Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

אופטימיזציה Assay מאפס במבחנה בדיקה של נדידת תאים עם מצלמה אופטית אוטומטית

Published: August 8, 2018 doi: 10.3791/57691
Automatic Translation
1, 1
1Department of Science and Environment, Roskilde University

Summary

כאן נתאר הליך כדי לבחון את התא ההעברה במבחנה עם מיקרוסקופ אופטי מצלמה אוטומטית. וזמינותו מאפס כבר בשימוש נרחב שבו הסגר על השריטה מלווה קצוב. מיקרוסקופ אופטי מאפשר זיהוי אמין וזול של נדידת תאים.

Abstract

נדידת תאים הוא תהליך חשוב זה משפיע על היבטים רבים של בריאות, כגון ריפוי הפצע סרטן, וזה, לפיכך, חיוני לפיתוח שיטות ללמוד את ההעברה. וזמינותו מאפס כבר זמן רב השיטה הנפוצה ביותר במבחנה לבדיקת תרכובות בעלות מאפיינים migration נגד פרו בגלל הליך שלו זולה ופשוטה. אולם, לבעיית וזמינותו מדווחים לעתים קרובות היא ההצטברות של תאי מעבר לקצה של השריטה. יתר על כן, כדי להשיג מידע וזמינותו, תמונות של חשיפות שונות חייב להילקח על פני תקופה של זמן, באותו מקום בדיוק כדי להשוות את התנועות של ההעברה. ניתן להשתמש בתוכניות ניתוח שונים כדי לתאר את הסגר מאפס, אך הם עבודה אינטנסיבית, אינו מדויק, ואת כוחות מחזורים של שינויי טמפרטורה. במחקר זה, נדגים שיטה ממוטב עבור בדיקת ההשפעה ההעברה, למשל עם החלבונים המתרחשים באופן טבעי האדם - ו שור-לקטופרין, שלהם פפטיד N-מסוף Lactoferricin על הקו תאים אפיתל HaCaT. אופטימיזציה מכריע היא לשטוף את לגרד ב- PBS, מה שמבטל את הצטברות תאים לאורך הקצה הנ. זו יכולה להיות מוסברת על ידי ההסרה של קטיונים, אשר הוכחו יש השפעה על חיבור תאים תאים תקין. כדי להבטיח זיהוי נכון של הגירה, בטיפול מראש עם מיטומיצין C, מעכב סינתזת ה-DNA, נוספה לפרוטוקול. לבסוף, נדגים אוטומטיות אופטי למצלמה, מה שמבטל מחזורי בטמפרטורה הקיצונית, כפיים עם ניתוח סגירת מאפס, תוך שהיא משפרת על הפארמצבטית להבטיח ניתוח קטעים זהים של השריטה לאורך זמן.

Introduction

ההעברה היא תהליך חשוב המשפיע מספר היבטים פיזיולוגיים. בריפוי הפצע, העברת מקל epithelization מחדש של העור. הפצעים ללא ריפוי, כגון לפצעים כרוניים, חיידקים הזדמנותית לגרום לזיהום הפצע, פצעים פתוחים הם אידיאליים עבור גידול חיידקים ועל היווצרות biofilm1,2. Biofilm הוא אחד הגורמים להתפתחות חיידקים עמידים, אשר הוא אחד האיומים הגדולים ביותר שלנו בחברה המודרנית3. בריפוי הפצע, תאים חיסוניים לא יכול לחדור את biofilm. ב סרטן, העברה של תאים סרטניים הוא צעד מכריע של גרורות, שהוא הגורם העיקרי למוות אצל חולים עם גידולים מוצקים4,5. לכן, זה הכרחי להיות מסוגל ללמוד ההעברה.

גירוד וזמינותו משמש לעתים קרובות כדי לבדוק את נדידת תאים כי זה זול וקל לביצוע על שורות תאים חסיד, כגון פיברובלסט, אנדותל, ותא אפיתל קווים6,7. כיום, קיימות מספר שיטות לביצוע שריטות8, חומרים שונים דווח לשמש, לרבות קיסמים9, מגרדים תא10, לייזרים11זרמים חשמליים12. כל אחת מהשיטות יש והחסרונות השונים, השיטה צריכה להיות החליט על פי הכלי סוג תקציב, ניתוח התא. לדוגמה, אם סוג התא בשימוש דורש ציפוי, הסרת לחץ ידני, למשל עם טיפ קיסם או פיפטה, ישפיע הדבר על הגירה בתוך האזור, יש להשתמש בשיטה שונה. במחקר זה, אנו נתמקד גירוד ידנית.

חסרון עבור גירוד ידני הוא וריאציה של גודל, צורות של השריטות, הצטברות של תאים בקצוות של השריטה. קיימים פרוטוקולים רבים, ומייעץ מאמר מצוטט מאוד מהירות מוגברת ו/או שטיפה לאחר גירוד13. בנוסף, מספר שיטות השתמשו כדי לצמצם את התפשטות, כיוון התפשטות התאים ניתן להבחין בין הגירה ולכן עלולה להחזיר תוצאות חיוביות שגויות של הגירה. כמה דיווח שיטות הרעבה סרום שקדמו מאפס14 ולאחר הפחתת כמות הנסיוב15. עם זאת, אף אחת מהשיטות האלה תוכל להבטיח שיש אין התפשטות. לכן, אנחנו מדווחים על טיפול טרום התאים עם מיטומיצין C כדי להבטיח תוצאות אמת של הגירה. מיטומיצין C הוא אנטיביוטיקה כי מעכב סינתזת ה-DNA על ידי יצירת של קשר קוולנטי עם ה-DNA, ומונע את הדנ א של הפרדת16. על ידי טיפול מראש עם מיטומיצין C ושטיפת תסיים לפני גירוד, הסגר שזוהו על הפער מדגים את ההעברה נכון של התאים (איור 1).

מאפיין של כל השיטות הוא הצורך עבור מערכת לנתח את תהליך ההעברה17. נפוצה שיטה זולה כדי לנתח את ההתקדמות הוא להשתמש במיקרוסקופ אור-השדה לקחת תמונות של השריטה בנקודות זמן שנקבע מראש, ואחריו ניתוח של סגירת הפער התמונה תוכנה18,19. שיטה זו גוזלת זמן, אמין לגבי לצלם באותו מקום, מיקוד, התנועה מן החממה המצלמה כוחות מחזורים של שינויי טמפרטורה בזמן מצולמות התמונות. פותחו שיטות אחרות כדי לזהות ההעברה על ידי מדידת הזרם הנוכחי. השינויים הנוכחיים, כתאי לכסות יותר שטח על הצלחת, אשר קרא כמו עלייה עכבה20. על ידי מדידת התנגדות, הסביבה של התאים אינו מושפע, השיטה ולכן היא נחשבת לא פולשנית. שיטה זו מסתמכת על צלחות מיוחדות עם אלקטרודות זהב, אשר יקר, אבל הם מאפשרים זיהוי של תהליכים רבים, כגון הדבקות הסלולר, הפצה, העברה מוות של תאים. חיסרון גדול של שיטה זו הוא כי המדידה עכבה לא ישירות מצביעות על ההעברה, כמו גורמים כמו טמפרטורה יש השפעה רבה על עכבה. שינויים עכבה יכולה להיגרם על ידי מספר גורמים אשר לא נבדקות על ידי התוכנה, יותר מקשה על הניתוח של הנתונים. לפיכך, היעדר ויזואליזציה דורש מיקרוסקופ אור קונבנציונלי כדי לוודא העברה.

כדי להתגבר על רוב המגרעות של טכניקות זמינים, אנו משתמשים במצלמה אופטית אוטומטית בזמן אמת. המצלמה אופטי היא מערכת זיהוי עם מיקרוסקופ תפוקה גבוהה ב פלטפורמה קטן עם עדשה, יחידת תאורה של מצלמה דיגיטלית. יש תוכנה מובנית, אשר ניתן לבחון ההגירה והתפשטות בין היתר. כדי לזהות את ההעברה, שני אלגוריתמים משמשים כדי לנתח את הצמיחה וקינטיקה ההעברה של תאים, אשר נקראים ההתפשטות ו הפצע ריפוי ניתוח, בהתאמה. ניתוח התפשטות הוא מבוסס על אלגוריתם פילוח תמונה בשני שלבים שחל במרקם ניתוח כדי לזהות את ההבדל בין שטחים מכוסי תא (מוצג בצהוב) וריק רקע אזורים על-ידי ניתוח ההיסטוגרמה מתקדם. הפצע ריפוי ניתוח מבוססת על אלגוריתם שלושה שלבים מזהה את טפט תא, מאתרת את הפער הפצע, והוא קובע את רוחב המרווח. השלבים נערכים אצל המוגדרות על-ידי המשתמש בזמן נקודות, הנתונים מוצג באזור מקורה, רוחב המרווח ואזור הפער. אחד היתרונות הגדולים של מחשב זה הוא כי הוא מאפשר הדמיה של תאים חסיד דרך נוזלי בגלל זווית המצלמה21. תמונות lenstakes בעת הטיית המצלמה מוקרנים אל ערימה-z של z-מטוס בודד ליצור כדי להבטיח כי התמונות בפוקוס (איור 2). z-במחסן נוצרות על-ידי מיזוג הסדרה של תמונות (למשל 40) שצולמו בניצב לקצה הפצע, ועל -פני כל הפצע. Z-הערימות מאפשר לכידה של העומק של השכבה תא, כמו גם מטוס בפוקוס על פני הפצע. יתר על כן, הסדרה של תמונות שאפשר להרכיב על אוסף וידאו של התמונות, בלחיצה על כפתור.

נדגים פרוטוקול ממוטבת גילוי של ההעברה בקו תא תקין HaCaT. בדקנו לקטופרין, שלה N-מסוף פפטיד, Lactoferricin, בני האדם, פרות, כדי לנתח את השפעתם על הגירה כמו מולקולות אלה הוכחו יש יישומים רבים מיקרוביאלית ו החיסונית להתכוונן מולקולות22 , 23. תרכובות ארבע, לעומת תאים HaCaT אינו מטופל, גורם הגדילה באפידרמיס (EGF) שימש פקד חיובי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הגדרת הניסוי נערך מסכים עם אוניברסיטת רוסקילדה, ויש אין מגבלה אתית ומשפטית. סקירה כללית של הסידור ניסיוני ניתן לראות באיור 1 ואת המנגנונים של המצלמה אופטי באיור2.

1. הכנה

  1. לבצע את כל הצעדים זרימה שכבתית-ספסל סטרילי על-ידי ניקוי הספסל, חסכון כל עם 70% אתנול לפני התחלת הניסוי.
  2. מקם את המצלמה אופטי חממה קונבנציונאלי ב 37 ° C עם 5% CO2 ליצירת תנאים אופטימליים עבור התאים.
  3. לגדל תאים HaCaT בתקשורת DMEM עם 10% FBS ואנטיביוטיקה 1 x (פניצילין, סטרפטומיצין) בבקבוקון T75.
  4. השתמש טריפסין 1 x 1 מ"ל כדי לנתק את התאים ואת תת מטפח אותן כל 3-4 ימים, על ידי פיזור זה מעל השכבה הסלולר. מחממים מראש לטמפרטורת החדר לפני השימוש.

2. יצירת של טפט של HaCaT תאים בצלחת Microtiter 48-ולס

  1. הסר את המדיום של הבקבוק T75 עם פיפטה פסטר.
  2. רחץ התאים חסיד הבקבוק על-ידי הוספת מ ל 1 x PBS עקר הבקבוקון T75.
    הערה: ודא PBS חינם של סידן ומגנזיום.
  3. הפיצו את PBS ולהסיר אותו עם פיפטה פסטר.
  4. חזור על שלב 2.2-2.3.
  5. להוסיף הבקבוקון טריפסין 1 x 1 מ"ל ומעוררים אותה לאורך השכבה התא.
  6. דגירה. הבקבוק ב- 37 מעלות צלזיוס חממה קונבנציונאלי עד התאים הם צמודי קרקע (5-8 דקות מספיקה עבור מרבית שורות תאים).
  7. להציג במיקרוסקופ אם התאים הם צמודי קרקע. ברגע התאים מנותקים, להוסיף 9 מ של התקשורת תרבות קבוע עם 10% FBS כדי להשבית את טריפסין 1 x.
  8. לספור את התא עם, או hemocytometer קולטר-מונה או דומה.
    הערה: Trypan blue יכול לשמש כדי להציג תאים מתים. עם זאת, טריפסין 1 x HaCaT תאים הם לגמרי בסיבוב כאשר בחיים.
  9. העברה 7.5 x 104 תאים/טוב בתקשורת FBS 10% µL 250 צלחת תרביות רקמה של 48-ובכן להטלטל עגול (צלחת רגילה).
    הערה: Assay גם ניתן להגדיר ב- 6-, 12-, 24- או צלחות 96-ובכן, אשר כולם יכולים להיות לבדיקה במיקרוסקופ אופטי.
  10. להניע בעדינות את הצלחת מצד לצד כדי להבטיח שהתאים מתפשטים באופן שווה בתוך הבארות, או התאים אנקה במרכז הבארות. לבדוק תחת מיקרוסקופ אור כדי לוודא שהתא מופצת באופן שווה בתקשורת
  11. לשים את הצלחת חממה2 CO קונבנציונאלי ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה או עד התאים יש דבקה בתחתית הבארות.

3. תוספת של גירויים לאפקטים ההעברה

  1. בדוק אם הבארות הן 90-95% confluent תחת מיקרוסקופ אור.
  2. הכינו 10 µg/mL של מיטומיצין C בהכמות המתאימה של המדיום.
    הערה: במחקר זה, מיטומיצין C נשמרת ב 4 ° C בפתרון מניות ב 1 מ"ג/מ"ל. מיטומיצין C בתמיסה ניתן לאחסן שבוע בחושך ב 2-8 ° c
  3. הסר את המדיה בילה עם פיפטה פסטר מכל קידוח.
  4. להוסיף 250 µL של µg/mL 5 של מיטומיצין C בכל טוב.
  5. דגירה את הצלחת. בשביל 2 h-CO 37 ° C ו-5%2.
  6. הכן גירויים של פפטידים על ידי דילול אותם בסכום המתאים של המדיום.
    הערה: במחקר זה, נבדקו שור ואנושי לקטופרין והן Lactoferricin-µg/mL 25 בנפח של 250 µL
  7. הסר את המדיום עם מיטומיצין C עם פיפטה פסטר.
  8. לשטוף את הבארות x 1 עם µL 250 1 x PBS (טמפרטורת החדר) ולהסיר לשטוף עם פסטר פיפטה.
  9. להוסיף µL 250 ל- 1 x PBS ותגרד באופן ידני את הבארות אנכית עם טיפ פיפטה µL 200. השתמש טיפ פיפטה חדש עבור כל טוב.
  10. להסיר את PBS ולהוסיף 250 µL פפטיד גירויים.
  11. לטעון את הצלחת במערכת אופטי מצלמה על-ידי התאמת את הברגים משני צידי הלוח. להשאיר את המכסה הצלחת microtiter.
    הערה: המצלמה יכולה לפעול עם מכסה פתוח במידת הצורך.

4. להגדיר את התוכנית עבור המצלמה אופטי במחשב

  1. לחץ על לחצן ייבוא בשורת המשימות בצד השמאל.
  2. בחר בפונקציה ריפוי פצעים בשורת המשימות בצד השמאל.
  3. בחר את סוג הלוח על ידי לחיצה מתחת לצלחת איור.
  4. ביטול בחירה של וולס, לא נעשה בו שימוש, על-ידי סימונן ולחץ לאפשר בצד השמאלי העליון על המסך.
    הערה: וולס כל נבחרות כברירת מחדל.
  5. התאם את המוקד של העדשה על הבארות כדי להתאים את המיקום של התאים על-ידי לחיצה ימנית על אחת הבארות.
    הערה: פוקוס אוטומטי יכול גם להיות מותאם באופן ידני על-ידי הזזת הסרגל בצד ימין של האיור צלחת.
  6. הגדר את תקופת הזמן לתמונות תחת התמונות מרווח (למשל (00: 30:00)).
  7. להגדיר את מספר החזרות שיתאימו תקופת הרצוי (למשל 97 חזרות).
  8. התחל ההפעלה על ידי לחיצה על לחצן ' התחל ' בפינה הימנית התחתונה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

HaCaT הוא קו תא תקין, אחד הסוגים התא הנפוץ ביותר של העור. כאשר פצע, תאי העור מתחיל להתרבות ולהעביר מעל למיטה הפצע כדי לסגור את הפצע (איור 3). שני התהליכים הם, לכן, חשיבות עליונה עבור ריפוי תקין.

המצלמה אופטי יכול לעקוב אחר שני תהליכים בזמן אמת. עבור העברה, המערכת נותנת שלוש ערכות נתונים: תא מכוסה באזור, רוחב המרווח ואזור הפער. כאשר ניטור שריטות שטופלו לקטופרין, Lactoferricin או EGF, מיקרוסקופ אופטי מאפשר לנו לעקוב אחר שלושה פרמטרים אלה לאורך זמן. לאחר 48 שעות דגירה, אנו מבחינים כי EGF הביא לסגירת 95% של הפצע, לעומת 38% הסגר של הפקד אינו מטופל (איור 3 א). גירסאות שונות של לקטופרין, Lactoferricin ממוקמים בין 33% ל- 62% הפצע סגר עם פפטידים להיות יותר חזק מאשר החלבונים האב. האחוז של סגירת הפצע, מחילופי לשינויים פער רוחב מאפס הראשונית, ניתן גם להתוות (איור 3B).

HaCaT התאים יש אינטראקציה של התא-התא חזק והם כאשר התאים נודדים, שורה של צעדים הנדרשים24. זמן קצר, התאים המובילים לשבש את האתר שלהם של אדהזיה בולטות, חוזה את שלד התא כדי להעביר25. ניתן להציג את בליטה של התאים המובילים בקלות עם המצלמה אופטי (איור 4).

Figure 1
איור 1 : זרימה סכמטי של וזמינותו מאפס כדי לבדוק הגירה על מצלמה אופטי. תאים HaCaT מצופה על צלחת 48-ובכן, מותר לדבוק במשך 24 שעות ביממה. התאים מראש שטופלו מיטומיצין C עבור 2 h לעכב את התפשטות, השריטה הוא ביצע ואחריו התוספת של פפטיד גירויים. הצלחת מוכנס לתוך יחידת המצלמה אופטי, הגירה ואחריו במשך 48 שעות.

Figure 2
איור 2 : טכנולוגיית הסריקה של המצלמה אופטי. יחידת אופטי עדשה של מצלמה אופטית אוטומטית המשופע על 6.25° למישור האופקי כדי לאפשר סריקה באמצעות פתרונות שונים כגון חיידקי ופתרונות הסלולר. סדרת תמונות נרכשות מכילים אוספי תמונות של כל מתמקדת, out-of-להתמקד והן בפוקוס, כדי להבטיח תמונות עם תאים בהמוקד. שונה מ-26.

Figure 3
איור 3 : העברה של טרום שטופלו מיטומיצין C HaCaT תא מעל 48 שעות. (A) ההעברה מזוהה במצלמה אופטית אוטומטית כל חצי שעה. במשך 48 שעות. התאים מטופלים מראש עם מיטומיצין C כדי לעכב את התפשטות. התאים מטופלים עם µg/mL 25 הומאני - או שור-לקטופרין (H-אם או אם B) או - Lactoferricin (H-LFcin, B-LFcin). גורם הגדילה אפיתל (EGF) משמש פקד חיובי ב- 500 ng/mL. לא מטופל HaCaT תאים משמשים פקד. (B) איור גרפי של הגירה של הטיפולים. התוצאות הם נציגים של שלושה מסלולי עצמאית, ניתנת תוצאות כמו סגר אחוז של השריטה הראשונית * p < 0.05, * * p < 0.01, * * * p < 0.001.

Figure 4
איור 4 : בולטות lamellipodia של מטופלים תאים HaCaT. Lamellipodia של התאים HaCaT מסומן על ידי החצים השחורים. האינטראקציה התא-התא חזק של HaCaT תוצאות תנועה דינמית של התאים כפי שהם להעביר בקלות יכול להיות שנצפו לאורך זמן.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

החשיבות של ההגירה במחקרים של פיתוח, ריפוי פצעים, אימונולוגיה, וסרטן הוביל מספר שיטות שונות ללמוד ההעברה. ההעברה יכול להיות ביטוי של ההתרחבות או סגירת הפער על ידי התאים. לרוב הסגר על השריטה נבדק, כפי שהוא קל יותר לגדל תאים חד שכבתי ולאחר מכן לבצע שריטה יותר גוברת התאים לטופס מסוים8. המחקר שלנו מדגים שיטת אופטימיזציה עבור מגרד ידנית, כמו השיטה אינה קלה ועלות נמוכה. הצגנו את מיטומיצין מעכב סינתזה של דנ א ג, ושטוף נוספת כדי למטב את השריטה לעומת שיטות שפורסמו18ולאחר השימוש של מצלמת אופטי המאפשר לימודי תפוקה גבוהה.

במבחנה וזמינותו מאפס דורש קו תא חסיד המאגד כראוי לתחתית הבארות, כדי לזהות ההעברה על שריטה, התפשטות צריך להיות מעוכבים. שתי תכונות אלה חיוניים וזמינותו. כדי לזהות נכון ההעברה, תוארו מספר גישות עם הורדת הריכוז סרום, ברעב התא לפני גירוד14, דימתיל סולפוקסיד או מעכבי שונים 13,27. באופן כללי, ניתן להשתמש באמצעי התקשורת ללא סרום, עם זאת, חלק תא שורות, כגון התא הראשי קווים, הצורך סרום התנועה, את ההישרדות. לכן, הבחירה צריכה להיעשות על פי הקו הסלולרי. שורות תאים שדורשות ציפוי יכול להיות בעיתיים assay הזה, כמו שריטות ידני יפריעו הציפוי גם כן.

סוגי תאים שונים דורשים מספר התאים כדי ליצור של טפט confluent בהתאם שיעור הצמיחה בגודל שלהם שונה. התאים HaCaT לדבוק לאחר כ 4-6 h אך נותרו ליישב בין לילה כדי להפוך של טפט יציב. אחד החסרונות העיקריים של וזמינותו גירוד הוא לא סדיר שריטות8. במחקר זה, אנו מראים כי קדם כביסה עם PBS וביצוע השריטה ב- PBS החדש מצמצם הצטברויות של תאים הפצועים ופגועות לאורך קצות השריטה. זה יכולים יכול להיות מוסבר על ידי צומת desmosomes המחבר את תאי העור. צמתי הם Ca2 +-תלויים24 ועל -ידי שימוש PBS, קטיונים יוסרו, אשר עלול להחליש את הידבקות תאים תאים חזקים. ובכך, השימוש של PBS עלולה לאפשר יותר להסרת התאים בנפרד, שמוביל פחות הצטברות של תאים בשולי הפצע. יתר על כן, המצלמה אופטי מודד חלק רחב של הבארות בכל הגדלים צלחת ומתאימה ל אני השריטה באמצעות אלגוריתם שלה שלושה שלבים. וכך, על ידי שטיפה מראש עם PBS ועל -ידי שימוש במצלמה אופטית, החסרונות של השריטות ידנית מסולקות. Z-הערימה של תמונות גורם התמקדות התאים יותר מדויק, אבל תלוי כמה שונה סוגי תאים לגדול, המוקד יכול להיות בעיה. אם התאים גדלים מדי, המוקד של המצלמה וישתנה בפוקוס כדי out-of-להתמקד. לפיכך, אם מיטומיצין C אינו בשימוש, זה יכול להיות יתרון כדי להגדיר את המוקד גבוה יותר אם הגדרת הניסוי שלך יפעל במשך יותר מ 24 שעות. המצלמה אופטי יש של הגדרת קל אשר מופעל באמצעות מחשב רגיל עם תוכנה אינטואיטיבית שיכול למדוד צלחות מ 6 - ל 96-ובכן צלחות microtiter ומאפשר לפיכך שונים set-ups מבחן. בעת בחירת מספר תמונות להילקח, קיימות מספר מגבלות. אם צלחת 96-ובכן, מספר תמונות יכול להשיג לא רק מוגבל למרחב במחשב, כמו ערכות נתונים יכול להיות גדול, ועל ידי המהירות של המצלמה. אם נדרשים הרבה תמונות ברצף מהיר, תנועת המצלמה יכול להיות גורם מגביל, כמו זה זקוק לזמן כדי לסרוק כל טוב.

המערכת האופטית מאפשר פשוט אך רב עוצמה ניטור. התמונות של השריטה ניתוח תהליך של סגירת הפער אך יכול לשמש גם עבור אפיון מורפולוגי של התאים. התוכנה מסמן את התאים צהוב ומשאיר את צבע הרקע אפור כמו תכונה סטנדרטית, משופרת לקצה הפצע, אבל בתמונות raw ברור זמינים צריכה זה להיות נחוץ עבור למשל פרסומים. התאים HaCaT יש אינטראקציות חזקה תא תא ההופכים את ההעברה להתרחש גיליון דינמי28. תכונה זו מקלה לראות lamellipodia של התאים נודדים לאורך זמן (איור 4).

מחקר זה מדגים את ההשפעה של החלבונים לקטופרין, שלהם פפטידים N-מסוף נגזר Lactoferricin, ו EGF כפקד חיובי, אך יכול להיות שונה כדי לבדוק תרופות שונות, פפטידים/חלבונים ו שילובים, מעכבי או תכשירים של ריפוי הפצע. וזמינותו גירוד יכול להיות שונה וממוטב כדי להתאים שורות תאים ותרכובות שונות שיכולות להשפיע על ההעברה. יחד, עם יכולת הניהול שלו זולה וקלה, וזמינותו הזה נגיש מאוד עבור רוב מעבדות. ניתן להשתמש במצלמה אופטית כדי לבדוק תרופות שונות, מעכבי או תכשירים עבור ההעברה, אלא גם התפשטות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

המועצה הדנית למען מחקר עצמאי, טכנולוגיה, ייצור, להעניק #4005-00029

Materials

Name Company Catalog Number Comments
oCelloScope BioSense Solution ApS Optical camera
UniExplorer software  BioSense Solution ApS (8.0.0.7144 (RL3))
HaCaT cell Donated from Bispebjerg Hospital
DMEM (1x) + GlutaMAX Gibco 31966-021 Medium for HaCaT
FBS Gibco 10270 Fetal bovine serum
PBS Gibco D837 Without Mg+ and Ca2+
Pencillin-Streptomycin Sigma P0781 Antibiotics
Trypsin (10x) Sigma T3924
Mitomycin C Tocris 3258 Inhibits proliferation
Microtiter plate Greiner Bio-one 677 180
Incubator Panasonic 37°C, 5% CO2
Hemocytometer Assistent Türk (0.1 mm)
Pipet boy Accu-Jet pro

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Frykberg, R. G., Banks, J. Challenges in the Treatment of Chronic Wounds. Advances in wound care. 4 (9), 560-582 (2015).
  2. da Silva, L., Carvalho, E., Cruz, M. T. Role of neuropeptides in skin inflammation and its involvement in diabetic wound healing. Expert opinion on biological therapy. 10 (10), 1427-1439 (2010).
  3. Vyas, K. S., Wong, L. K. Detection of Biofilm in Wounds as an Early Indicator for Risk for Tissue Infection and Wound Chronicity. Annals of Plastic Surgery. 76 (1), 127-131 (2016).
  4. Paul, C. D., Mistriotis, P., Konstantopoulos, K. Cancer cell motility: lessons from migration in confined spaces. Nature Reviews Cancer. 17 (2), 131-140 (2016).
  5. Folkman, J. Angiogenesis. Annual review of medicine. 57, 1-18 (2006).
  6. Monsuur, H. N., et al. Methods to study differences in cell mobility during skin wound healing in vitro. Journal of Biomechanics. 49 (8), 1381-1387 (2016).
  7. Tang, L., et al. Human lactoferrin stimulates skin keratinocyte function and wound re-epithelialization. The British journal of dermatology. 163 (1), 38-47 (2010).
  8. Ashby, W. J., Zijlstra, A. Established and novel methods of interrogating two-dimensional cell migration. Integrative Biology. 4 (11), 1338-1350 (2012).
  9. Klettner, A., Tahmaz, N., Dithmer, M., Richert, E., Roider, J. Effects of aflibercept on primary RPE cells: toxicity, wound healing, uptake and phagocytosis. British Journal of Ophthalmology. 98 (10), 1448-1452 (2014).
  10. Doyle, W., Shide, E., Thapa, S., Chandrasekaran, V. The effects of energy beverages on cultured cells. Food and Chemical Toxicology. 50 (10), 3759-3768 (2012).
  11. Zordan, M. D., Mill, C. P., Riese, D. J., Leary, J. F. A high throughput, interactive imaging, bright-field wound healing assay. Cytometry Part A. 79 (3), 227-232 (2011).
  12. Keese, C. R., Wegener, J., Walker, S. R., Giaever, I. Electrical wound-healing assay for cells in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (6), 1554-1559 (2004).
  13. Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nature Protocols. 2 (2), 329-333 (2007).
  14. Räsänen, K., Vaheri, A. TGF-beta1 causes epithelial-mesenchymal transition in HaCaT derivatives, but induces expression of COX-2 and migration only in benign, not in malignant keratinocytes. Journal of Dermatological Science. 58 (2), 97-104 (2010).
  15. Tochio, T., Tanaka, H., Nakata, S., Hosoya, H. Fructose-1,6-bisphosphate aldolase A is involved in HaCaT cell migration by inducing lamellipodia formation. Journal of Dermatological Science. 58 (2), 123-129 (2010).
  16. Tomasz, M. Mitomycin C: small, fast and deadly (but very selective). Chemistry and Biology. 2 (9), 575-579 (1995).
  17. Stamm, A., Reimers, K., Strauß, S., Vogt, P., Scheper, T., Pepelanova, I. In vitro wound healing assays - state of the art. BioNanoMaterials. 17 (1-2), 79-87 (2016).
  18. Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. In vitro Cell Migration and Invasion Assays. Journal of Visualized Experiments. (88), 1-8 (2014).
  19. Jonkman, J. E. N., et al. An introduction to the wound healing assay using live-cell microscopy. Cell Adhesion & Migration. 8 (5), 440-451 (2016).
  20. Hong, J., Kandasamy, K., Marimuthu, M., Choi, C. S., Kim, S. Electrical cell-substrate impedance sensing as a non-invasive tool for cancer cell study. The Analyst. 136 (2), 237-245 (2011).
  21. Fredborg, M., et al. Real-time optical antimicrobial susceptibility testing. Journal of Clinical Microbiology. 51 (7), 2047-2053 (2013).
  22. Jenssen, H. Anti herpes simplex virus activity of lactoferrin/lactoferricin - An example of antiviral activity of antimicrobial protein/peptide. Cellular and Molecular Life Sciences. 62 (24), 3002-3013 (2005).
  23. Jenssen, H., Hancock, R. E. W. Antimicrobial properties of lactoferrin. Biochimie. 91 (1), 19-29 (2009).
  24. Delva, E., Tucker, D. K., Kowalczyk, A. P. The desmosome. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 1 (2), 1-17 (2009).
  25. Ponti, A. Two Distinct Actin Networks Drive the Protrusion of Migrating Cells. Science. 305 (5691), 1782-1786 (2004).
  26. Canali, C., Spillum, E., Valvik, M., Agersnap, N., Olesen, T. Whitepaper a Digital Time-Lapse Bright Field Technology To Drive Faster, Higher Throughput Bioanalysis. , (2016).
  27. Peplow, P. V., Chatterjee, M. P. A review of the influence of growth factors and cytokines in in vitro human keratinocyte migration. Cytokine. 62 (1), 1-21 (2013).
  28. Ilina, O., Friedl, P. Mechanisms of collective cell migration at a glance. Journal of Cell Science. 122 (18), 3203-3208 (2009).

Tags

ביולוגיה גיליון 138 שריטה assay הגירה HaCaT פפטיד טיפול מיקרוסקופ אופטי גורם הגדילה באפידרמיס לקטופרין Lactoferricin
אופטימיזציה Assay מאפס <em>במבחנה</em> בדיקה של נדידת תאים עם מצלמה אופטית אוטומטית
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Vang Mouritzen, M., Jenssen, H.… More

Vang Mouritzen, M., Jenssen, H. Optimized Scratch Assay for In Vitro Testing of Cell Migration with an Automated Optical Camera. J. Vis. Exp. (138), e57691, doi:10.3791/57691 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter