Summary
Aqui descrevemos um procedimento para testar a célula migração em vitro com um microscópio de câmara óptica automatizada. O ensaio de risco tem sido amplamente utilizado, onde o encerramento da Risque é seguido por um período. O microscópio óptico permite detecção confiável e barata de migração celular.
Abstract
Migração celular é um processo importante que influencia muitos aspectos da saúde, tais como a cicatrização de feridas e câncer, e é, portanto, crucial para o desenvolvimento de métodos para estudar a migração. O ensaio de risco tem sido o método mais comum em vitro testar compostos com propriedades anti e pro migration por causa de seu baixo custo e simples procedimento. No entanto, um problema frequentemente relatados do ensaio é o acúmulo de células através da borda da risque. Além disso, para obter dados de ensaio, imagens de diferentes exposições devem ser tomadas durante um período de tempo no mesmo lugar para comparar os movimentos de migração. Análise de diferentes programas pode ser usado para descrever o fechamento zero, mas eles são mão de obra intensiva, impreciso e forças ciclos de mudanças de temperatura. Neste estudo, vamos demonstrar um método otimizado para testar o efeito de migração, por exemplo, com as proteínas naturais, humanos e bovinos-lactoferrina e seu peptídeo N-terminal Lactoferricin na linha de células epiteliais HaCaT. Uma otimização de crucial é lavar e arranhar em PBS, que elimina o referido acúmulo de células ao longo da borda. Isso pode ser explicado pela remoção de cátions, que foram mostrados para ter um efeito sobre a conexão do celular de queratinócitos. Para garantir a verdadeira detecção de migração, pré-tratamento com mitomicina C, um inibidor da síntese de DNA, foi adicionada ao protocolo. Finalmente, vamos demonstrar a automatizado óptica câmera, que elimina os ciclos de temperatura excessiva, trabalho manual com análise de risco de encerramento, enquanto melhora na reprodutibilidade e garantir a análise de seções idênticas da risque ao longo do tempo.
Introduction
A migração é um processo importante que influencia diversos aspectos fisiológicos. Na cicatrização de feridas, migração facilita a fase de re-epitelização da pele. Em feridas não-cura, tais como feridas crônicas, bactérias oportunistas causar infecção da ferida, e feridas abertas são ideais para o crescimento de bactérias e formação de biofilme1,2. Biofilme é uma das causas do desenvolvimento de bactérias resistentes, que é uma das maiores ameaças à nossa sociedade moderna3. Na cicatrização de feridas, as células do sistema imunológico não consegue penetrar o biofilme. Em câncer, migração de células cancerosas é um passo crucial de metástase, que é a principal causa de morte para pacientes com tumores sólidos4,5. Portanto, é crucial poder estudar a migração.
O ensaio de zero é frequentemente usado para testar a migração celular, porque é barato e fácil de realizar em linhas de células aderentes, tais como fibroblasto, endotelial e a célula epitelial linhas6,7. Hoje, existem vários métodos para executar arranhões8, e materiais diferentes foram relatados para ser usado, incluindo célula raspadores10palitos9, lasers11e correntes elétricas12. Todos os métodos têm diferentes prós e contras, e o método deve ser decidido de acordo com a ferramenta de tipo, orçamento e análise de célula. Por exemplo, se o tipo de célula usada necessita de revestimento, remoção de pressão manual, por exemplo, com uma ponta de palito de dente ou pipeta, influenciará a migração dentro da área, deve ser usado um método diferente. Neste estudo, focaremos na raspagem manual.
Uma desvantagem para raspagem manual é a variação do tamanho, as formas dos arranhões e acúmulo de células nas bordas da risque. Existem muitos protocolos, e um papel altamente citados aconselha aumentou a velocidade e/ou lavagem completa após coçar13. Além disso, vários métodos têm sido utilizados para minimizar a proliferação, uma vez que a proliferação das células não pode ser distinguida da migração e, portanto, pode dar resultados falso-positivos da migração. Alguns relataram métodos são fome soro precede o zero14 e diminuindo a quantidade de soro15. No entanto, nenhum desses métodos pode garantir que não há nenhuma proliferação. Portanto, nós relatamos um pré-tratamento das células com mitomicina C para garantir resultados verdadeiros da migração. Mitomicina C é um antibiótico que inibe a síntese de DNA, formando uma ligação covalente com o DNA, o que impede o DNA de separar16. Pré-tratamento com mitomicina C e lavagem com PBS antes de coçar, detectado encerramento do gap demonstra a verdadeira migração das células (Figura 1).
Uma característica de todos os métodos é a necessidade de um sistema analisar o processo de migração17. Um método de baixo custo para analisar o progresso e um comum é usar um microscópio de luz-campo para tirar fotos da risque em pontos de tempo pré-determinado, seguidos por uma análise do fechamento de gap em um software de imagem18,19. Este método é demorado, não confiável com relação ao tirar fotos no mesmo lugar e foco, e o movimento da incubadora para câmera forças ciclos de mudanças de temperatura enquanto fotos são tiradas. Outros métodos têm sido desenvolvidos para detectar a migração medindo o fluxo de corrente. As alterações atuais, como células cobrem mais espaço na placa, que é lido como um aumento da impedância de20. Medindo a impedância, o ambiente das células não é afectado, e o método, portanto, é considerado não-invasiva. Este método baseia-se em placas especializadas com eletrodos de ouro, que são caros, mas eles permitem a detecção de muitos processos, tais como adesão celular, proliferação, migração e morte celular. Uma grande desvantagem deste método é que a medição de impedância não indica diretamente a migração, como fatores tais como temperatura têm um grande impacto sobre a impedância. Alterações na impedância podem ser causadas por vários fatores que não são revisados pelo software, dificultando a análise dos dados. Portanto, a falta de visualização exige um microscópio de luz convencional para verificar a migração.
Para superar muitas das desvantagens das técnicas disponíveis, nós usamos uma câmera óptica automatizada em tempo real. A câmara óptica é um sistema de detecção com um microscópio de alta produtividade em uma pequena plataforma com uma lente, unidade de iluminação e uma câmera digital. Tem um built-in software, que pode testar a migração e proliferação entre outras coisas. Para detectar a migração, dois algoritmos são usados para analisar o crescimento e a cinética de migração das células, que são chamados a proliferação e a ferida que cura a análise, respectivamente. A análise de proliferação é baseado em um algoritmo de segmentação de imagens de duas etapas que se aplica a análise de textura para detectar a diferença entre as áreas cobertas de célula (mostrado em amarelo) e vazio fundo áreas por análise de histograma avançado. A análise de cicatrização de feridas é baseada em um algoritmo de três etapas que detecta a monocamada de células, localiza a abertura da ferida e determina a largura do fosso. Estas etapas são realizadas nos pontos de tempo determinados pelo usuário, e os dados são apresentados como coberta, largura do fosso e área de abertura. Uma das grandes vantagens desta máquina é que ele permite que imagens de células aderentes através de líquido por causa do ângulo da câmera21. As lenstakes inclinado que imagens são projetadas para uma pilha de um único plano z z geram para garantir que as fotos estão em foco (Figura 2). z-pilhas são geradas pela fusão da série de fotos (por exemplo, 40) perpendiculares à borda da ferida e através da ferida toda. Os z-pilhas permite capturar da profundidade da camada de células, bem como de um avião em foco através da ferida. Além disso, a série de imagens pode ser colocada juntos para uma coleção de vídeo das imagens, com o clique de um botão.
Vamos demonstrar um protocolo otimizado para a deteção de migração em linhagem celular de queratinócitos HaCaT. Nós testamos a lactoferrina e seu peptídeo N-terminal, Lactoferricin, com os humanos e as vacas, para analisar o seu efeito sobre a migração como estas moléculas têm demonstradas ter numerosas aplicações como antimicrobiano e imunológico, modulando as moléculas22 , 23. os quatro compostos foram comparados às células não tratadas de HaCaT e fator de crescimento epidérmico (EGF) foi usado como controle positivo.
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Protocol
A instalação experimental não tem nenhuma restrição ética e legal e foi conduzida de acordo com a Universidade de Roskilde. Uma visão geral sobre a montagem experimental pode ser vista na Figura 1 e os mecanismos da câmara óptica na Figura 2.
1. preparação
- Execute todas as etapas em um banco do fluxo laminar esterilizado por limpar a bancada e todos os equipamentos com etanol a 70% antes do início do experimento.
- Coloque a câmara óptica numa incubadora convencional a 37 ° C com 5% de CO2 para garantir condições ideais para as células.
- Desenvolvem-se células HaCaT na mídia DMEM com 10% FBS e 1 x antibióticos (penicilina e estreptomicina) num balão T75.
- Use tripsina de 1 x 1 mL para separar as células e sub, cultivá-las a cada 3-4 dias, por isso dispersar sobre a camada celular. Pré-aqueça a temperatura ambiente antes do uso.
2. gerar uma monocamada de HaCaT células em uma placa de microtitulação de 48-poços
- Remova o meio do balão T75 com uma pipeta Pasteur.
- Lave as células aderentes no frasco, adicionando 5 mL 1X PBS estéril para o balão de T75.
Nota: Certifique-se de que o PBS é livre de cálcio e magnésio. - Circule a PBS e removê-lo com uma pipeta Pasteur.
- Repita a etapa 2.2-2.3.
- Adicionar tripsina de 1 x 1 mL no balão e dispersá-la em toda a camada de células.
- Incubar o frasco a 37 ° C numa incubadora convencional até que as células são desanexadas (5-8 min é suficiente para a maioria das linhas de células).
- Ver no microscópio se as células são desanexadas. Uma vez que as células são desanexadas, adicionar 9 mL dos meios de cultura regular com 10% FBS para inactivar a tripsina 1 x.
- Contar a célula com qualquer um hemocytometer, um contador de coulter ou similar.
Nota: Trypan azul pode ser usado para exibir as células mortas. No entanto, em tripsina 1 x HaCaT células são perfeitamente redonda quando vivo. - Transferi 7,5 x 104 células/poço em 250 µ l 10% FBS meios de comunicação social para uma cultura de tecidos de 48-poço redondo placa (padrão).
Nota: ensaio também pode ser configurado em 6, 12, 24-ou placas de 96 poços, que tudo podem ser analisadas ao microscópio óptico. - Mover suavemente a placa de lado para lado para garantir que as células estão igualmente distribuídas em poços, ou as células irão se reunir no centro de poços. Inspecionar sob um microscópio de luz para certificar-se de que a célula é espalhada uniformemente na mídia
- Colocar a placa numa incubadora convencional CO2 a 37 ° C durante a noite ou até que as células tenham aderido ao fundo dos poços.
3. adição de estímulos para efeitos de migração
- Verifique se os poços estão confluente de 90-95% sob um microscópio de luz.
- Prepare-se 10 µ g/mL de mitomicina C em uma quantidade apropriada de médio porte.
Nota: Neste estudo, mitomicina C é mantido a 4 ° C em uma solução de 1 mg/ml. Mitomicina C em solução pode ser armazenada até uma semana no escuro a 2-8 ° C. - Remova a mídia passou com uma pipeta Pasteur de cada poço.
- Adicione 250 µ l de 5 µ g/mL de mitomicina C para cada poço.
- Incube a placa por 2 h a 37 ° C e 5% de CO2.
- Prepare-se estímulos de peptídeos diluindo-os em uma quantidade apropriada de médio porte.
Nota: Neste estudo, tanto a humana e bovina lactoferrina e Lactoferricin foram testados em 25 µ g/mL em um volume de 250 µ l - Remova o meio com mitomicina C com uma pipeta Pasteur.
- Lave os poços 1x com 250 ml de 1X PBS (temperatura ambiente) e remover a lavagem com uma Pasteur pipeta.
- Adicionar 250 µ l de 1X PBS e riscar manualmente os poços verticalmente com a ponta da pipeta 200 µ l. Use uma ponta de pipeta nova para cada poço.
- Remova a PBS e adicione 250 estímulos de peptídeo µ l.
- Monte a placa no sistema óptico da câmera, ajustando os parafusos em ambos os lados da placa. Deixe a tampa da placa de microtitulação.
Nota: A câmera pode operar com a tampa aberta, se necessário.
4. configurar o programa para a câmara óptica no computador
- Clique em Acquire na barra de tarefas à esquerda.
- Escolha a função de cicatrização de feridas na barra de tarefas à esquerda.
- Escolha o tipo de placa clicando abaixo a ilustração da placa.
- Cancelar a seleção de poços, não estiver em uso, marcando-os e clique em habilitar no lado superior esquerdo na tela.
Nota: Todos os poços são selecionados por padrão. - Ajuste o foco da lente em poços para ajustar a posição das células clicando em um dos poços.
Nota: Autofocus também pode ser ajustado manualmente, movendo a barra à direita da ilustração a placa. - Definir o período de tempo para imagens em Intervalo de imagens (por exemplo, (00:30:00)).
- Defina o número de repetições para caber o período desejado (por exemplo, 97 repetições).
- Começa a correr, clicando no botão Iniciar no canto inferior direito.
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Representative Results
HaCaT é uma linha de celular de queratinócitos, um dos tipos de célula mais abundantes na pele. Quando um ferimento ocorre, as células de pele começam a proliferar e migrar para o leito da ferida para fechar a ferida (Figura 3). Ambos os processos são, portanto, de extrema importância para a cura adequada.
A câmara óptica pode acompanhar os dois processos em tempo real. Para a migração, o sistema dá três conjuntos de dados: célula coberta, largura do fosso e área de abertura. Quando o monitoramento de riscos tratados com lactoferrina, Lactoferricin ou EGF, o microscópio óptico permite controlar estes três parâmetros ao longo do tempo. Após a incubação de 48 h, observamos que a EGF resultou em 95% de fechamento da ferida, em comparação com 38% de fechamento do controle não tratado (Figura 3A). As diferentes versões de lactoferrina e Lactoferricin são colocadas entre 33% e 62% ferida encerramento com os peptídeos, sendo mais potente que as proteínas do pai. A porcentagem de fechamento da ferida, determinado a partir de mudanças na largura do fosso do zero inicial, também pode ser plotado (Figura 3B).
HaCaT as células têm uma interação célula-célula forte e quando as células migram, série de passos é necessários24. Em breve, as principais células perturbam seu site de adesão, projetam-se e contraem o citoesqueleto para mover a25. A saliência das células principais facilmente pode ser vista com a câmera óptica (Figura 4).
Figura 1 : Fluxograma esquemática do ensaio para testar a migração em uma câmera óptica zero. HaCaT células são banhadas em uma placa de 48 e permitiu a aderir por 24 h. As células são pré-tratados com mitomicina C por 2 h inibir a proliferação, e o risco é executado e seguido pela adição de estímulos de peptídeo. A placa é inserida na unidade da câmara óptica e migração é seguida por 48 h.
Figura 2 : A tecnologia de varredura da câmara óptica. A unidade de lente ótica da câmara óptica automatizada é angulada 6,25 ° ao plano horizontal para habilitar a verificação através de várias soluções, tais como soluções bacterianas e celulares. A série adquirida de imagens contêm pilhas de imagem de todos os focos, ambos fora de foco e em foco, para assegurar imagens com a células em foco. Modificado de26.
Figura 3 : Migração da célula de pré-tratados mitomicina C HaCaT mais de 48 horas. (A) migração é detectada na câmara óptica automatizada a cada meia hora durante 48 h. As células são pré-tratados com mitomicina C para inibir a proliferação. As células são tratadas com 25 µ g/mL de humano - ou bovina-lactoferrina (H-LF ou B-LF) ou - Lactoferricin (H-LFcin, B-LFcin). Fator de crescimento epitelial (EGF) é usado como um controle positivo a 500 ng/mL. Não tratadas células HaCaT são usadas como um controle. (B) gráfico ilustração da migração dos tratamentos. Os resultados são representantes de três corridas independentes, e resultados são apresentados como uma porcentagem de fechamento da risque inicial * p < 0.05, * * p < 0,01, * * * p < 0,001.
Figura 4 : Salientes lamellipodia de trataram células de HaCaT. Lamellipodia das células HaCaT é marcado pelas setas pretas. A interação célula-célula forte da HaCaT resulta em movimento dinâmico das células como eles migram e podem facilmente ser observados ao longo do tempo.
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Discussion
A importância da migração em estudos de desenvolvimento, cicatrização de feridas, imunologia e câncer levou a diversos métodos para estudar a migração. Migração pode ser uma expressão da expansão ou o fechamento da lacuna pelas células. Mais frequentemente o encerramento da Risque é testado, como é mais fácil cultivar células em um monolayer e então fazer um arranhão do que o crescimento das células em uma forma específica de8. Nosso estudo demonstra um método otimizado para coçar manual, como a técnica é fácil de dominar e de baixo custo. Introduzimos a mitomicina de inibidor de síntese de DNA C, uma lavagem extra para otimizar o zero em comparação com métodos publicados18e o uso de uma câmera óptica que permite estudos de alta produtividade.
O ensaio zero em vitro requer uma linha de células aderentes que vincula corretamente no fundo dos poços e para detectar a migração de um arranhão, proliferação precisa ser inibido. Estas duas características são essenciais para o ensaio. Para detectar a verdadeira migração, várias abordagens têm sido descritas com redução da concentração de soro, a célula antes de coçar14, DMSO ou vários inibidores 13,27a morrer de fome. Em geral, uma mídia livre de soro pode ser usada, no entanto, alguns celular linhas, tais como linhas de célula primária, necessidade de soro para o movimento e a sobrevivência global. Portanto, a escolha deve ser feita de acordo com a linha celular. Linhas celulares que necessitam de revestimento podem ser problemáticas neste ensaio, como arranhões manuais irão perturbar o revestimento também.
Diferentes tipos de células requerem o número diferente de células para formar uma monocamada confluente, dependendo de sua taxa de crescimento e tamanho. As células HaCaT aderirem após cerca de 4-6 h, mas são deixadas para resolver durante a noite para fazer um monolayer estável. Uma das grandes desvantagens do ensaio zero é irregular riscos8. Neste estudo, mostramos que a pré-lavagem com PBS e tornando o scratch em PBS nova diminuem acumulações de células danificadas e feridas ao longo das bordas da risque. Plausivelmente, isto poderia ser explicado pela junção desmossomas conectando as células da pele. As junções são Ca2 +-dependente24 e usando PBS, os cátions são removidos, o que poderia enfraquecer a adesão célula-célula forte. Desse modo, o uso de PBS pode permitir melhor remoção das células individualmente, levando a menos acúmulo das células ao longo da borda da ferida. Além disso, a câmera óptica mede uma parte mais larga dos poços em todos os tamanhos de placa e adapta-se a dobras na zero através de seu algoritmo de três passos. Desse modo, pré-lavagem com PBS e usando a câmera óptica, as desvantagens do manuais arranhões são eliminadas. O z-empilhamento de imagens faz focando as células mais precisas, mas dependendo de como os diferentes tipos de células crescem, o foco pode ser um problema. Se as células crescem demais, o foco da câmera mudará de em foco para fora de foco. Assim, se não for usada a mitomicina C, pode ser vantajoso para definir o foco um pouco mais alto, se sua configuração experimental será executada por mais de 24 h. A câmara óptica tem um set-up fácil que é operado através de um computador padrão com um software intuitivo que pode medir chapas de 6 - para 96 poços da microplaca placas e, portanto, permite que várias instalações de teste. Ao escolher o número de imagens a serem tomadas, existem algumas limitações. Se for usada uma placa de 96 poços, o número de fotos, um pode obter é apenas limitada ao espaço no computador, como conjuntos de dados pode se tornar grande e pela velocidade da câmera. Muitas fotos forem necessários em uma rápida sucessão, o movimento da câmera pode ser um fator limitante, como precisa de tempo para fazer a varredura de cada bem.
O sistema óptico permite que simples, mas poderoso monitoramento. As fotos da risque são analisadas no que se refere o processo de fechamento do gap, mas também podem ser usadas para caracterização morfológica das células. O software marca as células amarelas e deixa a cor de fundo cinza como um recurso padrão, para visualizar melhor a borda da ferida, embora imagens raw obviamente estão disponíveis que deverão ser necessários para , por exemplo, publicações. As células HaCaT têm interações célula-célula forte que fazem a migração ocorre em uma dinâmica folha28. Esta característica torna mais fácil ver lamellipodia das células migrando ao longo do tempo (Figura 4).
Este estudo demonstra o efeito das proteínas de lactoferrina e seus peptídeos derivados do N-terminal Lactoferricin e EGF como um controle positivo, mas pode ser modificado para testar drogas diferentes, peptídeos/proteínas e combinações, como inibidores ou estimuladores de cicatrização de feridas. O ensaio de risco pode ser alterado e otimizado para caber várias linhas de células e compostos que podem afetar a migração. Juntos, com seu baixo custo e fácil gerenciamento, este ensaio é muito acessível para a maioria dos laboratórios. A câmara óptica poderia ser usada para testar drogas diferentes, inibidores ou estimuladores para a migração, mas também a proliferação.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Conselho dinamarquês de pesquisa independente, tecnologia e produção, conceder #4005-00029
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| oCelloScope | BioSense Solution ApS | Optical camera | |
| UniExplorer software | BioSense Solution ApS | (8.0.0.7144 (RL3)) | |
| HaCaT cell | Donated from Bispebjerg Hospital | ||
| DMEM (1x) + GlutaMAX | Gibco | 31966-021 | Medium for HaCaT |
| FBS | Gibco | 10270 | Fetal bovine serum |
| PBS | Gibco | D837 | Without Mg+ and Ca2+ |
| Pencillin-Streptomycin | Sigma | P0781 | Antibiotics |
| Trypsin (10x) | Sigma | T3924 | |
| Mitomycin C | Tocris | 3258 | Inhibits proliferation |
| Microtiter plate | Greiner Bio-one | 677 180 | |
| Incubator | Panasonic | 37°C, 5% CO2 | |
| Hemocytometer | Assistent | Türk (0.1 mm) | |
| Pipet boy | Accu-Jet pro |
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