результаты показывают значительное преимущество TIL отделение от опухоли неиммунизированных компонентов, как описано в протоколе. Кроме того мы с помощью метода описаны продемонстрировать значительный иммунологические неоднородность установленных солидных опухолей.
Серьезной проблемой с много методов диссоциации опухоли является потеря жизнеспособности образца, чаще всего в результате суровых пищеварение условия (то есть, повышенных температур, нехваткой питательных веществ и т.д.). Использование метода описаны пищеварение, с или без плотность градиента средних обогащения, обеспечивает около 70-90% всего клеточной жизнеспособности как оцениваются проточной цитометрии (рис. 1А). В TIL наблюдались аналогичные жизнеспособность обогатили и опухоли обогащенный фракций, предполагая, что этот метод вызывает минимальной общей токсичности (рис. 1, рис. 2C). Кроме того, градиент средней обогащения плотности способствует больше чем в 2 раза увеличение CD45 положительные TIL долю среди общего числа жизнеспособных клеток проанализированы по сравнению с необогащенного опухоли пищеварения (Рисунок 1B, C). Кроме того было обнаружено обогащения для повышения многочисленные подгруппы иммунных клеток, широко оценены в иммунной микроокружения исследований, включая клетки миелоидного производные супрессор (MDSCs), дендритные клетки (DCs), макрофаги, CD8 Т-клеток и CD4 Т-клеток ( Рисунок 1D, E). Это свидетельствует о том, что плотность градиента средних обогащения содействует глобальной immunocyte обогащения и не изолировать конкретных лимфоцита или миелоидной населения (см. дополнительный Рисунок 1A, B для проточной цитометрии стробирования метод, используемый для идентификации конкретной популяции клеток). Стоит отметить, однако, что многие коммерчески доступных плотность градиента разделения СМИ позволяют значительная часть эритроцитов и гранулоцитов пройти через этап разъединения. Таким образом если эти группы населения имеют интерес, дальнейшая оптимизация протокола может быть необходимым.
Рисунок 1 : Мягкое и эффективное обогащение иммунной опухолевого инфильтрата. Установленных МЕЕР опухоли был вырезан и переваривается с использованием метода описано. После переваривания сингл клеточной суспензии были разделены таким образом, что половина претерпела градиента плотности среднего обогащения и другая половина были непосредственно витражи. (A) совокупный поток цитометрии оценки клеточной жизнеспособности для пищеварения опухоли с или без градиента плотности среднего обогащения. (B) представитель проточной цитометрии стробирования участки показаны CD45 положительные иммунные клетки обогащение одного опухоли пищеварения с и без градиента плотности среднего обогащения. (C) совокупный поток цитометрии CD45 позитивных клеток показателей среди всего жизнеспособные клетки из опухоли пищеварения с или без градиента плотности среднего обогащения. (D) коэффициенты обогащения различных миелоидного и иммунных популяций лимфоцитов. Опухоли были переваривается в одну ячейку подвеска перед быть пятнами прямо или проходят градиента плотности обогащения до окрашивания и потока cytometry анализ. Коэффициент обогащения каждого типа клеток была рассчитана путем деления данной популяции клеток процент (среди всего жизнеспособных клеток начисленных) от пищеварения градиента обогащенного опухоли плотность его коллега необогащенного. Бар линии представляют собой медиану и края панели представляют собой минимальные и максимальные показатели. (E) таблица иммунной клеточных маркеров выражение, используемое для идентификации каждого иммунных клеток населения проанализированы. Статистическая значимость определялась с непарных t тест или тест Манна-Уитни. p < 0,05, **p < 0.01, ***p < 0,001, ***p < 0,0001, (n = 20 опухоли, N = 2 для всех графиков). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Одним из наиболее значительных преимуществ, которые предоставляет этот метод является способность самостоятельно профиль фракции неиммунизированных опухоли. После изоляции гранулированных неиммунизированных опухоли фракции, которая проходит через этапа среднего градиента плотности, могут выполняться сложные опухоли, профилирование панели, который ранее возможно были ограничены по номеру Флюорофор и ограничения количества образцов. Рисунок 2 A пример характеристика цитометрии потока опухоли с более чем 70% жизнеспособность и 99% CD45 отрицательные клетки обогащения. CD45 негативные дроби можно профилировать затем многочисленные опухоли функций, таких как общей жизнеспособности опухоли или apoptosis (то есть, caspase 3, annexin V и т.д.), распространения потенциал (т.е., Ki67) и выражения различных Иммунодепрессивные маркеры (то есть, запрограммированных смерти лиганд 1 (PD-L1) или PD-L2). Однако, следует отметить, что CD45 негативные фракция включает в себя опухолевых клеток, а также других элементов стромы и сосудистой микроокружения опухоли. Таким образом, если требуется прямой опухолевых клеток характеристика, опухолевых клеток конкретных маркер необходимо будет использоваться (т.е., Цитокератины, конкретных опухольассоциированных антигенов и т.д.). Аналогичным образом другие элементы стромальные опухоли может быть легко распознать и характеризуется после маркировки с маркером типа клеток конкретных такие опухоли сосудистой эндотелиальных клеток (CD31) и рака связаны фибробластов (α-гладких мышц актина). Тем не менее уровень жизнеспособность и CD45 отрицательные клетки обогащения весьма последовательной через повторяющиеся образцы, указывающее надежности метода градиента разделения плотности для обогащения компонент неиммунизированных опухоли (рис. 2B, C ).
Рисунок 2 : Обогащение и профилирования функций компонента неиммунизированных опухоли. (A) представитель изображение образца после плотность градиента средних обогащения с видимыми СМИ слой (розовый), ТИЛЬ слой (тонких темных белый), плотность градиента средний слой (прозрачный) и Пелле опухоли в нижней части трубки. (B) представитель проточной цитометрии стробирования стратегии, используемые для профилирования неиммунизированных опухолевого компонента с точечной жизнеспособность клеток (вверху), CD45 отрицательные клетки обогащения точечная (внизу слева) и три независимых маркеров, представляющих интерес выражение через участков гистограммы (PD-L1 сверху, PD-L2 среднего и нижней Ki67). FMO Гистограмма представляет образец витражи со всеми другими цветами группа, но отсутствует маркер интерес. Оценки совокупного потока цитометрии клеточной жизнеспособности (C) и (D) CD45 отрицательные клетки проценты среди общего числа жизнеспособных клеток опухоли Пелле фракции после градиента плотности среднего обогащения (n = 7-8 опухоли). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Несмотря на значительные усилия, чтобы характеризовать генетической гетерогенностью твердых опухолей мало работы есть подробная пространственная неоднородность иммунологические подмножеств в солидных опухолей. Таким образом, мы стремились определить как миелоидного и иммунологические лимфоцитов, резко различаются на протяжении одной твердой опухоли. Таким образом установленным МЕЕР опухоли был разделен на четыре равные части с особой тщательностью, чтобы убедиться, что каждый раздел содержит приблизительно равных интра опухолевой регионов, а также равных дермального - и перитонеального облицовки части (рис. 3А). Каждый кусок опухоли был переваривается отдельно и затем обогащенная средний градиент плотности и раскол среди миелоидного и лимфоцитов панели. Это позволило количественной оценки различных функций, включая количество населения часто начисленных immunocyte: Т-клеток, клеток CD4 + T, CD8 + Т-клетки, макрофаги, DCs, MDSCs (см. дополнительный Рисунок 1A, B для проточной цитометрии стробирования стратегия). В рамках одной опухоли значительные клеток изменчивость между разделами различные опухоли был отмечено (рис. 3b). Например, DC и Т-клеток всего клеток были найдены в зависимости от как 4 до 5 раз среди частей прилегающих опухоли. Эти кардинальные изменения были также отмечены когда анализа мобильных групп населения в процентах от общего числа жизнеспособных клеток (дополнительный рисунок 2A) и были замечены на аналогичных уровнях в двух других независимых опухолей (дополнительный рисунок 2B, C). Эти данные свидетельствуют о важности изоляции и анализа всей опухоли при выполнении анализа иммунной микроокружения, который может показаться нелогичным, если текущие протоколы включают деления опухоли для дополнительного анализа независимым методы (т.е., гистология, количественного определения РНК и т.д.). Кроме того эти данные могут объяснить расхождения в иммунологические анализы биопсий опухоли, как региональные внутриопухолевых иммунологической неоднородностью резко может исказить результаты биопсии.
Рисунок 3 : Оценка установленных опухоли иммунной гетерогенности. (A) представитель изображение установленных МЕЕР опухоли после хирургической резекции (слева) и после того, как равное разделение на 4 прилегающих частей (справа). Линейки-1 см, показано в черном на каждом изображении. (B) раз изменения различных миелоидного и лимфоцитов ячейки подсчитывает между каждой из 4 частей прилегающих опухоли; Каждый раздел тумора прошли же пищеварение, плотность градиента средних обогащения процедуры, окрашивание и анализа. Каждая часть опухоли показана как изменение раза количество клеток, как определяется путем деления его счетчик клеток, опухоли часть с низкой анализируемого клеток счетчик для заданной ячейки населения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Дополнительные Рисунок 1: представитель проточной цитометрии стробирования стратегии, используемые для профилирования иммунной компонент опухоли. (A) стробирование стратегии с соответствующими точечные участки, используемые для профилирования иммунного лимфоцита. (B) стробирование стратегии с соответствующими точечные участки, используемые для опухоли миелоидного иммунной профилирования. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Дополнительные Рисунок 2: дополнительные оценки неоднородности установленных опухоли. (A) сотовых процент среди общего числа жизнеспособных клеток раз переход от 4 равных опухоли части показано на рисунке 3. (B) и (C) являются два дополнительных установленных МЕЕР опухоли разделен на 4 прилегающих частей и проанализированы для иммунной неоднородность опухоли. Изменения раза количество клеток (слева) и ячейки в процентах среди общего числа жизнеспособных клеток сбросить изменения (справа) для каждого миелоидного и популяции клеток лимфоцитов проанализированы показаны изменчивость каждого из 4 частей прилегающих опухоли. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ВРЕМЯ состоит из разнообразных и сложных клеточных компонентов и молекул. Последние данные свидетельствуют о том, что точная характеристика этой среды может обеспечить более глубокого понимания лечения успеха или неудачи и может даже помочь определить механизмы терапевтического сопротивления. Например повышение уровня внутриопухолевых различных иммуносупрессивные клеток (т.е., MDSCs, регуляторных клеток T и т.д.) могут смягчить эффекторных иммунных реакций и отменить иммунотерапевтических эффекты. С другой стороны все большее присутствие внутриопухолевых эффекторных иммунитета населения (например, опухоль – специфичные CD8 + Т-клеток, естественных клеток-киллеров, Т-хелперы) может быть мощным предикторы успех лечения. Еще одна характеристика, что продолжает точно представлять опухоли иммунологического статуса является Фенотипические особенности опухолевых клеток, сами. Это включает в себя выражение различных иммуносупрессивные лигандов, ферменты или молекул, направленных на экспрессируемых эффекторных иммунные реакции (например, PD-L1, PD-L2, indolamine 2,3 dioxygenase, оксид азота и т.д.). Взятые вместе, это свидетельствует о необходимости для точной и широкий характеристика опухоли, так и иммунной клеточных функций твердых опухолей.
Технику, которую мы опишем здесь позволяет сепарация и обогащение иммунной и опухолевых клеток компонентов твердых мышиных подкожной опухоли. Затем независимых потока гранулярных профилирования может выполняться таким образом, чтобы полный рабочий день и взаимодействие опухолевых клеток со временем могут быть оценены. После обогащения обширные иммунной потока цитометрии панелей могут быть оптимизированы для дать характеристику ключевых миелоидного и лимфоидных клеточных компонентов, а также разнообразные возможности, описывая их фенотипические статуса. Аналогичным образом обширные опухолевых клеток сосредоточена группа может использоваться самостоятельно для предоставления широкого характеристика опухолевых клеток функций, а также. Относительная простота эта техника позволяет для одновременного анализа большого числа мышиных опухоли, который имеет решающее значение для отслеживания тенденций несмотря на биологическая изменчивость мышиных опухоли моделей. Кроме того опухоль иммунной обогащения обеспечивает лучшую идентификацию редкие иммунологические подмножеств (то есть, опухоль – специфичные цитотоксических Т-клеток), которые часто значительно недопредставлены в опухоли по сравнению с другими компонентами-иммунных клеток . Оптимизации этой техники можно разрешить дополнительные течению анализы на эти изолированные подмножеств, требующие обогащения, таких как coculture ex vivo анализов, мРНК профилирование, или приемных клеток передачи исследований.
Используя эту технику в подкожной опухоли мышиных модели, мы демонстрируем значительное обогащение глобальный и независимый иммунной подмножеств. Мы также продемонстрировать неиммунизированных опухоли, профилирования, которое может быть достигнуто с же образцы опухоли. Наконец мы показать важность всей опухоли иммунологические профилирования, как мы наблюдали значительный иммунологические гетерогенность в смежных разделах опухоли. В идеале, этот метод на основе DNase пищеварения и коллагеназы и градиента на основе разделения фракций иммунной и неиммунизированных опухоль может применяться к большинство из мышиных опухоли моделей, как ортотопическая и подкожно. Мы также отмечаем, что небольшие опухоли внештатных и меньше коллагена плотная опухоль модели (т.е., B16 меланомы) часто не требуют ферментативного пищеварения шаг для создания одного клеточной суспензии15; Однако, на основе градиента иммунной обогащения выполняет одинаково также в этих моделях опухоли, далее проверка его универсальность. Несмотря на ранее обеспокоенность коллагеназы антигена пищеварения на определенных клеточных подмножеств11мы еще должны соблюдать заметные потери окрашивания качества для любой из маркеров, которые мы профилированного. Тем не менее антиген чувствительность к этим условиям пищеварения следует оценивать с помощью надлежащего управления не усваиваются образцы до широкого принятия этой техники.
В заключение наша техника позволяет для точной, широкие и высок объём характеристика опухоли иммунной и неиммунизированных компонентов мышиных солидных опухолей. Выполняя независимых профилирование этих подмножеств, исследователи могут широко характеризуют время и понять лучше механистический твердые опухоли доклинических терапии. Этот метод может применяться легко подавляющее большинство мышиных опухоли моделей для анализа высокой пропускной способности лимфоцитов и миелоидный immunocyte численности населения и фенотипы через проточной цитометрии, или других течению анализов, которые требуют подмножество обогащения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
JMN признает финансовую поддержку от национального института Генеральной медицинских наук (T32GM088129) и Национального Института стоматологии и челюстно-лицевой исследований (F31DE026682), оба из национальных институтов здравоохранения. Содержание является исключительно ответственности авторов и не обязательно отражают официальную точку зрения национальных институтов здоровья. Этот проект был поддержан также цитометрии и сортировка сердечник клетки в колледж Бейлор с финансирования из низ (P30 AI036211 Р30 CA125123 и S10 RR024574) и экспертной помощи Джоэл м. Sederstrom.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6 to 12 week old male C57BL/6 mice | Jackson Laboratory | N/A | Mice used in our tumor studies |
| MEER Murine Syngeneic Cancer Cell line | Acquired from collaborator | N/A | E6/E7 HPV antigen expressing murine tonsillar epithelial cancer cell line |
| 70% isopropyl alcohol | EMD Milipore | PX1840 | |
| Murine surgical tool kit | World Precision Instruments | MOUSEKIT | Primarily only need scissors, tweezers, and a scalpel. |
| 24-well plate | Denville Scientific Inc. | T1024 | Or any 24-well flat bottom plate. |
| RPMI-1640 media | Sigma-Aldrich | R0883 | |
| Collagenase I | EMD Milipore | 234153 | |
| Collagenase IV | Worthington Biochemical Corporation | LS004189 | |
| DNase I | Sigma-Aldrich | 11284932001 | |
| Low Speed Orbital Shaker | BioExpress (supplier: Genemate) | S-3200-LS | Or any orbital shaker. |
| Thermoregulating incubator | Fisher Scientific | 13-255-27 | Or any other thermo-regulated incubator |
| FBS | Sigma-Aldrich | F8192 | |
| EDTA | AMRESCO | E177 | |
| 1 mL Pipette and tips | Eppendorf | 13-690-032 | Or any other pipette and tips |
| 40 um Cell Strainers | Fisher Scientific | 22363547 | |
| 50 mL Centrifuge Tubes | Denville Scientific Inc. | C1062-P | |
| 15 mL Conical Tubes | Denville Scientific Inc. | C1012 | |
| 10 mL Luer-Lok Syringe without needles | BD | 309604 | |
| Lymphoprep Density Gradient Medium | STEMCELL Technologies | 7811 | |
| Transfer Pipettes | Denville Scientific Inc. | P7212 | |
| 96-well U-bottom plates | Denville Scientific Inc. | ||
| DPBS | Sigma Aldrich | D8573 | |
| FoxP3 Transcription Factor Staining Buffer Set | ThermoFisher Scientific | 00-5523-00 | Fix/Permeabilization Buffer and Permeabilization Buffer |
| Thermoregulated Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
| Attune NxT Flow Cytometer | ThermoFisher Scientific | N/A | For 96-well cell volumetric counting |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) Clone 2.4G2 | ThermoFisher Scientific | 553141 | Fc Block |
| LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, for UV excitation | ThermoFisher Scientific | L34962 | Fixable viability stain |
| CD45 Monoclonal Antibody (30-F11), APC-eFluor 780 | ThermoFisher Scientific | 47-0451-80 | |
| TCR beta Monoclonal Antibody (H57-597), APC | ThermoFisher Scientific | 17-5961-82 | |
| CD8-α Antibody (KT15), PE | Santa Cruz Biotechnology | sc-53473 | |
| CD4 Monoclonal Antibody (GK1.5), PE-Cyanine5 | ThermoFisher Scientific | 15-0041-81 | |
| MHC Class II (I-A/I-E) Monoclonal Antibody (M5/114.15.2), Alexa Fluor 700 | ThermoFisher Scientific | 56-5321-82 | |
| CD11c Monoclonal Antibody (N418), PE-Cyanine5 | ThermoFisher Scientific | 15-0114-82 | |
| F4/80 Monoclonal Antibody (BM8), eFluor 450 | ThermoFisher Scientific | 48-4801-80 | |
| CD11b Monoclonal Antibody (M1/70), APC | ThermoFisher Scientific | 17-0112-81 | |
| Ly-6G (Gr-1) Monoclonal Antibody (RB6-8C5), PE | ThermoFisher Scientific | 12-5931-82 | |
| CD274 (PD-L1, B7-H1) Monoclonal Antibody (MIH5), PE-Cyanine7 | ThermoFisher Scientific | 25-5982-80 | |
| CD273 (B7-DC) Monoclonal Antibody (122), PerCP-eFluor 710 | ThermoFisher Scientific | 46-9972-82 | |
| Ki-67 Monoclonal Antibody (B56), BV711 | BD Biosciences | 563755 |
References
- Fouad, Y. A., Aanei, C. Revisiting the hallmarks of cancer. American Journal of Cancer Research. 7 (5), 1016-1036 (2017).
- Gajewski, T. F., Schreiber, H., Fu, Y. -X. Innate and adaptive immune cells in the tumor microenvironment. Nature Immunology. 14 (10), 1014-1022 (2013).
- Whiteside, T. L. The tumor microenvironment and its role in promoting tumor growth. Oncogene. 27 (45), 5904-5912 (2008).
- Chiou, V. L., Burotto, M. Pseudoprogression and Immune-Related Response in Solid Tumors. Journal of Clinical Oncology. 33 (31), 3541-3543 (2015).
- Menon, S., Shin, S., Dy, G. Advances in Cancer Immunotherapy in Solid Tumors. Cancers. 8 (12), 106 (2016).
- Denkert, C., et al. Tumor-Associated Lymphocytes As an Independent Predictor of Response to Neoadjuvant Chemotherapy in Breast Cancer. Journal of Clinical Oncology. 28 (1), 105-113 (2010).
- Lee, Y., et al. Therapeutic effects of ablative radiation on local tumor require CD8+ T cells: changing strategies for cancer treatment. Blood. 114 (3), 589-595 (2009).
- Stakheyeva, M., et al. Role of the immune component of tumor microenvironment in the efficiency of cancer treatment: perspectives for the personalized therapy. Current Pharmaceutical Design. 23, (2017).
- Gerner, M. Y., Kastenmuller, W., Ifrim, I., Kabat, J., Germain, R. N. Histo-Cytometry: A Method for Highly Multiplex Quantitative Tissue Imaging Analysis Applied to Dendritic Cell Subset Microanatomy in Lymph Nodes. Immunity. 37 (2), 364-376 (2012).
- Bayne, L. J., Vonderheide, R. H. Multicolor Flow Cytometric Analysis of Immune Cell Subsets in Tumor-Bearing Mice. Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (10), (2013).
- Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. Optimization of murine small intestine leukocyte isolation for global immune phenotype analysis. Journal of Immunological Methods. 405, 97-108 (2014).
- Casadevall, A., Fang, F. C. Rigorous Science: A How-To Guide. mBio. 7 (6), 01902-01916 (2016).
- Yao, Y., et al. CyTOF supports efficient detection of immune cell subsets from small samples. Journal of Immunological Methods. 415, 1-5 (2014).
- Kay, A. W., Strauss-Albee, D. M., Blish, C. A. Application of Mass Cytometry (CyTOF) for Functional and Phenotypic Analysis of Natural Killer Cells. Methods Mol. Biol. 1441, 13-26 (2016).
- Pachynski, R. K., Scholz, A., Monnier, J., Butcher, E. C., Zabel, B. A. Evaluation of Tumor-infiltrating Leukocyte Subsets in a Subcutaneous Tumor Model. Journal of Visualized Experiments. (98), (2015).
