Summary
Aquí se describe un método para separar y enriquecer los componentes del microambiente tumoral inmune y no inmune en tumores subcutáneos establecidos. Esta técnica permite el análisis separado de infiltrado inmune tumor y fracciones de tumor no inmune que pueden permitir una caracterización completa del microambiente tumoral inmune.
Abstract
El microambiente inmunológico del tumor (tiempo) se ha reconocido recientemente como un mediador crítico de la respuesta al tratamiento en tumores sólidos, especialmente para las inmunoterapias. Últimos avances clínicos en inmunoterapia destacan la necesidad de métodos reproducibles con precisión y completamente caracterizar el tumor y su infiltrado inmune asociada. Digestión enzimática del tumor y análisis cytometric del flujo permiten amplia caracterización de varios subconjuntos de células inmunitarias y fenotipos; sin embargo, profundidad del análisis a menudo está limitada por restricciones de fluoróforo en diseño del panel y la necesidad de adquirir muestras de tumor grande observar raras poblaciones inmunes de interés. Así, hemos desarrollado un método eficaz y alto rendimiento de separación y de enriquecer el infiltrado inmune del tumor de los componentes del tumor no inmunes. La digestión de tumor descrito y separación centrífuga de densidad permite caracterización independiente de tumor y el tumor fracciones infiltrado inmune y preserva la viabilidad celular y por lo tanto, proporciona una amplia caracterización del tumor estado inmunológico. Este método fue utilizado para caracterizar la heterogeneidad inmune espacial amplia en tumores sólidos, que demuestra la necesidad de técnicas perfiles inmunológicos tumor entero coherente. En general, este método proporciona una técnica eficaz y adaptable para la caracterización inmunológica de tumores murinos sólidos subcutáneos; como tal, esta herramienta puede utilizarse para caracterizar mejor las características inmunológicas tumorales y en la evaluación preclínica de nuevos estrategias de inmunoterapia.
Introduction
El momento represivo ha sido recientemente reconocido como un sello distintivo del cáncer y se sabe que juega un papel importante en el desarrollo, progresión y protección de los cánceres de tumor sólido así como reducir su susceptibilidad a la inmunoterapia1. El tiempo se compone de numerosos subconjuntos celulares y fenotipos, que proporcionan una visión crítica del estado inmunológico del tumor. Estos subconjuntos inmunológicos pueden ser estratificados más en células de origen mieloide, o linfocitos que juntos constituyen la mayoría de las respuestas inmunitarias innata y adaptativa2,3. Los avances recientes en el campo de la inmunoterapia de cáncer han demostrado que estrategias de inmunoterapia (es decir, los inhibidores de control inmune, receptor del antígeno quimérico de las células T, etc.) tienen el potencial para inducir cáncer durable regresiones; sin embargo, siguen siendo relativamente ineficaz en cánceres de tumor sólido4,5. Numerosos grupos han mostrado el obstáculo fundamental que puede jugar en el tiempo en tratamiento éxito6,7, y por lo tanto, existe una necesidad de evaluar con precisión nuevas inmunoterapias en el ajuste pre-clínico centrándose específicamente en su capacidad de modular o superar el tiempo8.
Los esfuerzos actuales para caracterizar el tiempo típicamente utilizan cualquiera microscopia o fluyen cytometry junto con anticuerpo etiquetado estrategias para identificar subconjuntos celulares inmunes y sus características9,10. Estas dos estrategias proporcionan únicamente información, como microscopía permite apreciación espacial de subconjuntos celulares y citometría de flujo proporciona alto rendimiento y cuantificación más amplio de los cambios celulares. A pesar de las mejoras recientes en inmunohistoquímica multiplex fluorescente optimizando los sistemas de proyección de imagen espectrales, que ahora pueden soportar hasta 7 parámetros, tamaño del panel limitado dificulta amplio nivel inmune perfiles y por lo tanto esta técnica es a menudo reservado para más centrado el análisis. Como resultado, citometría de flujo sigue siendo uno de inmune más utilizada técnicas de perfiles. A pesar de su uso generalizado en la caracterización del tiempo, los métodos utilizados para el procesamiento y coloración son muy variable. Más a menudo los protocolos utilizan un tumor disociación enzimática (es decir, colagenasas, ADNasa, etc.) y métodos de disociación manual para lograr suspensiones unicelular, seguida de anticuerpos de tinción y análisis7. A pesar de las ventajas de cada método, numerosos grupos han demostrado la amplia variabilidad que puede ser inducida a través de estas técnicas11. Esto hace comparaciones Cruz-estudio de perfiles de microambiente del tumor extremadamente difícil, incluso al evaluar el mismo modelo tumoral murino. Además, estos métodos proporcionan un potencial limitado para evaluar tumor celular e inmune tumor infiltra componentes independientemente, puesto que ambos componentes se entremezclan después de la digestión. Entonces límites de cantidad de muestra varios paneles de tinción y análisis, que se convierte en un problema de importancia cuando se intenta caracterizar subconjuntos inmunológicos raros (tumor-específicas, es decir, las células T)12. Técnicas más recientes como la citometría de masas o citometría por tiempo de vuelo (CyTOF), permiten análisis fenotípico multidimensional de subconjuntos celulares con algunos sistemas de apoyo a diseños de panel de más de 42 parámetros independientes13. A pesar del tremendo poder de CyTOF tecnología en perfiles inmune, sigue siendo limitada debido a los gastos, conocimientos de análisis y el acceso al equipo. Además, muchos protocolos CyTOF recomiendan purificación de inmunes subconjuntos para mejorar cocientes signal-to-noise14, y por lo tanto sugerimos que se podría utilizar nuestro método de enriquecimiento de CyTOF análisis para mejorar la calidad de los datos.
Adjunto describimos un análisis método que incorpora a inmune tumor infiltra la separación y digestión de microambiente del tumor. El propósito de este método es permitir perfiles de alto rendimiento independiente del infiltrado inmune tumor y fracciones celulares de tumor para una caracterización más amplia del microambiente tumoral. Usando este método, más demostramos la importancia de realizar análisis de todo tumor, como un modelo de tumor sólido subcutáneo fue encontrado para tener heterogeneidad inmunológica espacial significativa. En general, este método puede más exactamente y constantemente comparar entre muestras porque se enriquece en un subgrupo celular inmune dentro del tumor y permite perfiles independientes de la célula tumoral y fracciones inmunes de un tumor.
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Protocol
Todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por el institucional cuidado Animal y el Comité uso (IACUC) de la Baylor College of Medicine.
1. digestión y la cosecha tumor
Nota: El tiempo requerido para la cosecha es ~ 3-5 min/tumor y el tiempo requerido para el procesamiento de es ~ 1 h + 2-3 min/tumor.
- Eutanasia a ratones por la inhalación de dióxido de carbono y rocíe cada ratón abajo con etanol al 70% antes de la cosecha para evitar la contaminación del cabello. Quirúrgicamente quitar tumores subcutáneos de los ratones y asegúrese de que los tumores estén libres de cualquier contaminante del tejido (es decir, pelo, piel, peritoneo, etc.). Coloque cada tumor en 1,8 mL de base medios RPMI-1640 sin suero fetal bovino (FBS) en una placa de 24 pozos. Para las cosechas más grandes, mantener las placas frías sobre hielo para preservar la viabilidad celular.
Nota: Si la esterilidad es necesaria, todas las disecciones tumor tendrá que realizarse en un gabinete con instrumentos quirúrgicos estériles (es decir, tijeras, pinzas, etc.), así como cualquier otras medidas de bioseguridad. Tumores con el diámetro más largo entre 0.5 - 1 cm son óptimos, y los tumores más grandes o más pequeños requerirá escala de reactivos. - Utilice tijeras para cortar los tumores menos de 1 mm3 piezas de cada pozo.
- Preparar un 10 x digestión cóctel disolviendo colagenasa en 10 mg/mL, colagenasa IV en 2.500 U/mL y DNasa I en 200 U/mL de base medios RPMI-1640 (sin equipos).
Nota: La digestión cóctel puede ser preparada un día de antelación y almacenada a-20 ° C; sin embargo, un almacenamiento prolongado no se recomienda que las enzimas pierden actividad con el tiempo una vez disuelto. - Añadir 200 μL de 10 x Cóctel de disociación que contienen colagenasa I, colagenasa IV y DNasa I para cada pozo con los trozos de 1 mm3 .
- Permita que las muestras a digerir por 1 h a 37 º C agitando ligeramente a 60-100 rpm usando un agitador de placa orbital.
Nota: La elevación de la temperatura a 37 ° C durante la digestión enzimática puede causar activación inmune de la célula. - Después de 1 h, neutralizar la reacción mediante la adición de 1 mL de Medio RPMI-1640 suplementado con 5% FBS y 2 mM EDTA a cada pocillo.
- Pipetear la digestión del tumor y las piezas restantes del tumor en un tamiz de 40 μm celular sentado encima de un tubo de centrífuga de 50 mL.
Nota: Cortar la punta de una pipeta de 1 mL para transferir más fácil la digestión del tumor a la coladera. - Utilice un émbolo de la jeringa de 10 mL para separar mecánicamente las piezas tumor a través de la coladera. Periódicamente enjuague el filtro con 2 mL de Medio RPMI-1640 suplementado (que contiene 5% SBF) y repita hasta que el filtro de la celda esté libre de tumor.
Nota: Aproximadamente 4-10 mL de medio total debe ser suficiente para limpiar adecuadamente el filtro del tumor.
Nota: Coloque las muestras en hielo hasta que se complete este paso para que todas las muestras preservar la viabilidad celular. - Ajustar cada tubo de centrífuga de 50 mL para el mismo volumen utilizando los medios RPMI-1640 suplementados.
Nota: El ajuste de volumen es crítico para el equilibrio de la centrífuga. Saltarse este paso podría resultar en la centrifugadora daños o lesiones personales. - Centrifugar la suspensión celular (805 x g, 5 min, 4 ° C), desechar el sobrenadante y resuspender en 2 mL de Medio RPMI-1640 suplementado.
Nota: Se puede formar un agregado celular después de la centrifugación que es difícil de volver a suspender. Utilice una pipeta serológica de 5 mL y mezclar rápidamente para romper antes de proceder.
2. separación de fracciones celulares inmunes y Tumor
Nota: El tiempo necesario para este paso es aproximadamente de 1 h.
- Añadir 3 mL de medio de gradiente de densidad en la parte inferior de un tubo de centrífuga de 15 mL. Prepare y etiquete suficientes tubos para cada tumor.
- Los 2 mL de suspensión de células de tumor en la parte superior del medio de gradiente de densidad de la capa transfiriendo poco a poco hacia el lado del tubo para evitar la mezcla de las dos capas.
- Coloque cuidadosamente los tubos de capas en la centrifugadora y vuelta por 20 min a x g 805, 20 ° C, con ningún freno.
Nota: Es muy importante verificar el equilibrio adecuado y asegurarse de que no hay freno se utiliza durante la centrifugación. Cualquier interrupción de este proceso resultará en la capa de mezcla y la recuperación completa de la muestra va a ser difícil. - Transferir cuidadosamente el tumor infiltración leucocitaria (TIL) capa y la capa superior a un nuevo tubo de 15 mL con una pipeta de transferencia. Deseche todo medio de gradiente de densidad restante y resuspender el precipitado de tumor en la parte inferior del tubo 2 ml de RPMI-1640 suplementado.
Nota: Después de la centrifugación habrá cuatro capas visibles desde la parte superior a inferior que corresponden respectivamente a: los medios de comunicación, TILs, medio de gradiente de densidad y precipitado de células del tumor. Vea la figura 2A un ejemplo de las distintas capas. - Tanto el TIL de centrífuga y muestras tumorales en tubos (5 min, 805 x g, 4 º C) y descarte el sobrenadante.
- Resuspender la muestra hasta 200 μl y la pelotilla del tumor en 2 mL de Medio RPMI-1640 suplementado. Mantenga en hielo para preservar la viabilidad.
3. galjanoplastia y la coloración
Nota: El tiempo necesario para la galjanoplastia es 30 s, tumor; el tiempo necesario para la tinción de la superficie es de 1 h; el tiempo necesario para la tinción intracelular es de 40 minutos; el tiempo necesario para el análisis de citometría de flujo es de 1 - 4 min, tumor.
- Preparar y cuenta con placa de etiqueta un fondo U de 96 pocillos para cada inmune coloración panel y una placa adicional para celular.
Nota: Por lo general, tres platos se preparan en total: una placa panel centrado de linfocitos, una placa de panel mieloide centrado y una placa de recuento celular. - Las suspensiones unicelular en cada uno de la tinción alícuota panel de placas y un volumen del sistema en la placa de recuento.
Nota: La placa de la cuenta se utiliza para calcular el número total de células a cada panel de tinción, permitiendo que preciso recuento de población. Un citómetro de flujo con capacidades de muestreo y análisis volumétrico de placa de 96 pocillos puede proporcionar el número de células por μl de cada muestra y por lo tanto, calcular el número de células a cada panel de tinción. Las placas de recuento se pueden adquirir al día siguiente después de la fijación durante la noche a 4 ° C, lavado con tampón FACs (tampón de fosfato salino (PBS) con 2% SBF) y resuspender en un volumen de tampón FACs. - Lavan las células dos veces con 200 μL de tampón fosfato salino de Dulbecco (DPBS) por muestra por centrifugación (5 min, 805 x g, 4 º C) y descartar el sobrenadante entre cada enjuague para remover cualquier FBS gratis.
- Agregar 50 μl del bloque Fc, mezclar las muestras con una pipeta multicanal e incubar por 20 min a 4 ° C.
- Añadir 50 μl de 2 x concentración extracelular anticuerpos dirigidos a mezcla de tinción de viabilidad fijable, se mezclan y usando una pipeta multicanal, incubar por 30 min en la oscuridad a RT o 4 ° C.
Nota: Las condiciones exactas de la tinción para el anticuerpo dependen de las instrucciones del fabricante. Todas las diluciones de tinción deben estar en DPBS, con no FBS añadido para evitar la saturación del colorante de viabilidad pueden corregir. Consulte la Tabla de materiales y equipos para las diluciones óptimas del panel tinción utilizada en este manuscrito. Fijable viabilidad solución de tinción y el anticuerpo es preparado en una concentración de 2 x para proporcionar un final 1 x tinción concentración en 100 μl de volumen total de la coloración cuando se agrega al bloque de Fc. - Lavar las muestras dos veces con tampón FACs por centrifugación (5 min, 805 x g, 4 º C) y descartar los sobrenadantes entre cada enjuague.
- Resuspender en 200 μL de solución de fijación/permeabilización 1 x e incubar durante la noche a 4 ° C protegido de la luz.
Nota: El experimento puede hacer una pausa durante la noche en este punto: mantener las muestras a 4 ° C protegido de la luz. - Al día siguiente, Centrifugue las placas (805 x g, 5 min, 4 ° C) y descarte el sobrenadante.
- Enjuague una vez con 200 μL de 1 x de buffer de permeabilización, centrífuga (5 min, 805 x g, 4 º C) y descarte el sobrenadante.
- Añadir 100 μl de 1 x concentrado anticuerpo intracelular tinción panel preparado en buffer de permeabilización de 1 x e incubar durante 30 min en la oscuridad a RT o 4 ° C (esto depende de la tinción las recomendaciones del fabricante).
- Enjuague una vez con permeabilización 1 x buffer (5 min, 805 x g, 4 º C), desechar el sobrenadante y enjuague una segunda vez con tampón FACs (PBS con 2% FBS).
- Resuspender las muestras en 300 μL de tampón FACs (PBS con 2% SBF), transferir las muestras a tubos de citometría de flujo y realizar análisis de citometría de flujo.
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Representative Results
Nuestros resultados demuestran un beneficio significativo de hasta la separación de los componentes del tumor no inmune, como se explica en el protocolo. Además, usando el método descrito demuestran la heterogeneidad inmunológica significativa de tumores sólidos establecidos.
Un problema importante con muchas técnicas de disociación de tumor es la pérdida de la viabilidad de la muestra, más a menudo como resultado de las condiciones de digestión dura (es decir, elevadas temperaturas, inadecuado suministro de nutrientes, etc.). Utilizar el método de digestión descrito, con o sin densidad gradiente medio enriquecimiento, proporciona aproximadamente 70-90% viabilidad celular total según lo determinado por citometría de flujo (figura 1A). Viabilidades similares se observaron en la TIL enriquecido y tumor enriquecido fracciones, lo que sugiere que este método causa mínima toxicidad general (figura 1, figura 2C). Además, promovió un mayor enriquecimiento medio gradiente de densidad que aumento 2 veces en el CD45 positivo hasta la fracción de células viables totales analizados digestiones de tumor en comparación con no enriquecida (figura 1B, C). Además, el enriquecimiento fue encontrado para mejorar numerosos subconjuntos de células inmunitarias comúnmente evaluados en estudios de microambiente inmunológico, incluyendo células supresoras mieloides derivados (MDSCs), las células dendríticas (DCs), macrófagos, células T CD8 y CD4 de células T ( Figura 1D, E). Esto sugiere que el enriquecimiento medio degradado densidad promueve global immunocyte enriquecimientos y no aislar los linfocitos específicos o poblaciones mieloides (véase suplementario Figura 1A, B para la citometría de flujo, método utilizado para identificar que bloquean poblaciones celulares específicas). Cabe señalar sin embargo, que muchos medios de separación gradiente de densidad disponible en el mercado permiten una fracción significativa de eritrocitos y granulocitos al pasar por la fase de separación. Por lo tanto, si estas poblaciones son de interés, mayor optimización de protocolo puede ser necesario.
Figura 1 : Suave y efectivo enriquecimiento del infiltrado inmune tumor. Establecido MEER tumores fueron suprimidos y digestión utilizando el método descrito. Después de la digestión, suspensiones celulares solo fueron divididas tal que la mitad experimentó enriquecimiento medio gradiente de densidad y la otra que mitad directamente fueron manchada. (A) evaluación de citometría de flujo acumulativo de la viabilidad celular para digestiones de tumor con o sin enriquecimiento medio gradiente de densidad. Citometría de flujo representativo de (B) compuerta parcelas con enriquecimiento de CD45 positivo de la célula inmune de una digestión solo tumor con o sin enriquecimiento medio gradiente de densidad. (C) acumulado flujo cytometry CD45 positivos porcentajes entre células viables totales de digestiones de tumor con o sin enriquecimiento medio gradiente de densidad de la célula. (D) relación de enriquecimiento de varios mieloide e inmune poblaciones linfocitarias. Los tumores fueron digeridos en suspensión unicelular antes de ser teñido directamente o sometidos a enriquecimiento gradiente de densidad antes de la coloración y flujo cytometry análisis. Cada relación de enriquecimiento tipo celular se calculó dividiendo un porcentaje determinado de población de la célula (entre células viables totales evaluados) de la digestión de densidad gradiente tumor enriquecido por su contraparte no enriquecida. Las barras representan la mediana y los bordes de la barra de los ratios mínimos y máximos. (E) tabla de expresión de marcador celular inmunológico utilizada para identificar cada población de células inmunitarias analizada. Significación estadística se determinó con un impar t-test o test de Mann Whitney. p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ***p < 0.0001, (n = 20 tumores, N = 2 para todos los gráficos). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Uno de los más importantes beneficios que proporciona este método es la capacidad de la fracción no inmune tumor independientemente del perfil. Después de aislamiento de la fracción de alimentos peletizados no inmune tumor que atraviesa la fase medio gradiente de densidad, tumor complejo perfiles de paneles se puede realizar que previamente puede han sido limitadas por número de fluoróforo y limitaciones de cantidad de muestra. Figura 2 A muestra un ejemplo de la caracterización de citometría de flujo de tumor con más de 70% de viabilidad y enriquecimiento 99% CD45 célula negativa. La fracción de CD45 negativo entonces puede ser perfilada para numerosas características del tumor como la total viabilidad del tumor o apoptosis (es decir, caspasa 3, anexina V, etc.), capacidad de proliferación (es decir, Ki67) y la expresión de diversos marcadores de inmunosupresores (es decir, programado muerte-ligando 1 (PD-L1) o PD-L2). Sin embargo, cabe señalar que la fracción de CD45 negativo incluye las células del tumor, así como otros elementos stromal y vasculares del microambiente tumoral. Por lo tanto, si se requiere caracterización de células del tumor directa, un marcador específico de tumor de la célula tendría que ser utilizado (es decir, citoqueratina, antígeno tumor específico, etc.). Del mismo modo, otros elementos stromal tumor podrían ser fácilmente identificados y caracterizados después de etiquetar con un marcador específico de tipo de células como el cáncer y tumor las células endoteliales vasculares (CD31) fibroblastos asociados (actinia del músculo liso de α). Sin embargo, el nivel de viabilidad y CD45 negativo celda enriquecimiento es muy consistente a través de repetidas muestras, indicando la robustez de la técnica de separación del gradiente de densidad para el enriquecimiento del componente de tumor no inmune (figura 2B, C ).
Figura 2 : Enriquecimiento y perfiles de las características del componente no inmune tumor. (A) imagen representativa de una muestra tras enriquecimiento medio gradiente de densidad con capa media visible (rosa), hasta la capa (fina blanco turbio), capa media de la gradiente de densidad (claro) y pellets de tumor en la parte inferior del tubo. Citometría de flujo representativo de (B) estrategia que se utiliza para perfilar el componente de tumor no inmunes, con parcela de dispersión de viabilidad celular (arriba), CD45 célula negativo enriquecimiento dispersión trama (inferior izquierda) y tres marcadores independientes de interés que bloquean expresión mediante parcelas histograma (PD-L1 arriba, PD-L2 media e inferior de Ki67). Histograma FMO representa una muestra teñida con todos los demás colores panel pero que carece del marcador de interés. Evaluación de citometría de flujo acumulativo de viabilidad celular (C) y (D) CD45 porcentajes de célula negativa entre células viables totales de la fracción de sedimento de tumor tras enriquecimiento medio gradiente de densidad (n = 7-8 los tumores). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
A pesar de importantes esfuerzos para caracterizar la heterogeneidad genética de tumores sólidos, poco trabajo ha detallado la heterogeneidad espacial de subconjuntos inmunológicos en tumores sólidos. Por lo tanto el objetivo fue determinar cómo mieloide y linfocitarios inmunológica variadas drásticamente a lo largo de un solo tumor sólido. Así, un tumor de MEER establecido fue dividido en cuatro partes iguales con especial cuidado para asegurar que cada sección contenía aproximadamente igual regiones intra tumoral, así como porciones de la igual cutáneo y peritoneal-orientada (figura 3A). Cada pedazo de tumor fue digerido por separado y luego enriquecido por medio de gradiente de densidad y dividir entre un panel y mieloide y linfocitos. Esto permitió la cuantificación de varias características, incluyendo un número de poblaciones comúnmente evaluados immunocyte: células T CD4 +, células T CD8 +, células T, macrófagos, DCs, MDSCs (véase suplementario Figura 1A, B para la citometría de flujo compuerta estrategia). Dentro de un solo tumor, celular importante variabilidad entre las particiones diferentes del tumor fue conocido (figura 3b). Por ejemplo, DC y la célula de T total recuento se encontraron a variar por tanto como 4 a 5 veces entre piezas adyacentes tumor. Estos cambios drásticos también fueron observados cuando analizar la célula poblaciones como porcentaje de células viables totales (figura complementaria 2A) y se observaron a niveles similares en dos otros tumores independientes (complementario de la figura 2B, C). Estos datos demuestran la importancia de aislar y analizar todo el tumor cuando se realizan análisis de microambiente inmunológico, que pueden parecer contrario a la intuición si los protocolos actuales incluyen dividir el tumor para permitir análisis complementario por independiente métodos (es decir, histología, cuantificación de RNA, etc.). Además, estos datos pueden explicar las discrepancias en los análisis inmunológicos de biopsias del tumor, como heterogeneidad inmunológica intratumoral regional drásticamente podría sesgar los resultados de la biopsia.
Figura 3 : Evaluación de la heterogeneidad inmune tumor establecido. (A) imagen representativa de un tumor de MEER establecido después de la resección quirúrgica (izquierda) y después de división igual a adyacente 4 piezas (derecha). Barra de escala es 1 cm, que se muestra en negro en cada imagen. Pliegue (B) cambios de varios mieloide y recuento de linfocitos entre cada una de las 4 partes del tumor adyacente; cada sección del tumor experimentó la misma digestión, procedimiento de enriquecimiento medio gradiente de densidad, tinción y análisis. Cada parte del tumor se muestra como un cambio de doble conteo celular, determinado dividiendo su conteo de células por la parte del tumor con el recuento más bajo analizado células para una población celular determinada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Suplementario 1 figura: citometría de flujo representativo gating estrategia utilizada para el perfilado de componente inmune tumor. (A) estrategia que bloquean con diagramas de dispersión respectivo utilizados para perfilar inmune de linfocitos. (B) compuerta estrategia con diagramas de dispersión respectivo utilizados para perfilar inmune mieloide del tumor. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Suplementario figura 2: evaluación adicional de la heterogeneidad del tumor establecido. (A) porcentaje celular entre células viables totales doble cambio de tumor igual 4 piezas se muestra en la figura 3. (B) y (C) son dos tumores de MEER establecidos adicionales divididos en 4 partes adyacentes y analizados en heterogeneidad inmunológica del tumor. Cambios celulares cuenta doble (izquierda) y los porcentajes de celular entre células viables totales doblan cambios (derecha) para cada uno mieloide y población de la célula linfocito mostrando la variabilidad de cada una de las piezas adyacentes tumor 4. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El tiempo se compone de moléculas y componentes celulares diversos y complejos. La evidencia reciente sugiere que una caracterización precisa de este entorno puede proporcionar una mejor comprensión del tratamiento de éxito o fracaso y puede incluso ayudar a identificar mecanismos de resistencia terapéutica. Por ejemplo, aumentando los niveles de intratumoral de varias células inmunosupresoras (es decir, MDSCs, células de T reguladoras, etc.) puede atenuar la respuesta inmune efectora y derogar efectos inmunoterapéuticos. Por otro lado, la creciente presencia de intratumoral de poblaciones inmunes efectoras (por ejemplo, las células de CD8 + T tumor-específicas, las células asesinas naturales, linfocitos T) puede ser poderosos predictores del éxito del tratamiento. Otra caracterización que sigue para representar fielmente el estado inmunológico del tumor es las características fenotípicas de las células del tumor ellos mismos. Esto incluye la expresión de varios ligandos inmunosupresores, enzimas o moléculas dirigidas a disminuyendo efector inmune respuestas (es decir, PD-L1, PD-L2, indolamina 2,3 dioxigenasa, óxido nítrico, etc.). Tomados en conjunto, esto demuestra la necesidad de caracterización precisa y amplia de los inmunes y tumor características celulares de tumores sólidos.
La técnica que describimos en el presente documento permite separación y enriquecimiento de los inmunes y tumor componentes de la célula de sólidos tumores subcutáneos murinos. Luego, perfiles de citometría de flujo independiente se pueden realizar por lo que se puede apreciar el tiempo completo y la interacción de las células del tumor con el tiempo. Tras el enriquecimiento, paneles de citometría de flujo inmune extensa pueden ser optimizados para permitir la caracterización de los principales componentes celulares mieloides y linfoides, así como una variedad de características que describen su condición fenotípica. Del mismo modo, extensa del tumor celular enfocado puede utilizarse independientemente para proporcionar una caracterización amplia de características de la célula tumoral, así. La relativa simplicidad de esta técnica permite el análisis simultáneo de un gran número de tumores murinos, que es fundamental para la observación de las tendencias a pesar de la variabilidad biológica de los modelos de tumores murinos. Además, enriquecimiento inmune tumor proporciona la mejor identificación de subconjuntos inmunológicos raros (es decir, tumor específico células de T citotóxicas), que son a menudo considerablemente subrepresentadas dentro del tumor en comparación con otros componentes de la célula inmune no . Optimización de esta técnica puede permitir análisis adicionales aguas abajo en estos subconjuntos aislados que necesitan enriquecimiento, como ensayos de cocultivo ex vivo , mRNA de perfiles o estudios de transferencia celular adoptiva.
Usando esta técnica en un modelo tumoral murino subcutáneo, nos demuestran el enriquecimiento significativo de subconjuntos inmunes globales e independientes. También demostramos que el tumor no inmunes de perfiles que puede lograrse desde las mismas muestras de tumor. Finalmente, mostramos la importancia de todo tumor perfiles inmunológicos, como se observó heterogeneidad significativa inmunológica en las secciones adyacentes de un tumor. Idealmente, esta técnica de la colagenasa y la digestión de la ADNsa y gradiente de separación de las fracciones de inmunes y no inmunes de tumor podrían aplicarse a la mayoría de los modelos de tumores murinos, ambos ortotópico y subcutánea. También hemos observado que pequeños tumores no establecido y menos modelos de tumor colágeno denso (es decir, B16 melanoma) a menudo no requieren un paso de digestión enzimática para generar suspensiones celulares solo15; sin embargo, basados en gradiente inmune enriquecimiento realiza igualmente así en estos modelos de tumores, validando aún más su versatilidad. A pesar de la preocupación previa por digestión del antígeno de colagenasa en subconjuntos específicos de celular11, aún tenemos que observar una notable pérdida de calidad por cualquiera de los marcadores que hemos perfilado la coloración. Sin embargo, sensibilidad antígeno a estas condiciones de digestión debe evaluarse utilizando muestras control no-digerido adecuado antes de la adopción amplia de esta técnica.
En conclusión, nuestra técnica permite la caracterización precisa, amplia y de alto rendimiento de los componentes de inmunes y no inmunes de tumor de ratón tumores sólidos. Mediante la realización de perfiles independiente de estos subconjuntos, investigadores ampliamente pueden caracterizar el tiempo y conocer mejor mecanicista de terapias preclínicos de tumor sólido. Este método puede aplicarse fácilmente a la mayoría de los modelos de tumores murinos para análisis de alto rendimiento de linfocitos y mieloides immunocyte conteos de población y fenotipos mediante citometría de flujo, u otros ensayos posteriores que necesitan enriquecimiento de subconjunto.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
JMN reconoce apoyo financiero del Institute of General Medical Sciences (T32GM088129) y el Instituto Nacional de odontología e investigación craneofacial (F31DE026682) de los institutos nacionales de salud. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representan necesariamente las opiniones oficiales de los institutos nacionales de salud. Este proyecto fue apoyado también por la citometría y la base de clasificación de la célula en el Baylor College of Medicine con la financiación de los NIH (P30 AI036211 CA125123 P30 y S10 RR024574) y la asistencia de expertos de Joel M. Sederstrom.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6 to 12 week old male C57BL/6 mice | Jackson Laboratory | N/A | Mice used in our tumor studies |
| MEER Murine Syngeneic Cancer Cell line | Acquired from collaborator | N/A | E6/E7 HPV antigen expressing murine tonsillar epithelial cancer cell line |
| 70% isopropyl alcohol | EMD Milipore | PX1840 | |
| Murine surgical tool kit | World Precision Instruments | MOUSEKIT | Primarily only need scissors, tweezers, and a scalpel. |
| 24-well plate | Denville Scientific Inc. | T1024 | Or any 24-well flat bottom plate. |
| RPMI-1640 media | Sigma-Aldrich | R0883 | |
| Collagenase I | EMD Milipore | 234153 | |
| Collagenase IV | Worthington Biochemical Corporation | LS004189 | |
| DNase I | Sigma-Aldrich | 11284932001 | |
| Low Speed Orbital Shaker | BioExpress (supplier: Genemate) | S-3200-LS | Or any orbital shaker. |
| Thermoregulating incubator | Fisher Scientific | 13-255-27 | Or any other thermo-regulated incubator |
| FBS | Sigma-Aldrich | F8192 | |
| EDTA | AMRESCO | E177 | |
| 1 mL Pipette and tips | Eppendorf | 13-690-032 | Or any other pipette and tips |
| 40 um Cell Strainers | Fisher Scientific | 22363547 | |
| 50 mL Centrifuge Tubes | Denville Scientific Inc. | C1062-P | |
| 15 mL Conical Tubes | Denville Scientific Inc. | C1012 | |
| 10 mL Luer-Lok Syringe without needles | BD | 309604 | |
| Lymphoprep Density Gradient Medium | STEMCELL Technologies | 7811 | |
| Transfer Pipettes | Denville Scientific Inc. | P7212 | |
| 96-well U-bottom plates | Denville Scientific Inc. | ||
| DPBS | Sigma Aldrich | D8573 | |
| FoxP3 Transcription Factor Staining Buffer Set | ThermoFisher Scientific | 00-5523-00 | Fix/Permeabilization Buffer and Permeabilization Buffer |
| Thermoregulated Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
| Attune NxT Flow Cytometer | ThermoFisher Scientific | N/A | For 96-well cell volumetric counting |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) Clone 2.4G2 | ThermoFisher Scientific | 553141 | Fc Block |
| LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, for UV excitation | ThermoFisher Scientific | L34962 | Fixable viability stain |
| CD45 Monoclonal Antibody (30-F11), APC-eFluor 780 | ThermoFisher Scientific | 47-0451-80 | |
| TCR beta Monoclonal Antibody (H57-597), APC | ThermoFisher Scientific | 17-5961-82 | |
| CD8-α Antibody (KT15), PE | Santa Cruz Biotechnology | sc-53473 | |
| CD4 Monoclonal Antibody (GK1.5), PE-Cyanine5 | ThermoFisher Scientific | 15-0041-81 | |
| MHC Class II (I-A/I-E) Monoclonal Antibody (M5/114.15.2), Alexa Fluor 700 | ThermoFisher Scientific | 56-5321-82 | |
| CD11c Monoclonal Antibody (N418), PE-Cyanine5 | ThermoFisher Scientific | 15-0114-82 | |
| F4/80 Monoclonal Antibody (BM8), eFluor 450 | ThermoFisher Scientific | 48-4801-80 | |
| CD11b Monoclonal Antibody (M1/70), APC | ThermoFisher Scientific | 17-0112-81 | |
| Ly-6G (Gr-1) Monoclonal Antibody (RB6-8C5), PE | ThermoFisher Scientific | 12-5931-82 | |
| CD274 (PD-L1, B7-H1) Monoclonal Antibody (MIH5), PE-Cyanine7 | ThermoFisher Scientific | 25-5982-80 | |
| CD273 (B7-DC) Monoclonal Antibody (122), PerCP-eFluor 710 | ThermoFisher Scientific | 46-9972-82 | |
| Ki-67 Monoclonal Antibody (B56), BV711 | BD Biosciences | 563755 |
References
- Fouad, Y. A., Aanei, C. Revisiting the hallmarks of cancer. American Journal of Cancer Research. 7 (5), 1016-1036 (2017).
- Gajewski, T. F., Schreiber, H., Fu, Y. -X. Innate and adaptive immune cells in the tumor microenvironment. Nature Immunology. 14 (10), 1014-1022 (2013).
- Whiteside, T. L. The tumor microenvironment and its role in promoting tumor growth. Oncogene. 27 (45), 5904-5912 (2008).
- Chiou, V. L., Burotto, M. Pseudoprogression and Immune-Related Response in Solid Tumors. Journal of Clinical Oncology. 33 (31), 3541-3543 (2015).
- Menon, S., Shin, S., Dy, G. Advances in Cancer Immunotherapy in Solid Tumors. Cancers. 8 (12), 106 (2016).
- Denkert, C., et al. Tumor-Associated Lymphocytes As an Independent Predictor of Response to Neoadjuvant Chemotherapy in Breast Cancer. Journal of Clinical Oncology. 28 (1), 105-113 (2010).
- Lee, Y., et al. Therapeutic effects of ablative radiation on local tumor require CD8+ T cells: changing strategies for cancer treatment. Blood. 114 (3), 589-595 (2009).
- Stakheyeva, M., et al. Role of the immune component of tumor microenvironment in the efficiency of cancer treatment: perspectives for the personalized therapy. Current Pharmaceutical Design. 23, (2017).
- Gerner, M. Y., Kastenmuller, W., Ifrim, I., Kabat, J., Germain, R. N. Histo-Cytometry: A Method for Highly Multiplex Quantitative Tissue Imaging Analysis Applied to Dendritic Cell Subset Microanatomy in Lymph Nodes. Immunity. 37 (2), 364-376 (2012).
- Bayne, L. J., Vonderheide, R. H. Multicolor Flow Cytometric Analysis of Immune Cell Subsets in Tumor-Bearing Mice. Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (10), (2013).
- Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. Optimization of murine small intestine leukocyte isolation for global immune phenotype analysis. Journal of Immunological Methods. 405, 97-108 (2014).
- Casadevall, A., Fang, F. C. Rigorous Science: A How-To Guide. mBio. 7 (6), 01902-01916 (2016).
- Yao, Y., et al. CyTOF supports efficient detection of immune cell subsets from small samples. Journal of Immunological Methods. 415, 1-5 (2014).
- Kay, A. W., Strauss-Albee, D. M., Blish, C. A. Application of Mass Cytometry (CyTOF) for Functional and Phenotypic Analysis of Natural Killer Cells. Methods Mol. Biol. 1441, 13-26 (2016).
- Pachynski, R. K., Scholz, A., Monnier, J., Butcher, E. C., Zabel, B. A. Evaluation of Tumor-infiltrating Leukocyte Subsets in a Subcutaneous Tumor Model. Journal of Visualized Experiments. (98), (2015).
