Summary
Hier beschrijven we een methode om te scheiden en verrijken van de componenten van de tumor immuun en niet-immuun communicatie in gevestigde subcutane tumoren. Deze techniek maakt het mogelijk voor de afzonderlijke analyse van tumor immuun infiltreren en niet-immuun tumor breuken die uitgebreide karakterisering van de tumor immuun communicatie kunnen toestaan.
Abstract
De tumor immuun communicatie (keer) heeft onlangs erkend als een kritische bemiddelaar van solide tumoren, met name voor immuuntherapie antistofrespons behandeling. Recente klinische vooruitgang in immunotherapie wijzen op de noodzaak voor reproduceerbare methoden om nauwkeurig en grondig karakteriseren de tumor en de bijbehorende immuun infiltreren. Tumor enzymatische spijsvertering en flow cytometrische analyse mogelijk globale karakterisering van talrijke immuun cel subsets en fenotypen; grondigheid van de analyse wordt echter vaak beperkt door fluorophore beperkingen op het deelvenster Ontwerp en de noodzaak om het verwerven van grote tumor monsters te observeren van zeldzame immuun populaties van belang. Zo hebben we een effectieve en hoge doorvoer-methode voor het scheiden en verrijken van de tumor immuun infiltreren van de niet-immuun tumor componenten ontwikkeld. De beschreven tumor spijsvertering en centrifugaal dichtheid gebaseerde scheiding techniek kunt afzonderlijke karakterisering van de tumor en tumor immuun infiltreren breuken behoudt cellulaire levensvatbaarheid en biedt dus een globale karakterisering van de tumor immunologische staat. Deze methode werd gebruikt voor het karakteriseren van de uitgebreide ruimtelijke immuun heterogeniteit in stevige tumors, die verder de noodzaak voor consistente hele tumor immunologische profiling technieken toont. Over het geheel genomen, deze methode biedt een effectieve en flexibele techniek voor de karakterisering van immunologische van subcutane solide lymfkliertest tumoren; als zodanig, deze tool kan worden gebruikt om beter karakteriseren de tumoraal immunologische functies en in de preklinische evaluatie van roman immunotherapeutische strategieën.
Introduction
De onderdrukkende tijd is onlangs erkend als een stempel van kanker, en is bekend om te spelen een belangrijke rol in de ontwikkeling, progressie en bescherming van de solide tumor kankers, evenals verzachten van hun gevoeligheid voor immunotherapie1. De tijd is samengesteld uit tal van cellulaire deelverzamelingen en fenotypen, die allemaal kritisch inzicht geven in de immunologische toestand van de tumor. Deze immunologische deelverzamelingen kunnen verder worden gelaagde in cellen van lymfocyt of myeloïde oorsprong, die tezamen het merendeel van de aangeboren en adaptieve immuunresponsen2,3 vormen. Recente ontwikkelingen op het gebied van kanker immunotherapie is gebleken dat immunotherapeutische strategieën (dat wil zeggen, immuun checkpoint remmers, chimeer antigeen receptor T-cellen, enz.) het potentieel hebben voor het opwekken van duurzame kanker regressies; ze blijven echter relatief inefficiënt in4,5van de kankers van de stevige tumor. Talrijke groepen de kritische hindernis hebben aangetoond dat de tijd op de behandeling succes6,7 spelen kunt, en er dus een noodzaak om te nauwkeurig evalueren nieuwe immuuntherapie in de pre-klinische setting blijft, specifiek gericht op hun mogelijkheid om te moduleren of de tijd8overwinnen.
Huidige inspanningen te karakteriseren van de tijd meestal gebruiken beide microscopie of stroom cytometry samen met antilichaam labeling van strategieën om immuun cellulaire deelverzamelingen en hun functies9,10te identificeren. Deze twee strategieën informeren uniek verschillende, zoals microscopie ruimtelijke waardering van cellulaire deelverzamelingen kunt en stroom cytometry hoge doorvoer en bredere kwantificering van cellulaire veranderingen biedt. Ondanks de recente verbeteringen in fluorescerende multiplex immunohistochemistry optimaliseren van spectrale imaging systemen, die nu kunnen maximaal 7 parameters worden ondersteund, beperkte deelvenster grootte bemoeilijkt brede niveau immuun profilering en deze techniek is dus vaak gereserveerd voor meer gerichte analyses. Dientengevolge, blijft stroom cytometry een van de meest gebruikte immuun profilering technieken. Ondanks het wijdverbreide gebruik in tijd karakterisering zijn de methoden die worden gebruikt voor het verwerken en kleuring heel variabel. Vaakst protocollen gebruiken een tumor distantiëren van enzym (dat wil zeggen, collagenases, DNase, etc.) en handmatige dissociatie methoden om eencellige schorsingen, gevolgd door antilichaam kleuring en analyse7. Ondanks de voordelen van elke methode, hebben talrijke groepen aangetoond de uitgebreide variabiliteit die kan worden opgewekt door middel van deze technieken-11. Dit maakt vergelijkingen van de Kruis-studie van tumor communicatie profilering uiterst moeilijk, zelfs bij de beoordeling van de dezelfde lymfkliertest tumor-model. Bovendien, deze methoden bieden beperkte mogelijkheden te evalueren van de cellulaire tumor en tumor immuun infiltreren componenten onafhankelijk, aangezien beide componenten worden afgewisseld na vertering. Monster hoeveelheid beperkt dan multi panel kleuring en analyse, die een groot probleem wordt wanneer u probeert te karakteriseren van zeldzame immunologische deelverzamelingen (dat wil zeggen, tumor-specifieke T-cellen)12. Meer recente technieken zoals massa cytometry of cytometry van de tijd van de vlucht (CyTOF), voldoende hoge-dimensionale fenotypische analyse van cellulaire deelverzamelingen met sommige systemen ondersteunen panel ontwerpen van meer dan 42 onafhankelijke parameters13. Ondanks de enorme kracht van CyTOF technologie in immuun profilering, blijft het beperkt vanwege de kosten, de deskundigheid van de analyse en de toegang tot de apparatuur. Bovendien, vele CyTOF protocollen adviseren zuivering van immuun deelverzamelingen om signal-to-noise verhouding14, en dus we suggereren dat onze verrijking methode kan worden gebruikt voor CyTOF analyse ter verbetering van de kwaliteit van de gegevens.
Hierin beschrijven we een tumor communicatie spijsvertering en analyse methode waarin tumor immuun infiltreren scheiding. Het doel van deze methode is dat de onafhankelijke high-throughput profilering van de tumor immuun infiltreren en tumor cellulaire breuken voor bredere karakterisering van de communicatie van de tumor. Met behulp van deze methode, wij verder laten zien het belang van het uitvoeren van de analyse van de hele tumor, zoals een subcutane solide tumor model bleek te hebben belangrijke immunologische tot ruimtelijke heterogeniteit. Over het geheel genomen, deze methode kan nauwkeuriger en consequent vergelijken tussen monsters omdat het verrijkt voor immuun cellulaire subsets binnen de tumor en voorziet in onafhankelijke profilering van de cel van de tumor en immuun breuken van een tumor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle methoden die hier worden beschreven zijn goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) van Baylor College of Medicine.
1. tumor oogst en spijsvertering
Opmerking: De tijd die nodig is voor de oogst is ~ 3-5 min/tumor, en de tijd die nodig is voor de verwerking is ~ 1 h + 2-3 min/tumor.
- Muizen euthanaseren kooldioxide na inademing en spray elke muis omlaag met 70% ethanol voordat de oogst om te voorkomen dat haar besmetting. Chirurgisch verwijderen van subcutane tumoren uit de muizen en ervoor zorgen dat de tumoren gratis van alle contaminerende weefsel (dat wil zeggen, haren, huid, buikvlies, enz.). Elke tumor in 1.8 mL basis RPMI-1640 media zonder foetale runderserum (FBS) in een 24-well plaat plaatsen. Voor grotere oogsten, houd platen koud op ijs te behouden van cellulaire levensvatbaarheid.
Opmerking: Als steriliteit vereist is, alle tumor dissecties zal moeten worden uitgevoerd in een kabinet met steriele chirurgische instrumenten (dat wil zeggen, schaar, pincet, enz.), alsmede verdere stappen inzake bioveiligheid. Tumoren met de langste diameter tussen 0,5 - 1 cm zijn optimaal en groter of kleiner tumoren vergt schalen van reagentia. - Gebruik schaar te snijden de tumoren in minder dan 1 mm3 stuks binnen elk putje.
- Een 10 x spijsvertering cocktail bereiden door ontbinding collagenase ik op 10 mg/mL, collagenase IV op 2.500 U/mL, en DNase ik bij 200 U/mL in basis RPMI-1640 media (zonder FBS).
Opmerking: De spijsvertering cocktail kan worden een dag van tevoren bereid en opgeslagen bij-20 ° C; langdurige opslag wordt echter niet aanbevolen, omdat enzymen activiteit na verloop van tijd eens ontbonden verliest. - Voeg 200 µL van 10 x dissociatie cocktail met collagenase I, collagenase IV en DNase ik aan elk putje met de 1 mm3 stuks.
- Toestaan dat de monsters te verteren gedurende 1 uur bij 37 ° C terwijl licht schudden bij 60-100 rpm met behulp van een shaker orbitale plaat.
Opmerking: De hoogte van temperatuur tot 37 ° C gedurende de enzymatische spijsvertering kan veroorzaken immuun cel activatie. - Na 1 uur, de reactie te neutraliseren door toevoeging van 1 mL van RPMI-1640 media aangevuld met 5% FBS en 2 mM EDTA aan elk putje.
- Pipetteer de spijsvertering van de tumor en de resterende tumor stukken in een 40 µm cel zeef zit op de top van een centrifuge-tube van 50 mL.
Opmerking: Knippen de tip off van een 1 mL pipet tip voor gemakkelijker doorgifte van de tumor vertering naar de zeef. - Gebruik een 10 mL spuit zuiger om mechanisch gedesag de tumor stukken door de zeef. Regelmatig spoelen de zeef met 2 mL aangevuld RPMI-1640 media (met 5% FBS) en herhaal tot de cel zeef duidelijk van tumor is.
Opmerking: Ongeveer 4-10 mL totale media toereikend te zijn om voldoende spoel de zeef van tumor.
Opmerking: Leg monsters op ijs totdat deze stap is voltooid voor alle monsters voor het behoud van cellulaire levensvatbaarheid. - Elke 50 mL centrifugebuis aan de media RPMI-1640 aangevuld met hetzelfde volume aanpassen.
Opmerking: De aanpassing van het volume is van cruciaal belang voor het balanceren van de centrifuge. Deze stap overslaan kan resulteren in centrifuge schade of lichamelijk letsel. - Centrifugeer de schorsingen van de cel (805 x g, 5 min, 4 ° C), gooi het supernatant en resuspendeer in 2 mL zuiver aangevuld RPMI-1640 media.
Opmerking: Een cel aggregaat kan vormen na het centrifugeren dat moeilijk te resuspendeer. Gebruik een serologische Pipetteer 5 mL en meng snel te breken voordat u verdergaat.
2. scheiding van immuun- en Tumor cellulaire breuken
Opmerking: De tijd die nodig is voor deze stap is ongeveer 1 uur.
- Voeg 3 mL van de kleurovergang medium dichtheid aan de onderkant van een centrifugebuis 15 mL. Bereiden en label genoeg buizen voor elke tumor.
- De 2 mL celsuspensie tumor op de top van het medium dichtheid kleurovergang door pipetteren langzaam langs de zijkant van de buis om te voorkomen dat het mengen van de twee lagen laag.
- Zorgvuldig plaats de gelaagde buizen in de centrifuge en spin voor 20 min op 805 x g, 20 ° C, met geen rem.
Opmerking: Het is uitermate belangrijk om te controleren juiste balanceren en te waarborgen dat geen rem wordt gebruikt tijdens het centrifugeren. Verstoring van dit proces zal resulteren in het mengen van de laag en het herstel van de totale steekproef moeilijk zal zijn. - Zorgvuldig overbrengen de tumor infiltreren leukocyten (TIL) laag en de media van de bovenste laag om een nieuwe tube van 15 mL met behulp van een precisiepipet overdracht. Verwijderen van alle resterende kleurovergang medium dichtheid en resuspendeer de pellet tumor aan de onderkant van de buis in 2 mL zuiver aangevuld RPMI-1640.
Opmerking: Na het centrifugeren zal er vier zichtbare lagen van boven naar beneden die respectievelijk overeenkomen met: media, TILs, kleurovergang medium dichtheid en tumor cel pellet. Zie Figuur 2A voor een voorbeeld van de verschillende lagen. - Centrifugeer beide de TIL en tumor monsters in aparte buizen (5 min, 805 x g, 4 ° C) en verwijder het supernatant.
- Resuspendeer de TIL monster in 200 µL en de tumor pellet in 2 mL zuiver aangevuld RPMI-1640 media. Houd op ijs te behouden van de levensvatbaarheid.
3. plating en kleuring
Opmerking: De tijd die nodig is voor de plating is 30 s/tumor; de tijd die nodig is voor het oppervlak vlekken is 1 h; de tijd die nodig is voor de intracellulaire vlekken is 40 min; de tijd die nodig is voor stroom cytometry analyse 1 is - 4 min/tumor.
- Bereiden en label een 96-Wells U-bodem plaat voor elke immuun kleuring paneel en een extra plaat voor cel telt.
Opmerking: Normaal gesproken drie platen zijn bereid in totaal: een deelvenster lymfocyt gerichte plaat, een plaat myeloïde gerichte paneel en een cel tellen plaat. - Aliquot de eencellige schorsingen in elk van de kleuring van het deelvenster platen en een ingestelde geluidsvolume in de graaf-plaat.
Opmerking: De graaf plaat wordt gebruikt voor het berekenen van het totale aantal cellen toegevoegd aan elk kleuring paneel, waardoor nauwkeurige cel bevolking graven. Een cytometer van de stroom met 96-wells-plaat bemonsterings- en analysemethoden volumetric mogelijkheden bieden het aantal cellen per µL in elk monster, en daarom, bereken het aantal cellen toegevoegd aan elke kleuring deelvenster. Graaf platen kunnen worden verworven de volgende dag na fixatie 's nachts bij 4 ° C, spoelen met FACs buffer (met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) met 2% FBS), en resuspending in een vastgestelde hoeveelheid FACs buffer. - Het wassen van de cellen tweemaal met 200 µL van Dulbecco fosfaatgebufferde zoutoplossing (DPBS) per monster door centrifugeren (5 min, 805 x g, 4 ° C) en het supernatant tussen elke spoelen om elke vrije FBS te verwijderen.
- Voeg 50 µL van Fc blok, meng de monsters met behulp van een precisiepipet multi-kanaals en incubeer gedurende 20 min bij 4 ° C.
- Voeg 50 µL van 2 x geconcentreerd extracellulaire targeting antilichaam en corrigeerbare levensvatbaarheid vlek mengsel, mix met behulp van een precisiepipet multi-kanaals en incubeer gedurende 30 min. in het donker bij RT of 4 ° C.
Opmerking: De exacte kleuring voorwaarden voor het antilichaam afhankelijk van de instructies van de fabrikant. Alle kleuring verdunningen moet in DPBS, met geen toegevoegde FBS ter voorkoming van de verzadiging van de kleurstof corrigeerbare levensvatbaarheid. Raadpleeg de Tabel van materialen/uitrusting voor de optimale verdunningen van hettoezichtpanel kleuring gebruikt in dit manuscript. Antilichaam en corrigeerbare levensvatbaarheid kleurstofoplossing is bereid met een concentratie van 2 x te verstrekken een uiteindelijke 1 x kleuring concentratie in 100 µL van totale kleuring volume wanneer toegevoegd aan het Fc-blok. - Het wassen van de monsters tweemaal met FACs buffer door centrifugeren (5 min, 805 x g, 4 ° C) en het supernatant tussen elke spoel te verwijderen.
- Resuspendeer in 200 µL 1 x fixatie/permeabilization oplossing en na een nacht bebroeden bij 4 ° C beschermd tegen licht.
Opmerking: Het experiment kan worden onderbroken 's nachts op dit punt: monsters bij 4 ° C beschermd tegen het licht houden. - De volgende dag, centrifugeren van de platen (805 x g, 5 min, 4 ° C) en verwijder het supernatant.
- Spoel eenmaal met 200 µL van 1 x permeabilization buffer, centrifuge (5 min, 805 x g, 4 ° C), en verwijder het supernatant.
- Voeg 100 µL van 1 x geconcentreerd intracellulaire antilichaam kleuring paneel bereid in 1 x permeabilization buffer en incubeer gedurende 30 min. in het donker bij RT of 4 ° C (dit hangt kleuring aanbevelingen van de fabrikant).
- Spoel na met 1 x permeabilization buffer (5 min, 805 x g, 4 ° C), verwijder het supernatant en spoelen een tweede keer met FACs buffer (PBS met 2% FBS).
- Resuspendeer de monsters in 300 µL van FACs buffer (PBS met 2% FBS), het overbrengen van de monsters naar stroom cytometry buizen, en stroom cytometry analyses uit te voeren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Onze resultaten tonen aan dat het aanzienlijke voordeel van TIL scheiding van niet-immune tumor componenten, zoals uiteengezet in het protocol. Bovendien, met behulp van de beschreven methode we de belangrijke immunologische heterogeniteit van gevestigde stevige tumors laten zien.
Een significant probleem met vele tumor dissociatie technieken is het verlies van levensvatbaarheid van de steekproef, meestal als gevolg van harde spijsvertering voorwaarden (d.w.z., verhoogde temperaturen, onvoldoende voedingsstoffen aanbod, enz.). Gebruik van de methode beschreven spijsvertering, met of zonder dichtheid kleurovergang middellange verrijking, zorgt voor ongeveer 70-90% totale cellulaire levensvatbaarheid zoals beoordeeld door stroom cytometry(Figuur 1). Vergelijkbare viabilities werden waargenomen in de TIL verrijkt en tumor verrijkt breuken, suggereren dat deze methode zorgt ervoor dat minimale algemene toxiciteit (Figuur 1A, Figuur 2C). Bovendien, de dichtheid kleurovergang middellange verrijking bevorderd een groter dan 2-fold toename van de CD45 positief TIL breuk onder totaal aantal levensvatbare cellen geanalyseerd ten opzichte van niet-verrijkt tumor spijsvertering (Figuur 1B, C). Bovendien verrijking bleek te verbeteren van talrijke immuun cel subsets algemeen beoordeeld in immuun communicatie studies, met inbegrip van de suppressor myeloïde-afgeleide cellen (MDSCs), dendritische cellen (DC's), CD8 T-cellen, macrofagen en CD4 T-cellen ( Figuur 1D, E). Dit suggereert dat de dichtheid kleurovergang middellange verrijking verrijking van de globale immunocyte bevordert en niet isoleren doet specifieke lymfocyt of myeloïde populaties (Zie aanvullende figuur 1A, B voor de stroom cytometry gating-methode gebruikt om te identificeren specifieke cel populaties). Het is vermeldenswaard echter dat vele verkrijgbare dichtheid verlopende scheiding medias toestaan een belangrijke fractie van erytrocyten en granulocyten passeren de scheiding-fase. Dus, als deze populaties van belang zijn, verder protocolverbetering kan nodig zijn.
Figuur 1 : Zachte en effectieve verrijking van tumor immuun infiltreren. Gevestigde MEER tumoren waren weggesneden en verteerd met behulp van de beschreven methode. Na vertering, eencellige schorsingen werd verdeeld zodat de helft onderging een dichtheid kleurovergang middellange verrijking en de andere die helft direct werden gekleurd. (A) cumulatieve stroom cytometry beoordelingvan de cellulaire leefbaarheid voor de spijsvertering van de tumor met of zonder dichtheid kleurovergang middellange verrijking. (B) vertegenwoordiger stroom cytometry gating percelen weergegeven: CD45 positieve immuun cel verrijking van de spijsvertering van een enkele tumor met en zonder dichtheid kleurovergang middellange verrijking. (C) cumulatieve stroom cytometry CD45 positieve cel percentages onder totaal aantal levensvatbare cellen van de spijsvertering van de tumor met of zonder dichtheid kleurovergang middellange verrijking. (D) verrijking ratio's van diverse myeloïde en lymfocyt immuun populaties. Tumoren waren verteerd in eencellige schorsing voor direct wordt gekleurd of dichtheid kleurovergang verrijking vóór de kleuring en stroom cytometry analyse ondergaan. Elk celtype verrijking verhouding werd berekend door een bepaalde cel-bevolking-percentage (onder totaal aantal levensvatbare cellen beoordeeld) van de dichtheid kleurovergang verrijkt tumor vertering door zijn niet-verrijkt tegenhanger. Bar lijnen vertegenwoordigen de mediaan en de randen van de balk vertegenwoordigen de minimale en maximale verhoudingen. (E) inhoudsopgave immuun cellulaire marker-expressie gebruikt voor het identificeren van elke immuun cel bevolking geanalyseerd. Statistische significantie werd bepaald met een ongepaard t-test of Mann-Whitney. p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0.001, ***p < 0,0001, (n = 20 tumoren, N = 2 voor alle grafieken). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Een van de belangrijkste voordelen die deze methode biedt is de mogelijkheid om zelfstandig de Fractie van de niet-immuun tumor. Na de isolatie van de Ingehuld niet-immuun tumor breuk die door de dichtheid kleurovergang middellange fase loopt, complexe tumor profilering panelen kan worden uitgevoerd die eerder kan hebben zijn beperkt door fluorophore nummer en monster hoeveelheid beperkingen. Figuur 2 A toont een voorbeeld van de tumor stroom cytometry karakterisering met meer dan 70% levensvatbaarheid en 99% CD45 negatieve cel verrijking. De negatieve CD45-fractie kan vervolgens worden geprofileerd voor talrijke tumor functies zoals de algehele levensvatbaarheid van de tumor of apoptosis (dat wil zeggen, caspase 3, Annexine V, etc.komt), proliferatie capaciteit (bijvoorbeeld Ki67) en de uitdrukking van diverse immunosuppressieve markeringen (dat wil zeggen, geprogrammeerd dood-ligand 1 (PD-L1) of PD-L2). Opgemerkt zij echter dat de negatieve CD45-fractie zowel tumorcellen, evenals andere stromale en vasculaire elementen van de communicatie van de tumor omvat. Dus, als de karakterisering van de cel van het directe tumor vereist is, een specifieke tumormarker voor cel zou moeten worden gebruikt (dat wil zeggen, cytokeratin, specifieke tumor-geassocieerde antigeen, enz.). Ook kunnen andere stromale tumor-elementen gemakkelijk worden geïdentificeerd en gekenmerkt na labelen met een celtype specifieke marker zoals tumor vasculaire endotheliale cellen (CD31) en kanker geassocieerd fibroblasten (α-gladde spier actine). Het niveau van de levensvatbaarheid en CD45 negatieve cel verrijking is echter zeer consistente in verschillende herhaalde steekproeven, met vermelding van de robuustheid van de dichtheid verlopende scheiding techniek voor niet-immune tumor component verrijking (Figuur 2B, C ).
Figuur 2 : Verrijking en profilering van de functies van de component niet-immuun tumor. (A) representatieve afbeelding van een steekproef na dichtheid kleurovergang middellange verrijking met zichtbare media laag (roze), TIL laag (dunne duistere wit), dichtheid kleurovergang middellange laag (doorzichtig) en tumor pellet aan de onderkant van de buis. (B) vertegenwoordiger stroom cytometry gating strategie gebruikt voor profilering van de niet-immuun tumor-component, met cel levensvatbaarheid scatterplot (boven), CD45 negatieve cel verrijking scatterplot (linksonder), en drie onafhankelijke markeringen van belang expressie via histogram percelen (PD-L1 bovenaan, PD-L2 midden en Ki67 onderkant). FMO histogram steekproef een gekleurd met alle andere kleuren van het deelvenster, maar ontbreekt de markering van belang. Cumulatieve stroom cytometry beoordeling van cellulaire levensvatbaarheid (C) en (D) CD45 negatieve cel percentages onder totaal aantal levensvatbare cellen van de tumor pellet breuk na dichtheid kleurovergang middellange verrijking (n = 7-8-tumoren). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Ondanks aanzienlijke inspanningen te karakteriseren de genetische heterogeniteit van solide tumoren, heeft weinig werk de ruimtelijke heterogeniteit van immunologische deelverzamelingen in stevige tumors gedetailleerd. Wij dus gericht om te bepalen hoe myeloïde en immunologische deelverzamelingen lymfocyt drastisch gevarieerd gedurende een één solide tumor. Dus, een gevestigde MEER tumor was verdeeld in vier gelijke delen met speciale zorg aan dat elke sectie bevat ongeveer gelijke intra-tumoral regio's, alsmede gelijke dermale en peritoneale-gerichte delen (Figuur 3A). Elk stuk tumor was verteerd afzonderlijk, en vervolgens verrijkt door de kleurovergang medium dichtheid en verdeeld over een myeloïde en lymfocyt panel. Hierdoor kwantificering van verschillende functies waaronder een aantal algemeen beoordeeld immunocyte populaties: CD4 + T cellen, CD8 + T cellen, T-cellen, macrofagen, DCs, MDSCs (Zie aanvullende figuur 1A, B voor de stroom cytometry gating strategie). Binnen een enkele tumor was belangrijke cel variabiliteit tussen de verschillende tumor partities genoteerd (Figuur 3b). Bijvoorbeeld, zowel DC en T-cel-cel totaal graven werden gevonden om te variëren door maar liefst 4 tot 5-voudig tussen aangrenzende tumor delen. Deze drastische veranderingen werden ook opgemerkt wanneer analyseren cel populaties in procenten van het totaal aantal levensvatbare cellen (aanvullende figuur 2A) en werden waargenomen bij vergelijkbare doses in twee andere onafhankelijke tumoren (aanvullende figuur 2B, C). Deze gegevens tonen het belang van isoleren en het analyseren van de hele tumor bij het uitvoeren van analyses van immuun communicatie, die contra-intuïtief lijkt als huidige protocollen verdelen de tumor bevatten zodat aanvullende analyse door onafhankelijke methoden (dat wil zeggen, histologie, RNA kwantificering, enz.). Bovendien kunnen deze gegevens verschillen in immunologische analyses van tumor biopsieën, verklaren als regionale intratumoral immunologische heterogeniteit drastisch biopsie resultaten scheeftrekken kan.
Figuur 3 : Beoordeling van gevestigde tumor immuun heterogeniteit. (A) representatieve afbeelding van een gevestigde MEER tumor na chirurgische resectie (links) en na gelijke verdeling in 4 aangrenzende delen (rechts). De bar van de schaal is 1 cm, in zwart op elke afbeelding weergegeven. (B) vouw verandert van diverse myeloïde en cel lymfocyt telt tussen elk van de 4 aangrenzende tumor delen; elke sectie van de tumor onderging de dezelfde spijsvertering, dichtheid kleurovergang middellange verrijking procedure, kleuring en analyse. Elk deel van de tumor wordt weergegeven als een cel tellen vouw verandering, zoals bepaald door het delen van zijn cel tellen door het deel van de tumor met de laagste geanalyseerde cel tellen voor een bepaalde cel bevolking. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Aanvullende Figuur 1: vertegenwoordiger stroom cytometry gating strategie gebruikt voor tumor immuun component profileren. (A) Gating strategie met respectieve scatter percelen gebruikt voor lymfocyt immuun profileren. (B) Gating strategie met respectieve scatter percelen gebruikt voor tumor myeloïde immuun profileren. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Aanvullende Figuur 2: aanvullende beoordeling van gevestigde tumor heterogeniteit. (A) cellulaire percentage onder totaal aantal levensvatbare cellen vouw verandering van 4 gelijke tumor onderdelen weergegeven in Figuur 3. (B) en (C) zijn twee extra gevestigde MEER tumoren ingedeeld in 4 aangrenzende stukken en geanalyseerd voor immuun heterogeniteit van de tumor. Cel graaf vouw wijzigingen (links) en cel percentages onder totaal aantal levensvatbare cellen vouwen wijzigingen (rechts) voor elk myeloïde en lymfocyt celpopulatie geanalyseerd waaruit blijkt de variabiliteit van elk van de 4 delen van aangrenzende tumor. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De tijd is samengesteld uit diverse en complexe cellulaire componenten en moleculen. Recent bewijs suggereert dat nauwkeurige karakterisering van deze omgeving kan zorgen voor een beter begrip van de behandeling succes of mislukking, en kan zelfs helpen bij het identificeren van de mechanismen van therapeutische resistentie. Bijvoorbeeld, kan toenemende intratumoral van verschillende immunosuppressieve cellen (dat wil zeggen, MDSCs, regulatoire T-cellen, enz.) verzachten effector immuunresponsen en trekt immunotherapeutische effecten. Aan de andere kant, kunnen de toenemende aanwezigheid van het intratumoral van effector immuun populaties (bijv, tumor-specifieke CD8 + T cellen, natural killer cellen, T-helper cellen) krachtige voorspellers van succes van de behandeling. Een ander karakterisering die blijft nauwkeurig vertegenwoordigen immunologische status van de tumor is de fenotypische kenmerken van de tumorcellen zelf. Dit omvat uitdrukking van verschillende immunosuppressieve liganden, enzymen of moleculen downregulating effector immuunresponsen gericht (dat wil zeggen, PD-L1, PD-L2, indolamine 2,3 dioxygenase, stikstofmonoxide, enz.). Samen genomen, toont dit de noodzaak voor accurate en globale karakterisering van zowel de immuun- en tumor cellulaire functies van solide tumoren.
De techniek die we hierin beschrijven kunt scheiding en verrijking van zowel de immuun- en tumor celbestanddelen van solide lymfkliertest subcutane tumoren. Vervolgens, onafhankelijke stroom cytometrische profileren kan worden uitgevoerd zodat de full-time en interactie van tumorcellen met de tijd kunnen worden gewaardeerd. Naar aanleiding van verrijking, uitgebreide immuun stroom cytometry panelen kunnen worden geoptimaliseerd zodat karakterisering van belangrijke myeloïde en lymfoïde cellulaire componenten, evenals een verscheidenheid aan functies beschrijven hun fenotypische status. Uitgebreide tumor cel gericht paneel kan ook zelfstandig worden gebruikt om globale karakterisering van tumor cel eigenschappen ook. De relatieve eenvoud van deze techniek zorgt voor de gelijktijdige analyse van grote aantallen lymfkliertest tumoren, die is van cruciaal belang voor het observeren trends ondanks de biologische variabiliteit van lymfkliertest tumor modellen. Tumor immuun verrijking voorziet bovendien in betere identificatie van zeldzame immunologische deelverzamelingen (dat wil zeggen, tumor-specifieke cytotoxische T-cellen), die vaak sterk ondervertegenwoordigd zijn binnen de tumor ten opzichte van andere niet-immuun celbestanddelen . Optimalisatie van deze techniek kunnen verder stroomafwaarts analyses op deze geïsoleerde deelverzamelingen waarvoor verrijking, zoals coculture ex vivo tests, mRNA profilering, of adoptief cel overdracht studies.
Met behulp van deze techniek in een subcutane lymfkliertest tumor model, we laten zien van de aanzienlijke verrijking van wereldwijde en onafhankelijke immuun subsets. We tonen ook de niet-immuun tumor profilering die uit de dezelfde tumor monsters kan worden bereikt. Tot slot laten we zien het belang van de hele tumor immunologische profiling, zoals we belangrijke immunologische heterogeniteit in aangrenzende secties van een tumor gezien. Ideaal, deze techniek van collagenase en DNase gebaseerde spijsvertering en verloop gebaseerde scheiding van de tumor immuun en niet-immuun breuken kunnen worden toegepast op de meeste lymfkliertest tumor modellen, beide orthotopic en onderhuidse. Wij hebben ook geconstateerd dat kleine niet-gevestigde tumoren en minder collageen-dichte tumor modellen (dat wil zeggen, B16 melanoom) doen niet vereisen vaak een enzymatische spijsvertering stap voor het genereren van eencellige schorsingen15; kleurovergang gebaseerde immuun verrijking voert echter even zo goed in deze tumor modellen, verder valideren zijn veelzijdigheid. Ondanks voorafgaande bezorgdheid over collagenase antigeen spijsvertering op specifieke cellulaire deelverzamelingen11moeten we nog een opmerkelijke verlies van kwaliteit voor elk van de markeringen die we hebben geprofileerd kleuring naleven. Niettemin, antigeen gevoeligheid voor deze voorwaarden spijsvertering moet worden beoordeeld met behulp van adequate controle van de niet-verteerde monsters vóór brede goedkeuring van deze techniek.
Kortom, zorgt onze techniek voor nauwkeurige, brede en hoge gegevensdoorvoer karakterisering van de tumor immuun en niet-immuun componenten van lymfkliertest solide tumoren. Door het uitvoeren van onafhankelijke profilering van deze deelverzamelingen, kunnen onderzoekers in grote lijnen karakteriseren de tijd en beter mechanistische inzicht in solide tumor preklinische therapieën. Deze methode kan gemakkelijk worden toegepast op de overgrote meerderheid van lymfkliertest tumor modellen van lymfocyten en myeloïde immunocyte bevolking graven en fenotypen via stroom cytometry p.a. hoge doorvoer, of andere stroomafwaartse testen waarvoor deelverzameling verrijking.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
JMN erkent financiële steun van het National Institute of General Medical Sciences (T32GM088129) en het nationale Instituut van Dental & craniofaciale onderzoek (F31DE026682) die zowel van de National Institutes of Health. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijk de officiële standpunten van de National Institutes of Health. Dit project was het ook ondersteund door het Cytometry en de cel Sorteren kern aan Baylor College of Medicine met financiële steun van de NIH (P30 AI036211 P30 CA125123 en S10 RR024574) en de deskundige hulp van Joel M. Sederstrom.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6 to 12 week old male C57BL/6 mice | Jackson Laboratory | N/A | Mice used in our tumor studies |
| MEER Murine Syngeneic Cancer Cell line | Acquired from collaborator | N/A | E6/E7 HPV antigen expressing murine tonsillar epithelial cancer cell line |
| 70% isopropyl alcohol | EMD Milipore | PX1840 | |
| Murine surgical tool kit | World Precision Instruments | MOUSEKIT | Primarily only need scissors, tweezers, and a scalpel. |
| 24-well plate | Denville Scientific Inc. | T1024 | Or any 24-well flat bottom plate. |
| RPMI-1640 media | Sigma-Aldrich | R0883 | |
| Collagenase I | EMD Milipore | 234153 | |
| Collagenase IV | Worthington Biochemical Corporation | LS004189 | |
| DNase I | Sigma-Aldrich | 11284932001 | |
| Low Speed Orbital Shaker | BioExpress (supplier: Genemate) | S-3200-LS | Or any orbital shaker. |
| Thermoregulating incubator | Fisher Scientific | 13-255-27 | Or any other thermo-regulated incubator |
| FBS | Sigma-Aldrich | F8192 | |
| EDTA | AMRESCO | E177 | |
| 1 mL Pipette and tips | Eppendorf | 13-690-032 | Or any other pipette and tips |
| 40 um Cell Strainers | Fisher Scientific | 22363547 | |
| 50 mL Centrifuge Tubes | Denville Scientific Inc. | C1062-P | |
| 15 mL Conical Tubes | Denville Scientific Inc. | C1012 | |
| 10 mL Luer-Lok Syringe without needles | BD | 309604 | |
| Lymphoprep Density Gradient Medium | STEMCELL Technologies | 7811 | |
| Transfer Pipettes | Denville Scientific Inc. | P7212 | |
| 96-well U-bottom plates | Denville Scientific Inc. | ||
| DPBS | Sigma Aldrich | D8573 | |
| FoxP3 Transcription Factor Staining Buffer Set | ThermoFisher Scientific | 00-5523-00 | Fix/Permeabilization Buffer and Permeabilization Buffer |
| Thermoregulated Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
| Attune NxT Flow Cytometer | ThermoFisher Scientific | N/A | For 96-well cell volumetric counting |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) Clone 2.4G2 | ThermoFisher Scientific | 553141 | Fc Block |
| LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, for UV excitation | ThermoFisher Scientific | L34962 | Fixable viability stain |
| CD45 Monoclonal Antibody (30-F11), APC-eFluor 780 | ThermoFisher Scientific | 47-0451-80 | |
| TCR beta Monoclonal Antibody (H57-597), APC | ThermoFisher Scientific | 17-5961-82 | |
| CD8-α Antibody (KT15), PE | Santa Cruz Biotechnology | sc-53473 | |
| CD4 Monoclonal Antibody (GK1.5), PE-Cyanine5 | ThermoFisher Scientific | 15-0041-81 | |
| MHC Class II (I-A/I-E) Monoclonal Antibody (M5/114.15.2), Alexa Fluor 700 | ThermoFisher Scientific | 56-5321-82 | |
| CD11c Monoclonal Antibody (N418), PE-Cyanine5 | ThermoFisher Scientific | 15-0114-82 | |
| F4/80 Monoclonal Antibody (BM8), eFluor 450 | ThermoFisher Scientific | 48-4801-80 | |
| CD11b Monoclonal Antibody (M1/70), APC | ThermoFisher Scientific | 17-0112-81 | |
| Ly-6G (Gr-1) Monoclonal Antibody (RB6-8C5), PE | ThermoFisher Scientific | 12-5931-82 | |
| CD274 (PD-L1, B7-H1) Monoclonal Antibody (MIH5), PE-Cyanine7 | ThermoFisher Scientific | 25-5982-80 | |
| CD273 (B7-DC) Monoclonal Antibody (122), PerCP-eFluor 710 | ThermoFisher Scientific | 46-9972-82 | |
| Ki-67 Monoclonal Antibody (B56), BV711 | BD Biosciences | 563755 |
References
- Fouad, Y. A., Aanei, C. Revisiting the hallmarks of cancer. American Journal of Cancer Research. 7 (5), 1016-1036 (2017).
- Gajewski, T. F., Schreiber, H., Fu, Y. -X. Innate and adaptive immune cells in the tumor microenvironment. Nature Immunology. 14 (10), 1014-1022 (2013).
- Whiteside, T. L. The tumor microenvironment and its role in promoting tumor growth. Oncogene. 27 (45), 5904-5912 (2008).
- Chiou, V. L., Burotto, M. Pseudoprogression and Immune-Related Response in Solid Tumors. Journal of Clinical Oncology. 33 (31), 3541-3543 (2015).
- Menon, S., Shin, S., Dy, G. Advances in Cancer Immunotherapy in Solid Tumors. Cancers. 8 (12), 106 (2016).
- Denkert, C., et al. Tumor-Associated Lymphocytes As an Independent Predictor of Response to Neoadjuvant Chemotherapy in Breast Cancer. Journal of Clinical Oncology. 28 (1), 105-113 (2010).
- Lee, Y., et al. Therapeutic effects of ablative radiation on local tumor require CD8+ T cells: changing strategies for cancer treatment. Blood. 114 (3), 589-595 (2009).
- Stakheyeva, M., et al. Role of the immune component of tumor microenvironment in the efficiency of cancer treatment: perspectives for the personalized therapy. Current Pharmaceutical Design. 23, (2017).
- Gerner, M. Y., Kastenmuller, W., Ifrim, I., Kabat, J., Germain, R. N. Histo-Cytometry: A Method for Highly Multiplex Quantitative Tissue Imaging Analysis Applied to Dendritic Cell Subset Microanatomy in Lymph Nodes. Immunity. 37 (2), 364-376 (2012).
- Bayne, L. J., Vonderheide, R. H. Multicolor Flow Cytometric Analysis of Immune Cell Subsets in Tumor-Bearing Mice. Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (10), (2013).
- Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. Optimization of murine small intestine leukocyte isolation for global immune phenotype analysis. Journal of Immunological Methods. 405, 97-108 (2014).
- Casadevall, A., Fang, F. C. Rigorous Science: A How-To Guide. mBio. 7 (6), 01902-01916 (2016).
- Yao, Y., et al. CyTOF supports efficient detection of immune cell subsets from small samples. Journal of Immunological Methods. 415, 1-5 (2014).
- Kay, A. W., Strauss-Albee, D. M., Blish, C. A. Application of Mass Cytometry (CyTOF) for Functional and Phenotypic Analysis of Natural Killer Cells. Methods Mol. Biol. 1441, 13-26 (2016).
- Pachynski, R. K., Scholz, A., Monnier, J., Butcher, E. C., Zabel, B. A. Evaluation of Tumor-infiltrating Leukocyte Subsets in a Subcutaneous Tumor Model. Journal of Visualized Experiments. (98), (2015).
