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Biology

Optimisé de gratter Assay for In Vitro test de Migration cellulaire avec une caméra optique automatisée

Published: August 8, 2018 doi: 10.3791/57691
Automatic Translation
1, 1
1Department of Science and Environment, Roskilde University

Summary

Ici, nous décrivons une procédure pour tester la cellule migration in vitro avec un microscope caméra optique automatisé. Le dosage zéro a été largement utilisé lorsque la fermeture de la rayure est suivie pour une période déterminée. Le microscope optique permet une détection fiable et bon marchée de la migration cellulaire.

Abstract

La migration cellulaire est un processus important qui influe sur les nombreux aspects de la santé, comme la cicatrisation et le cancer, et il est donc crucial pour le développement de méthodes pour étudier la migration. Le dosage zéro a longtemps été la méthode la plus courante en vitro pour tester des composés ayant des propriétés anti - et pro - migration en raison de son faible coût et simple procédure. Toutefois, un problème souvent signalé du dosage est l’accumulation de cellules sur le bord de la rayure. En outre, pour obtenir des données de l’essai, images d’expositions différentes il faut sur une période de temps à l’endroit exact même comparer les mouvements de la migration. Analyse de différents programmes peut être utilisés pour décrire la fermeture scratch, mais ils sont travail intensif, inexactes et les forces des cycles de changements de température. Dans cette étude, nous démontrons une méthode optimisée pour tester l’effet de la migration, par exemple avec les protéines d’origine naturelle homme et de la lactoferrine Bovine et leur peptide N-terminal lactoferricine sur la lignée cellulaire épithéliale HaCaT. Une optimisation cruciale consiste à laver et gratter dans du PBS, qui élimine l’accumulation susmentionnée de cellules le long du bord. Cela pourrait s’expliquer par la suppression des cations, qui auraient dû être divulgués à avoir un effet sur la connexion de cellules kératinocytes. Pour assurer la véritable détection des migrations, le prétraitement avec la mitomycine C, un inhibiteur de synthèse de l’ADN, a été ajouté au protocole. Finalement, nous démontrons l’automatisé caméra optique, ce qui élimine les cycles de température excessive, le travail manuel avec analyse de fermeture scratch, tout en améliorant le reproductibilité et assurant l’analyse des sections identiques du scratch au fil du temps.

Introduction

La migration est un processus important qui influe sur plusieurs aspects physiologiques. Dans la cicatrisation des plaies, migration facilite la re-epithelization de la peau. Dans les plaies non-guérison, telles que les plaies chroniques, bactéries opportunistes causent l’infection de la plaie, et plaies ouvertes sont idéales pour la croissance de bactéries et de la formation du biofilm1,2. Le biofilm est une des causes du développement de bactéries résistantes, qui est l’une des menaces plus importantes de notre société moderne3. Dans la cicatrisation des plaies, les cellules immunitaires ne puissent pas pénétrer le biofilm. Dans le cancer, la migration des cellules cancéreuses est une étape charnière de métastases, qui est la principale cause de décès chez les patients atteints de tumeurs solides4,5. Il est donc crucial de pouvoir étudier la migration.

Le dosage zéro est souvent utilisé pour tester la migration cellulaire, parce que c’est bon marché et facile à exécuter sur des lignées de cellules adhérentes, tels que les fibroblastes, endothélial et cellules épithéliales lignes6,7. Aujourd'hui, plusieurs méthodes existent pour effectuer des rayures8et différents matériaux ont été signalés à utiliser, notamment des cure-dents9cellule grattoirs10, lasers11et courants électriques12. Toutes les méthodes ont des inconvénients et des avantages différents, et la méthode doit être décidée selon l’outil de type, budget et analyse cellulaire. Par exemple, si le type de cellule utilisée nécessite de revêtement, suppression de pression manuelle, par exemple avec une pointe d’un cure-dent ou d’une pipette, aura une influence sur les migrations au sein de la zone, une autre méthode doit être utilisée. Dans cette étude, nous nous concentrerons sur grattage manuel.

Un inconvénient de raclage manuel est la variation de la taille, les formes des rayures et l’accumulation de cellules sur les bords de la rayure. Nombreux protocoles existent, et un papier cité conseille une vitesse accrue et/ou lavage complet après grattage13. En outre, plusieurs méthodes ont été utilisées pour minimiser la prolifération, étant donné la prolifération des cellules ne peut pas être distinguée de la migration et par conséquent peut donner des résultats faussement positifs des migrations. Certains signalé des méthodes sont la privation de sérum précédant le scratch14 et en diminuant la quantité de sérum15. Toutefois, aucune de ces méthodes peut s’assurer qu’il n’y a aucune prolifération. Par conséquent, nous présentons un prétraitement des cellules avec la mitomycine C pour s’assurer que les résultats réels de la migration. La mitomycine C est un antibiotique qui inhibe la synthèse de l’ADN en formant une liaison covalente avec l’ADN, ce qui empêche l’ADN de séparation16. Par prétraitement avec la mitomycine C et se laver avec du PBS avant de se gratter, la fermeture détectée de l’écart illustre la véritable migration des cellules (Figure 1).

Une caractéristique de toutes les méthodes est la nécessité d’un système analyser le processus de migration17. Une méthode peu coûteuse pour analyser l’état d’avancement et une commune consiste à utiliser un microscope à lumière-champ de prendre des images de la rayure à des moments prédéterminés, suivies d’une analyse de la fermeture de l’espace dans une image logiciel18,19. Cette méthode est longue et peu fiable en ce qui concerne la prise de photos au même endroit et à la mise au point et le mouvement de l’incubateur à caméra forces cycles de changements de température, tandis que les photos ont été prises. Autres méthodes ont été développées pour détecter des migrations en mesurant le débit de courant. Les changements en cours, sous forme de cellules couvrent plus d’espace sur la plaque, qui se lit comme une augmentation de l' impédance20. En mesurant l’impédance, l’environnement des cellules n’est pas affectée, et la méthode est donc considéré comme non invasif. Cette méthode s’appuie sur des plaques spécialisées avec électrodes en or, qui sont chers, mais ils permettent la détection de nombreux processus, tels que l’adhésion cellulaire, la prolifération, la migration et la mort cellulaire. Un gros inconvénient de cette méthode est que la mesure d’impédance n’indique pas directement la migration, comme les facteurs comme la température ont un impact considérable sur l’impédance. Changement de l’impédance peut être causée par plusieurs facteurs qui ne sont pas examinés par le logiciel, complique l’analyse des données. Par conséquent, l’absence de visualisation nécessite un microscope optique classique pour vérifier la migration.

Pour surmonter plusieurs des inconvénients des techniques disponibles, nous utilisons une caméra optique automatisée en temps réel. La caméra optique est un système de détection avec un microscope de haut-débit dans une petite plateforme avec une lentille, dispositif d’éclairage et un appareil photo numérique. Il a un logiciel intégré, qui permet de tester migration et prolifération entre autres choses. Pour détecter les migrations, les deux algorithmes sont utilisés pour analyser la croissance et la cinétique de la migration des cellules qui s’appellent la prolifération et la cicatrisation de l’analyse, respectivement. L’analyse de prolifération est basé sur un algorithme de segmentation d’image en deux étapes qui applique l’analyse de texture pour détecter la différence entre les zones couvertes de cellule (indiqué en jaune) et vide zones de base établi par l’analyse avancée d’histogramme. L’analyse de cicatrisation est basée sur un algorithme Triple qui détecte la monocouche cellulaire, localise l’écart de la plaie et détermine la largeur de la fente. Ces étapes sont effectuées aux moments déterminés par l’utilisateur et les données sont présentées en zone couverte, largeur de la fente et zone d’écart. Un des grands avantages de cette machine est qu’il permet l’imagerie de cellules adhérentes à travers liquide à cause de l’angle de la caméra21. Les caméra lenstakes incliné images projetées à une pile d’un seul plan z z génèrent pour s’assurer que les images sont en discussion (Figure 2). z-piles sont générées par la fusion de la série de photos (par exemple 40) prises perpendiculaires au bord de la plaie et à travers la plaie ensemble. Les z-piles permet de capturer de la profondeur de la couche de cellules, mais aussi un plan de mise au point dans l’ensemble de la plaie. En outre, la série d’images peut être Assemblée pour une collection de vidéos des images, avec le clic d’un bouton.

Nous démontrons un protocole optimisé pour la détection de la migration dans la lignée de cellules kératinocytes HaCaT. Nous avons testé la lactoferrine et son peptide N-terminal, lactoferricine, chez l’homme et des vaches, d’analyser leurs effets sur les migrations, comme scientifiques ont révélé que ces molécules ont de nombreuses applications comme antimicrobien et immunitaire modulant molécules22 , 23. les quatre composés ont été comparées aux cellules HaCaT non traitées et de facteur de croissance épidermique (EGF) a été utilisé comme témoin positif.

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Protocol

Le montage expérimental n’a aucune restriction éthique et juridique et a été menée en accord avec Université de Roskilde. Un aperçu de la mise en place expérimentale peut être vu dans la Figure 1 et les mécanismes de la caméra optique dans la Figure 2.

1. préparation

  1. Exécutez toutes les étapes dans un stérile à flux laminaire-banc en nettoyant le banc et tous les équipements avec l’éthanol à 70 % avant le début de l’expérience.
  2. Placez la caméra optique dans un incubateur à 37 ° C, avec 5 % de CO2 pour s’assurer des conditions optimales pour les cellules à classique.
  3. La croissance de cellules HaCaT en milieu DMEM avec 10 % de SVF et 1 x antibiotiques (pénicilline et streptomycine) dans une fiole de T75.
  4. Trypsine 1 x 1 mL permet de détacher les cellules et les cultivent tous les 3-4 jours, par disperser au-dessus de la couche cellulaire. Préchauffer à température ambiante avant utilisation.

2. générer une monocouche de HaCaT des cellules dans une plaque de microtitration 48-puits

  1. Retirez le support de la fiole T75 avec une pipette Pasteur.
  2. Laver les cellules adhérentes dans la fiole en ajoutant 5 mL 1 x PBS stérile à la fiole T75.
    Remarque : Assurez-vous que le PBS est exempt de calcium et de magnésium.
  3. Faire circuler les PBS et enlevez-le avec une pipette Pasteur.
  4. Répétez l’étape 2.2-2.3.
  5. Ajouter trypsine 1 x 1 mL dans le ballon et il disperse à travers la couche de cellules.
  6. Incuber le ballon à 37 ° C dans une étuve classique jusqu'à ce que les cellules sont détachent (5-8 min est suffisant pour la plupart des lignées de cellules).
  7. Voir sous le microscope si les cellules sont individuelles. Une fois que les cellules sont individuelles, ajouter 9 mL des milieux de culture ordinaire avec 10 % FBS pour inactiver la trypsine 1 x.
  8. Compter les cellules avec soit un hémocytomètre, un compteur coulter ou similaire.
    Remarque : Le bleu trypan peut être utilisé pour afficher des cellules mortes. Cependant, en trypsine 1 x HaCaT, les cellules sont parfaitement ronde quand vivant.
  9. Transférer 7,5 x 104 cellules/puits dans les médias de SBF 250 µL 10 % sur une plaque de culture de tissus 48 puits à fond rond (plaque standard).
    Note: dosage réglable vers le haut en 6, 12, 24 ou des plaques de 96 puits, qui toutes peuvent être analysés au microscope optique.
  10. Déplacez doucement la plaque de côté à l’autre pour s’assurer que les cellules sont également répartis dans les puits ou les cellules seront réuniront au centre du puits. Inspecter sous un microscope optique pour s’assurer que la cellule est répartie dans les médias
  11. Mettre la plaque dans un conventionnel CO2 incubateur à 37 ° C pendant la nuit ou jusqu'à ce que les cellules ont adhéré au fond des puits.

3. Ajout de Stimuli pour les effets de la Migration

  1. Vérifier si les puits sont confluents de 90 à 95 % sous un microscope optique.
  2. Préparer 10 µg/mL de la mitomycine C dans une quantité appropriée du milieu.
    Remarque : Dans cette étude, la mitomycine C est maintenue à 4 ° C dans une solution-mère à 1 mg/mL. La mitomycine C dans une solution peut être conservée jusqu'à une semaine dans l’obscurité entre 2 et 8 ° C.
  3. Retirez le support usé avec une pipette Pasteur de chaque puits.
  4. Ajouter 250 µL de 5 µg/mL de la mitomycine C dans chaque puits.
  5. Incuber la plaque pendant 2 h à 37 ° C et 5 % de CO2.
  6. Préparer des stimuli de peptides en diluant dans une quantité appropriée de la moyenne.
    Remarque : Dans cette étude, humain et bovin lactoferrine tant lactoferricine ont été testés à 25 µg/mL pour un volume de 250 µL
  7. Enlever le support avec la mitomycine C, avec une pipette Pasteur.
  8. Laver les puits Pipetter 1 x 250 µL de 1 x PBS (température ambiante) et enlever le lavage avec un Pasteur.
  9. Ajouter 250 µL de solution 1 PBS x et gratter manuellement les puits verticalement avec une pointe de pipette 200 µL. Utiliser un nouvel embout de la pipette pour chaque puits.
  10. Supprimez les PBS et stimuli de peptide 250 µL.
  11. Monter le système de caméra optique en ajustant les vis des deux côtés de la plaque. Laissez le couvercle sur la plaque de microtitration.
    Remarque : La caméra peut fonctionner avec le couvercle ouvert si nécessaire.

4. configurer le programme pour la caméra optique sur l’ordinateur

  1. Cliquez sur acquérir dans la barre d’outils sur la gauche.
  2. Choisissez la fonction la cicatrisation dans la barre d’outils sur la gauche.
  3. Choisissez le type de plaque en cliquant sous l' illustration de la plaque.
  4. Désactiver l’option puits, ne l’utilisez, en les marquant et cliquez sur activer en haut à gauche sur l’écran.
    Remarque : Tous les puits sont sélectionnés par défaut.
  5. Régler la netteté de la lentille sur les puits pour s’adapter à la position des cellules par un clic droit sur l’un des puits.
    Remarque : Mise au point automatique peut également être ajusté manuellement en déplaçant la barre à droite de l’illustration de la plaque.
  6. Définissez le délai prévu pour donner des images dans l’Intervalle (par exemple (00:30:00)).
  7. Définir le nombre de répétition pour s’adapter à la période souhaitée (par exemple 97 répétitions).
  8. Lancer l’exécution en cliquant sur le bouton Démarrer dans le coin inférieur droit.

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Representative Results

HaCaT est une lignée de cellules kératinocytes, un des types de cellules plus abondantes dans la peau. En cas d’une plaie, les cellules de la peau commencent à proliférer et à migrer vers le lit de la plaie pour refermer la plaie (Figure 3). Les deux processus sont donc d’une importance capitale pour la bonne cicatrisation.

La caméra optique peut suivre les deux processus en temps réel. Pour les migrations, le système donne trois ensembles de données : cellule couverte zone, largeur de la fente et zone de gap. Lorsque la surveillance rayures traités avec la lactoferrine, lactoferricine ou EGF, le microscope optique permet de surveiller ces trois paramètres au fil du temps. Après 48 h d’incubation, nous observons que l’EGF a abouti à 95 % de fermeture de la plaie, comparée à 38 % de fermeture du contrôle non traité (Figure 3 a). Les différentes versions de la lactoferrine et la lactoferricine sont placées entre 33 % et refermer les plaies de 62 % avec les peptides étant plus puissant que les protéines de parent. Le pourcentage de fermeture de la plaie, déterminé à partir des changements dans la largeur de la fente de la zéro initial, peut aussi être tracées (Figure 3 b).

Les cellules HaCaT ont une interaction forte cellule-cellule et quand les cellules migrent, série d’étapes est requis24. Peu de temps, les cellules principales perturbent leur site d’adhésion, font saillie et contracter le cytosquelette pour déplacer le25. La saillie des cellules principales peut facilement considérer avec la caméra optique (Figure 4).

Figure 1
Figure 1 : Diagramme schématique du scratch test pour tester la migration sur une caméra optique. Cellules HaCaT sont plaqués sur une plaque de 48 puits et autorisés à se conformer pendant 24 h. Les cellules sont pré-traitées avec la mitomycine C pendant 2 h inhiber la prolifération et le scratch a été réalisé et suivi par l’addition des stimuli de peptide. La plaque est insérée dans l’appareil de la caméra optique, et la migration est suivie pendant 48 h.

Figure 2
Figure 2 : La technologie d’analyse de la caméra optique. L’unité optique de la caméra optique automatisée est inclinée à 6,25 ° à l’horizontale pour activer l’analyse par le biais de diverses solutions telles que des solutions bactériennes et cellulaires. La série acquise d’images contiennent des piles d’image des tous les axes, les out-of-focus et mise au point, afin d’assurer des images avec les cellules in-focus. Modification du26.

Figure 3
Figure 3 : Transfert de pré-traité mitomycine C HaCaT cellule plus de 48 heures. (A) Migration est détectée sur la caméra optique automatisée toutes les demi-heures pendant 48 h. Les cellules sont prétraités avec la mitomycine C pour inhiber la prolifération. Les cellules sont traitées avec 25 µg/mL de humain - ou bovine-lactoferrine (H-LF ou B-LF) ou - lactoferricine (H-LFcin, B-LFcin). Facteur de croissance épithélial (EGF) est utilisé comme témoin positif à 500 ng/mL. Les cellules HaCaT non traitées sont utilisées comme un contrôle. (B) graphique de l’illustration de la migration des traitements. Les résultats sont des représentants des trois essais indépendants, et les résultats sont donnés comme un pourcentage de fermeture du scratch initial * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001.

Figure 4
Figure 4 : Saillie lamellipodia des traités de cellules HaCaT. Lamellipodia des cellules HaCaT est marquée par les flèches noires. L’interaction forte cellule-cellule de l’HaCaT se traduit par un mouvement dynamique des cellules qu’ils migrent et peuvent être facilement observées au fil du temps.

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Discussion

L’importance de la migration dans les études de développement, la cicatrisation des plaies, immunologie et le cancer a conduit à plusieurs méthodes différentes pour étudier les migrations. Migration peut être une expression de l’expansion ou la fermeture de l’écart par les cellules. Plus souvent la fermeture de la rayure est testée, comme il est plus facile à cultiver des cellules en une monocouche et ensuite faire une égratignure à la croissance des cellules dans une formule spécifique8. Notre étude démontre une méthode optimisée pour faire du scratch manuel, car la technique est facile à maîtriser et à faible coût. Nous vous présentions la mitomycine d’inhibiteur de la synthèse ADN C, un lavage supplémentaire afin d’optimiser l’égratignure comparé aux méthodes publiées18et l’utilisation d’une caméra optique qui permet des études de haut débit.

L’essai in vitro gratter avec nécessite une ligne de cellules adhérentes qui lie correctement au fond des puits et pour détecter les migrations sur une égratignure, prolifération doit être inhibée. Ces deux caractéristiques sont essentielles pour l’essai. Pour détecter la migration réelle, plusieurs approches ont été décrites avec diminution de la concentration sérique, la cellule avant grattage14, DMSO ou divers inhibiteurs 13,27de faim. En général, un support sans sérum peut être utilisé, cependant, certaines lignées de cellules, telles que les lignes cellulaires primaires, sérum de la nécessité pour le mouvement et la survie globale. Donc, le choix doit être effectué selon la lignée cellulaire. Lignées cellulaires nécessitant un revêtement peuvent être problématiques dans ce test, comme les rayures manuels perturbera le revêtement aussi bien.

Différents types de cellules ont besoin du nombre de cellules pour former une monocouche confluente selon leur taux de croissance et de taille différents. Les cellules HaCaT adhèrent après environ 4 à 6 h, mais restent à régler du jour au lendemain pour faire une monocouche stable. Un des inconvénients majeurs du dosage zéro est rayures irrégulières8. Dans cette étude, nous montrons que le prélavage avec du PBS et fait le scratch dans du PBS nouvelle diminuent des accumulations de cellules blessés et endommagés le long des bords de la rayure. Plausible, cela pourrait s’expliquer par l’intersection de desmosomes reliant les cellules de la peau. Les jonctions sont Ca2 +-dépendante24 et à l’aide de PBS, les cations sont enlevées, qui pourrait affaiblir l’adhérence des cellules. Ainsi, l’utilisation de PBS pourrait permettre meilleure élimination des cellules individuellement, menant à moins l’accumulation des cellules le long du bord de la plaie. En outre, la caméra optique mesure une grande partie des puits dans toutes les tailles de plaques et s’adapte aux palées dans le scratch par l’intermédiaire de son algorithme Triple. Ainsi, par un prélavage avec du PBS et à l’aide de la caméra optique, les inconvénients des rayures manuels sont éliminés. Le z-empilement des images fait en se concentrant sur les cellules plus précis, mais selon la façon dont les différents types de cellules poussent, le focus peut être un problème. Si les cellules se développent trop, le focus de la caméra passera de mise au point à out-of-focus. Ainsi, si la mitomycine C n’est pas utilisée, il peut être avantageux de définir le focus un peu plus haut, si votre installation expérimentale se déroulera pendant plus de 24 h. La caméra optique a un montage facile qui est commandé par un ordinateur standard avec un logiciel intuitif qui peut mesurer des plaques de 6 à 96-puits microplaques et par conséquent permet diverses configurations de test. Lorsque vous choisissez le nombre d’images à prendre, il existe très peu de limitations. Si l'on utilise une plaque à 96 puits, le nombre de photos que l'on peut obtenir est seulement limitée à l’espace sur l’ordinateur, comme des ensembles de données peut devenir volumineux et par la vitesse de l’appareil photo. Si plusieurs images sont nécessaires dans une succession rapide, le mouvement de la caméra peut être un facteur limitant, car il a besoin de temps pour analyser chaque bien.

Le système optique permet simple mais puissant de surveillance. Les photos du scratch sont analysés en ce qui concerne le processus de la fermeture de l’espace, mais peuvent également être utilisés pour la caractérisation morphologique des cellules. Le logiciel marque les cellules jaunes et laisse la couleur d’arrière-plan gris comme une fonction standard, pour mieux visualiser le bord de la plaie, mais les images raw sont évidemment disponibles si qui s’avère nécessaire pour les publications par exemple . Les cellules HaCaT ont des interactions fortes cellules qui permettent la migration se produisent dans une feuille dynamique28. Cette caractéristique le rend facile de voir les lamellipodia des cellules migratrices au fil du temps (Figure 4).

Cette étude montre l’effet des protéines lactoferrine et leurs peptides N-terminales dérivées lactoferricine et EGF comme témoin positif, mais pourrait être modifiée afin de tester différents médicaments, peptides/protéines et combinaisons, comme inhibiteurs ou stimulateurs de la cicatrisation des plaies. Le dosage zéro peut être modifié et optimisé pour s’adapter à différentes lignées cellulaires et les composés qui peuvent affecter la migration. Ensemble, avec sa facilité de gestion simple et à faible coût, ce dosage est très accessible pour la plupart des laboratoires. La caméra optique pourrait être utilisée pour tester différents médicaments inhibiteurs ou stimulateurs pour la migration, mais aussi la prolifération.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Le Conseil danois pour la recherche indépendante, de technologie et de Production, contribue #4005-00029

Materials

Name Company Catalog Number Comments
oCelloScope BioSense Solution ApS Optical camera
UniExplorer software  BioSense Solution ApS (8.0.0.7144 (RL3))
HaCaT cell Donated from Bispebjerg Hospital
DMEM (1x) + GlutaMAX Gibco 31966-021 Medium for HaCaT
FBS Gibco 10270 Fetal bovine serum
PBS Gibco D837 Without Mg+ and Ca2+
Pencillin-Streptomycin Sigma P0781 Antibiotics
Trypsin (10x) Sigma T3924
Mitomycin C Tocris 3258 Inhibits proliferation
Microtiter plate Greiner Bio-one 677 180
Incubator Panasonic 37°C, 5% CO2
Hemocytometer Assistent Türk (0.1 mm)
Pipet boy Accu-Jet pro

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References

  1. Frykberg, R. G., Banks, J. Challenges in the Treatment of Chronic Wounds. Advances in wound care. 4 (9), 560-582 (2015).
  2. da Silva, L., Carvalho, E., Cruz, M. T. Role of neuropeptides in skin inflammation and its involvement in diabetic wound healing. Expert opinion on biological therapy. 10 (10), 1427-1439 (2010).
  3. Vyas, K. S., Wong, L. K. Detection of Biofilm in Wounds as an Early Indicator for Risk for Tissue Infection and Wound Chronicity. Annals of Plastic Surgery. 76 (1), 127-131 (2016).
  4. Paul, C. D., Mistriotis, P., Konstantopoulos, K. Cancer cell motility: lessons from migration in confined spaces. Nature Reviews Cancer. 17 (2), 131-140 (2016).
  5. Folkman, J. Angiogenesis. Annual review of medicine. 57, 1-18 (2006).
  6. Monsuur, H. N., et al. Methods to study differences in cell mobility during skin wound healing in vitro. Journal of Biomechanics. 49 (8), 1381-1387 (2016).
  7. Tang, L., et al. Human lactoferrin stimulates skin keratinocyte function and wound re-epithelialization. The British journal of dermatology. 163 (1), 38-47 (2010).
  8. Ashby, W. J., Zijlstra, A. Established and novel methods of interrogating two-dimensional cell migration. Integrative Biology. 4 (11), 1338-1350 (2012).
  9. Klettner, A., Tahmaz, N., Dithmer, M., Richert, E., Roider, J. Effects of aflibercept on primary RPE cells: toxicity, wound healing, uptake and phagocytosis. British Journal of Ophthalmology. 98 (10), 1448-1452 (2014).
  10. Doyle, W., Shide, E., Thapa, S., Chandrasekaran, V. The effects of energy beverages on cultured cells. Food and Chemical Toxicology. 50 (10), 3759-3768 (2012).
  11. Zordan, M. D., Mill, C. P., Riese, D. J., Leary, J. F. A high throughput, interactive imaging, bright-field wound healing assay. Cytometry Part A. 79 (3), 227-232 (2011).
  12. Keese, C. R., Wegener, J., Walker, S. R., Giaever, I. Electrical wound-healing assay for cells in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (6), 1554-1559 (2004).
  13. Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nature Protocols. 2 (2), 329-333 (2007).
  14. Räsänen, K., Vaheri, A. TGF-beta1 causes epithelial-mesenchymal transition in HaCaT derivatives, but induces expression of COX-2 and migration only in benign, not in malignant keratinocytes. Journal of Dermatological Science. 58 (2), 97-104 (2010).
  15. Tochio, T., Tanaka, H., Nakata, S., Hosoya, H. Fructose-1,6-bisphosphate aldolase A is involved in HaCaT cell migration by inducing lamellipodia formation. Journal of Dermatological Science. 58 (2), 123-129 (2010).
  16. Tomasz, M. Mitomycin C: small, fast and deadly (but very selective). Chemistry and Biology. 2 (9), 575-579 (1995).
  17. Stamm, A., Reimers, K., Strauß, S., Vogt, P., Scheper, T., Pepelanova, I. In vitro wound healing assays - state of the art. BioNanoMaterials. 17 (1-2), 79-87 (2016).
  18. Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. In vitro Cell Migration and Invasion Assays. Journal of Visualized Experiments. (88), 1-8 (2014).
  19. Jonkman, J. E. N., et al. An introduction to the wound healing assay using live-cell microscopy. Cell Adhesion & Migration. 8 (5), 440-451 (2016).
  20. Hong, J., Kandasamy, K., Marimuthu, M., Choi, C. S., Kim, S. Electrical cell-substrate impedance sensing as a non-invasive tool for cancer cell study. The Analyst. 136 (2), 237-245 (2011).
  21. Fredborg, M., et al. Real-time optical antimicrobial susceptibility testing. Journal of Clinical Microbiology. 51 (7), 2047-2053 (2013).
  22. Jenssen, H. Anti herpes simplex virus activity of lactoferrin/lactoferricin - An example of antiviral activity of antimicrobial protein/peptide. Cellular and Molecular Life Sciences. 62 (24), 3002-3013 (2005).
  23. Jenssen, H., Hancock, R. E. W. Antimicrobial properties of lactoferrin. Biochimie. 91 (1), 19-29 (2009).
  24. Delva, E., Tucker, D. K., Kowalczyk, A. P. The desmosome. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 1 (2), 1-17 (2009).
  25. Ponti, A. Two Distinct Actin Networks Drive the Protrusion of Migrating Cells. Science. 305 (5691), 1782-1786 (2004).
  26. Canali, C., Spillum, E., Valvik, M., Agersnap, N., Olesen, T. Whitepaper a Digital Time-Lapse Bright Field Technology To Drive Faster, Higher Throughput Bioanalysis. , (2016).
  27. Peplow, P. V., Chatterjee, M. P. A review of the influence of growth factors and cytokines in in vitro human keratinocyte migration. Cytokine. 62 (1), 1-21 (2013).
  28. Ilina, O., Friedl, P. Mechanisms of collective cell migration at a glance. Journal of Cell Science. 122 (18), 3203-3208 (2009).

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